Nghiên ứu hế tạo bộ xét nghiệm sắ ký miễn dịh sử dụng hạt nano vàng để phát hiện nhanh vi khuẩn esherihia oli gây bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

ĐÀO THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU TẠO BỘ XÉT NGHIỆM SẮC KÝ MIỄN DỊCH SỬ
DỤNG HẠT NANO VÀNG ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH
VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – Năm 2018

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057205015851000000


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

ĐÀO THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU TẠO BỘ XÉT NGHIỆM SẮC KÝ MIỄN DỊCH SỬ
DỤNG HẠT NANO VÀNG ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH
VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. PGS. TS. TRƢƠNG QUỐC PHONG
2. TS. TRẦN QUANG HUY

Hà Nội – Năm 2018


Luận văn thạc sĩ khoa học

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn là nghiên cứu của tôi dƣới sự chỉ đạo khoa
học của các Thầy hƣớng dẫn và sự hỗ trợ của Phịng thí nghiệm kỹ thuật Protein Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Bách khoa
Hà Nội và Phịng thí nghiệm Siêu cấu trúc - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng. Các
kết quả trong luận văn hoàn toàn trung thực, số liệu và tính tốn chƣa đƣợc cơng bố
trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu trƣớc đây.
Mọi dữ liệu, hình ảnh và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều đƣợc thu
thập và sử dụng nguồn dữ liệu tin cậy và đƣợc trích dẫn rõ nguồn gốc
Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan trên.
Hà Nội, ngày 28 tháng 8 năm 2018
Học viên

Đào Thị Thanh Huyền

1


Luận văn thạc sĩ khoa học

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS Trƣơng Quốc Phong
và TS. Trần Quang Huy – những ngƣời thầy đã ln tận tình giúp đỡ, định hƣớng,
góp ý cho tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi xin trân trọng
cảm ơn Ths. Nguyễn Thanh Thủy và các đồng nghiệp khác đã hết lòng chia sẻ kiến
thức, kinh nghiệm quý báu để tôi thực hiện và hồn thiện luận văn.
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn học
viên, sinh viên công tác tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
và Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội và Phòng thí nghiệm
siêu cấu trúc - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng đã góp những ý kiến q báu cho
tơi, giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện luận văn.
Và tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn đồng
hành, động viên tôi về mọi mặt để tơi hồn thành luận văn.
Với điều kiện, khả năng và thời gian thực hiện có giới hạn nên đề tài khơng
thể tránh những thiếu sót. Tơi mong muốn nhận đƣợc sự góp ý của các thầy cơ và
các bạn để đề tài đƣợc hoàn thiện hơn.
Hà Nội, ngày 28 tháng 8 năm 2018
Học viên

Đào Thị Thanh Huyền

2


Luận văn thạc sĩ khoa học

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... 1
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. 2
DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................... 6

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... 7
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 8
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ..................................................................................... 11
1.1. TÌNH HÌNH CHUNG ........................................................................................ 11
1.1.1. Tình hình nhiễm Escherichia coli trên Thế giới. ........................................... 11
1.1.2. Tình hình nhiễm E. coli ở Việt Nam ............................................................... 11
1.2. ESCHERICHIA COLI ........................................................................................ 12
1.2.1. Đặc điểm chung .............................................................................................. 12
1.2.2. Hình thể và tính chất bắt màu .........................................................................13
1.2.3. Đặc điểm sinh hóa học ....................................................................................13
1.2.4. Cấu trúc kháng nguyên....................................................................................14
1.2.5. Phân loại E.coli . .............................................................................................15
1.2.6. Cơ chế sinh bệnh và bệnh cảnh lâm sàng. ......................................................16
1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán E. coli. ..................................................................18
1.3.1. Phƣơng pháp định danh kinh điển...................................................................18
1.3.2. Phƣơng pháp thử nghiệm tạo váng và gây ngƣng kết hồng cầu. .................... 18
1.3.3. Phƣơng pháp thử nghiệm trên động vật thực nghiệm. ....................................18
1.3.4. Phƣơng pháp miễn dịch gắn men. ...................................................................19
1.3.5. Kỹ thuật sinh học phân tử. .............................................................................19
1.3.6. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch. ..............................................................................20
CHƢƠNG II. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................................25
2.1. Vật liệu ...............................................................................................................25
2.1.1. Hóa chất và kháng thể. ....................................................................................25
2.1.2. Thiết bị ............................................................................................................26
2.2.3. Nguyên lý que thử sắc kĩ miễn dịch ...............................................................27

3


Luận văn thạc sĩ khoa học

2.2.

Quy trình thực nghiệm ....................................................................................29

2.2.1. Xác định hình thái, kích thƣớc hạt nano vàng ................................................29
2.2.2. Quy trình xác lập điều kiện tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng ............29
2.3.

Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp kháng thể - nano vàng ..........31

2.3.1. Xác định hàm lƣợng kháng thể ......................................................................31
2.3.2. Xác định độ pH thích hợp ..............................................................................31
2.3.3. Xác định nhiệt độ cộng hợp ...........................................................................32
2.3.4. Xác định thời gian cộng hợp ..........................................................................32
2.3.5. Xác định điều kiện cố định cộng hợp lên miếng cộng hợp ............................32
2.3.6. Xác định thời gian sấy miếng cộng hợp .........................................................33
2.4.

Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai ...................................................33

2.4.1. Xác định nồng độ kháng thể cố định phù hợp................................................33
2.4.2. Xác định nhiệt độ cố định phù hợp ................................................................34
2.4.3. Lựa chọn đệm cố định kháng thể ...................................................................34
2.5.

Tạo que thử và đánh giá đặc tính que thử .......................................................34

2.5.1. Lựa chọn vật liệu miếng thấm mẫu ................................................................34
2.5.2. Kiểm tra hoạt động của que thử. ....................................................................35
2.5.3. Xác định hệ đệm mẫu phù hợp.......................................................................36

2.5.4. Khảo sát đặc tính que thử ...............................................................................36
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................41
3.1. Điều chế hạt nano vàng ......................................................................................41
3.2. Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp kháng thể - nano vàng .............41
3.2.1. Xác định nồng độ kháng thể phù hợp ............................................................41
3.2.2. Xác định PH phù hợp tạo cộng hợp ................................................................43
3.2.3. Xác định nhiệt độ tạo cộng hợp ......................................................................44
3.2.4. Xác định thời gian tạo cộng hợp .....................................................................45
3.2.5. Xác định thời gian sấy tấm cộng hợp ..............................................................45
3.3.

Nghiên cứu điều kiện cố định kháng thể lên màng lai ....................................46

3.3.1. Xác định hàm lƣợng kháng thể cố định phù hợp: ..........................................46

4


Luận văn thạc sĩ khoa học
3.3.2. Xác định nhiệt độ cố định phù hợp ................................................................47
3.3.3. Xác định đệm cố định kháng thể lên màng nitrocellulose .............................47
3.4.

Tạo que thử và đánh giá đặc tính que thử .......................................................48

3.4.1. Kiểm tra hoạt động que thử ............................................................................48
3.4.2. Xác định hệ đệm mẫu phù hợp.......................................................................49
3.4.3. Khảo sát độ lặp lại ..........................................................................................50
3.4.4. Khảo sát ngƣỡng phát hiện .............................................................................51
3.4.5. Khảo sát phản ứng chéo .................................................................................51

3.4.6. Khảo sát thời gian bảo quản que thử ..............................................................52
3.4.7. Khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu .......................................................................53
CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..........................................................55
4.1. Kết luận ..............................................................................................................55
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 56
PHỤ LỤC ..................................................................................................................63

5


Luận văn thạc sĩ khoa học

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình ảnh E.coli quan sát bằng kính hiển vi điện tử .................................13
Hình 2.2. . Các chỉ thị đƣợc sử dụng trong kỹ thuật sắc kí miễn dịch ..................... 24
Hình 2.1. Mơ hình que thử nhanh theo ngun lý kẹp sandwich ............................ 27
Hình 2.2 .quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng .............................................. 29
Hình 2.2. Hình ảnh E.Coli đƣợc xác định dƣới kính hiển vi điện tử ....................... 36
Hình 2.3. Hình ảnh mẫu ngƣng kết với kháng thể kháng E.coli ..............................37
Hình 2.4. Hình ảnh định lƣợng vi khuẩn E.coli trong mẫu gốc ...............................37
Hình 3.1. Hình thái, kích thƣớc hạt nano vàng dƣới kính hiển vi điện tử truyền qua ............ 41
Hình 3.2. Xác định hàm lƣợng kháng thể gắn với hạt nano vàng ............................43
Hình 3.3. Xác định ph để tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng .....................44
Hình 3.4. Tối ƣu nhiệt độ tạo cộng hợp (4c, 25c và 37c) ...................................44
Hình 3.5. Tối ƣu thời gian tạo cộng hợp (30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút) .......... 45
Hình 3.6. Tối ƣu thời gian sấy tấm cộng hợp ..........................................................46
Hình 3.7. Xác định hàm lƣợng kháng thể cố định ...................................................46
Hình 3.8. Xác định nhiệt độ cố định kháng thể lên màng lai ................................... 47
Hình 3.9. Kết quả thử nghiệm các loại đệm khác nhau cố định kháng thể lên màng ........ 48

Hình 3.10. Kiểm tra hoạt động của que thử với điều kiện thiết lập ban đầu ...........48
Hình 3.11. Kết quả thử nghiệm các dung dịch ly giải mẫu khác nhau ....................49
Hình 3.12. Kết quả xét nghiệm với 10 mẫu âm tính (n=10) ...................................50
Hình 3.13 . Kết quả xét nghiệm với 10 mẫu dƣơng tính (n=10) .............................. 50
Hình 3.14. Ngƣỡng phát hiện ...................................................................................51
Hình 3.15. Kiểm tra phản ứng chéo của que thử .....................................................52
Hình 3.16. Kiểm tra thời gian bảo quản que thử ...................................................... 53

6


Luận văn thạc sĩ khoa học

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
E. coli

Escherichia coli

AuNPs

Gold nanoparticle (hạt nano vàng)

BSA

Bovine Serum Albumin

cDNA

Complementary DNA

CRS

Congenital Rubella Syndrome

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

FP

Fusion Peptide

Ig

Immunoglobulin

mRNA

Messenger RNA

NSP

Non-Structural Protein

PAGE

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Pr A

Protein A

PBS

Phosphate Buffered Saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic Acid

WHO

World Health Organization

TCMR

Tiêm chủng mở rộng

EDC

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide

NHS

N-hydroxysuccinimide

PEG

Polyethylene glycol

7


Luận văn thạc sĩ khoa học

LỜI MỞ ĐẦU
Vi khuẩn tồn tại khắp nơi và giữ vai trò quan trọng trong mọi hệ sinh thái.
Đa số các lồi vi khuẩn có lợi, nhƣng cũng có một số loại gây nên những bệnh
nghiêm trọng [1]. Nhiễm bệnh do vi khuẩn không chỉ ảnh hƣởng rất lớn tới sức
khỏe ngƣời dân mà còn gây thiệt hại nặng nề đến kinh tế xã hội. Vi khuẩn gây bệnh
có thể tồn tại lâu dài trong mơi trƣờng và có thể gây bệnh khi có sự tiếp xúc trực
tiếp hay gián tiếp với con ngƣời hay động vật. Ngƣời hay động vật có thể bị nhiễm
bệnh từ mơi trƣờng nƣớc, khơng khí, thực phẩm, dụng cụ cá nhân hay bị cơn trùng
đốt [1]. Khơng khí là môi trƣờng truyền bệnh của hơn 20 loại vi khuẩn gây viêm
não, viêm đƣờng hô hấp, lao hoặc tiêu chảy [2]. Nƣớc cũng là môi trƣờng truyền
bệnh của rất nhiều mầm bệnh liên quan đến đƣờng tiêu hóa, trong đó có phẩy khuẩn
tả, các loại vi khuẩn nhƣ Campylobacter spp., Escherichia coli (E.coli), Legionella
pneumophila, Salmonella spp… [3]. Một số mầm bệnh cũng có thể lây truyền qua
thực phẩm nhƣ vi khuẩn Campylobacter, E. coli, Salmonella hay Shigella [4]. Hiện
nay, an toàn thực phẩm đang là một trong những thách thức, quan tâm hàng đầu trên
thế giới, đặc biệt là các nƣớc đang phát triển trong đó có Việt Nam. Trong gần
325.000 ca nhập viện hằng năm do thực phẩm ở Mỹ, vi khuẩn đƣợc xác định là
nguyên nhân chính, chiếm tới 60% [5]. Theo thống kê của Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ƣơng, chỉ tính trong 6 tháng đầu năm 2016, tiêu chảy là bệnh truyền nhiễm
có số ngƣời mắc cao nhất khu vực miền Nam với tổng số 55.528 ca mắc bệnh. Bên
cạnh đó, gần 1.500 ca mắc các bệnh khác do vi khuẩn gây nên [6]. Trong đƣờng

tiêu hóa, E. coli cộng sinh với cơ thể góp phần tiêu hóa thức ăn, sản xuất một số
Vitamin và giữ cân bằng sinh thái các vi khuẩn. Nhƣng E. coli cũng là vi khuẩn gây
bệnh cơ hội quan trọng trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đƣờng tiết niệu,
viêm đƣờng mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết [11].
E. coli có thể gây nhiều bệnh khác nhƣ viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết
thƣơng. Việc chẩn đốn gặp khó khăn vì các triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu.
Phần lớn các vi khuẩn E.coli khơng có ảnh hƣởng gì đáng kể đến sức khỏe chỉ một
số có thể gây tiêu chảy và tùy vào địa phƣơng, độ tuổi ngƣời bệnh mà các vi khuẩn

