Thực tập thử nghiệm sinh học ctu

BÀI 1. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME
α-AMYLASE CỦA CAO CHIẾT THỰC VẬT
I.MỤC ĐÍCH YÊU CẦU
- Hiểu được cơ chế hoạt động của enzyme α-amylase trong phản ứng thủy phân tinh bột.
- Khảo sát khả năng ức chế enzyme amylase của cao chiết thực vật.
II. THỰC HÀNH
1.Chuẩn bị
a. Pha dung dịch đệm phosphate natri, pH 7
- Lần lượt pha hai dung dịch (a) và (b) theo công thức sau:
+ Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH2PO4 hòa tan và định mức đến
1000mL.
+ Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na2HPO4.7H2O hoặc 71,7 g
Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000mL.
- Lấy 39 mL dung dịch (a) cho vào bình định mức 100mL, thêm dung dịch (b) cho đến vạch.
Thu được dung dịch đệm phosphate natri pH 7.
b. Chuẩn bị cao chiết
- Cân chính xác 10 mg cao chiết cho vào eppendorf tube 1mL rồi thêm 1mL DMSO.
- Lắc đều cho tan hoàn toàn thu được dung dịch cao chiết có nồng độ 10.000 µg/mL (xem như
dung dịch gốc).
- Tiến hành pha loãng dung dịch gốc thành dãy nồng độ như sau :400, 800, 1600 và 3200
µg/mL theo Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Hướng dẫn pha loãng cao chiết
Nồng độ cao chiết µg/mL
Thể tích dung dịch gốc (µL) Thể tích DMSO 10%( µL)
400
20
480
800
40
460
1600

80
420
3200
160
340
Ghi chú : Nên sử dụng các dung dịch có nồng độ lớn để pha lỗng thành các dung dịch có nồng
độ thấp hơn để giảm sai số.
c. Pha dung dịch tinh bột
- Cân chính xác 20 mg tinh bột cho vào cốc thủy tinh ,thêm 10 mL nước cất , khuấy đều .
- Đun bằng lò vi sóng cho đến khi tinh bột tan hồn tồn.
- Dung dịch tinh bột thu được có nồng đồ 2mg/mL, dung dịch này cần được để nguội hoàn
toàn trước khi sử dụng.
d. Pha enzyme α-amylase
- Cân chính xác 2mg enzyme α-amylase cho vào eppendorf và thêm vào 2mL dung dịch đệm
phosphate natri pH 7.
1


- Dung dịch enzyme thu được có nồng độ 1mg/mL tương đương 30 U/mL (U). Sau đó rút 100
µL enzyme α-amylase 30 U vào eppendorf tube 1mL và rút thêm 900 µL dung dịch đệm
phosphate pH=7 vào đánh đều lên thu được dung dịch enzyme α-amylase nồng độ 3 U dùng cho
thí nghiệm.
2. Xác định khả năng ức chế enzyme amylase của cao chiết
- Đánh số ống eppendorf từ 1 đến 7.
- Lần lượt thực hiện cho vào ống eppendorf và thực hiện các bước thí nghiệm như được trình
bày trong Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Các bước thử nghiệm ức chế enzyme α-amylase của cao chiết thực vật
Hóa chất
Ống 1
Ống 2

Ống 3
Ống 4
Ống 5
Ống 6
Đệm phosphate
Cao chiết
DMSO 10%
Đệm phosphate
Enzyme αamylase (3U)
Đệm phosphate

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL,
Nồng
độ 400
µg/mL

100 µL
Nồng
độ 800
µg/mL

100 µL
Nồng
độ 1600
µg/mL

100 µL
Nồng
độ 3200
µg/mL

100 µL

-

-

-

50 µL

50 µL

50 µL

50 µL

-

Ống 7

100 µL

100 µL

-

-

-

100 µL
-

100 µL

50 µL

50 µL

-

-

o
Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37 C trong 5 phút
Tinh bột
100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
Hỗn hợp phản ứng tiếp tục được ủ ở 37oC trong 15 phút
HCl đậm đặc

200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL
Thuốc thử iod
300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL
Đo OD ở bước sóng 660 nm

100 µL
200 µL
300 µL

Ghi chú: “-” là khơng thêm vào.
Khả năng ức chế enzyme α-amylase của 1 cao chiết ở nồng đồ xác định được biểu diễn thông
qua hiệu suất phản ứng thủy phân tinh bột dựa vào lượng tinh bột còn thừa sau khi đã ngừng
phản ứng thủy phân . Lượng tinh bột thừa được kiểm tra thông qua phản ứng màu với iod. Hiệu
suất phản ứng được tính theo cơng thức:
Hiệu suất phản ứng (%) =

Ac - As
Ac

x100
2


Trong đó:
Acontrol hay Ac là giá trị mật độ quang của dung dịch đối chứng (lượng tinh bột ban đầu).
(Ống 7)
Asample hay As là giá trị mật độ quang của dung dịch sau phản ứng (lượng tinh bột còn lại
sau phản ứng)
Ac luôn lớn hơn As
Hiệu suất ức chế là lượng enzyme bị ức chế trong phản ứng

