Bài giảng Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký lỏng hiện đại trong kiểm nghiệm thuốc

Ứng Dụng Các Kỹ Thuật
Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong
Kiểm Nghiệm Thuốc
PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm

Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm Thuốc
Mục tiêu
 Trình bày được xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký
lỏng và các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng
 Trình bày được cấu hình và lợi điểm của các hệ thống UHPLC,
và UPLC

 Biết được nguyên tắc chuyển đổi một quy trình phân tích bằng
HPLC sang UPLC và ngược lại

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm Thuốc
Nội dung

 Xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký lỏng
 Các kỹ thuật phân tách trong sắc ký lỏng
 Kỹ thuật UHPLC (Ultra High Performace Liquid Chromaography)

 Kỹ thuật UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography)
 Chuyển đổi phương pháp phân tích HPLC sang UPLC và ngược lại

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm Thuốc

Xu hướng nghiên cứu hiện nay
trong sắc ký lỏng

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký lỏng

 Pha tĩnh và cột sắc ký
 Thiết bị phân tích

 Kỹ thuật phân tích

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký lỏng
Mục đích
 Phân tích nhanh (high-throughput)
 Hiệu năng cao (phương pháp phân tích, thiết bị, phịng thí
nghiệm)
 Phân tích tự động và liên tiếp với nhiều phương pháp
 Chuyển đổi phương pháp phân tích mà khơng cần thẩm định lại
 Tiện lợi cho người phân tích
 Quản lý, vận hành, xử lý và lưu trữ dữ liệu của 1 hệ thống,
nhiều hệ thống trong phịng thí nghiệm, nhiều phịng thí nghiệm

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký lỏng

Những tiến bộ

về kỹ thuật phân tích sắc ký

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM

Các kỹ thuật phân tách bằng sắc ký
Phân tách chất bay hơi và khơng phân cực dựa vào

GC

chương trình nhiệt
• Hiệu năng thấp (đơn vị chiều dài) [N]
• Độ chọn lọc giới hạn [α]

Gas Chromatography

Phân tách các chất không bay hơi và các chất phân

LC

cực dựa vào hiệu năng cột gia tăng
• Hiệu năng vừa phải [N]

• Độ chọn lọc vừa phải [α]
Liquid Chromatography

Việc phân tách dựa vào độ chọn lọc chuyển pha

SFC
Nguyễn Đức Tuấn

• Hiệu năng cao [N]
• Độ chọn lọc cao [α]
Đại học Y Dược TPHCM

Sắc ký lỏng siêu tới hạn
Sắc ký lỏng siêu tới hạn (SFC, Supercritical Fluid Chromatography)
 Khởi đầu vào những năm 1990
 Khắc phục một số nhược điểm của GC và HPLC

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Tại sao SFC không được chấp nhận ?
Mặc dù SFC có những ưu điểm, nhưng chưa
bao giờ được chấp nhận rộng rãi …. Tại sao ?
•

•

•

Thiếu ổn định
– Thời gian lưu thay đổi
– Thể tích tiêm có độ đúng thấp
– Việc phân phối dung môi không ổn định khi tỷ lệ
dung môi dưới 5%
Thiết bị vận hành kém
– Độ tin cậy của thiết bị không đủ (hệ thống bơm,
kiểu tiêm, bộ phận điều hoà áp suất cột)
– Sự khuếch tán và thể tích hệ thống lớn nên ngăn

chặn sự dung nhận các hạt pha tĩnh nhỏ và thời
gian phân tích không nhanh
Độ nhạy thấp
– Độ nhiễu cao do bơm và đầu dò
– Ảnh hưởng bởi chỉ số khúc xạ của CO2

Nguyễn Đức Tuấn

Nếu tất cả các
vấn đề trên
được giải
quyết ?

Đại học Y Dược TPHCM


Sắc ký hội tụ siêu hiệu năng
Sắc ký hội tu siêu hiệu năng (UPCC, Ultra Performance Convergence
Chromatography)
 Khởi đầu vào năm 2012
 Phát triển từ SFC

Hệ thống
UPCC-PDA-MS

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM

Sự kỳ vọng từ UPCC

UPCC = UPC2

SFC

UPCC là kỹ thuật phân tích được phát triển từ kỹ
thuật SFC, có độ tin cậy và ổn định.

