Bài giảng PCR và chẩn đoán phân tử

11/7/2014

Khoa Y Dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội
Bộ mơn Y Dược học cơ sở

PCR và chẩn đốn phân tử

ThS. Phạm Thị Hồng Nhung

Những phát minh có ý nghĩa cách mạng trong
Sinh học phân tử

Kary Mullis

1


11/7/2014

Nhắc lại về phản ứng chuỗi trùng hợp – PCR
(Polymerase Chain Reaction)
ã Khỏi nim v PCR
Phản ứng nhân bản đoạn DNA nhờ
enzyme polymerase in vitro vi 2
on mi trên máy PCR

• Nguyên tắc của PCR?

Máy PCR Prime (Anh)

o DNA mÉu (template)

o

2 đoạn mồi (primer)

o Taq pol (tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus)/ Pfu pol
(tách từ vi khuẩn Archaea)/
o

Bốn loại deoxirinucleotide triphotphate (dATP, dTTP,
dGTP, dCTP)

o Dung dịch đệm (Pol Buffer)
o (Ion Mg2+)

Phương pháp tiến hành PCR

2


11/7/2014

Ứng dụng của PCR trong nghiên cứu di truyền học người
• Chẩn đốn bệnh
o Các bệnh nhiễm trùng do virut,
vi khuẩn, nấm
o HIV/AIDS,…
o Chẩn đốn ung thư và q trình
theo dõi bệnh

• Tư vấn di truyền y học

o Chẩn đốn nhanh các bệnh di
truyền và dị tật bẩm sinh
o Chẩn đốn sớm sinh con
gái/trai khơng cần chọc ối

• Khoa học hình sự
o Xác định danh tính tội phạm,
nạn nhân dựa vào vết máu khơ,
sợi tóc, nước bọt, tinh dịch..
o Xác định huyết thống

Ứng dụng của PCR trong nghiên cứu di truyền học người
• Di truyền dược lý
o Tiên lượng khả năng đáp ứng thuốc của từng cá thể, từ đó lựa
chọn loại thuốc và liều lượng thuốc thích hợp

3


11/7/2014

Ứng dụng trong chẩn đốn
• Ưu điểm
o Chỉ cần lượng DNA nhỏ để chẩn đoán. Người lớn:
các tế bào máu, niêm mạc. Bào thai: lượng nhỏ lông
tơ màng đệm.
o Độ nhạy cao
o Thời gian thực hiện nhanh (~3 giờ)
o Đơn giản và ít tốn kém

• Nhược điểm
o Giới hạn của độ dài đoạn gen đích được nhân lên
thường khơng q 1.5 kb.
o Ngoại nhiễm
o Sai sót của Taq pol

Ứng dụng trong chẩn đoán
Real-time PCR (Q-PCR)
o Phát hiện và định lượng (quantitative) sản phẩm
khuếch đại khi phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở
phát huỳnh quang.
o Hai tác nhân phát huỳnh chính:

Tác nhân gắn vào DNA mạch đơi (Ethidium Bromide,
SYBR Green, EvaGreen ...)


Tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ...).

4


11/7/2014

Ứng dụng trong chẩn đoán
Real-time PCR (Q-PCR)
Đường nền (baseline): là số chu kỳ PCR trong đó tín hiệu huỳnh
quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của
thiết bị.
Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): là số chu kỳ PCR ở đó tín hiệu
đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền. Số lượng trình tự đích trong mẫu ban
đầu càng cao thì số chu kỳ cần để vượt ngưỡng phát hiện càng nhỏ,

nghĩa là giá trị Ct càng thấp.

Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang xanh SYBR cho năm mẫu,
mỗi mẫu làm 3 lần qPCR lặp lại

Ứng dụng trong chẩn đoán
Real-time PCR (Q-PCR)
o Phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh ở người
như virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán và
theo dõi điều trị.
o Phát hiện HCV, H.pylori, chẩn đoán sớm HIV ở trẻ em,
phát hiện thai nhi nhiễm Rubella, lao:
o Trong bệnh phẩm sử dụng một cặp mồi được thiết kế để nhân
bản vùng gene IS6110. IS6110 là những trình tự gắn chèn đặc
trưng cho các chủng vi khuẩn lao (Mycobacterium complex)
và hiện diện với số lượng lớn trong DNA bộ gene của
Mycobacterium và được xem là đối tượng thích hợp nhất để
phát hiện vi khuẩn lao. Mẫu xét nghiệm được kết luận là
dương tính khi kết quả phân tích “đường cong nóng chảy” cho
thấy Tm của sản phẩm PCR thu được tương ứng với Tm của
vùng gene IS6110 được nhân bản.