8


Luận văn thạc sĩ khoa học
trên đây có những ảnh hƣởng khác nhau nhƣ gây tiêu chảy ra máu, trƣờng hợp
nghiêm trọng có thể gây nhiễm trùng máu, suy thận …
Vì vậy, việc phát hiện sớm, chính xác tác nhân gây bệnh là yếu tố then chốt
để đƣa phƣơng pháp điều trị kịp thời. Việc phát hiện tác nhân vi khuẩn gây bệnh
chủ yếu vẫn dựa theo phƣơng pháp truyền thống, thƣờng qua bốn bƣớc: (i) làm giàu
sơ bộ; (ii) làm giàu có chọn lọc; (iii) phân lập; (iv) xác định chủng vi khuẩn bằng
các kỹ thuật sinh hóa, huyết thanh hoặc sinh học phân tử [1,7]. Nhƣợc điểm chính
của các kỹ thuật chẩn đoán truyền thống là phải thực hiện nhiều bƣớc và mất thời
gian. Thông thƣờng, với các phƣơng pháp chẩn đoán truyền thống, thời gian nhận
đƣợc kết quả chính xác chủng vi khuẩn nào gây bệnh nào phải mất 8 đến 48 giờ,
giới hạn phát hiện tới 105- 10 6 cfu/mL nếu không làm giàu sơ bộ. Trong khi đó, một
số kỹ thuật chẩn đốn sinh học phân tử có độ nhạy cao, có thể cho kết quả sau vài
giờ. Tuy nhiên, kỹ thuật này phải đƣợc thực hiện ở phịng xét nghiệm an tồn sinh
học bậc 2 trở lên, sinh phẩm cũng nhƣ thiết bị chẩn đốn đắt tiền và khó áp dụng
cho tất cả các cơ sở xét nghiệm [8]. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (ICA immunochromatographic assay) là một trong những kỹ thuật đƣợc phát triển để phát
hiện tác nhân gây bệnh trong mẫu mà không cần đến những thiết bị chuyên dụng,
cho biết kết quả nhanh chỉ sau một bƣớc phân tích [9]. ICA có thiết kế đơn giản, có

độ nhạy và độ đặc hiệu cao, ổn định theo thời gian trong các điều kiện môi trƣờng
khác nhau.
Từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, với mong muốn tạo ra một bộ xét
nghiệm sắc ký miễn dịch có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đề tài này đƣợc đề xuất
cho luận văn thạc sỹ với tiêu đề: “Nghiên cứu tạo bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch
sử dụng hạt nano vàng để phát hiện nhanh vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh”.
Mục tiêu chính của đề tài nhằm tạo ra bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch trên cơ sở hạt
nano vàng để phát hiện nhanh vi khuẩn E.coli gây bệnh.
Nội dung nghiên cứu đề tài:
- Tạo cộng hợp kháng thể kháng vi khuẩn E.coli và hạt nano vàng
- Nghiên cứu điều kiện cố định kháng thể lên màng lai

9


Luận văn thạc sĩ khoa học
- Tạo que thử và đánh giá đặc tính que thử sắc ký miễn dịch sử dụng hạt nano
vàng để phát hiện nhanh vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh

10


Luận văn thạc sĩ khoa học

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.

Tình hình chung

1.1.1. Tình hình nhiễm Escherichia coli trên Thế giới.

Tiêu chảy đƣợc coi là vấn đề y tế toàn cầu, là nguyên nhân hàng đầu gây
bệnh tật và tử vong cho trẻ em các nƣớc đang phát triển. Căn nguyên gây tiêu chảy
thƣờng do các tác nhân vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng Escherichia coli (E. coli) là 1
trong những căn nguyên vi khuẩn thƣờng gặp [46].
Vi khuẩn E. coli chủ yếu sống trong đƣờng tiêu hóa của con ngƣời, chúng là
tác nhân chính gây bệnh tiêu chảy, thơng thƣờng dễ điều trị và không gây nguy
hiểm. Tuy nhiên cũng có những chủng thuộc nhóm Enterohaemorrhagic E. coli
(EHEC) có thể gây tiêu chảy kèm những biến chứng nặng nhƣ tán huyết, suy thận,
ví dụ nhƣ chủng E. coli O157:H7. Vào tháng 05 - 06/2011 ở châu Âu đã xảy ra một
dịch bệnh do chủng E. coli lạ có tên O104:H4 gây ra khiến 54 ngƣời tử vong, chủng
E. coli mới này không những gây tiêu chảy với các biến chứng nặng hơn chủng E.
coli O157:H7 mà cịn có khả năng kháng hầu hết các kháng sinh thƣờng dùng, kể cả
carbapenem [48], khiến cho việc điều trị vơ cùng khó khăn. E. coli đƣơc xác định là
căn nguyên gây tiêu chảy chính ở trẻ em, chiếm 20 – 40% căn nguyên gây tiêu chảy
[21, 22, 23, 24]. Ở châu Á, E.coli cũng là tác nhân quan trọng gây tiêu chảy ở
ngƣời, thƣờng gây ra sự tiêu chảy ở trẻ em mới thôi bú mẹ ở các nƣớc phát triển và
sự tiêu chảy ở những ngƣời đi du lịch.
Bên cạnh đấy, ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật ngày càng gia tăng ở các quốc
gia đang phát triển và phát triển. Ở Nhật Bản năm 1996 có khoảng 800 ngƣời bị nhiễm
bệnh do Enterohaemorrhagic E. coli [51]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, tỷ lệ vi
khuẩn E. coli gây bệnh ngày càng gia tăng ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là các nƣớc
thuộc khu vực châu Á. Tình trạng nhiễm E. coli không chỉ xảy ra ở trong bệnh viện mà
cịn trong cả cộng đồng [49].
1.1.2. Tình hình nhiễm E. coli ở Việt Nam
Ở Việt Nam, ngộ độc thực phẩm là một vấn đề đang đƣợc quan tâm hàng