Sắc ký hội tụ

Data courtesy of Davy Guillarme, Jean-Luc Veuthey LCAP, University of Geneva, Switzerland

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Chất lỏng siêu tới hạn là gì ?
Tăng nhiệt độ và
áp suất
Lỏng/khí

Nguyễn Đức Tuấn

Tăng nhiệt độ và
áp suất
Điểm tới hạn

Lỏng siêu tới hạn

Đại học Y Dược TPHCM


Một số chất lỏng siêu tới hạn

Lỏng
siêu tới hạn
N2O
NH3
n-butane
CO2

Nguyễn Đức Tuấn

Nhiệt độ tới hạn
(oC)
36,5
132,5
152,0
31,3

Áp suất tới hạn
(psi)
1053,7
1653,3
551,1
1071,3

Đại học Y Dược TPHCM

Lợi điểm của CO2
•
•
•
•
•

Tinh khiết hóa học, dung mơi ổn định và không phân cực
Không độc và không cháy
Dễ bay hơi
Dễ kiểm soát trạng thái vật lý
Ln có sẳn
– Sản phẩm phụ của quá trình lên men
• Được xem như khí “Xanh”
– Định nghĩa khí “Xanh”:
• Ngăn chặn/giảm tối thiểu chất thải
• Giảm độc
• Tái sử dụng
• Giảm tối thiểu năng lượng sử dụng

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Thuận lợi của SFC
Khuếch tán
(cm2/s)

Độ nhớt
(g/cmxs)

Khí

10-1

10-4

Lỏng siêu
tới hạn

10-4 – 10-3
Như chất
lỏng

10-4 – 10-3
như chất khí

Lỏng

< 10-5

10-2

Khuếch tán thấp, độ nhớt thấp
dẫn đến sắc ký nhanh và
hiệu quả

Nguyễn Đức Tuấn

Hạn chế của sắc ký khí

 Phải tạo dẫn xuất với chất không
bay hơi, phân cực và hấp phụ
 Hợp chất không bền với nhiệt

 Hợp chất cao phân tử

Hạn chế của sắc ký lỏng
 Hợp chất bay hơi
 Hợp chất khó tan

Đại học Y Dược TPHCM


Lựa chọn dung môi
Sức dung môi
Năng lực
rửa giải [Eo]

Độ phân
cực [P’]

0

0,1

Xylene

0,22

2,5

Toluene

0,22

2,4

Diethyl ether

0,29

2,8

Dichloromethane

0,30

3,1

Chloroform

0,31

4,1

Acetone

0,43

5,1

Dioxane

0,43

4,8

THF

0,48

4,0

MTBE

0,48

2,5

Ethyl acetate

0,48

4,4

DMSO

0,50

7,2

Acetonitrile

0,52

5,8

Isopropanol

0,60

3,9

Ethanol

0,68

4,3

Methanol

0,73

5,1

Dung môi

Mạnh

Pha thuận

Yếu

CO2 siêu tới hạn

Pentane, Hexane,
Heptane

Nước

Nguyễn Đức Tuấn

Pha thuận

CO2 siêu tới hạn được
sử dụng trong sắc ký hội
tụ có thể hỗn hịa với
các dung mơi có năng
lực rửa giải khác nhau,
cho phép lựa chọn được
nhiều dung môi khi triển
khai sắc ký

Sắc ký hội tụ

Pha đảo

10,2

Đại học Y Dược TPHCM


Lựa chọn pha tĩnh

Lựa chọn pha tĩnh

Sắc ký hội tụ có thể sử
dụng cả cột pha thuận và
pha đảo, cho phép có
nhiều lựa chọn khi triển
khai sắc ký

Silica / BEH
2-ethylpyridine
Cyano
Aminopropyl
Diol

Pha thuận
Sắc ký hội tụ

Amide
PFP
Phenyl

Pha đảo

C18 < C8

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Sử dụng/thải bỏ dung môi – LC và UPCC
Sử dụng

Chất thải

2mL/min x 20min

LC

1) 40mL heptane
2) 1.2mL 1,4 dioxane

41 mL dung môi

2.5mL/min x 2min

UPC2

1) 4.85mL CO2 CO2
2) 0.15mL Methanol
(3%)

Nguyễn Đức Tuấn

0,15mL Methanol

Đại học Y Dược TPHCM


Các thuốc chẹn beta (β-blockers)

β-blockers

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM