tóm tắt luận án nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm elisa phát hiện nọc rắn độc và ứng dụng lâm sàng chuẩn đoán rắn độc cắn ở việt nam

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Rắn độc cắn là một trong những tai nạn nguy hiểm thường gặp ở
các nước nhiệt đới, với trên 2,5 triệu người bị rắn độc cắn và khoảng
125.000 người tử vong do rắn độc cắn mỗi năm. Ở nước ta, các
chuyên gia ước tính mỗi năm có khoảng 30.000 người bị rắn cắn.
Thống kê số liệu của gần hai nghìn bệnh nhân rắn độc cắn nhập viện
Chợ Rẫy điều trị cho thấy, một số loài rắn độc thường gây tai nạn rắn
cắn nhất ở khu vực Miền Nam nước ta là rắn lục xanh (43,3%), hổ
đất (23,8%), chàm quạp (19,4%), hổ mèo (10%) và hổ chúa (1,2%).
Ở Việt Nam, đã có 2 loại huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR)
thương phẩm đặc hiệu nọc rắn lục xanh và hổ đất đang được sử dụng
trên lâm sàng. Tuy nhiên, việc chẩn đoán loài rắn độc cắn để sử dụng
HTKNR chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng và chưa có bộ xét
nghiệm phát hiện nọc rắn độc.
Trên thế giới, có nhiều kỹ thuật miễn dịch được ứng dụng trong
phát hiện nọc rắn độc, trong đó kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn
enzyme (ELISA) là kỹ thuật thường được áp dụng để chế tạo bộ xét
nghiệm phát hiện nọc rắn độc.
Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu
chế tạo bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn độc và ứng dụng
lâm sàng chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam” được tiến hành nhằm
mục tiêu:
1. Chế tạo bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc độc của 4 loài
rắn lục xanh, hổ đất, chàm quạp, hổ chúa và phát triển bộ xét
nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc độc của 2 loài rắn lục xanh và
hổ đất ở Việt Nam.
2. Đánh giá hiệu quả phát hiện nọc và định loài rắn độc của bộ xét
nghiệm ELISA trong các bệnh phẩm lâm sàng.
2
Những đóng góp mới của luận án:

- Chế tạo thành công bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc độc
của 4 loài rắn lục xanh, hổ đât, chàm quạp và hổ chúa.
- Lần đầu tiên tại Việt Nam, nghiên cứu đã sử dụng huyết thanh
kháng nọc rắn thương phẩm do Viện vắc xin và Sinh phẩm y tế tại
Nha Trang sản xuất (loại đang được sử dụng điều trị rắn độc cắn trên
lâm sàng), làm nguyên liệu chế tạo thành công bộ xét nghiệm AbE-
ELISA phát hiện nọc độc của 2 loài rắn lục xanh và hổ đất.
- Bộ xét nghiệm AB-ELISA và AbE-ELISA có khả năng phát hiện
được mẫu nọc rắn chuẩn pha trong các dịch sinh học khác nhau như:
máu, huyết tương, nước tiểu và dung dịch đệm ở mức dưới 4 ng/ml,
tùy thuộc vào loại nọc rắn và loại mẫu xét nghiệm. Bộ xét nghiệm
AbE-ELISA có khả năng phát hiện được nọc rắn lục xanh và hổ đất
trong tất cả các loại mẫu xét nghiệm trên lâm sàng bao gồm: máu
toàn phần, nước tiểu và dịch vết cắn.
Bố cục của luận án:
Luận án gồm 112 trang với 19 hình, 3 sơ đồ, 10 biểu đồ và 15
bảng, trong đó: đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan tài liệu (33 trang);
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (22 trang); Kết quả nghiên
cứu (27 trang); Bàn luận (25 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1
trang). Tài liệu tham khảo: 122 tài liệu (tiếng Việt 12, tiếng Anh
110).
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TAI NẠN RẮN CẮN VÀ CHẨN ĐOÁN RẮN ĐỘC CẮN
1.1.1. Một số loài rắn độc thường gặp gây ra tai nạn rắn cắn ở
Việt Nam
Theo Trần Kiên và Nguyễn Quốc Thắng (1995), Việt Nam có hơn
một trăm loài rắn, trong đó có hàng chục loài rắn độc phân bố cả trên
3
cạn và dưới nước. Trong đó, một số loài rắn độc thường gặp gây ra
tai nạn rắn độc cắn ở nước ta đó là:

1.1.1.1. Rắn lục xanh (Trimeresurus albolabris)
1.1.1.2. Rắn hổ đất (Naja naja kaouthia)
1.1.1.3. Rắn chàm quạp (Calloselasma rhodostoma)
1.1.1.4. Rắn hổ mèo (Naja naja siamensis)
1.1.1.5. Rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah)
1.1.2. Một số đặc điểm lâm sàng rắn độc cắn
Các triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm độc do rắn cắn rất
đa dạng, phong phú, bao gồm các triệu chứng tại chỗ và toàn thân.
1.1.3. Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam
Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam chủ yếu vẫn dựa vào triệu
chứng lâm sàng là chính và chưa có bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn
độc nào được nghiên cứu và ứng dụng trên lâm sàng trong chẩn đoán
xác định loài rắn cắn. Vì vậy, chế tạo bộ xét nghiệm phát hiện nọc
rắn độc ứng dụng trong chẩn đoán loài rắn độc cắn ở Việt Nam là
yêu cầu cần thiết.
1.2. KHÁNG THỂ KHÁNG NỌC RẮN VÀ MỘT SỐ KỸ
THUẬT MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN NỌC RẮN ĐỘC
1.2.1. Kháng thể kháng nọc rắn
1.2.1.1. Đặc điểm cấu tạo kháng thể kháng nọc rắn
1.2.1.2. Sản xuất kháng thể kháng nọc rắn
1.2.2. Một số kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn độc
1.2.2.1. Kỹ thuật khuếch tán miễn dịch (Immunodiffusion)
1.2.2.2. Kỹ thuật điện di miễn dịch (Immunoelectrophoresis)
1.2.2.3. Kỹ thuật ngưng kết (Haemagglutination)
1.2.2.4. Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay - RIA)
1.2.2.5. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Immunofluoresence)
4
1.2.2.6. Kỹ thuật miễn dịch quang (optical immunoassay)
1.2.2.7. Xét nghiệm nhanh (rapid test)
1.3. XÉT NGHIỆM ELISA