5


11/7/2014

Ứng dụng trong chẩn đốn
Reverse-Transcription PCR (RT-PCR)
• Phát hiện các tác nhân gây

bệnh là virus có hệ gen là
RNA (retrovirus)
• Phát hiện sớm và chính
xác virus Dengue trong
máu bệnh sốt xuất huyết
trong vòng 3 ngày đầu tiên
mắc bệnh.

Chỉ thị RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA
Nguyên tắc

RAPD = PCR + các cặp mồi nhẫu nhiên

Chỉ thị RAPD có một số đặc tính sau:
1. Khơng cần biết trước trình tự ADN
2. Kích thước các đoạn mồi: 9-12 Nu, tối thiểu là 4 Nu

3. Số lượng mồi khơng hạn chế

Ứng dụng chính
• Phân tích tính đa hình khi sự phân biệt về hình thái là khơng
hiệu quả.
• Định loại tác nhân gây bệnh (sán lá gan….)

6


11/7/2014

Ch th RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA

Băng điện di RAPD 2 dòng ngô A&B; các primer 2, 4 và 5
cho thÊy sù kh¸c biƯt vỊ dÊu chn RAPD cđa chóng

Chỉ thị SSR - Simple sequence repeates
Nguyên tắc
SSR = PCR + cặp mồi tại trình tự vùng biên các vùng lặp lại

Chỉ chị SSR thường được chuẩn bị qua các bước sau:
1. Tách các đoạn DNA mang các trình tự lặp lại đơn giản như
[GATA], [CGA], [GC].
2. Xác định trình tự tại các vùng biên của các trình tự lặp lại.
3. Thiết kế mồi tương ứng với các trình tự vùng biên.
4. PCR với các Nu được đánh dấu phóng xạ.
5. Đánh giá tính đa dạng về các trình tự lặp lại trên cơ sở các
sản phẩm thu được từ phản ứng PCR( dùng phương pháp
phóng xạ tự chụp)

7


11/7/2014

Nghiên cứu trường hợp: Chẩn đốn Hungtinton
• Gen IT15/Hungtingtin nằm ở vị trí
4p16.3 được nhân dịng năm 1993
• Đột biến gây bệnh mở rộng đoạn
CAG ở exon 1.
• Protein huntingtin 348 kD là đích tác
động của caspase 3- một protease liên

quan đến q trình apoptosis ở tế bào
thần kinh
• Chuẩn đốn bệnh bằng cách: Xác
định kích thước đoạn lặp => xác định
độ lặp lại của [CAG]

17
24
46
41

A
B
C
D
A,B

B,D

A,C A,D B,C

B,D

C,D A,B

220
20
180
160
140

120
100
80

8


11/7/2014

Chỉ thị AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism
Nguyên tắc
AFLP = Enzym giới hạn + PCR + cặp mồi đặc hiệu
ADN hệ gen tổng số
Cắt bằng enzym giới hạn

Gắn đoạn nối (adaptor)

Gắn đoạn mồi

Thực hiện phản ứng PCR

Dấu chuẩn ADN

9


11/7/2014

Chỉ thị AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism
Nguyên tắc

AFLP = Enzym giới hạn + PCR + cặp mồi đặc hiệu

Ứng dụng
- In dấu DNA, lập bản đồ DNA marker có hiệu quả nhất so
với những marker khác (Vos và ctv., 1995).
- Tạo nhóm liên kết di truyền giữa các giống.
- Đánh giá mức độ liên hệ di truyền hoặc sự khác nhau giữa
các giống.
- Là công cụ hiệu quả để phát hiện tính chất đa hình nên dễ
dàng nhận biết sự khác biệt giữa các cá thể.

Chỉ thị RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
Nguyên tắc
RFLP = PCR + cặp mồi đặc hiệu +enzym cắt giới hạn

10


11/7/2014

Nghiên cứu trường hợp: Sử dụng PCR- RFLP để
xác định các SNP liên quan đến đáp ứng thuốc

www.themegallery.c

Nghiên cứu trường hợp: Sử dụng PCR- RFLP để
xác định các SNP liên quan đến đáp ứng thuốc

Y học

Di truyền học

Dược học

Phân tích các đa hình di truyền các gen:

mã hóa cho các protein là đích tác dụng
của thuốc.

mã hóa cho các enzym chuyển hóa thuốc
cùng các chất ngoại lai từ mơi trường vào
cơ thể.