Hiệu suất ức chế (%) = 100% - hiệu suất phản ứng (%)

Do cao chiết có màu nên sẽ ảnh hưởng đến kết quả khảo sát , do đó cần đo quang phổ của cao
chiết:
Ta thực hiện như sau: chuẩn bị các ống 2’, 3’, 4’ , 5’ được thay các dung dịch (enzyme, tinh
bột, HCl đậm đặc, thuốc thử Iod) bằng đệm phosphate (Bảng 1.3)
Độ hấp thu quang phổ thực sự sẽ bằng: Ống 2-2’ ; Ống 3-3’ ; Ống 4-4’ ; Ống 5-5’
Bảng 1.3. Các bước thử nghiệm sự ảnh hưởng của cao chiết đến giá trị Abs
Hóa chất
Ống 2’
Ống 3’
Ống 4’
Đệm phosphate
750 µL
750 µL
750 µL
100 µL, nồng
100 µL, nồng
100 µL, nồng
Cao chiết
độ 400 µg/mL
độ 800 µg/mL
độ 1600 µg/mL
Đo OD bước sóng 660 nm
III. BÁO CÁO KẾT QUẢ
1. Biểu diễn kết quả

Hình 1.1. Đo OD ở bước sóng 660 nm

3

Ống 5’
750 µL
100 µL, nồng
độ 3200 µg/mL


- Bảng biểu thị mật độ quang và phần trăm ức chế của dung dịch cao chiết thực vật
Nồng độ Cao chiết
Ống eppendorf
Abs
% ức chế
µg/mL
1
0.257
2
400
0.338
34.77
3
800
0.453
46.60
4
1600
0.623
64.09
5
3200
0.698

71.81
6
0.886
7
0.972
- Dựa vào bảng số liệu trên ta vẽ được đồ thị như sau :

Hình 1.2. Đồ thị biểu diễn phần trăm enzyme α-amylase bị ức chế theo nồng độ cao chiết
1. Tính giá trị IC50: Từ phương trình đường chuẩn “y= 0,0125x + 35,529” suy ra giá trị IC50
của cao chiết
50 – 35,529
IC50 =
= 1157.7 ( mg/ml)
0,0125

2. Nhận xét khả năng ức chế emzyme của cao chiết:
- Khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao chiết được xác định dựa vào lượng tinh bột còn
lại sau phản ứng thủy phân để đánh giá mức độ thủy phân của enzyme α-amylase.
4


- Sau phản ứng lượng tinh bột còn lại càng nhiều thì khả năng ức chế α-amylase của cao chiết
càng cao, kết quả từ ống 1 đến ống 5 là khi nồng độ cao chiết tăng dần mẫu của dung dịch từ
không màu (ống 1 là đối chứng ) chuyển dần sang xanh tím ở các ống 2,3,4,5) => chứng tỏ
lượng lượng tinh bột còn thừa sau phản ứng tăng dần ( do tinh bột kết hợp với iod-tinh bột có
màu xanh) => giá trị Abs tăng dần.
- Phần trăm ức chế tăng dần khi nồng độ cao chiết tăng dần suy ra hiệu quả ức chế α-amylase
tăng khi nồng độ cao chiết tăng . Do đó cao chiết có khả năng ức chế enzyme α-amylase làm cho
enzyme khơng có khả năng thủy phân tinh bột.
- Ảnh hưởng của DMSO: Ta nhận thấy độ hấp thu quang phổ ở ống 6 ( khảo sát DMSO có

ảnh hưởng hoạt động của enzyme ) và ống 1 (đối chứng ) bằng nhau nên % ức chế = 0% => Vì
vậy DMSO khơng làm giảm hiệu suất phản ứng thủy phân tinh bột.

5


BÀI 2 - 3. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN KHẢO
SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH
A. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

I. MỤC ĐÍCH U CẦU:
- Biết cách chuẩn bị mơi trường nuôi cấy vi khuẩn và khảo sát khả năng kháng khuẩn.
- Biết cách khử trùng môi trường và chuẩn bị môi trường đặc nuôi cấy vi khuẩn.1
II. THỰC HÀNH
1. Pha chế mơi trường
- Mơi trường LB Broth powder (có sẵn): cân 25 g mơi trường LB, sau đó thêm vào1000
mL nước cất và điều chỉnh pH 7,2.
- Môi trường được pha từ các hóa chất
Thành phần mơi trường (chuẩn bị 1000 mL môi trường) gồm:
NaCl
10g
Tryptone/ Peptone
10g
Cao nấm men (Yeast Extract)
5g
Agar
15g
- Các hóa chất trên lần lượt được cân và cho và cốc thủy tinh, sau đó cho nước vào đếnvạch
1000 mL.