1.3.1. Lựa chọn xét nghiệm ELISA trong chế tạo bộ xét nghiệm
phát hiện nọc rắn độc
Mặc dù có nhiều kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn độc đã
được nghiên cứu và ứng dụng như phân tích ở mục 1.2.2. Tuy nhiên,
kỹ thuật miễn dịch được sử dụng phổ biến nhất trong chế tạo bộ xét
nghiệm phát hiện nọc rắn độc chính là xét nghiệm ELISA.
1.3.2. Một số thiết kế xét nghiệm ELISA được ứng dụng trong
chế tạo bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn
- Nguyên lý chung của xét nghiệm ELISA: là dùng kháng nguyên
hoặc kháng thể đánh dấu để phát hiện phức hợp kháng nguyên kháng
thể qua chất chỉ thị màu.
- Thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich sử dụng mô hình 2 kháng thể
Thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich avidin-biotin (AB-
ELISA): bao gồm một kháng thể gắn bản, một kháng thể phát hiện
gắn biotin, cộng hợp HRP gắn avidin (horseradish peroxidase -
avidin) và cơ chất phát hiện phức hợp kháng nguyên kháng thể.
- Thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich sử dụng mô hình 3 kháng thể
Thiết kế xét nghiệm AbE-ELISA sandwich sử dụng mô hình 3
kháng thể bao gồm: một kháng thể gắn bản, kháng thể phát hiện là
kháng thể đặc hiệu kháng nguyên nhưng có nguồn gốc sản xuất khác
với kháng thể gắn bản. Cộng hợp HRP-kháng thể kháng lại kháng
thể phát hiện và cơ chất dùng để phát hiện phức hợp kháng nguyên
kháng thể. Đây là thiết kế xét nghiệm trong đó kháng thể phát hiện
không phải xử lý gắn enzyme hay gắn biotin nên sẽ có độ ổn định và
hiệu giá tốt hơn so với kháng thể phát hiện sử dụng trong thiết kế
5
nghiên cứu nói trên. Cộng hợp HRP-kháng thể kháng kháng thể phát
hiện có thể được cung cấp dưới dạng thương phẩm nên có tính đặc
hiệu và độ ổn định cao hơn.
1.3.3. Một số chỉ tiêu đánh giá xét nghiệm ELISA

Trong phát triển xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn, một số chỉ
tiêu đánh giá thường được quan tâm là độ đặc hiệu, độ nhạy, độ ổn
định và thời gian xét nghiệm.
1.3.4. Bộ xét nghiệm ELISA thương phẩm phát hiện nọc rắn độc
Cho đến nay, mới có hai bộ xét nghiệm chẩn đoán rắn độc cắn
được phát triển ở Úc và Ấn Độ. Tuy nhiên, những bộ xét nghiệm này
không phù hợp cho việc phát hiện nọc rắn độc ở Việt Nam.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Nghiên cứu chế tạo huyết thanh thỏ đơn đặc hiệu kháng nọc rắn
Thỏ đực xám khoẻ mạnh, trọng lượng từ 2 – 2,5 kg, số lượng 12
con. Thỏ được chia làm 4 lô, mỗi lô 3 con.
- Nghiên cứu đánh giá hiệu quả phát hiện nọc rắn độc của bộ xét
nghiệm ELISA trên lâm sàng
Mẫu bệnh phẩm xét nghiệm phát hiện nọc rắn gồm: 115 mẫu máu
toàn phần, 119 mẫu nước tiểu và 4 mẫu dịch vết cắn được lấy từ 122
bệnh nhân bị rắn độc cắn điều trị tại khoa Bệnh nhiệt đới, Bệnh viện
Chợ Rẫy Tp. Hồ Chí Minh.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Nọc tổng số của 4 loài rắn độc (lục xanh, hổ đất, chàm quạp và hổ
chúa) ở dạng đông khô, là sản phẩm nghiên cứu thuộc đề tài
6
KCB.04.06.01 đã nghiệm thu năm 2009. Các hóa chất, sinh phẩm và
thiết bị nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích do các hãng sản xuất có
uy tín cung cấp.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch tạo huyết thanh
thỏ kháng nọc rắn

2.2.1.1. Chế tạo kháng nguyên nọc rắn
Từ 4 loại nọc rắn đông khô chế tạo 4 loại kháng nguyên nọc rắn
theo quy trình của Selvanayagam và CS (1999).
2.2.1.2. Gây miễn dịch tạo huyết thanh thỏ kháng nọc rắn
Thỏ được chia làm 4 nhóm, mỗi nhóm 3 con: Gây miễn dịch theo
quy trình của Chotwiwatthanakun và CS (2001), đó là sử dụng liều
thấp, thể tích nhỏ, tiêm dưới da nhiều mũi dọc hai bên sống lưng và
tiêm nhắc lại.
2.2.2. Xét nghiệm ELISA gián tiếp (indirect ELISA)
- Xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn
- Đánh giá phản ứng chéo giữa huyết thanh kháng nọc rắn đơn đặc
hiệu với nọc độc của các loài rắn khác
2.2.3. Tinh chế kháng thể
Kháng thể đặc hiệu với nọc rắn của từng loài rắn được tách chiết
và tinh sạch theo qui trình tinh chế 3 bước:
* Bước 1: Tách chiết IgG từ huyết thanh thỏ bằng sắc ký ái lực với
cột protein G.
* Bước 2: Tách chiết IgG đặc hiệu nọc rắn từ chế phẩm IgG tổng số
bằng sắc ký miễn dịch với cột chứa kháng nguyên nọc rắn đặc hiệu.
* Bước 3: Loại bỏ các phân tử kháng thể phản ứng chéo giữa các loài
rắn bằng phương pháp hấp phụ miễn dịch với cột KNNR dị loài.
7
2.2.4. Gắn Biotin vào kháng thể
2.2.5. Chuẩn bị huyết thanh ngựa đặc hiệu nọc rắn lục xanh và
hổ đất do IVAC cung cấp
2.2.6. Bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc rắn độc
2.2.6.1. Thiết kế xét nghiệm AB-ELISA
Xét nghiệm được xây dựng theo nguyên lý ELISA sandwich với
phức hợp Avidin – Biotin.
2.2.6.2. Chế tạo bộ xét nghiệm AB-ELISA

2.2.6.3. Qui trình xét nghiệm AB-ELISA
- Bước 1: bộ xét nghiệm AB-ELISA được gắn trên giá đỡ.
- Bước 2: cho 100 µl mẫu thử (máu toàn phần, huyết tương, huyết
thanh, nước tiểu, dịch vết cắn ).
- Bước 3: cho thêm 100 µl kháng thể phát hiện gắn biotin.
- Bước 4: cho thêm 100 µl cộng hợp HRP-avidin vào mối giếng.
- Bước 5: cho thêm vào mỗi giếng 100 µl cơ chất OPD nồng độ 0,5
mg/ml có bổ xung thêm 0,006 % H
2
O
2
. Đọc kết quả sau 5 phút.
Nhận định kết quả:
- Xét nghiệm dương tính khi: OD
mẫu
> X
OD chứng âm
+ 3SD
- Xét nghiệm âm tính khi: OD
mẫu
≤ X
OD chứng âm
+ 3SD
2.2.6.4. Đánh giá độ ổn định và hiệu quả phát hiện nọc rắn độc của
bộ xét nghiệm AB-ELISA trong phòng thí nghiệm
Mức độ ổn định của bộ xét nghiệm AB-ELISA được kiểm tra
định kỳ mỗi tháng một lần trong 6 tháng đầu sau khi sản xuất.
Hiệu quả phát hiện nọc rắn độc của bộ xét nghiệm AB-ELISA
trong phòng thí nghiệm được đánh giá dựa trên khả năng phát hiện
mẫu nọc rắn chuẩn pha trong các dung dịch PBS-T, huyết thanh hoặc

huyết tương, máu toàn phần và nước tiểu ở các nồng độ khác nhau:
8
32 ng/ml; 16 ng/ml; 8 ng/ml; 4 ng/ml; 2 ng/ml; 1 ng/ml; 0,5 ng/ml và
0,25 ng/ml.
2.2.7. Bộ xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc rắn độc
2.2.7.1. Thiết kế xét nghiệm AbE-ELISA
Xét nghiệm được xây dựng theo nguyên lý ELISA sandwich với
3 kháng thể đặc hiệu (kháng thể ngựa, kháng thể IgG thỏ và cộng
hợp HRP-kháng thể chuột kháng IgG thỏ).
2.2.7.2. Chế tạo bộ xét nghiệm AbE-ELISA
2.2.7.3. Qui trình xét nghiệm AbE-ELISA
Gồm 5 bước tương tự như ở mục 2.2.6.3
Nhận định kết quả:
- Xét nghiệm dương tính khi: OD
mẫu
> X
OD chứng âm
+ 3SD
- Xét nghiệm âm tính khi: OD
mẫu
≤ X
OD chứng âm
+ 3SD
2.2.7.4. Tối ưu hóa xét nghiệm AbE-ELISA
2.2.7.5. Đánh giá phản ứng chéo của xét nghiệm AbE-ELISA với nọc
độc của một số loài rắn độc khác ở Việt Nam
2.2.7.6. Đánh giá độ ổn định và hiệu quả phát hiện nọc rắn độc của
bộ xét nghiệm AbE-ELISA trong phòng thí nghiệm
Tương tự như phương pháp trình bày ở mục 2.2.6.4
2.2.8. Đánh giá hiệu quả phát hiện nọc và định loài rắn độc của

bộ xét nghiệm ELISA trong các bệnh phẩm lâm sàng
* Bước 1: Hoàn thiện bệnh án nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng và
thu thập mẫu xét nghiệm từ các bệnh nhân nhiễm độc do rắn cắn.
* Bước 2: Đánh giá hiệu quả phát hiện nọc rắn độc bằng cách tiến
hành xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc rắn độc theo quy trình
mô tả tại mục 2.2.7.3 với tất cả các mẫu bệnh phẩm thu được.
9
* Bước 3: Đánh giá độ phù hợp chẩn đoán xác định loài rắn cắn của
bộ xét nghiệm ELISA với chẩn đoán xác định loài rắn cắn trên lâm
sàng bằng hệ số KAPPA.
2.3. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê y sinh học
Sơ đồ 2.1. Mô hình nghiên cứu
10
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. BỘ XÉT NGHIỆM AB-ELISA PHÁT HIỆN NỌC ĐỘC
CỦA 4 LOÀI RẮN: LỤC XANH, HỔ ĐẤT, CHÀM QUẠP VÀ
HỔ CHÚA
3.1.1. Bốn loại kháng thể thỏ đặc hiệu loài rắn dùng trong bộ xét
nghiệm AB-ELISA
Biểu đồ 3.4. Kết quả xét nghiệm ELISA gián tiếp đánh giá tính
đặc hiệu loài rắn của các chế phẩm kháng thể kháng nọc rắn
Nhận xét: các chế phẩm kháng thể IgG thỏ đặc hiệu loài rắn thu
được sau tinh chế phản ứng rất mạnh với nọc độc tương ứng, có thể
coi các chế phẩm kháng thể thu được là kháng thể đặc hiệu loài rắn.
3.1.2. Bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc rắn độc
Tổng số 1050 xét nghiệm đã được chế tạo phục vụ cho thử
nghiệm độ nhạy, khảo sát độ ổn định của bộ xét nghiệm và thử
nghiệm lâm sàng.

