Nghiên Ứu Tăng Ường Tá Dụng Ứ Hế Esherihia Oli Ủa Nisin Bằng Áh Kết Hợp Với Hoá Hất Và Á Biện Pháp Xử Lý Nhiệt.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
------------------------------------

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ
E.COLI CỦA NISIN BẰNG CÁCH KẾT HỢP VỚI HÓA
CHẤT VÀ CÁC BIỆN PHÁP XỬ LÝ NHIỆT

NGUYỄN TIẾN THÀNH

HÀ NỘI 2006

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061131697651000000


1

MỞ ĐẦU
Thực phẩm, xét về phương diện vi sinh, là một mơi trường giàu chất
dinh dưỡng và rất thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật. Sự nhiễm tạp vi
sinh vật lại vô cùng dễ dàng khi thực phẩm không được bảo quản tốt. Nhiều
biện pháp bảo quản thực phẩm được sử dụng như: ướp muối, bảo quản lạnh,
lạnh đông, sấy, gia nhiệt, lên men, bổ sung các chất bảo quản hoá học hoặc
kháng sinh… Tuy nhiên các phương pháp này có thể làm thay đổi giá trị dinh
dưỡng và giá trị cảm quản của thực phẩm hoặc để lại dư lượng và có nguy cơ
gây ra các tác động phụ có hại cho người sử dụng. Vì vậy, một chất bảo quản
có nguồn gốc sinh học khơng ảnh hưởng tới chất lượng của thực cũng như an
toàn với con người là rất cần thiết.

Một trong các chất có hoạt tính kháng khuẩn, an tồn và hữu hiệu trong
bảo quản thực phẩm là nisin. Nisin có phổ tác dụng rộng với nhiều loại vi
khuẩn Gram dương như: Staphylococcus, Bacillus, Lactobacillus và đặc biệt
là một số vi khuẩn gây bệnh và gây hư hỏng thực phẩm: Clostridium,
Bacillus. Nisin có bản chất là protein nên dễ dàng bị phân huỷ bởi các enzim
trong hệ tiêu hóa, khơng để lại dư lượng và gây ra hiện tượng nhờn thuốc như
các chất kháng sinh y học. Ngoài ra, sử dụng nisin trong bảo quản thực phẩm
(đặc biệt là các sản phẩm đồ hộp) có tính kinh tế hơn bởi có thể tiết kiệm năng
lượng (giảm nhiệt độ và và rút ngắn thời gian thanh trùng) cho các quá trình
xử lý nhiệt, vẫn đảm bảo hiệu quả kháng khuẩn mà không làm giảm giá trị
dinh dưỡng của sản phẩm.
Bên cạnh những ưu điểm, nisin cũng có nhược điểm đó là khơng có khả
năng tác dụng tới nấm men, nấm mốc, đặc biệt là đối với nhóm vi khuẩn
Gram âm như E. coli, Salmonella…vốn là nguyên nhân gây bệnh qua thực
phẩm chủ yếu và để lại hậu quả nghiêm trọng cho con người. Một chất bảo


2

quản thực phẩm đảm bảo phải có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế được hầu hết
các vi sinh vật có hại, nhằm tạo ra một sản phẩm an tồn. Vì vậy, với những
nhược điểm chưa khắc phục được như vậy, việc ứng dụng nisin trong bảo
quản thực phẩm còn nhiều hạn chế.
Khả năng kháng nisin của vi khuẩn Gram âm có được là nhờ cấu tạo của
thành tế bào. Do tác động của một số yếu tố môi trường như pH, hoá chất, áp
suất thẩm thấu và đặc biệt là nhiệt độ, lớp màng tế bào có thể bị suy yếu hoặc
hư hỏng, vi khuẩn Gram âm trở nên nhạy cảm hơn với nisin.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu tăng cường tác
dụng ức chế E. coli của nisin bằng cách kết hợp với các biện pháp xử lý
nhiệt” đã được tiến hành nhằm góp phần tăng cường hơn nữa khả năng ứng

dụng của nisin trong bảo quản thực phẩm.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nisin
1.1.1. Bacterioxin
Vi sinh vật là một trong những nguyên nhân chính gây ra các bệnh có
liên quan tới thực phẩm. Ngay trong những ngày đầu tiên, kể từ khi người ta
phát hiện ra vi sinh vật và ảnh hưởng của chúng đối với con người, người ta
đã tìm mọi cách để có thể kiểm soát được sự sinh trưởng và phát triển của vi
sinh vật trong thực phẩm. Ngoài các biện pháp truyền thống như sấy, bảo
quản lạnh, thanh trùng, ướp muối… thì một biện pháp khác cũng rất phổ biến
đó là sử dụng các chất phụ gia bảo quản thực phẩm.
Trong các chất phụ gia bảo quản thực phẩm, phải kể đến một nhóm các
chất bảo quản có tên gọi là bacterioxin. Bacterioxin được tạo ra bởi vi khuẩn,
bản chất thường là oligo hoặc polypeptit và có các đặc tính tiêu diệt các vi
khuẩn có quan hệ họ hàng với chủng sản [16].
Bacterioxin được biết đến đầu tiên là colicin - được tạo ra bởi chủng vi
khuẩn Gram âm E. coli. Được phát hiện lần đầu tiên bởi Gratia vào năm 1925,
“principe V” là sản phẩm của 1 chủng E. coli để chống lại các chủng E. coli
khác. Gratia và Fredericq (1946) đã gọi chất này bằng thuật ngữ “colicin”, sau
đó đến năm 1953, Jacob và một số cộng sự đã gọi bằng thuật ngữ
“bacterioxin” để chỉ các protein khả năng kháng khuẩn. Thuật ngữ colicin
hiện nay dùng để nhấn mạnh các protein kháng khuẩn được tạo ra bởi các vi
khuẩn E. coli và các chủng thuộc Enterobacteriaceae [44].
Ban đầu, các bacterioxin (cũng như colicin) được định nghĩa là các
protein kháng khuẩn có phổ tác dụng hẹp, có thể hấp phụ lên các vị trí đặc
biệt trên bề mặt của tế bào. Khi phát hiện ra một kháng sinh mới, để dự đoán

4

chất này có phải là một bacterixin hay khơng, người ta thường xác định bản
chất protein của chúng thông qua việc sử dụng các enzym proteaza.
Người ta có thể xác định một chất là bacterioxin thông qua 6 tiêu chuẩn
sau đây [1] [20]:
−

Phổ tác dụng hẹp, chỉ có tác dụng ức chế với các lồi vi khuẩn có quan
hệ họ hàng với vi khuẩn sinh ra nó.

−

Trong phân tử có một phần là protein cần thiết cho tác dụng ức chế của
nó.

−

Chúng là chất gây độc đối với vi khuẩn đối kháng.

−

Để ức chế được các vi khuẩn nhạy cảm, bacterioxin phải được gắn vào
một chất mang đặc hiệu trên tế bào nhạy cảm.

−

Vi khuẩn sinh ra bacterioxin phải tự sinh ra chất kháng bacterioxin của

nó và hai phân tử này đều nằm ở plasmit.

−

Được tổng hợp khi có tác động qua lại với vi khuẩn đối kháng.
Bacterioxin gồm nhiều loại khác nhau, trong đó bacterioxin của vi khuẩn

lactic được quan tâm nhất bởi hiệu quả và mức độ an toàn của chúng. Mỗi
bacterioxin được chọn lọc và dùng để chống lại các chủng vi khuẩn cụ thể.
Tuy nhiên, hiệu quả của nó trong thực phẩm cịn bị ảnh hưởng của nhiều yếu
tố khác. Bacterioxin của vi khuẩn lactic được chia thành 3 nhóm chính (bảng
1.1), trong đó nhóm I (lantibiotic) là nhóm được chú ý nhất trong các nghiên
cứu hiện nay.


5

Bảng 1.1: Bacterioxin của vi khuẩn lactic [51].
Bacterioxin

Chủng sản

Phổ tác dụng Kích thước (aa a )

Nhóm I: Lantibiotic
Nisin (A và Z)

Lactococcus lactis

Rộng

34

Lacticin 481

Lactococcus lactis

Rộng

27

Lactocin S

Lactococcus sake

Rộng

37

Carnocin U149

Carnobacterium pisicola

Rộng

35-37

Variacin

Micrococcus varians

Rộng

25

Nhóm II: Phi - lantibiotic, kích thước nhỏ, bền nhiệt
Lactococcin A

Lactococcus lactis

Hẹp

54

Lactococcin B

Lactococcus lactis

Hẹp

47

Lactococcin M

Lactococcus lactis

Hẹp

48

Mesenterocin 52B

Leuconostoc mesenteroides

Hẹp

32

Curvaticin FS47

Lactobacillus curvatus

TB

31

Sakacin A

Lactobacillus sake

TBb

41

Sakacin P

Lactobacillus sake

TB

41

Carnobacterioxin A, B

Carnobacterium piscicola

TB

53, 48

Pediocin AcH/PA-1

Pediococcus acidilactici

TB

44

Leucocin A-UAL-187

Leuconostoc gelidum

TB

37

Enterocin 1146/A

Enterococcus faecium

TB

47

Piscicolin 126

Carnobacterium piscicola

TB

44

Hẹp

333

Bacterioxin giống Pediocin:

Nhóm III: Kích thước lớn, kém bền nhiệt
Helveticin J

Lactobacillus helveticus

Chú thích: : aa: axit amin; TB : Trung bình
a

b

Nhóm lantibotic bao gồm các peptit kích thước nhỏ (65 kDa) chứa các
axit amin bất thường (các axit amin thioete) lanthionin (Lan) L-

6

metyllanthionin (MeLan) và một số các axit amin dehydrat (dehydrated amino
acids) như 2,3-didehydroalanin (Dha) (do serin khử nước) và 2,3didehydrobutyrin (Dhb) (do threonin khử nước) [58].
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu về nisin
Nisin là một bacterioxin được tạo ra bởi một số chủng vi khuẩn
Lactococcus lactis. Cho đến này, nisin được nghiên cứu nhiều nhất về các
tính chất và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Lịch sử nghiên cứu nisin
kéo dài gần một thể kỷ qua, kể từ những năm 1925, khi người ta lần đầu tiên
phát hiện ra nisin [20].
Khi xem xét những bất thường trong quá trình xuất phomat như hiện
tượng lên men diễn ra chậm hoặc hỏng, người ta đã phát hiện ra nguyên nhân
của hiện tượng này là do thực khuẩn thể và một số chủng vi khuẩn hình cầu
có trong sữa có khả năng ức chế các chủng vi sinh vật khác trong quá trình lên
men. Năm 1928, Rogers và Whittier là người đầu tiên công bố về tác động ức
chế của nisin sinh ra do Streptococcus lactis (hiện nay Lactococcus lactis
subsp. lactis) đối với Lactobacillus bulgaricus [20]. Tên nisin được Mattick
và Hirsch (1947) gọi là xuất phát từ ý nghĩa “ chất ức chế N” (N inhibitory
substance), bởi vì Lactococcus lactis ban đầu được phân vào nhóm N
Streptococcus.
Ban đầu người ta chỉ nghiên cứu ứng dụng nisin trong y học và nisin chủ
yếu được nghiên cứu để ứng dụng vào chống bệnh viêm vú của bị sữa [37].
Tuy nhiên nhiều nghiên cứu sau đó đã chỉ ra là nisin khơng thích hợp cho
mục đích đó bởi độ hồ tan thấp ở pH sinh lý, và bị thuỷ phân bởi proteaza
của hệ tiêu hóa.
Ngược lại, xuất phát từ những ưu điểm: khơng độc, khơng kích thích
tăng trưởng, có hoạt tính chống Clostridium, nisin có thể trở thành chất bảo

7

quản thực phẩm có hiệu quả. Năm 1951, Hirsch và một số tác giả khác bắt
đầu kiểm tra khả năng ứng dụng vào thực phẩm của nisin. Hirch đã chứng
minh: sử dụng chủng vi khuẩn lactic sinh nisin làm giống lên men ban đầu
(starter culture) có thể ngăn chặn sự hư hỏng phomat gây ra bởi Clostridium
botulium [36]. Cùng lúc đó, nhiều nhà nghiên cứu khác cũng đã sử dụng
chủng vi khuẩn sinh nisin vào quá trình lên men phomat để ức chế sự lên men
butyric của các vi khuẩn gây hư hỏng và gây thối phomat [20].
Cho tới năm 1957, nisin bắt đầu xuất hiện trong các phân xưởng sản xuất
pho mát quy mô nông trại để bảo quản các sản phẩm làm ra. Cũng trong năm
này, hãng Aplin and Barrett đã đưa ra chế phẩm thương mại của nisin để sử
dụng trong thực phẩm [20]. Dạng chế phẩm của nisin sẵn có nhất hiện nay
trên thị trường đó là Nisaplin TM, với thành phần 2,5 % nisin, 77,5 % NaCl
và sữa gầy [16, 51, 75].
Gross và Morrell là người đầu tiên làm sáng tỏ cấu trúc của nisin vào
năm 1971 [31]. Sau đó, có ít nhất là 6 loại nisin được phát hiện thấy và được
xác định các tính chất (các loại này được ký hiệu bằng các ký tự từ A đến E
và Z), trong đó loại nisin A là dạng hoạt động nhất.
Mức độ an toàn của nisin
Người ta đã thử nghiệm mức độ an toàn của nisin trên 2 loại động vật
chuột và lợn và đã khẳng định nisin khơng có hại hoặc gây ảnh hưởng rất ít
đối với động vật thí nghiệm [27, 70]. Giá trị LD50 đối với động vật thí
nghiệm là 7 g/kg trọng lượng cơ thể [38].
Tổ chức nông lương thực và thực phẩm quốc tế, tổ chức y tế thế giới
(FAO/WHO) đồng ý cho phép sử dụng nisin trong bảo quản thực phẩm từ
năm 1969 [15, 16, 20]. Hiện nay, nisin nằm trong danh mục các chất phụ gia
được phép sử dụng với ký hiệu quốc tế E234. Tổ chức FAO/WHO cũng