- Cốc hóa chất được đặt trên máy khuấy từ và được khuấy đều cho đến khi các hóa chấthịa
tan hồn tồn.
- Điều chỉnh pH mơi trường pH 7,2.
2. Khử trùng môi trường và chuẩn bị môi trường đặc trên đĩa petri
- Môi trường sau khi pha xong được chuyển vào chai chịu nhiệt, đĩa petri được cho vào túi
nylon kiếng (hoặc gói trong giấy dầu).
- Mơi trường và đĩa petri được cho vào nồi khử trùng nhiệt ướt và khử trùng ở nhiệt độ121°C
trong 30 phút.
- Sau khi khử trùng xong, chai chứa môi trường và đĩa petri được cho vào tủ cấy vôtrùng.
- Các đĩa được đặt chồng lên nhau (khoảng 4 - 5 đĩa).
- Môi trường được chia vào các đĩa petri, thao tác được thực hiện như sau:
+ Tay phải cầm chai chứa môi trường đã khử trùng và hơ nhẹ miệng chai trên đèn cồn,tay
trái mở nắp chai và hơ miệng chai trên ngọn lửa đèn cồn lần thứ 2.
+ Tay trái cầm và mở nắp đĩa petri cuối cùng, tay phải nghiêng chai mơi trường và rót mơi
trường vào đĩa petri (lớp mơi trường dày khoảng 2 – 3 mm), đậy nắp đĩa lại và mởnắp đĩa petri
thứ 2 và thực hiện tương tự cho đĩa thứ 3 và 4.
- Sau khi rót xong, cho môi trường vào tất cả các đĩa cần mở hé đĩa trên cùng để hơi nước
không đọng lại trên nắp đĩa, để yên cho môi trường nguội và đặc lại.
6


- Sau khi môi trường trong các đĩa petri đã nguội, các đĩa môi trường được cho vào các túi
nylon và buộc kín lại để đảm bảo vơ trùng (các đĩa petri được đặt úp lại, đáy dưới của đĩa petri
nằm phía trên), ghi tên mơi trường và ngày tháng năm. Các đĩa mơi trườngcó thể được sử dụng để
cấy vi khuẩn hoặc được trữ trong tủ lạnh để sử dụng trong thí nghiệm.
3. Chuẩn bị mơi trường đặc trên đĩa petri trong thử hoạt tính kháng khuẩn
- Khi khử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, độ dày môi trường
trên các đĩa petri cần đồng đều, nên việc chuẩn bị môi trường cũng được tiến hành tương tự như
trên nhưng cần chia môi trường vào các ống nghiệm trước khi khửtrùng.
- Chia 10 mL (hoặc 15 mL tùy theo kích thước đĩa) mơi trường sau khi phối trộn vào mỗi ống

nghiệm.
- Dùng nút gòn đây các ống nghiệm lại, sau đó cho ống nghiệm vào túi nylon kiếng, cộtmiệng
túi và cho vào nồi khử trùng nhiệt ướt và khử trùng 30 phút ở 121°C.
- Sau khi khử trùng xong, môi trường trong từng ống nghiệm được cho vào mỗi dĩa petri.
- Các thao tác còn lại tương tự như mục 2.
Chú ý:
- Thao tác rót môi trường phải nhanh và nhẹ để hạn chế bọt khí và sự nhiễm khuẩn.
- Mặt agar phải phẳng, khơng gợn sóng.
- Sau 1-2 ngày cần kiểm tra lại xem mơi trường có bị nhiễm khuẩn khơng rồi mới sử dụngđể
cấy hay phân lập.
III. BÁO CÁO KẾT QUẢ
Chuẩn bị được các đĩa môi trường đúng cách không bị nhiễm.

B. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH
I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU
- Pha chế được các nồng độ kháng sinh hoặc cao chiết
- Thực hiện được thí nghiệm thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cơ bản.
II. THỰC HÀNH
1. Chuẩn bị kháng sinh hoặc cao chiết của một loài thực vật
a. Chuẩn bị kháng sinh hoặc cao chiết thực vật nồng độ 1280 µg/mL
- Cân chính xác 1,28 mg kháng sinh hoặc cao chiết cho vào eppendorf.
- Dùng micropipet lấy 1 mL DMSO 1% cho vào eppendorf.
- Vortex cho mẫu hịa tan hồn tồn được kháng sinh gốc , nồng độ 1280 µg/mL.
Giải thích: Dùng DMSO 10% để dễ hòa tan thuốc kháng sinh trong dung dịch hơn, nhưng do
DMSO có tính kháng khuẩn nên nếu dùng nồng độ quá cao (trên 10%) sẽ làm cho kết quả thí
nghiệm bị sai lệch . Do đó nồng độ DMSO được tăng lên đến 10% để dễ hòa tan thuốc và cao
chiết nhưng vẫn không làm ảnh hưởng đến kết quả về mức độ kháng sinh của thuốc và cao chiết.
b. Chuẩn bị cao chiết hoặc kháng sinh thử nghiệm
7