11
3.1.3. Độ nhạy và khả năng phát hiện nọc rắn độc của xét
nghiệm AB-ELISA trong phòng thí nghiệm
Bảng 3.1. Độ nhạy của bộ xét nghiệm AB-ELISA
phát hiện nọc rắn độc
Loại mẫu
Độ nhạy (ng/ml)
Lục xanh
Chàm
quạp
Hổ đất
Hổ chúa
Máu toàn phần
Huyết tương
Huyết thanh
Nước tiểu
Dung dịch đệm
3,2
1,6
0,8
1,6
0,8
3,2
0,8
0,8
1,6
0,8
1,6
0,8
0,8

1,6
0,4
1,6
0,8
0,8
3,2
0,4
Nhận xét: kết quả cho thấy bộ xét nghiệm AB-ELISA có thể phát
hiện nọc độc trong tất cả các mẫu thử và độ nhạy của xét nghiệm là
khác nhau ở mỗi loại dịch xét nghiệm và loại nọc rắn, tuy nhiên xét
nghiệm này có thể phát hiện nọc độc ở mức < 3,2 ng/ml.
3.1.4. Độ ổn định của xét nghiệm AB-ELISA
Biểu đồ 3.6. Độ ổn định của bộ xét nghiệm AB-ELISA
bảo quản ở 4 C
Nhận xét: Bộ xét nghiệm ổn định được dưới 3 tháng
12
3.2. BỘ XÉT NGHIỆM AbE-ELISA PHÁT HIỆN NỌC ĐỘC
CỦA 2 LOÀI RẮN LỤC XANH VÀ HỔ ĐẤT
3.2.1. Bộ xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc rắn lục xanh và
hổ đât
Tổng số 720 xét nghiệm (240 thanh xét nghiệm) đã được chế tạo
phục vụ cho thử nghiệm độ nhạy, khảo sát độ ổn định của bộ xét
nghiệm và thử nghiệm lâm sàng.
3.2.2. Điều kiện tối ưu của phản ứng AbE-ELISA
Các điều kiện tối ưu cho phản ứng AbE-ELISA thu được như sau:
- Kháng thể ngựa gắn lên giếng xét nghiệm:5,0 µg/ml
- Kháng thể IgG thỏ đặc hiệu loài rắn lục xanh và hổ đất: 2,0 µg/ml
- Cộng hợp HRP- kháng thể chuột kháng IgG thỏ (antirabbit IgG –
HRP): pha loãng 1/10.000
- Thời gian ủ cơ chất màu: 5 phút

3.2.3. Độ nhạy và khả năng phát hiện nọc rắn độc của bộ xét
nghiệm AbE-ELISA trong phòng thí nghiệm
Bảng 3.6. Độ nhạy của bộ xét nghiệm AbE-ELISA
phát hiện nọc rắn độc
Loại mẫu
Độ nhạy (ng/ml)
Nọc rắn lục xanh
Nọc rắn hổ đất
Máu toàn phần
Huyết tương
Nước tiểu
Dung dịch đệm
4,0
2,0
2,0
1,0
2,0
1,0
1,0
0,5
Nhận xét: xét nghiệm có thể phát hiện nọc rắn độc trong tất cả các
loại mẫu thử và độ nhạy của xét nghiệm là khác nhau ở mỗi loại dịch
thể và loại nọc rắn. Tuy nhiên, xét nghiệm này có thể phát hiện nọc
độc ở mức nanogram trong máu toàn phần, huyết tương và nước tiểu.
13
3.2.4. Phản ứng chéo của xét nghiệm AbE-ELISA với nọc của
một số loài rắn độc khác ở Việt Nam
Biểu đồ 3.8. Phản ứng chéo của xét nghiệm AbE-ELISA với nọc
của một số loài rắn độc khác ở nồng độ 25 ng/mL
Nhận xét: ở mọi nồng độ được khảo sát, giá trị OD của giếng có

phản ứng đặc hiệu luôn cao hơn rõ rệt so với các giếng còn lại là các
giếng chứng âm và giếng thử phản ứng chéo.
3.2.5. Độ ổn định bộ xét nghiệm AbE-ELISA
Biểu đồ 3.9. Độ ổn định của bộ xét nghiệm AbE-ELISA
bảo quản ở 4 C
Nhận xét: không có sự khác biệt giá trị OD chứng dương của bộ xét
nghiệm AbE-ELISA sau bảo quản ở 4
o
C thời gian 3 tháng so với 6
14
tháng. Bộ xét nghiệm có độ ổn định trong 6 tháng kể từ ngày sản
xuất.
3.3. HIỆU QUẢ PHÁT HIỆN NỌC VÀ ĐỊNH LOÀI RẮN ĐỘC
CỦA BỘ XÉT NGHIỆM ELISA TRONG CÁC BỆNH PHẨM
LÂM SÀNG
3.3.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
3.3.2. Kết quả xét nghiệm phát hiện nọc và định loài rắn độc của
xét nghiệm AbE-ELISA trong các bệnh phẩm lâm sàng
Bảng 3.11. Kết quả xét nghiệm AbE-ELISA
trong các bệnh phẩm: máu, nước tiểu và dịch vết cắn
Kết quả xét nghiệm
ELISA
Dương tính
Âm
tính
Rắn lục xanh
Rắn hổ đất
Máu (n = 115)
23
6