8

khuyến cáo mức hấp phụ tối đa hàng ngày nisin vào trong cơ thể cho 1 người
nặng 70 kg là 60 mg nisin tinh khiết, tương đương với 33000 đơn vị hoạt tính
quốc tế [15, 16, 20]. Tuy nhiên, ở Australia, Pháp, Anh, người ta cho phép sử
dụng nisin không hạn chế trong công nghiệp chế biến phomat. Ở Mỹ, lượng
nisin sử dụng tối đa trong thực phẩm là 10000 đơn vị hoạt tính trên 1 gam
thực phẩm; ở Nga là 8000 đơn vị hoạt tính trên 1 gam sản phẩm [15]. Trong
khi đó ở Argentina, Italy và Mexico, giới hạn này lại thấp, chỉ khoảng 500
đơn vị hoạt tính quốc tế trên 1 gam đối với sản phẩm format chế biến và các
sản phẩm khác [15].
Ở Mỹ, cơ quản quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) cho phép sử dụng
bacterioxin nisin như là phụ gia thực phẩm an toàn (GRAS - generally
recognized as safe). Khi một chất kháng sinh tự nhiên được sử dụng như là
chất bảo quản thực phẩm thì chủng vi sinh vật sinh ra chất kháng sinh đó cũng
được coi là vi sinh vật an tồn (GRAS - generally recognized as safe
microorganism). Do vậy, việc sử dụng các chủng vi khuẩn sinh nisin như các
lactococci không bị hạn chế [15, 16].
Hướng nghiên cứu chính về nisin hiện nay
Hiện nay, nisin đã được sử dụng như là chất phụ gia thực phẩm an toàn ở
hơn 50 quốc gia trên thế giới [20]. Tuy nhiên, những nghiên cứu về nisin vẫn
đang diễn ra liên tục theo một số hướng chính:
−

Nghiên cứu mở rộng tác động của nisin với các chủng vi sinh vật thuộc
nhóm vi khuẩn Gram âm, nấm men và nấm mốc - vốn có tính kháng
nisin ở điều kiện thông thường.

−

Nghiên cứu sử dụng nisin để chế tạo các màng bao gói thực phẩm, thay
thế phương pháp bổ sung trực tiếp nisin vào thực phẩm.


9

1.1.3. Tính chất của nisin
1.1.3.1. Cấu trúc của nisin.
Cấu trúc hoàn thiện của nisin được làm sáng tỏ bởi Gross và Morell vào
đầu những năm 70.
Nisin được xếp vào nhóm 1: lantibiotics chứa các axit amin dị thường
[40, 51, 75]. Phân tử nisin bao gồm 34 axit amin trong đó có 1 số là axit amin
đã cải biến. Những cải biến đó là sự khử nước ở xerin và threonin, tạo ra axit
amin dehydroalanin và axit amin dehydrobutyrin. Các axít amin này liên kết
với các axit amin khác thông qua cầu lưu huỳnh, tạo thành 5 vịng đặc trưng
(hình 1.1) [12, 77].

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử nisin [30, 32].

Năm nội vòng phân tử được tạo bởi các liên kết thioete. Trong đó vịng
A 3-7, Ala-S-Ala là lanthionine, cịn 4 vòng B, C, D, E tương ứng 8-11, 1319, 23-26, 25-28 là các β-metyl lanthionine. Các vòng A, B, C sẽ hợp lại
thành nhóm ngăn cách với nhóm cịn lại gồm 2 vịng D và E thơng qua axit
amin thứ 21 đóng vai trị như một “bản lề” (hình 1.4). Phân tử nisin không
chứa các axit amin thơm nên không hấp thụ ở bước sóng 280 nm [6].
Các axit amin dị thường đóng vai trị như một nhóm ái nhân
(nucleophile) được xác định thông qua khả năng phản ứng với các mercaptan


10

[49]. Có thể các nhóm này rất quan trọng để đảm bảo bacterioxin có khả năng
xâm nhập vào màng tế bào đích. Cấu trúc gồm 5 vịng của nisin giúp cho
peptit có độ vững chắc [46], đồng thời góp phần kháng lại các enzym proteaza
và sự biến tính do nhiệt [61].
Phân tử nisin có thể tồn tại ở dạng monome với khối lượng phân tử 3350
Dal [6]. Do các phân tử nisin có thể tương tác liên kết với nhau thơng qua các
nhóm axit dehydroamin và các nhóm amin [49], nên nisin có thể tồn tại ở
dạng dime hay tetrame với khối lượng phân tử tương ứng là 6700 Dal và
13400 Dal [6].
1.1.3.2. Một số tính chất hố lý của nisin.
Do có bản chất là một protein nên hầu hết các đặc điểm hóa lý của nisin
đều phụ thuộc vào pH của mơi trường xung quanh.
a, Độ hồ tan của nisin.
Nisin bản chất là một peptit mang điện tích dương nên độ hồ tan của nó
phụ thuộc vào pH.
Độ hịa tan của nisin giảm nhanh chóng khi pH thay đổi từ vùng axit lên
vùng trung tính và kiềm. Nisin hồ tan tốt nhất ở pH=2 (độ hòa tan 57
mg/ml), giảm xuống nhanh ở pH=6 (1,5 mg/ml) và hòa tan rất ít ở pH=8 (0,25
mg/ml). Hầu như nisin không tan trong mơi trường trung tính hoặc kiềm [49].
Theo Liu và cộng sự, độ hòa tan của nisin phụ thuộc tỷ lệ nghịch với
nồng độ dung dịch đệm natri photphat [49]. Ở cùng giá trị pH, với nồng độ
dung dịch đệm 0,2M, độ hòa tan của nisin thấp hơn tới 42 % so với trường
hợp nồng độ dung dịch đệm 0,05M. Dung dịch HCl 0,02N có thể hồ tan
nisin tốt nhất. Người ta đã chứng tỏ khi hoà tan trong axit HCl, nisin cho hoạt
tính cao hơn hẳn so với hồ tan trong nước [49].