- Đánh số các ống nghiệm từ 1 đến 5 tương ứng với các nồng độ 8(µg/mL), 16(µg/mL),
32(µg/mL), 64(µg/mL), 128(µg/mL).
- Dùng micropipet hoặc pipet lấy 4,5 mL DMSO 1% cho vào ống nghiệm 5 và 2,5 mL và các
ống nghiệm 1,2,3,4.
-Lấy 0,5 mL kháng sinh gốc cho vào ống nghiệm 5 , sau đó vortex để trộn mẫu.
- Tiếp tục lấy 2,5 mL dung dịch từ ống nghiệm 5 chuyển sang ống nghiệm 4, vortex trộn mẫu
được nồng độ 128 (µg/mL).
- Lấy 2,5 mL dung dịch trong ống nghiệm 4 chuyển sang ống nghiệm 3 vortex trộn mẫu được
nồng độ 64(µg/mL).
- Tiến hành tương tự đối với các ống nghiệm còn lại.
2.Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm
- Vi khuẩn được nuôi và nhân mật số trong môi trường LB lỏng (được lắc trên máy lắc ngang
trong 24 giờ).
- Dịch vi khuẩn được pha lỗng 106 với nước cất (vơ trùng) hoặc dung dịch NaCl 0,9% (vơ
trùng).
3. Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị 5 đĩa môi trường LB đặc và ghi số thứ tự từ 1 – 5 (tương ứng 5 nồng độ kháng sinh
hoặc cao chiết)
-100 µl dung dịch khuẩn được nhỏ trên bề mặt môi trường , để khoảng 5 – 10 phút cho bề mặt
môi trường khô.
- Dùng cây đục lỗ có đường kính 7mm, đã được khử trùng ấn mạnh lên bề mặt môi trường đã
trãi vi khuẩn E. coli. Mỗi đĩa petri đụt 3 lỗ.
- Mỗi lỗ cho 50 µl kháng sinh ở từng nồng độ khảo sát vào.
- Sau đó chờ cho kháng sinh hoặc chất thử nghiệm (cao chiết) khuếch tán hoàn toàn trong agar,
đậy nắp đĩa petri ghi nhận ngày, tháng, năm thực hiện thí nghiệm và nồng độ kháng sinh đã thực
hiện.
- Các đĩa petri đã thực hiện được đặt trong tủ ủ ở 32oC trong 24 giờ. Quan sát và ghi nhận kết
quả thí nghiệm bằng cách là đo đường kính vùng ức chế ( dùng thước đo với đơn vị mm) bao

gồm đường kính khoanh giấy và vùng vi khuẩn không phát triển (trong). Để quan sát rõ cần đặt
đĩa petri trên nền đen. Ranh giới vùng ức chế được xác định là vùng khơng có khuẩn lạc phát
triển.
- Đọc kết quả lần lượt từ đĩa petri có nồng độ kháng sinh thấp nhất. Nồng độ MIC được xác
định ở đĩa mơi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn
chỉ còn 1-3 khuẩn lạc mọc. Ở nồng độ thấp nhất, khơng có vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi
nhận là: nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó. Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi
khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó.

8


III. BÁO CÁO KẾT QUẢ
1. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn E.coli của kháng sinh Tetracycline các nồng độ 8
((µg/mL) , 16(µg/mL), 32(µg/mL), 64(µg/mL) và 128(µg/mL).

Hình 3.1 Hoạt tính kháng vi khuẩn của kháng sinh Tetracycline ở các nồng độ
2. Thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn E.coli của cao chiết ở các nồng độ 8
((µg/mL) ,16(µg/mL), 32(µg/mL), 64(µg/mL) và 128(µg/mL).

Hình 3.2 Thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn của cao chiết
9


- Bảng biểu diễn đường kính trung bình vịng kháng khuẩn theo từng nồng độ của
kháng sinh Tetracycline và cao chiết
Đường kính trung bình vịng
Đường kính trung bình vịng
Nồng độ (µg/mL)
kháng khuẩn trong đĩa petri

kháng khuẩn trong đĩa petri
chứa cao chiết (mm)
chứa kháng sinh (mm)
8
19
20
16
20
23
32
22
24
64
23
26
128
26
28
- Dựa vào bảng số liệu trên ta vẽ được đồ thị như sau :

Hình 3.3 Đường biểu diễn đường kính trung bình vịng kháng khuẩn theo dãy nồng độ
- Từ đồ thị biểu diễn đường kính vịng kháng khuẩn ta có nhận xét:
- Từ biểu đồ trên ta nhận thấy hoạt tính kháng khuẩn E.coli tăng dần theo dãy nồng độ từ thấp
đến cao (từ 8 µg/mL – 128 µg/mL).
- Đối với kháng sinh và cao chiết có nồng độ tăng dần thì đường kính vịng kháng khuẩn tăng
dần, cịn đối với DMSO 10% khơng xuất hiện vòng kháng khuẩn.
- Khả năng kháng khuẩn của kháng sinh Tetracycline thì ln cao hơn cao chiết ở nồng độ
khảo sát.
- Nồng độ ức chế tối thiểu MIC có khả năng kháng khuẩn của kháng sinh Tetracycline cao
chiết là 8 µg/mL.

10


BÀI 4 - 5. PHƯƠNG PHÁP GIẢI PHẨU CHUỘT NHẮT TRẮNG.
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN CỦA CAO CHIẾT THỰC
VẬT TRÊN CHUỘT TỔN THƯƠNG GAN DO
CARBONTETRACHLORIDE
A. PHƯƠNG PHÁP GIẢI PHẨU CHUỘT NHẮT TRẮNG

I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU
- Quan sát hình dạng ngồi của chuột nhắt trắng.
- Biết cách lấy máu tĩnh mạch đuôi và máu tim của chuột nhắt trắng.
- Biết cách giải phẫu gan/thận của chuột nhắt trắng.
II. THỰC HÀNH
1. Quan sát hình thái bên ngồi của chuột
Giới: Animalia.
Ngành: Vertebrata.
Lớp: Mammalia.
Bộ: Rodentia.
Họ: Muridae.
Bộ: Mus.
Loài: Mus musculus Linnaeus.
Chuột nhắt có cơ thể nhỏ, long trắng được chia thành 4 phần chính: đầu, mình, đi và tứ chi.
Tai rộng, thân được bao phủ bởi long mao màu trắng (trừ phần mõm), tai và đi ít lơng. Chuột
có 4 răng: 2 răng trên và hai rang dưới, nhọn và bén. Mắt chuột màu hồng. Chuột đực và cái có
thể phân biệt khi chuột trưởng thành dựa vào bộ phận sing dục.
2. Phương pháp cân và lấy áu tĩnh mạch đuôi chuột nhắt trắng
- Chuột nhắt trắng được cân bằng cách cho vào ống falcon 15ml (đã trừ trọng lượng của ống
falcon) và cân bằng cách phân tích.

- Máu tĩnh mạch đi được lấy bằng cách dùng lưỡi lam rạch một vết ở đuôi chuột khoảng 0.2
mm, vuốt nhẹ đuôi để lấy máu chảy ra. Giọt máu này có thể cho vào Eppendorf cho các thí
nghiệm khác, hoặc có thể cho lên que thử để đo glucose huyết của chuột. Chuột được cầm máu
bằng cách giữ chặt vị trí cắt bằng bơng gòn tẩm cồn khoảng 1 phút.
3. Phương pháp giải phẫu chuột nhắt trắng
Quá trình giải phẫu chuột gồm các bước sau:
- Bước 1: Gây mê.
Dùng bơng gịn thấm diethyl ether cho vào lọ thủy tin có nắp đậy. Sau đó, cho chuột vào và
đậy nắp lại khoảng 3 phút. Quan sát cho đến khi chuột khơng cịn thở nữa.
- Bước 2: Giải phẫu chuột
Cố định chuột: Đặt chuột nằm ngửa, dùng kim ghim cố định 2 chi trên và 2 chi dưới vào
khay mổ (kim ghim nghiêng về phía ngồi một góc 450.
11


Cắt da: Dùng kéo cắt vị trí * (cách hậu môn khoảng 0,5 cm) 1 lỗ thủng. Tiếp đến cắt về phía
2 chi trên của chuột, tiếp tục cắt về 2 phía chi dưới của chuột. Sau đó, kéo da về 2 phía và dùng
kim ghim cố định vào khay mổ
Cắt cơ: Dùng kẹp nâng cơ bụng lên, cắt một đường dọc cho đến mẫu hình kiếm của xương
ức.
Lưu ý: Khi cắt cơ, mũi kéo hướng chếch lên để tránh đứt các nội quan.
- Bước 3: Mở lộ tim và lấy máu tim
Dùng kéo cắt bỏ phần xương sườn mở lộ tim và tiến hành lấy máu tim.
Dùng kim tiêm (đã bơm bỏ khí trong ống) đâm nhẹ vào đỉnh tâm thất trái, kéo nhẹ kim tiêm
để máu được đẩy vào ống tiêm và lấy thể tích máu từ khoảng 0,7-1 ml. Sau đó máu được đưa
vào ống đơng lắc đều nhẹ.
- Bước 4: Giải phẫu lấy gan và thận
Tách gan: Gan là nội tạng lớn nhất trong cơ thể nằm sát khoang ngực, gan có 4 thùy. Cắt rời
gan khỏi cơ thể ở tĩnh mạch cửa và động mạch gan.
Tách thận: Thận màu nâu đỏ hình hạt đậu nằm sát cột sống, ở xoang bụng. Tuyến thượng

thận tròn màu trắng nằm trên thận. Thận được cắt rời khỏi cơ thể ở vị trí động mạch thận, tĩnh
mạch thận và cắt ngang niệu quản để thận rời bang quang. Sau khi cắt cơ thể, gan và thận được
làm sạch bằng dung dịch muối sinh lý và trữ tạm thời và khay chứa nước đá.
II. BÁO CÁO KẾT QUẢ
1. Kết quả mẫu giải phẫu

Hình 4.2. Gan và thận

Hình 4.1. Chuột giải phẫu
12


2. Kết quả mẫu gan chuột

Nghiệm thức 1

Nghiệm thức 3

Nghiệm thức 2

Nghiệm thức 5

Nghiệm thức 4

Hình 4.3. Các mẫu gan chuột

B. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN CỦA CAO CHIẾT THỰC VẬT TRÊN