86
Tỷ lệ phần trăm
dương tính
25,2 %
Nước tiểu (n = 119)
45
8
66
Tỷ lệ phần trăm
dương tính
44,5 %
Dịch vết cắn (n = 4)
0
2
2
Tỷ lệ phần trăm
dương tính
50%
Tổng số mẫu (n = 238)
84
154
Nhận xét: tỷ lệ xét nghiệm dương tính với mẫu máu là 25,2% và
trong mẫu nước tiểu cao hơn là 44,5%. Tỷ lệ xét nghiệm dương tính
trong mẫu dịch vết cắn là 2/4 = 50%.
15
Bảng 3.12. Kết quả xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện
nọc rắn lục xanh theo chẩn đoán lâm sàng phân biệt loài rắn cắn
Lâm Sàng
XN ELISA
Rắn lục

xanh cắn
Không phải rắn
lục xanh cắn
Cộng
Dương tính
45 (62,5 %)
1 (2 %)
46
Âm tính
27 (37,5 %)
49 (98 %)
76
Cộng
72 (100%)
50 (100 %)
122
KAPPA = 0,56
Nhận xét: kết quả xét nghiệm AbE- ELISA dương tính với nọc rắn
lục xanh trong các mẫu bệnh phẩm ở những bệnh nhân có chẩn đoán
lâm sàng: rắn lục xanh cắn là 62,5 %. Hiệu quả chẩn đoán xác định
loài rắn lục xanh cắn bằng xét nghiệm AbE-ELISA có độ phù hợp
với chẩn đoán xác định loài rắn lục xanh cắn trên lâm sàng với
KAPPA = 0,56.
Bảng 3.13. Kết quả xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện
nọc rắn lục xanh theo chẩn đoán lâm sàng phân biệt mức độ
nhiễm độc rắn lục xanh cắn
Lâm sàng
XN ELISA
Rắn lục xanh cắn
có RLĐM

Rắn lục xanh cắn
không có RLĐM
Dương tính
30 (81,1 %)
15 (42,9 %)
Âm tính
7 (18,9 %)
20 (57,1 %)
Cộng
n = 37 (100 %)
n = 35 (100 %)
Nhận xét: kết quả xét nghiệm AbE-ELISA dương tính với nọc rắn
lục xanh trong các mẫu bệnh phẩm ở những bệnh nhân có chẩn đoán
lâm sàng: rắn lục xanh cắn có rối loạn đông máu (RLĐM) là 81,1 %
và ở nhóm bệnh nhân rắn lục xanh cắn không có RLĐM là 42,9 %.
16
Bảng 3.14. Kết quả xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện
nọc rắn hổ đất trên lâm sàng
Lâm Sàng
XN ELISA
Rắn hổ (hổ đất
và hổ mèo) cắn
Không phải
rắn hổ cắn
Cộng
Dương tính
13 (68,4 %)
0 (0 %)
13
Âm tính

6 (31,6 %)
103 (100 %)
109
Cộng
19 (100 %)
103 (100 %)
122
KAPPA = 0,78
Nhận xét: kết quả xét nghiệm AbE-ELISA dương tính với nọc rắn
hổ đất trong các mẫu bệnh phẩm ở những bệnh nhân có chẩn đoán
lâm sàng rắn hổ (hổ đất và hổ mèo) cắn là 68,4 %. Hiệu quả chẩn
đoán xác định loài rắn hổ (hổ đất và hổ mèo) cắn bằng xét nghiệm
AbE-ELISA có độ phù hợp với chẩn đoán xác định loài rắn hổ cắn
trên lâm sàng với KAPPA = 0,78.
Bảng 3.15. Phân bố kết quả phát hiện nọc rắn độc
theo thời gian lấy mẫu xét nghiệm sau khi bị rắn cắn
Loại mẫu xét
nghiệm và tỷ lệ
dương tính
Xét nghiệm ELISA
Trước 3 giờ
3-24 giờ
Sau 24 giờ
+
-
+
-
+
-
Máu (n=115)

7
13
21
47
1
26
Tỷ lệ dương tính (+)
7/20 (35%)
21/68 (30,9%)
1/27 (3,7%)
Nước tiểu (n=119)
9
14
35
33
9
19
Tỷ lệ dương tính (+)
9/23 (39,1%)
35/68 (51,5%)
9/28 (32,1%)
Dịch vết cắn (n=4)
1
1
1
1
Tỷ lệ dương tính (+)
1/2
1/2
Nhận xét: kết quả cho thấy tỷ lệ xét nghiệm AbE-ELISA dương tính