Xây dựng pháp đồ phịng và điều trị bệnh hiệu quả
cho từng cá nhân

11


11/7/2014

Nghiên cứu trường hợp : Sử dụng PCR- RFLP để
xác định các SNP liên quan đến đáp ứng thuốc


Acetyl hố là q trình thêm nhóm acetyl (CH3-C(=O)) vào một hợp chất hữu cơ. Ví dụ như trong phản ứng
tổng hợp asipirin:

Salicylic acid

Acetylsalicylic acid
(aspirin)

Bằng cách acetyl hóa, những phân tử được acetyl hố
có thể tăng khả năng đi qua được hàng rào máu não,
hàng rào mạch.
Thuốc có thể vận chuyển lên não nhanh hơn, làm
tăng hiệu quả tác dụng của chúng.

Sơ lược về enzym N-Acetyltransferase 2 ở người


Acetyl hoá các thuốc bởi enzym N-acetyltransferase (NAT)
là một bước chuyển hố vơ cùng quan trọng giúp cơ thể tránh
khỏi các phản ứng q khích với thuốc và mơi trường.

Mã hố cho protein phân bố rải rác ở tất cả các mơ.

NAT
Mã hố cho protein hoạt động chủ yếu ở gan.
Khả năng chuyển hóa thuốc và các chất độc.
Giảm nguy cơ mắc các chứng bệnh ung thư, dị ứng.

12


11/7/2014

SNP G857A có vai trị dược lý quan trọng

Giảm
hoạt
tính của
enzym

NAT2
Biến đổi cấu hình lập thể tại
trung tâm xúc tác của enzym.

G857A
Gen NAT2

LOGO

 Tỉ số OD260/280 các mẫu: 1,6 – 2,0.
 Hàm lượng ADN: 35 ng/µl – 400 ng/µl.

ADN đủ hàm lượng và tinh sạch cho phản ứng nhân bản bằng PCR

23kb

ADN tổng số tách chiết được từ các mẫu máu bảo quản trong EDTA
LOGO

13


11/7/2014

Sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen NAT2 mang các SNP được quan tâm
Mồi xuôi: 5’-GGAACAAATTGGACTTGG-3’
Mồi ngược: 5’-TCTAGCATGAATCACTCTGC-3’

1093 bp

Thành phần

phản ứng
ADN khn
[Mg2+]
dNTP
Taq polymerase

100 – 250 ng
2 mM
0,3 mM
1u/ 25 µl

Mồi

0,3 mM

Nồng độ

Sản phẩm điện di trên gel agarose 1%
Làn 1 – 7: sản phẩm nhân dịng
M: thang ADN chuẩn kích thước 1kb

M

1

2

3

4

LOGO

5

6

7

8

1093 bp
819 bp

238 bp

Sản phẩm PCR được cắt bằng BamHI trên gel agarose 2%
M: ADN chuẩn kích thước 100bp.
Các làn 1 – 3, 5, 6: Đồng hợp tử GG
Các làn 7, 8: Đồng hợp tử AA
Làn 4: Dị hợp tử AG

LOGO

14


11/7/2014

Quy trình PCR nhân dịng gen NAT2

Thành phần

Nồng độ gốc

Template

Nồng độ hoạt

Thể tích một phản

động

ứng (20 µl)

100 – 250 ng

1 µl

2 mM

1.6 µl

Mg2+

?

dNTP

2 mM

?

3 µl

Buffer

10 X

1X

2 µl

?

0.3 µM

1.5 µl

1u/µl

?

Primer
(x2)
Taq
DDW

Chu trình nhiệt:
Biến tính: 940C (4 min)

30 chu kỳ: 940C (30 sec)
570C (45 sec)
720C (90 sec)
Kéo dài:
720C (10 min)

1 µl
8.4 µl

LOGO

Báo cáo thực hành
• Phần bắt buộc: báo cáo kết quả điện di sản phẩm
PCR/ sản phẩm cắt
• Phần tự chọn: chọn 1 trong 2 hình thức
1. Trả lời câu hỏi:
- Nêu vai trò của các thành phần trong phản ứng
PCR?
- Nêu nguyên tắc của các phương pháp PCR khác mà
bạn biết (Assembly PCR (PCA), Inverse PCR,
Nested PCR, Hot Start PCR…)
2. Tìm bài báo có nội dung: sử dụng PCR để xác định
một bệnh nào đó.

15