CHUỘT TỔN THƯƠNG GAN DO CARBOTETRACHLORIDE

I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
- Nắm được các nguyên tắc và thao tác cơ bản của thử nghiệm in vivo trên chuột.
- Hiểu được cơ chế gây tổn thương gan bằng carbon tetrachloride (CCl4) và sự tổn thương gan
chuột khi nhiễm độc CCl4.
II. THỰC HÀNH
1. Chuẩn bị thí nghiệm
- Chia ngẫu nhiên 15 con chuột vào 5 chuồng và đánh dấu thứ tự các chuồng.
- Dùng viết đánh dấu chuột trong mỗi chuồng bằng cách vạch vào đuôi chuột 1,2,3 vạch. Cân
và ghi nhận trọng lượng từng con chuột.

13


- Nồng độ CCl4 được cho uống là 0,2 ml pha trong dầu olive với tỷ lệ 1:4 (Pha trong dầu olive
vì CCl4 dễ bay hơi và dầu olive như tá dược để chuột dễ hấp thụ).
- Nồng độ cao chiết được cho uống là 200 mg/kg trọng lượng chuột.
- Nồng độ Silymarin được cho uống là 100mg/kg trọng lượng chuột.
Lập bảng về trọng lượng chuột và liều lượng thuốc/hóa chất cho bước thí nghiệm tiếp theo
như bảng sau:
Bảng 5.1: Trọng lượng chuột và liều lượng thuốc/hóa chất cho thí nghiệm.
Trọng
Trọng
Ký lượng chuột lượng chuột
Ký hiệu
hiệu
trước khi
sau khi
chuồng
chuột
uống hóa

uống hóa
chất (g)
chất (g)
1
25.63
2
34.64
Chuồng
1
3
31.55
4
36.80
1
35.14
35.90
2
31.70
34.46
Chuồng
2
3
36.20
42.14
4
35.34
42.40
1
31.52
32.12

2
27.50
28.64
Chuồng
3
3
30.00
4
33.83
1
22.03
2
31.72
32.62
Chuồng
4
3
35.16
4
31.00
31.12
1
32.28
2
30.16
Chuồng
5
3
30.46
31.76

4
30.03

Trọng
lượng gan
chuột sau
khi uống
hóa chất (g)
1.58
1.92
2.14
2.58
2.42
3.11
2.23
2.8
2.48
2.51

2.52

1.92

Cân nặng chuột x 100

(mg)

1000

- Lượng Cao chiết cho chuột chuồng 5 uống:

14

Khối lượng cao
chiết/ Silymarin
(mg)

0

0

0.2

0.2

2.52

- Lượng Silymarin cho chuột chuồng 4 uống:
Lượng Silymarin =

Thể tích
CCl4
(ml)

0.2

2.20 mg Silymarin
3.17 mg Silymarin
3.52 mg Silymarin
3.10 mg Silymarin
6.46 mg Cao chiết

6.03 mg Cao chiết
6.09 mg Cao chiết
6.01 mg Cao chiết


Lượng Cao chiết =

Cân nặng chuột x 200

(mg)

1000

2. Bố trí thí nghiệm
Dựa vào bảng trên bố trí thí nghiệm như sau:
- Nghiệm thức 1: Chuột bình thường cho uống 0,2 ml nước cất.
- Nghiệm thức 2: Chuột bình thường cho uống 0,2 ml dầu olive, sau 1 giờ uống thêm 0,2 ml
DMSO 1%.
- Nghiệm thức 3: Chuột bình thường cho uống 0,2 ml CCl4 pha trong dầu olive, sau 1 giờ
uống thêm 0,2 ml DMSO 1%.
- Nghiệm thức 4: Chuột bình thường cho uống 0,2 ml CCl4 pha trong dầu olive, sau 1 giờ
uống thêm 0,2 ml Silymarin (nồng độ 100mg/kg trọng lượng chuột) pha trong DMSO 1%.
- Nghiệm thức 5: Chuột bình thường cho uống 0,2 ml CCl4 pha trong dầu olive, sau 1 giờ
uống thêm 0,2 ml cao chiết thực vật (nồng độ 200mg/kg trọng lượng chuột) pha trong DMSO
1%. Chuột được thực hiện gây tổn thương gan và điều trị trong 10 ngày, mỗi ngày thí nghiệm
được thực hiện vào 7 hoặc 8 giờ sáng.
3. Giải phẫu chuột
- Sau 10 ngày kết thúc thí nghiệm, chuột được giải phẫu lấy gan (phương pháp giống bài 4).
- Tách toàn bộ gan khỏi cơ thể chuột, quan sát, ghi nhận và chụp hình cấu trúc bên ngồi gan.
- Cân và ghi nhận trọng lượng gan chuột ở các nghiệm thức