trong vòng 3 giờ đầu sau khi bị rắn cắn trong các mẫu máu và nước
17
tiểu tương đương nhau với tỷ lệ là 35% và 39,1%. Tỷ lệ xét nghiệm
AbE-ELISA dương tính trong khoảng thời gian từ 3 giờ đến 24 giờ
sau khi bị rắn cắn trong mẫu nước tiểu là 51,5%, trong khi tỷ lệ này ở
mẫu máu chỉ là 30,9 %. Sau 24 giờ kể từ khi bị rắn cắn vẫn có khả
năng phát hiện được nọc độc trong mẫu nước tiểu với tỷ lệ xét
nghiệm dương tính là 32,1%. Chỉ có 1 trường hợp cho kết quả xét
nghiệm dương tính trong mẫu máu ở giờ thứ 28 sau khi bị rắn cắn
chiếm tỷ lệ 3,7%.
CHƯƠNG 4
BÀN LUẬN
4.1. BỘ XÉT NGHIỆM AB-ELISA PHÁT HIỆN NỌC ĐỘC
CỦA 4 LOÀI RẮN LỤC XANH, HỔ ĐẤT, CHÀM QUẠP VÀ
HỔ CHÚA
4.1.2. Bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc độc của 4 loài rắn
lục xanh, hổ đất, chàm quạp và hổ chúa
Bộ xét nghiệm AB-ELISA do chúng tôi chế tạo cũng sử dụng các
thanh loại 8 giếng đáy phẳng như mô tả trong bộ xét nghiệm của
Cox, bộ xét nghiệm có khả năng phát hiện đồng thời nọc của 4 loại
rắn độc phổ biến ở Việt Nam là: lục xanh, hổ đất, chàm quạp và hổ
chúa. Việc sử dụng cộng hợp avidin – biotin làm tăng khả năng phát
hiện nọc rắn so với xét nghiệm bằng kỹ thuật ngưng kết hàng trăm
lần và có độ nhạy phát hiện tương đương với sử dụng cộng hợp
kháng thể gắn enzyme. Điều này đã được chứng minh trong công
trình nghiên cứu của Ernesto Amuy năm 1997,Selvanayagam và
cộng sự (1999) và Lê Văn Đông và CS (2003).
4.1.3. Độ nhạy của xét nghiệm AB-ELISA
Độ nhạy phát hiện nọc rắn độc của bộ xét nghiệm AB-ELISA
được trình bày ở bảng 3.1 cho thấy xét nghiệm có thể phát hiện nọc

18
độc ở tất cả các mẫu thử là máu toàn phần, huyết tương, huyết thanh,
nước tiểu và dung dịch đệm với độ nhạy phát hiện nọc rắn trong
dung dịch đệm là 0,4 – 0,8 ng/ml. Các xét nghiệm AB-ELISA phát
hiện nọc rắn độc do các tác giả khác nghiên cứu có độ nhạy phát hiện
nọc độc tương tự như kết quả nghiên cứu của chúng tôi và đều ở mức
ng/ml.
4.1.4. Độ ổn định của bộ xét nghiệm AB-ELISA
Một hạn chế lớn nhất mà chúng tôi gặp phải khi chế tạo bộ xét
nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc rắn độc đó là thời gian ổn định của
bộ xét nghiệm dưới 3 tháng.
4.2. BỘ XÉT NGHIỆM AbE-ELISA PHÁT HIỆN NỌC ĐỘC
CỦA 2 LOÀI RẮN LỤC XANH VÀ HỔ ĐẤT
4.2.1. Bộ xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc độc của 2 loài
rắn lục xanh và hổ đất
Bộ xét nghiệm AbE-ELISA cũng được chế tạo bằng những vật
liệu được sử dụng tương tự trong bộ xét nghiệm AB-ELISA. Tuy
nhiên, đây là bộ xét nghiệm chỉ có khả năng phát hiện đồng thời hai
loại nọc rắn độc đó là lục xanh và hổ đất chứ không phải bốn loại
nọc rắn độc như bộ xét nghiệm AB-ELISA. Đây là bộ xét nghiệm
được thiết kế dựa trên nguyên lý ELISA sandwich (3 kháng thể).
Trong đó, chúng tôi sử dụng kháng thể gắn bản là kháng thể ngựa có
trong huyết thanh kháng nọc rắn thương phẩm đang được sử dụng
trên lâm sàng do IVAC sản xuất. Kháng thể phát hiện là kháng thể
IgG thỏ đặc hiệu nọc rắn sau tinh sạch và cộng hợp HRP-kháng thể
chuột kháng IgG thỏ.
Mô hình xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc rắn trong nghiên
cứu này phù hợp với mô hình xét nghiệm ELISA sandwich 3 kháng
thể của Selvanayagam (1999) và Hung Dong Zong (2003).
19

4.2.3. Độ nhạy của xét nghiệm AbE-ELISA
Độ nhạy của xét nghiệm AbE-ELISA cũng đạt mức ng/ml và thấp
nhất trong dung dịch đệm là 0,5 – 1 ng/ml tùy thuộc loại nọc rắn. Độ
nhạy phát hiện nọc rắn độc của xét nghiệm AbE-ELISA trong nghiên
cứu này tương tự với độ nhạy phát hiện nọc rắn độc của xét nghiệm
ELISA sandwich 3 kháng thể do Selvanayagam chế tạo năm 1999;
Hung Dong-Zong và cộng sự năm 2003. Bộ xét nghiệm AbE-ELISA
trong nghiên cứu này đã chứng minh được khả năng phát hiện nọc
rắn độc trong các mẫu dịch sinh học như máu toàn phần, huyết
tương, nước tiểu.
4.2.4. Phản ứng chéo của xét nghiệm AbE-ELISA với nọc của
một số loài rắn độc khác ở Việt Nam
Bằng việc sử dụng 4 mẫu nọc chuẩn lục xanh, hổ đất, chàm quạp
và hổ chúa ở các nồng độ khác nhau để thực hiện xét nghiệm AbE-
ELISA. Chúng tôi nhận thấy rằng, ở mọi nồng độ nọc rắn chuẩn <
200 ng/ml không thấy xuất hiện phản ứng dương tính giả của kít phát
hiện nọc rắn lục xanh và hổ đất với 3 loại nọc rắn chuẩn khác loài
được khảo sát.
4.2.5. Độ ổn định của bộ xét nghiệm AbE-ELISA
So với bộ xét nghiệm AB-ELISA thì bộ xét AbE-ELISA có độ ổn
định tốt hơn với thời gian ổn định 6 tháng trong điều kiện bảo quản ở
4
0
C. Bộ xét nghiệm AbE-ELISA có độ ổn định tốt hơn bởi vì các
sinh phẩm dùng trong chế tạo kít đều là các sinh phẩm đã được
thương mại hóa, như huyết thanh ngựa đặc hiệu nọc rắn lục xanh và
hổ đất do IVAC sản xuất đã chứng minh được hiệu quả điều trị trên
lâm sàng, cho phản ứng “trực tiếp” giữa HTKNR và nọc độc có
trong cơ thể nạn nhân. Cộng hợp HRP-kháng thể chuột kháng IgG
thỏ do hãng Sigma, Mỹ cung cấp. Chế phẩm IgG thỏ đặc hiệu loài