11

b, Độ bền nhiệt.
Nisin kém bền và dễ dàng mất hoạt tính ở pH cao [49]. Cơ chế của sự
mất hoạt tính này chưa được làm sáng tỏ. Hầu hết các nghiên cứu đều cho
rằng có thể là do sự biến tính protein, sự thay đổi về cấu tạo hóa học. Các axit
amin dehydro là các nhóm ái nhân (nucleophile), đặc biệt ở pH cao, các nhóm
này dễ phản ứng với các nhóm ái điện tử như: ion OH-, nhóm amin bị khử
proton, nhóm hydroxyl thiếu proton…Các tương tác này có thể xảy ra trong
nội tại phân tử hoặc giữa các phân tử nisin với nhau. Do bản thân trong phân
tử nisin có 3 axit amin dehydro nên rất dễ có tương tác giữa các nhóm trong
cùng một phân tử nisin tạo thành các liên kết chéo [49]. Khi các tương tác này
xảy ra, hoạt tính kháng khuẩn của nisin sẽ mất đi.
Nisin là một bacterioxin bền nhiệt. Hoạt tính của nó gần như khơng thay
đổi ở nhiệt độ 4-10oC, ở 30-60 oC sau 30 phút vẫn giữ được 80-90% hoạt tính
ban đầu. Từ 80oC trở lên, hoạt tính bắt đầu giảm mạnh, sau 60 phút ở 100 oC,
vẫn còn 50% hoạt tính. Ở 121oC, sau 10 phút hoạt tính còn 46%, sau 60 phút
còn 22%.
Độ bền nhiệt phụ thuộc vào pH, pH càng thấp thì độ bền nhiệt càng tăng.
Ở pH=2, nisin bền sau khi hấp 115,6o C, ở pH=5 thì 40% hoạt tính giảm, ở
pH=6,8 mất hơn 90% hoạt tính.
E.A. Davies và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới độ bền
nhiệt của nisin, với chế độ nhiệt là 115oC trong 20 phút và 121oC trong 15
phút. Kết quả chỉ ra rằng, dung dịch nisin không hoàn toàn bền ở pH=2 mà
bền nhất ở pH=3 (bảng 1.2) [22].
So với các bacterioxin khác, nisin có độ bền nhiệt hơn hẳn. Helveticin V1829 mất hoạt tính khi xử lý 50 oC/30 phút, acidocin B giữ nguyên hoạt tính
xử lý 70oC/10 phút, nhưng ở 100o C thì mất hết hoạt tính [20]. Trong q trình


12

bảo quản thực phẩm, hoạt tính nisin cũng bị giảm, đặc biệt là khi nhiệt độ và

pH cao. Tuy vậy nisin có thể bền sau 30 tuần trong bơ phomát với pH=5,8 và
nhiệt độ 20oC.
Bảng 2: Biến đổi hoạt tính nisin sau quá trình xử lý nhiệt [22]
Giá trị pH
1
2
3
3,5
4
5

Hoạt tính cịn lại ngay sau xử lý
nhiệt
IU/ml
%
700
7
7150
71,5
9750
97,5
8200
82
7860
78,6
4350
43,5

Hoạt tính cịn lại sau 2 tuần
bảo quản ở 20 - 25oC

IU/ml
%
500
5
6700
67
9450
94,5
8300
83
8300
83
4000
40

1.1.3.3. Tính chất kháng khuẩn của nisin
a, Phổ kháng khuẩn
Nisin khơng có khả năng tác động tới vi khuẩn Gram âm, nấm men và
nấm mốc. Thông thường nisin chỉ tác động được đối với vi khuẩn Gram
dương, trong đó có vi khuẩn lactic, một số vi khuẩn gây bệnh như Listeria,
Staphylococcus, Mycobacterium và các vi khuẩn sinh bào tử Bacillus,
Clostridium [15, 16, 20].
Nisin có tác động lên cả tế bào sinh dưỡng và bào tử của vi khuẩn. Với tế
bào sinh dưỡng nhạy cảm, nisin có tác động ức chế hoặc tiêu diệt ngay cả
trong điều nhiệt độ, pH, độ ẩm thích hợp cho quá trình phát triển của vi
khuẩn. Khả năng tác động phụ thuộc vào độ nồng độ của nisin, mật độ tế bào
vi khuẩn, hình thái của vi khuẩn nhạy cảm và một số yếu tố khác [15, 16, 20].
Đối với bào tử của vi khuẩn, nisin có tác động kìm hãm sự nảy mầm của
chúng. Bào tử của bacilli và clostridia thực tế là nhạy cảm với nisin hơn so

13

với tế bào sinh dưỡng của chúng. Các bào tử qua xử lý nhiệt sẽ nhạy cảm hơn
đối với nisin. Ví dụ như bào tử Clostridium PA3969 khi qua xử lý nhiệt
121oC/3 phút trở lên nhạy cảm gấp 10 lần so với không qua xử lý nhiệt. Scott
và Taylor đã chứng minh nisin có thể ngăn chặn sự nảy mầm của bào tử các
chủng Clostridium botulium loại A, B, E. Theo Campebell, chỉ cần một lượng
0,03 ppm nisin trong môi trường sản phẩm là đủ ức chế sự phát triển bào tử
của một số loài chịu nhiệt như Clostridia, Bacilli [14]. Với nồng độ 2 IU/ml,
nisin đủ ngăn chặn được sự phát triển của bào tử chịu nhiệt Subtilis
thermophilus [14]. Vì vậy nisin có tác động có hiệu quả hơn đặc biệt là trong
các sản phẩm có độ axit thấp có trải qua giai đoạn chế biến nhiệt như các sản
phẩm rau quả đóng hộp.
Cơ chế tác động của nisin đối với bào tử chưa rõ ràng, cho dù người ta
đã xác định được nisin sẽ liên kết với nhóm sulfhydryl của chuỗi protein [54].
Cơ chế này cũng không giống cơ chế tác động vào màng nguyên sinh chất đối
với các tế bào sinh dưỡng.
b, Cơ chế tác động của nisin đối với tế bào sinh dưỡng.
Một trong những cơ chế giải thích tác động của nisin đối với tế bào nhạy
cảm là do sự tạo thành các lỗ nhỏ (pore) trên màng nguyên sinh chất
(cytoplasm membrane), gây thất thoát các phân tử, ion có kích thước nhỏ
trong nội bào, làm giảm thế năng vận chuyển prôton PMF (Proton Motive
Force), ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp ATP, dẫn tới sự chết tế bào
[52].
Cơ chế tác động của nisin đối với tế bào nhạy cảm được nhiều nghiên
cứu đưa ra. Phần lớn quan điểm cho rằng, để tác động tới vi khuẩn, nisin phải
trải qua hai bước chính: bám trên thành tế bào vi khuẩn nhạy cảm, xâm nhập
qua thành tế bào và tạo các lỗ nhỏ trên màng nguyên sinh chất.

14

Để xâm nhập qua thành tế bào, nisin phải tiếp xúc đuợc với thành tế bào
nhờ các liên kết với các thành phần trên bề mặt. Các liên kết đó có thể là liên
kết tĩnh điện. Do nisin có bản chất là protein, nên pH có thể là một yếu tố tác
động tới khả năng liên kết của nisin với bề mặt tế bào. Một số nghiên cứu đã
công bố, ở pH 6,5, nisin có khả năng hấp phụ lên bề mặt của tế bào chủng
sinh nisin, ở bị giải phóng khi pH < 3 [5, 62]. Tuy vậy, với mỗi một chủng vi
sinh vật khác nhau thì giá trị pH tối ưu cho sự tiếp xúc với thành tế bào sẽ
khác.
Với đích tấn cơng là màng ngun sinh chất, nên đầu tiên nisin phải xâm
nhập qua thành tế bào Gram dương. Thông thường nisin qua màng tế bào nhờ
sự khuếch tán. Monteville cho
rằng, phụ thuộc vào mức độ
dày và háo nước mà thành tế
bào hoạt động như là 1 màng
chọn lọc phân tử. Việc loại bỏ
màng tế bào của Listeria
kháng nisin làm nó trở nên
nhạy cảm với nisin đã chứng
tỏ vai trị của thành tế bào với

Hình 1.2: Sự tạo thành mao quản của nisin theo
cơ chế tang trống [52]

việc chống lại tác động của
nisin [52].
Một số giả thiết về cơ chế hình thành lỗ trên màng nguyên sinh chất tế
bào nhạy cảm do tác dụng của nisin đã được thông báo.

Cơ chế “chèn” (insertion model):
Sau khi khuếch tán qua thành tế bào, nisin sẽ liên kết với màng nguyên
sinh chất của tế bào nhạy cảm. Sahl và cộng sự (1991) cho rằng nisin có liên


15

kết tĩnh điện với các nhóm photphat mang điện tích âm của photpholipit trên
bề mặt màng. Sau đó, do có thế năng ψ tích điện (transmembrane electrical
potential) giữa mặt trong và mặt ngoài màng nguyên sinh chất, nên các phân
tử nisin sẽ ‘chèn’ vào màng nguyên sinh chất và cùng nhau tạo thành các mao
quản như hình tang trống (barrel stave) (hình 1.2) [67].
Cơ chế tạo nêm (wedge - model)
Một cơ chế khác gọi là cơ chế “nêm ” cho rằng, các phân tử nisin liên kết
nhẹ với các điện tích âm của màng để tập trung ở một vị trí nào đó trên màng

Hình 1.3: Cơ chế “nêm” tạo lỗ của nisin trên màng nguyên sinh chất.
1. Nisin có phía đầu C mang điện tích dương liên kết với với các nhóm mang điện tích
âm của photpholipit. Sự có mặt của nhiều phân tử nisin dẫn tới làm xáo động, mật trật tự
lớp màng lipit.
2. Do có chênh lệch thế năng tích điện ∆ψ và ∆pH, nisin chèn vào màng tế bào
3: Các lỗ được hình thành, nisin liên kết với photpholipit điện tích âm làm xáo trộn
màng của lipit và tạo các lỗ hình nêm. Do trạng thái của lớp màng lipit như vậy, ln có
xu hướng về trạng thái ban đầu, nên thời gian tồn tại của các mao quản này rất ngắn, vài
mili giây và nisin nhanh chóng bị giải phóng trở lại trạng thái nằm dọc theo bề mặt tế
bào [29].


16

và làm thay đổi động lực của màng lipit. Do có thế năng tích điện của màng ψ
(khoảng -100mV), các phân tử nisin sẽ chèn vào màng, trong khi đó các
phospholipit âm sẽ bị uốn cong và tạo thành các lỗ tương tự như cái nêm
(hình 1.3) [21]. Theo cơ chế này, lỗ nhỏ được hình thành từ nhiều phân tử
nisin, tác động tới lipit và chuyển các lipit sang cấu trúc không bền về mặt
động lực học. Do vậy sự tồn tại các lỗ này rất ngắn, lipit sẽ cố gắng sắp xếp
để trở về cấu trúc kép ban đầu và dễ dàng phá bỏ các lỗ được tạo nên [29].
Cơ chế tạo mao quản có sự tham gia của lipit II.
Có thể nói đây là cơ chế giải thích sự hình thành các lỗ nhỏ của nisin
hồn thiện nhất, nó có thể giải thích được cho nhiều kết quả nghiên cứu về tác

Hình 1.4: Lipit II và nisin [39]

động của nisin. Breukink và cộng sự (1999) đưa ra một cơ chế tác động của
nisin với sự tham gia của một thành phần trong photpholipit, là lipid II. Vắng
mặt lipid II, nisin xâm nhập màng tế bào ở nồng độ 1µM, ngược lại khi có
mặt lipid II chỉ cần 1nM nisin đủ tạo ra tác động tương tự. Dựa vào đây người
ta cũng giải thích vì sao E. coli kháng nisin tốt hơn Micrococcus flavus. Hàm


17

lượng lipid II trong màng nguyên sinh chất của E. coli khoảng 2000 phân tử
trong khi đó Micrococcus flavus có tới 100000 phân tử trong một tế bào [13].
Breukink và cộng sự (2003) cho rằng lipid II không chỉ là điểm tiếp
nhận của nisin mà thậm chí có thể là một cấu tử hình thành lỗ; khi đó lipid II
nằm ở phía bên ngồi của các lỗ mao quản tạo ra. Thông thường các lỗ sẽ
được tạo nên từ 5 đến 8 phân tử nisin với cùng một số lượng phân tử lipit II
[11]. Số lượng phân tử nisin tham gia hình thành mao quản càng nhiều thì
kích thước của mao quản càng lớn. Chính vì thế mà có thể thất thốt các nội

chất có khối lượng nhỏ hoặc lớn: các ion hoặc các ATP, các enzim nội
bào…[39]

Hình 1.5: Cơ chế tạo lỗ trên màng nguyên sinh chất của nisin khi có mặt lipit II.
1- Đầu tiên nisin liên kết với nửa carbohydrat của lipit II (điện tích dương của nisin sẽ liên
kết với điện tích âm của nhóm photphat trên lipit II), do vậy mà không cần tới các điện tích
âm trên bề mặt màng nguyên sinh chất.
2 - Nhờ có cấu trúc như bản lề, đầu C của nisin sau đó sẽ di chuyển và sắp xếp theo chiều
ngang của màng nguyên sinh chất. Các phức hợp nisin/lipid II sẽ cùng nhau hình thành nên
mao quản. Độ bền của các lỗ nhỏ này kéo dài từ vài miligiây tới vài giây. Q trình hình
thành lỗ nhỏ này khơng phụ thuộc vào thế năng của màng.

Kết quả của sự hình thành mao quản là làm thất thốt các phân tử, và
chất hồ tan có khối lượng nhỏ như axit amin, ion, ATP từ nguyên sinh chất,


18

do vậy phá vỡ thế năng màng tế bào, đình chỉ các hoạt động sinh tổng hợp
dẫn đến sự chết của tế bào [11, 13, 28, 39, 53, 67, 78].
1.1.4. Ứng dụng của bacterioxin và nisin trong bảo quản thực phẩm
Việc ứng dụng bacterioxin vào bảo quản thực phẩm đang ngày càng phổ
biến. Hiện nay, có 3 hướng tiếp cận để ứng dụng bacterioxin vào bảo quản
thực phẩm [69]:
−

Bổ sung vào thực phẩm các vi khuẩn lactic sinh bacterioxin.

−

Bổ sung bacterioxin tinh khiết hoặc bán tinh khiết vào thực phẩm

−

Sử dụng một sản phẩm được lên men trước bởi chủng vi khuẩn sinh
bacterioxin như là một thành phần trong quá trình chế biến thực phẩm

1.1.4.1. Bảo quản thịt và các sản phẩm từ thịt
Thịt và các sản phẩm từ thịt dễ có khả năng nhiễm L. monocytogenes.
Chính khả năng phát triển ở nhiệt độ thấp, trong điều kiện yếm khí, nên L.
monocytogenes là một trong những nguyên nhân gây mất an toàn cho thực
phẩm nguy hiểm nhất. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để kiểm soát L.
monocytogenes trong các sản phẩm thịt [41, 66].
Pawar và cộng sự (2000) đã xác định, nisin với nồng độ 400 và 800 IU/g
và kết hợp với 2% NaCl có thể ức chế được L. monocytogenes trong thịt trâu
nguyên liệu cắt mỏng. Các mẫu thịt này được ủ cùng với 10 3 cfu/g L.
monocytogenes và được bảo quản ở 4°C. Số lượng L. monocytogenes đếm
trong mẫu kiểm chứng tăng lên từ 103 tới 106,4 cfu/g sau 16 ngày. Việc bổ
sung nisin với hàm lượng 400 IU/g đã kéo dài thời gian pha tiềm phát của L.
monocytogenes, và ở hàm lượng 800 IU/g làm số lượng L. monocytogenes
giảm xuống 102,4 cfu/g thấp hơn so với mẫu đối chứng sau 16 ngày. Khi nhiệt


19

độ tăng lên 37°C, hiệu quả ức chế của nisin kém đi. Sự có mặt 2% NaCl kết
hợp với nisin đã làm tăng hiệu quả bảo quản của nisin ở cả 2 nhiệt độ [15].
Cutter và Siragusa (1994) đã đánh giá khả năng bảo quản của nisin đối
với sản phẩm thịt bò. Thịt bò tươi được bổ sung khoảng 10 4 cfu/cm2 chủng vi
khuẩn Brochothrix thermosphacta, Carnobacterium divergens hoặc L.

innocua. Nisin được phun trực tiếp lên bề mặt thịt bò tươi với hoạt tính (5000
AU/ml) làm giảm mật độ tế bào khoảng 101,8 - 10 3,5 cfu/cm2 sau ngày đầu tiên
và 102,0 - 103,6 cfu/cm2 sau khi bảo quản ở 4°C sau 1 ngày [17].
Fang và Lin (1994) tìm ra rằng việc bổ sung 10000 IU/ml nisin vào thịt
lợn thăn ức chế được sự phát triển của L. monocytogenes, nhưng khơng có tác
dụng đối với Pseudomonas fragi. Nisin tỏ ra hiệu quả hơn hẳn khi sử dụng kết
hợp với kỹ thuật bao gói điều chỉnh mơi trường xung quanh thực phẩm
(modified atmosphere packaging - MAP) với thành phần khí quyển gồm
100% CO 2 hoặc 80% CO 2 + 20% không khí. MAP và nisin với nồng độ
(1000 hoặc 10000 IU/ml) ức chế sự phát triển của cả 2 vi sinh vật, và người ta
cũng thấy rằng hiệu quả kết hợp của MAP/nisin tốt hơn ở nhiệt độ 4°C so với
20°C [24].
Nitrit là một phụ gia được sử dụng trong các sản phẩm thịt để đảm bảo
giữ màu đỏ và ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây hư hỏng và gây độc
như C. botulinum. Tuy nhiên nitrit có thể phản ứng với các amin bậc 2 trong
thịt hình thành các tác nhân gây ung thư nitrozamin. Chính do tác hại này của
nitrit mà hiện nay các nhà nghiên cứu đang cố gắng tìm kiếm các chất khác
thay thế cho nitrit, trong đó bacterioxin là một lựa chọn. Rayman và các cộng
sự (1981) đã sử dụng kết hợp 3000 IU/g nisin và 40 ppm nitrit để ức chế gần
như hoàn toàn sự phát triển của bào tử Clostridium sporogenes trong sản
phẩm thịt nghiền ở nhiệt độ 37°C trong 56 ngày [61].