Tổng quan về kỹ thuật PCR

TỔNG QUAN
PCR


• PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản trình tự DNA quan tâm
trong test tube.
• K.Mullis phát minh năm 1985 => 8 năm sau đạt giải Nobel hóa
• Thành phấn cần có:
1. DNA polymerase
2. dNTP
3. Primer ( F – R)
4. DNA mẫu ( DNA mục tiêu)
5. Buffer
6. Mg 2+
• Ưu điểm PCR: Nhanh – Nhạy – Đặc hiệu


SO SÁNH NHÂN BẢN TỰ NHIÊN VÀ PCR
Replication – tái bản

PCR

DNA

DNA template / RNA

Enzyme

Ko cần nhưng bù lại cần nhiệt độ

DNA polymerase

DNA polymerase

dNTPs

dNTPs

Mg 2+

Mg 2+

Primer: RNA

Primer DNA ( F – R)

Ko cần buffer

buffer


Mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn
a. Biến tính: 94 đô C – 15s – 1min
+ Dưới tác động của nhiệt độ 2 sợi của DNA tách
nhau ra thành các sợi đơn
b. Bắt cặp: 55 -65 độ C – 15s – 1min
+ Các primer bám vào:
F bám vào antisene
R bám vào sene
+ Phụ thuộc vào primer: đặc biêt G + C 40%
chiều dài 18 -> 22 nu

c. Kéo dài: 72 độ C – 30s – 3min
+ Primer chạy dài tạo sản phẩm
+ Ko quá 300 nu
+ DNA polymerase chỉ hoạt động khi có primer
+ Kéo dài chiều 5’ – 3’

Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)


Nhằm tăng tính đặc hiệu sẽ sử dụng 2 primer để giới hạn đoạn gene PCR



REAL TIME PCR
qPCR


PCR

q PCR

Định tính – xác định có đoạn gene hay
khơng

Xác định số lương gen mục tiêu, bao
nhiêu bản, bao hàm cả định tính tính
Chất phát huỳnh quang

Quan sát trên gel điện di trong buồng
chụp điên di

Thu ảnh thông qua detectior thu nhận
tính hiệu ánh sáng

Chất phát huỳnh quang – là chất khi nhận năng lượng ở một
luồng ánh sáng tới thì sẽ tích lũy và phát ra năng lượng ở bước
sống cao hơn
 Ethidium bromide – sáng gấp 25 lần
 SYBR green – sáng gấp 200 lần


• PCR có thể quan sát trực tiếp
• Cấu tạo: + Máy luân nhiệt PCR
+ Máy quang phổ huỳnh
+ Máy vi tính
• Mỗi chu kì gồm 2 q trình diễn ra đồng thời:
+ PCR - Nhân bản DNA
+ Đo độ phát huỳnh quang
• Cách nhận biết có tín hiệu
+Phẩm nhuộm -> Ghép với sợi DNA => tạo tín hiệu huỳnh quang
+Probe đặc hiệu –> gắn với trình tự đích => tạo tín hiệu huỳnh quang
Ưu điêm: Định lượng – Nhậy nhất – Đặc hiệu – Hiệu quả - Nhanh, qui trình đơn
giản – Giảm nguy cơ ngọại nhiễm




GIẢI PHÁP REAL TIME PCR
• 1. Theo dõi phản ứng PCR đang xảy ra
• 2. Định lượng nồng độ DNA mẫu trước phản

ứng bằng cách so sáng Ct mẫu với Ct của các
chất đã biết trước nồng độ
• 3. Dùng Melt Curve để xác định đặc tính của
sản phẩm khuếch đại
• 4. Phân tích end – point, xác định dương tính
hoặc âm tính





KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG
• Chu kỳ ngưỡng – Ct – Threshold Cycle (Ct): nơi mà tín hiệu huỳnh
quang cao hơn tín hiệu nền một cách tháy rõ, có tương quan chặt
chẽ với số lượng DNA đích ban đầu.

• Số lượng bản DNA đích ban
đầu càng nhiều thì thời điểm
Ct phát hiện tín hiệu sản phẩm
khuếch đại càng sớm


QUY TRÌNH VÀ THIẾT BỊ