20
rắn được tạo ra trong nghiên cứu này đều ở dạng phân tử IgG nguyên
vẹn không gắn biotin hay enzyme nên có độ ổn định cao hơn.
4.3. HIỆU QUẢ PHÁT HIỆN NỌC VÀ ĐỊNH LOÀI RẮN ĐỘC
CỦA BỘ XÉT NGHIỆM ELISA TRONG CÁC BỆNH PHẨM
LÂM SÀNG
4.3.2. Kết quả xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc và định loài
rắn độc trong các bệnh phẩm lâm sàng
- Kết quả xét nghiệm AbE-ELISA trong các loại mẫu xét nghiệm:
máu, nước tiểu và dịch vết cắn
Xét nghiệm AbE-ELISA trong nghiên cứu này đã phát hiện được
nọc rắn độc có trong tất cả các loại mẫu bệnh phẩm lâm sàng là máu
toàn phần, nước tiểu và dịch vết cắn.
- Kết quả xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc rắn lục xanh
Kết quả xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn lục xanh dương tính
ở bệnh nhân có chẩn đoán lâm sàng: rắn lục xanh cắn đạt tỷ lệ cao là
62,5 %. Kết quả xét nghiệm ELISA dương tính hay âm tính phụ
thuộc vào nồng độ nọc độc có trong mẫu xét nghiệm của bệnh nhân.
Nồng độ nọc độc phụ thuộc vào lượng nọc độc xâm nhập vào cơ thể
nạn nhân sau khi bị cắn và thời gian lấy mẫu xét nghiệm.
Trên lâm sàng, người ta phân chia những bệnh nhân bị rắn lục
xanh cắn thành hai nhóm: nhóm có nhiễm độc toàn thân (là những
bệnh nhân có rối loạn đông máu) và nhóm nhiễm độc nhẹ hoặc
không có nhiễm độc toàn thân (là những bệnh nhân không có rối
loạn đông máu). Kết quả xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn lục
xanh dương tính ở nhóm bệnh nhân bị rắn lục xanh cắn có rối loạn
đông máu là rất cao chiếm tỷ lệ là: 81,1% (bảng 3.13). Kết quả này
hoàn toàn phù hợp với thực tế lâm sàng vì những bệnh nhân bị rắn
lục xanh cắn có rối loạn đông máu thường có nồng độ nọc rắn lục
21

xanh trong máu và nước tiểu cao hơn những bệnh nhân bị rắn lục
xanh cắn không có rối loạn đông máu.
- Kết quả xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc rắn hổ đất
Kết quả xét nghiệm ELISA dương tính với nọc rắn hổ đất trong
các mẫu bệnh phẩm ở những bệnh nhân có chẩn đoán lâm sàng: rắn
hổ (hổ đất và hổ mèo) cắn là 68,4 % (bảng 3.14). Tuy số mẫu xét
nghiệm của nhóm bệnh nhân bị rắn hổ (hổ đất và hổ mèo) cắn chưa
nhiều, nhưng kết quả cho thấy có phản ứng chéo xảy ra ở những
bệnh nhân có chẩn đoán lâm sàng rắn hổ mèo cắn, trong khi xét
nghiệm của chúng tôi lại cho kết quả dương tính với nọc rắn hổ đất.
Như vậy, xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn hổ đất trong nghiên
cứu này mới chỉ có khả năng phân biệt được những bệnh nhân bị rắn
hổ cắn (common cobra) với những bệnh nhân bị các loài rắn gây độc
thần kinh khác cắn.
- Kết quả xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc rắn độc theo thời
gian lấy mẫu xét nghiệm
Kết quả cho thấy, xét nghiệm ELISA dương tính với mẫu máu và
nước tiểu ở thời điểm trước 3 giờ sau khi bị rắn cắn là tương đương
nhau, với tỷ lệ lần lượt là 35% và 39,1% (bảng 3.15). Như vậy, kết
quả nghiên cứu của tôi cho thấy, nọc rắn độc xuất hiện trong máu và
nước tiểu trước 3 giờ kể từ khi bị rắn cắn. Cụ thể là sau hai giờ kể từ
khi bị rắn cắn đã có thể phát hiện được nọc rắn độc trong nước tiểu.
Trong khoảng thời gian từ 3 đến 24 giờ sau khi bị cắn thì tỷ lệ xét
nghiệm ELISA dương tính trong mẫu nước tiểu cao hơn trong mẫu
máu với tỷ lệ lần lượt là 51,5% và 30,9% (bảng 3.15). Điều này hoàn
toàn phù hợp bởi vì: nước tiểu là đường thải trừ chính của nọc độc ra
khỏi cơ thể. Nồng độ nọc độc ở bệnh nhân nhiễm độc nặng có xu
hướng cao hơn bệnh nhân không có nhiễm độc nặng, kết quả là thải
22
trừ nhiều hơn ra nước tiểu làm cho tỷ lệ xét nghiệm nước tiểu cho kết