- Cắt lấy 250 mg gan chuột rửa sạch bằng nước muối sinh lý, sau đó trữ trong ống eppendorf
ở nhiệt độ -200C cho thí nghiệm bài 6.
II. BÁO CÁO KẾT QUẢ
1. Giải thích cơ chế gây độc của CCl4
- CCl4 được sử dụng phổ biến làm tác nhân gây tổn thương gan do chất này tạo ra gốc tự do
gây ra hiện tượng peroxyl hóa màng tế bào gan trong thời gian ngắn. Ngồi ra, chất này cịn làm
suy kiệt hệ thống chống oxi hóa của cơ thể do làm giảm các gốc thiol.
- Sau khi vào cơ thể, CCl4 bị chuyển hóa một phần bởi các cytochrome P - 450 tạo thành
N-acetyl para-benzoquiononimin gây peroxyl hóa lipid và sinh ra malonyl dialdehyde dẫn đến
tổn thương các tế bào gan. Kết quả sẽ làm tăng hàm lượng các enzyme (men gan) như aspartate
transaminase (AST), alanine transaminase (ALT) và làm biến đổi cấu trúc gan.
- Khi hấp thụ vào cơ thể, CCl4 sẽ sinh ra các gốc tự do Trichloromethyl CCl3 thông qua hệ
thống enzyme cytochrome P - 450. CCl3 được đánh giá là tác nhân chính gây ra ngộ đọc trên cơ
thể.
- Trong hơ hấp kị khí, CCl3 sẽ tạo ra hàng loạt các sản phẩm là các chất độc bao gồm
hexachloroethane (Cl3CCCl3), carbon monoxide (CO), đặc biệt là CHCl3 gây tổn thương gan,
viêm gan.
-Trong q trình hơ hấp hiếu khí có mặt O2, CCl3 sẽ chuyển hóa thành trichloromethanol
(Cl3COH) hay tiền thân của phosgene (COCl2), sau đó bị thủy phân tạo thành CO2, từ đó gây rối
15


loạn chức năng ty thể. Sự trương lên của tế bào gan và cảm ứng các gen liên quan đến stress
hoặc các gen bảo vệ gây độc cho gan.
2. Ghi nhận màu, mô tả mức độ tổn thương gan đại thể gan chuột giữa các nhóm chuột thí
nghiệm
- Nghiệm thức 1: Chuột cho uống 0,2 ml nước cất (đối chứng sinh lý).
* Nhận xét: Gan có màu đỏ tươi, bề mặt gan láng mịn. Gan khơng có
dấu hiệu tổn thương.

Nghiệm thức 1
- Nghiệm thức 2: Chuột cho uống 0,2 ml dầu olive + 0,2 ml DMSO
1%.
* Nhận xét: Gan vẫn màu đỏ, nhưng xuất hiện ít vết sần trên bề mặt
do DMSO làm tổn thương thần kinh, gây stress oxy hóa làm gan tổn
thương nhẹ, sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị của Silymarin và cao
chiết.
Nghiệm thức 2
- Nghiệm thức 3: Chuột bình thường cho uống 0,2 ml CCl4 pha trong
dầu olive + 0,2 ml DMSO 1% (đối chứng bệnh lý).
* Nhận xét: Gan bị tổn thương nặng do chuột uống CCl4 nhiều ngày
liên tục, khơng cịn màu đỏ tươi, màu tái nhạt, bề mặt xuất hiện nhiều
vết sần.
Nghiệm thức 3
- Nghiệm thức 4: Chuột cho uống 0,2 ml CCl4 pha trong dầu olive + 0,2
ml Silymarin pha trong DMSO 1% (đối chứng dương).
* Nhận xét: Gan màu đỏ tái, bề mặt phẳng hơn và ít vết sần hơn nghiệm
thức 3 do chuột uống CCl4 dẫn đến tổn thương gan sau đó uống
Silymarin thì mức độ tổn thương gan sẽ giảm xuống vì Silymarin đã
được chứng minh là thuốc có tác dụng tốt để điều trị viêm gan, vàng gan,
xơ gan và chống lại các tổn thương gây hại đến gan.
16

Nghiệm thức 4


- Nghiệm thức 5: Chuột cho uống 0,2 ml CCl4 pha trong dầu olive 0,2
ml + cao chiết thực vật pha trong DMSO 1% (thử nghiệm bảo vệ gan
của cao chiết).
* Nhận xét: Gan có màu đỏ nhạt, ít vết sần và vét bầm trên bề mặt hơn

nghiệm thức 3, chuột uống CCl4 dẫn đến tổn thương gan sau đó uống
thêm cao chiết thì mức độ tổn thương gan sẽ giảm xuống chứng tỏ cao
chiết có hoạt tính bảo vệ gan.