11


Luận văn thạc sĩ khoa học

đầu, theo ƣớc tính của Bộ Y tế, chỉ riêng năm 2001 đã có 4,2 triệu ngƣời bị ngộ độc
thực phẩm. Từ năm 2001đến năm 2006, cả nƣớc ghi nhận hơn 5.600.000 trƣờng
hợp tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm, trong đó 84 trƣờng hợp tử vong. Theo thống
kê của Cục Y tế dự phòng - Bộ Y tế, 5 tháng đầu năm 2011 có 10 vụ ngộ độc thực
phẩm tại 7 tỉnh với 138 ngƣời mắc, 116 ngƣời phải nhập viện cấp cứu, trong đó
4/10 vụ ngộ độc do vi sinh vật và chủ yếu là E.coli. Các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ
nhiễm E. coli sinh ESBL ở trong một số bệnh viện lên đến 65,8% và các vi khuẩn
này kháng lại các thuốc kháng sinh thơng dụng với tỷ lệ cao. Tình trạng nhiễm E.
coli sinh ESBL ở ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng nơng thơn tỉnh Thái Bình chiếm
tỷ lệ cao (82,3%). Các vi khuẩn này đã kháng lại các kháng sinh thông dụng với tỷ
lệ từ 23,7% đến 100%. Các vi khuẩn không chỉ xuất hiện trong bệnh viện mà nó đã
lan rộng ra cộng đồng và chủng vi khuẩn này có thể là nguồn lan truyền các gen
kháng kháng sinh nguy hiểm trong cộng đồng [50]. Tỷ lệ nhiễm E.coli (tại các chợ
ở 5 tỉnh phía Nam) trong thịt tƣơi sống là 100% đối với cả 3 nhóm thịt gà, heo và
vịt. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong thủy sản tƣơi sống là 63,9%; cụ thể phân loại theo mức
độ nguy cơ ô nhiễm, mức 1 chiếm 17%, mức 2 chiếm 53% và mức 3 chiếm 25,5%.
Đối với mức 3, loại mẫu sò chiếm tỷ lệ cao nhất 58,3%, thấp nhất là hàu và nghêu
(12,5%) [47].
Hiện nay thức ăn đƣờng phố phát triển tràn lan, tự phát, dẫn đến không đảm
bảo vệ sinh an tồn thực phẩm, ln tiềm ẩn nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm. Theo
một nghiên cứu mô tả cắt ngang của Phạm Văn Doanh – Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây
Nguyên và cộng sự, tại 98 cơ sở bán thức ăn đƣờng phố tại thành phố Pleiku – Gia
lai từ tháng 8/2013 đến tháng 6/2014. Kết quả có 24,5% bàn tay ngƣời chế biến bị
nhiễm vi khuẩn E. coli, trong đó 6,1% bàn tay nhiễm vi khuẩn E. coli nhóm gây
bệnh đƣờng ruột enteropathogenic E. coli.
1.2.

Escherichia coli

1.2.1. Đặc điểm chung

E. coli là một loại trực khuẩn gram âm, thƣờng tìm thấy bên trong phần dƣới
của ruột của các động vật máu nóng. Chúng thƣờng khơng gây bệnh, nhƣng một số

12


Luận văn thạc sĩ khoa học
chủng có thể gây nên tiêu chảy và nhiễm trùng sinh mủ (pyogenic infections). Các
chủng gây bệnh đƣợc phân loại bởi cơ chế sinh bệnh đặc biệt (specific pathogenic
mechanisms) [15].
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc:
Lớp: Gammaproteobacteria.
Bộ: Eubacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Escherichiae
Lồi: Escherichia coli
E. coli cịn có tên là Bacteriam coli Commue đƣợc ông Escherich phát hiện
năm 1885 trong trƣờng hợp tiêu chảy ở trẻ em [16].

1.2.2. Hình thể và tính chất bắt màu
E. coli là một vi khuẩn dài nên thƣờng đƣợc gọi là trực khuẩn E. coli. Kích
thƣớc trực khuẩn E. coli khoảng 2-3µm x 0,5µm, bắt màu Gram(-). Một số chủng
có vỏ, hầu hết có lơng, khơng sinh nha bào [17].

Hình 1.1 Hình ảnh E.coli quan sát bằng kính hiển vi điện tử

1.2.3. Đặc điểm sinh hóa học
E. coli lên men nhiều loại đƣờng nhƣ glucose, lactose, manitol, trừ EIEC
lactose (-). E. coli có khả năng sinh indol, khơng sinh H 2S, khơng có men

13


Luận văn thạc sĩ khoa học
urease[17].
- E. coli là loại vi khuẩn hiếu khí hay hiếu kỵ khí tùy tiện. Nhiệt độ thích hợp
để ni cấy là 37 oC, pH 7,4. E. coli có thể mọc ở 40oC và sống đƣợc ở nhiệt độ
5÷40 oC. E. coli phát triển dễ dàng trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, một số
chủng có thể phát triển trên mơi trƣờng tổng hợp rất nghèo chất dinh dƣỡng. Ở
những điều kiện thích hợp E. coli phát triển rất nhanh, thời gian phân chia thành
một thế hệ mới khoảng 20 đến 30 phút. Trong môi trƣờng lỏng (nhƣ canh thang),
sau 3÷4 giờ E. coli đã làm đục nhẹ môi trƣờng, sau 24giờ làm đục đều và dƣới đáy
ống có thể có cặn. Trên mơi trƣờng đặc, sau khoảng 8÷10giờ có thể thấy khuẩn lạc
dƣới kính lúp, sau 24giờ đƣờng kính khuẩn lạc khoảng 1,5mm. Hình thái khuẩn lạc
điển hình là dạng S: trịn, lồi, ƣớt, màu xám, bề mặt sáng bóng, bờ đều; nhƣng cũng
có thể gặp dạng M (nhầy) hoặc dạng R (khô, nhăn nheo).
- Trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng E. coli mọc thành các khuẩn lạc tròn ƣớt
(dạng S), màu trắng đục; để lâu các khuẩn lạc trở nên khô nhăn (dạng R), kích
thƣớc khóm 2÷3mm. Trên thạch máu: có chủng E. coli tan huyết β, có chủng E. coli
tan huyết dạng α. Trên mơi trƣờng chẩn đốn chun biệt nhƣ thạch Endo E. coli
mọc thành các khuẩn lạc tím có ánh kim. Trên môi trƣờng Macconkey, SS các
khuẩn lạc E. coli màu hồng đỏ đƣợc tạo nên do vi khuẩn E.coli có khả năng lên men
lactose. Trên các mơi trƣờng đƣờng: E. coli lên men sinh hơi lactose, glucose,
galactose, lên men không đều saccarose, không lên men dextrin và glycogen.
- E. coli cho phản ứng Indol dƣơng tính, phản ứng Methyl Red (phản ứng
MR) dƣơng tính, Voges-Proskauer (phản ứng VP) âm tính, citrat âm tính, H 2S âm
tính, hồn ngun nitrat thành nitrit, lysine decarboxylase dƣơng tính[18].

1.2.4. Cấu trúc kháng nguyên
Vi khuẩn đƣờng ruột E. coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp. Dựa vào tính

chất kháng nguyên, ngƣời ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyết
thanh (serotype) khác nhau [19]:

14


Luận văn thạc sĩ khoa học
- Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào,
cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau. Đặc tính của
kháng nguyên O là:
 Chịu đƣợc nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2 giờ.
 Kháng cồn, khơng bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.
 Bị hủy bởi formol 5%.
 Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24 giờ.
- Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng
ngƣng kết O. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây
bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chun biệt cho từng lồi vật chủ.
- Kháng ngun lơng H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo
bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các
proteinase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng
thể tƣơng ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng kết H.
- Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): có hơn 100 loại khác nhau và
nằm ngồi kháng ngun O. Kháng nguyên K là polysaccharide hay là
protein. Nếu kháng ngun K che phủ hồn tồn thân vi khuẩn thì sẽ ngăn
cản phản ứng ngƣng kết O. Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen)
giúp E. coli bám vào tế bào biểu mơ trƣớc khi xâm lấn đƣờng tiêu hóa hay
đƣờng tiết niệu.
- Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): có dạng hình sợi, dài khoảng 4
m, thẳng hay xoắn, đƣờng kính 2,1 – 7 nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào
niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn .

Hiện nay có hơn 700 tuýp huyết thanh của E. coli từ sự tổ hợp các nhóm
kháng nguyên O, H, K, F. Dựa vào đó, ngƣời ta có thể định danh vi khuẩn.

1.2.5. Phân loại E.coli .
Có nhiều cách phân loại E. coli. Cách phân loại theo týp huyết thanh đƣợc
dùng nhiều nhất, cách phân loại này dựa trên cấu trúc kháng nguyên O, K và H có
trên bề mặt tế bào vi khuẩn, trên 700 týp huyết thanh khác nhau của E. coli đã đƣợc

15


Luận văn thạc sĩ khoa học
tìm thấy. Cách phân loại thứ hai dựa vào sự ly giải bởi phage đặc hiệu, có khoảng
50 týp phage.
Dựa vào tính chất gây bệnh, E. coli đƣợc chia làm 5 loại [20]:
(1) E. coli sinh độc tố Shiga (STEC- Shiga toxigenic E. coli hay VTECVerotoxigenic E. coli và EHEC Enterohemorrhagic E. coli ).
(2) E. coli gây bệnh đƣờng ruột (EPEC- Enteropathogenic E. coli).
(3) E. coli sinh độc tố đƣờng ruột (ETEC- Enterotoxigenic E. coli).
(4) E. coli bám dính kết tập ở ruột (EAEC hay EaggEC- Enteroaggregative
E. coli).
(5) E. coli tấn công hay xâm lấn đƣờng ruột (EIEC- Enteroinvasive E. coli).

1.2.6. Cơ chế sinh bệnh và bệnh cảnh lâm sàng.
Tất cả mọi ngƣời đều có nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn E. coli vì các nguyên
nhân sau: (i) Uống nƣớc bị ô nhiễm: Ở một số vùng nơng thơn, ngƣời dân vẫn cịn
thói quen sử dụng nƣớc từ giếng khoan hoặc từ sông, suối, ao, hồ trong nấu nƣớng
và sinh hoạt hàng ngày… Đây chính là nguồn lây nhiễm vi khuẩn E.coli cao nhất.
Ngay cả ở các thành phố lớn nếu nguồn nƣớc máy cung cấp khơng đƣợc xử lý tốt
vẫn có thể gây bùng phát một đợt dịch bệnh do nhiễm vi khuẩn E.coli sau khi ngƣời
dân sử dụng nguồn nƣớc bị ô nhiễm; (ii) Ăn uống không đảm bảo vệ sinh: Vi khuẩn

E.coli có thể cịn tồn tại trong các thức ăn chƣa đƣợc nấu chín, sữa khơng tiệt trùng,
nƣớc trái cây hoặc rau củ quả tƣơi. Khi chúng ta ăn những loại thực phẩm này vào
thì rất dễ bị nhiễm bệnh; (iii) Lây truyền từ ngƣời sang ngƣời: Chẳng hạn nhƣ
những ngƣời bị nhiễm bệnh làm việc trong nhà hàng và không rửa tay đúng cách
sau khi đi vệ sinh có thể lây truyền bệnh cho khách hàng và các nhân viên khác; (iv)
Tiếp xúc với động vật nhiễm mầm bệnh: Vi khuẩn E.coli có thể lây lan trong các
trang trại, các vƣờn thú và hội chợ. Đặc biệt khi chúng ta tiếp xúc với thú cƣng
trong nhà bị nhiễm bệnh thì có nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn E.coli rất cao; (v) Sức đề
kháng kém, bị giảm acit dạ dày: Trẻ em, ngƣời cao tuổi, những ngƣời phẫu thuật dạ
dày hoặc đang dùng thuốc giảm axit dạ dày là những đối tƣợng dễ bị nhiễm khuẩn
vì lý do này.

16


Luận văn thạc sĩ khoa học
Triệu chứng nhiễm E. coli thƣờng xuất hiện 3-4 ngày sau khi tiếp xúc với vi
khuẩn. Tuy nhiên, các triệu chứng có thể xuất hiện sớm nhất là 24 giờ hoặc muộn
nhất là 1 tuần sau đó. Chúng ta khơng nên bỏ qua những dấu hiệu sau:
-

Đau bụng hoặc co cứng bụng trầm trọng. Cơn đau thƣờng kéo đến một
cách đột ngột không bào trƣớc

-

Tiêu chảy nƣớc, bắt đầu một vài giờ sau khi cơn đau bắt đầu

-

Đi phân có máu đỏ tƣơi khoảng một ngày sau đó do vi khuẩn sinh ra các
chất độc làm tổn hại niêm mạc đƣờng ruột

-

Buồn nôn và nôn ói

-

Sốt nhẹ,

-

Mệt mỏi , do mất nƣớc và chất điện giải

Những triệu chứng trên thƣờng dễ bị nhầm lẫn với các căn bệnh đƣờng tiêu
hóa khác. Do vậy nếu tự chuẩn đốn bệnh tại nhà thì rất dễ bị nhầm lẫn. Vi khuẩn
E.coli đƣợc biết đến là thủ phạm gây ra nhiều căn bệnh nhƣ:
-