quả dương tính cao hơn. Mặt khác, do nước tiểu có có chế tái hấp thu
nước và cô đặc nên nồng độ nọc độc trong nước tiểu ở thời điểm lấy
mẫu vẫn có lượng nọc độc đủ cao cho kết quả xét nghiệm dương tính
trong khi mẫu máu cho kết quả xét nghiệm âm tính.
Sau 24 giờ kể từ khi bị rắn cắn vẫn có khả năng phát hiện được
nọc độc trong mẫu nước tiểu với tỷ lệ xét nghiệm dương tính là
32,1%. Kết quả này phù hợp với kết quả công bố của Sueli (2010) về
thời gian tồn tại của nọc độc trong nước tiểu là trong 7 ngày đầu kể
từ khi tiêm nọc độc. Chỉ có 1 trường hợp (chiếm tỷ lệ 3,7%) cho kết
quả xét nghiệm dương tính trong mẫu máu ở giờ thứ 28 sau khi bị
rắn cắn. Như vậy, sau 24 giờ tỷ lệ xét nghiệm ELISA dương tính với
nọc độc trong mẫu máu rất thấp. Kết quả nghiên cứu này cho thấy
chỉ nên lấy mẫu máu xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc trong vòng 24
giờ đầu kể thừ khi bị rắn cắn. Sau 24 giờ, chúng ta chỉ nên lấy mẫu
nước tiểu hoặc dịch vết cắn (nếu có) để xét nghiệm.
- Hiệu quả xác định loài rắn độc cắn bằng xét nghiệm AbE-
ELISA với xác định loài rắn cắn trên lâm sàng
Kết quả tính toán hệ số KAPPA ở bảng 3.12 cho thấy, nếu sử dụng
xét nghiệm AbE-ELISA làm công cụ chẩn đoán xác định loài rắn lục
xanh cắn khi bệnh nhân vào viện có độ phù hợp với chẩn đoán lâm
sàng khi bệnh nhân ra viện với KAPPA = 0,56. Kết quả tính toán hệ
số KAPPA ở bảng 3.14 cho thấy, chẩn đoán xác định loài rắn hổ cắn
bằng xét nghiệm AbE-ELISA khi bệnh nhân vào viện so với chẩn
đoán lâm sàng khi bệnh nhân ra viện có độ phù hợp cao hơn
(KAPPA = 0,78).
23
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu được và những phân tích nêu trên, đề tài rút ra
các kết luận sau:
1. Đã chế tạo được bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc độc

của 4 loài rắn lục xanh, hổ đất, chàm quạp, hổ chúa và phát triển
thành công bộ xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc độc của 2
loài rắn lục xanh và hổ đất ở Việt Nam với các thông số kỹ thuật
sau:
- Bộ xét nghiệm AB-ELISA có khả năng phát hiện và phân biệt
được nọc độc chuẩn của 4 loài rắn độc: lục xanh, hổ đất, chàm quạp
và hổ chúa pha trong máu toàn phần, huyết tương, nước tiểu và dung
dịch đệm với ngưỡng phát hiện dao động từ 0,4 – 3,2 ng/ml tùy theo
loại nọc rắn và loại mẫu pha. Độ ổn định của bộ xét nghiệm không
quá 3 tháng kể từ ngày sản xuất trong điều kiện bảo quản ở 4
0
C.
- Bộ xét nghiệm AbE-ELISA có khả năng phát hiện và phân biệt
được nọc độc chuẩn của rắn lục xanh và hổ đất pha trong máu toàn
phần, huyết tương, nước tiểu và dung dịch đệm với ngưỡng phát hiện
dao động từ 0,5 – 4,0 ng/ml tùy theo loại nọc rắn và loại mẫu pha.
Độ ổn định của bộ xét nghiệm đạt trên 6 tháng kể từ ngày sản xuất
trong điều kiện bảo quản ở 4
0
C.
2. Qua phân tích 115 mẫu máu, 119 mẫu nước tiểu và 4 mẫu dịch
vết cắn của 122 bệnh nhân rắn độc cắn điều trị tại Bệnh viện
Chợ Rẫy cho thấy, hiệu quả phát hiện nọc và định loài rắn độc
của bộ xét nghiệm ELISA trong các bệnh phẩm lâm sàng như
sau:
- Bộ xét nghiệm AbE-ELISA có khả năng phát hiện được nọc rắn
lục xanh và hổ đất trong tất cả các loại mẫu xét nghiệm trên lâm sàng
bao gồm: máu toàn phần, nước tiểu và dịch vết cắn với tỷ lệ xét
24
nghiệm dương tính lần lượt là: 25,2%; 44,5% và 50 %. Tỷ lệ phát

hiện được nọc rắn lục xanh ở nhóm bệnh nhân có chẩn đoán lâm
sàng rắn lục xanh cắn là 62,5%. Tỷ lệ này cao hơn ở nhóm bệnh
nhân rắn lục xanh cắn có nhiễm độc toàn thân và có sử dụng huyết
thanh kháng nọc rắn lục xanh trong điều trị là 81,1%. Tỷ lệ phát hiện
được nọc rắn hổ (hổ đất và hổ mèo) ở nhóm bệnh nhân có chẩn đoán
lâm sàng rắn hổ cắn là 68,4%.
- Chẩn đoán xác định loài rắn lục xanh bằng xét nghiệm AbE-
ELISA khi vào viện phù hợp với chẩn đoán lâm sàng khi ra viện với
KAPPA = 0,56. Chẩn đoán xác định loài rắn hổ (hổ đất và hổ mèo)
bằng xét nghiệm AbE-ELISA khi vào viện phù hợp với chẩn đoán
lâm sàng khi ra viện với KAPPA = 0,78.
KIẾN NGHỊ
Nên ứng dụng bộ xét nghiệm AbE-ELISA trong chẩn đoán loài
rắn độc tại các cơ sở cấp cứu và điều trị rắn độc cắn, góp phần mở
rộng việc chỉ định và sử dụng sớm HTKNR, giảm bớt tỷ lệ tử vong
và di chứng cho nạn nhân rắn độc cắn ở nước ta.
Để có được bộ xét nghiệm AbE-ELISA thương phẩm, cần tiếp tục
nghiên cứu phát triển và hoàn thiện bộ xét nghiệm AbE-ELISA để
xác lập độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm dựa trên panel
mẫu của nhiều loại nọc độc khác nhau.