Nghiệm thức 5

3. Vẽ biểu đồ trọng lượng gan
Khối lượng tương đối của gan chuột được tính theo cơng thức:
Khối lượng tương đối của gan chuột =

Khối lượng gan chuột
Khối lượng chuột

x 100

(%)

Bảng 5.2. Khối lượng tương đối của gan chuột với 5 nghiệm thức
Số thứ tự
Nghiệm thức 1
Nghiệm thức 2
Nghiệm thức 3
Nghiệm thức 4
Nghiệm thức 5

Khối lượng trung
bình của chuột (g)
32.16
34.60
29.51

31.87
30.46

Khối lượng trung bình
của gan chuột (g)
2.06
2.64
2.50
2.52
1.92

- Dựa vào bảng số liệu ta vẽ được biểu đồ:

17

Khối lượng tương đối
của gan chuột (%)
6.41
7.63
8.47
7.91
6.30


BÀI 6. KHẢO SÁT SỰ PEROXYDE HÓA LIPID Ở CHUỘT THƯỜNG
GAN DO CARBONTETRACHLORIDE
I. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU
- Nắm được các nguyên tắc và thao tác cơ bản của thử nghiệm in vivo lên chuột.
- Hiểu được cơ chế của sự peroxyde hóa lipid trên gan chuột bị tổn thương bởi CCl4 bằng
phương pháp xác định chất chỉ thị malondialdehyde (MDA).

II. THỰC HÀNH
1. Nguyên tắc
- Malonyl dialdehyde (MDA) được sinh ra trong q trình peroxyde hóa lipid nên được sử
dụng như market sinh học trong các thử nghiệm đánh giá sự peroxyde hóa lipid in vivo. Khi cho
MDA phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid
thiobarbituric (TBA) tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước song 532nm. Phương trình
phản ứng như sau:

2. Thực hành
- 100 mg gan chuột ( đã được chuẩn bị ở Bài 5 ).
- Dùng chày cối thủy tinh nghiền gan trong 400 µL dung dịch KCL 0,9% đã được làm lạnh
trước, thao tác nghiền được thực hiện trong bình đá lạnh.
- Thêm vào 200 µL dung dịch đệm phosphate và ủ ở 37oC trong 30 phút.
- Thêm vào 200 µL acid trichloroacetic 10%.
- Ly tâm hỗn hợp 13000 vịng/phút trong 10 phút.
- Hút lấy 400 µL phần dịch nổi ở trên cho vào mỗi ống Eppendorf sạch đã đánh số trước.
- Thêm vào hỗn hợp phản ứng 200 µL acid thiobarbituric 0,8%.
- Sấy ở 100oC và để nguội 30 phút.
- Phức tạo ra giữa MDA và TBA được phát hiện bằng cách đo mật độ quang bước song
532nm.
18


III. BÁO CÁO KẾT QUẢ
1. Biểu đồ dạng cột biểu diễn hiệu quả sự kháng peroxyde hóa lipid giữa các nhóm chuột
theo giá trị OD đo được.

Hình 6.1. Đo giá trị OD của các nghiệm thức
(Kết quả đo OD của nhóm lấy từ B5 đến F5 lần lượt tương ứng với 5 nghiệm thức)

Nghiệm thức
Giá trị OD

Bảng 6.1. Giá trị OD ở bước sóng 532nm
1
2
3
4
0.246
0.292
0.283
0.196

- Dựa vào bảng số liệu ta vẽ được biểu đồ:

19

5
0.428


2. Giải thích kết quả thí nghiệm về khả năng kháng oxy hóa của các nhóm chuột bị tổn
thương gan được và không được điều trị.
- Khi cho malonyl dialdehyde (MDA) phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo phức màu
hồng. Màu hồng càng đậm, lượng MDA càng nhiều  giá trị OD đo được càng lớn. Dựa vào
biểu đồ biểu diễn sự kháng peroxyde hóa lipid giữa các nhóm chuột theo giá trị OD, ta thấy:
- Nghiệm thức 1 (đối chứng sinh lý): giá trị OD đo được là 0.246.
Kết luận: chuột chỉ uống nước cất nên tế bào gan bình thường.
- Nghiệm thức 2 (đối chứng bệnh lý): giá trị OD đo được là 0.292.
Kết luận: DMSO làm tổn thương thần kinh, gây stress oxy hóa làm gan tổn thương nhẹ.

- Nghiệm thức 3: giá trị OD đo được là 0.283.
Kết luận: CCl4 gây tổn thương gan nghiêm trọng.
- Nghiệm thức 4 (đối chứng dương): giá trị OD đo được là 0.196.
Kết luận: Silymarin có tác dụng bảo vệ và chống lại tổn thương gan bởi CCl4. Do đó, sự
peroxyde hóa lipid giảm  lượng MDA sinh ra thấp.
- Nghiệm thức 5 (thử nghiệm bảo vệ gan của cao chiết): giá trị OD đo được là 0.428.
* Kết luận: Chưa thấy được hiệu quả của cao chiết, kết quả giá trị OD đo được chưa đúng với
lý thuyết. Có thể do một số nguyên nhân sau:
- Khối lượng chuột chưa đồng đều, thể trạng, cơ địa của mỗi chuột khác nhau nên khi sửdụng
cùng một liều dùng có thể gây ra các kết quả khơng giống nhau.
- Q trình pha cao chiết và cho uống thuốc có thể cịn có sai số, chưa được chính xác.

20