Tiêu chảy cấp: Phần lớn những ngƣời nhiễm vi khuẩn E.coli thƣờng bị
tiêu chảy đầu tiên. Ngƣời bệnh có biểu hiện đi phân nhày nƣớc kèm theo
máu. Tình trạng đau bụng, nơn mửa, sốt cao và mất nƣớc cũng khó tránh
khỏi khi bị tiêu chảy do nhiễm khuẩn E.coli

-

Viêm đại tràng: Loại vi khuẩn này cũng đƣợc liệt kê vào danh sách các
tác nhân gây ra bệnh viêm đại tràng. Chúng có thể khiến ngƣời bệnh bị
rối loạn tiêu hóa, thƣờng là tiêu chảy, đi ngồi ra máu và mất nƣớc

nghiêm trọng nếu không đƣợc phát hiện và điều trị kịp thời.

Các bệnh lý khác: Vi khuẩn E.coli có khả năng di chuyển đến hệ tiết niệu
hay xâm nhập vào trong máu và đƣợc truyền đi khắp cơ thể gây ra hàng loạt các căn
bệnh nhƣ: Nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, viêm thận, viêm phổi, nhiễm trùng máu,
viêm màng não…
Có thể thấy việc nhiễm vi khuẩn E.coli khá nguy hiểm và chúng ta không nên
xem nhẹ cơng tác phịng ngừa loại vi khuẩn này lây lan thành dịch bệnh trong cộng
đồng. Các chuyên gia y tế cho biết cách tốt nhất để phịng bệnh giữ gìn vệ sinh môi

17


Luận văn thạc sĩ khoa học
trƣờng sống sạch sẽ; chỉ nên ăn các thức ăn đã đƣợc nấu chín, uống nƣớc đun sôi để
nguội và tuyệt đối không nên ăn các thức ăn không đảm bảo vệ sinh đƣợc bày bán
ngồi lề đƣờng. Thêm vào đó việc trang bị một số kiến thức cơ bản để biết đƣợc vi
khuẩn E.coli là gì, các nguyên nhân gây nhiễm khuẩn E.coli và triệu chứng gặp phải
khi bị nhiễm bệnh cũng có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phòng ngừa và điều trị
bệnh.

1.3.

Các phƣơng pháp chẩn đốn E. coli.
Có nhiều phƣơng pháp xác định E. coli đã đƣợc sử dụng từ trƣớc đến nay.

Các phƣơng pháp dƣới đây chỉ đƣợc nêu tóm tắt nguyên lý và các ƣu điểm, nhƣợc
điểm của các phƣơng pháp đó.

1.3.1. Phƣơng pháp định danh kinh điển.

Bệnh phẩm phân đƣợc cấy trên môi trƣờng ức chế chọn lọc cho các vi khuẩn
đƣờng ruột nhƣ Endo, Mac- Conkey, DCL, SMAC. Việc xác định E. coli dựa vào
các tính chất sinh vật hóa học.
Sử dụng test Indole dƣơng tính ở 99% chủng E. coli. Đây là test đơn giản
nhất để phân biệt E. coli. Dùng kháng huyết thanh mẫu đặc hiệu với các yếu tố
kháng nguyên O, H, K để định loại E. coli. Tuy nhiên phƣơng pháp này thƣờng chỉ có
giá trị phân biệt E. coli với các thành viên khác trong họ vi khuẩn đƣờng ruột [25]. Do
sự đa dạng về cấu trúc kháng nguyên của E. coli nên độ nhạy và độ đặc hiệu của
phản ứng này bị hạn chế. Phƣơng pháp này cũng tốn kém và mất rất nhiều thời gian
vì có q nhiều týp huyết thanh của E. coli, mặt khác một số chủng vi khuẩn gây
bệnh đƣờng ruột khác có thể phản ứng chéo [25].

1.3.2. Phƣơng pháp thử nghiệm tạo váng và gây ngƣng kết hồng cầu.
Thử nghiệm này thƣờng đƣợc dùng để sàng lọc. Độ nhạy và độ đặc hiệu của
thử nghiệm tạo váng trên mơi trƣờng lỏng trong chẩn đốn EAEC khoảng 90%. Thử
nghiệm này cho kết quả nhanh, đơn giản, dễ thực hiện ở các phòng xét nghiệm vi
sinh bệnh viện [26].

1.3.3. Phƣơng pháp thử nghiệm trên động vật thực nghiệm.
Một số thử nghiệm trên súc vật dựa trên đặc điểm độc lực của ETEC đã đƣợc

18