Báo cáo thực hành thiết bị và kỹ thuật cnsh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HCM
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
NHĨM 10

XÁC ĐỊNH NẤM MALASSEZIA GÂY BỆNH LANG
BEN Ở NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR
SEQUENCING

MÔN HỌC: THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GVHD: TS. HUỲNH VĂN BIẾT

TP. Thủ Đức, ngày 25 tháng 10 năm 2023

1


THÀNH VIÊN NHĨM
VÕ HỒNG PHONG

21126464

NGUYỄN ĐỨC LỢI

21126398

VÕ HỒNG PHẨM

21126154

2

NỘI DUNG BÁO
CÁO

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NẤM MALASSEZIA
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ BỆNH LANG BEN
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU

3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NẤM
MALASSEZIA

4


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NẤM
MALASSEZIA
1.1. Vài nét lịch sử

1.2. Đặc điểm

1.3. Tác động đến bệnh
da

1.4. Một số bệnh lý

5

1.1. Vài nét lịch sử

1853

1874

1951

1995 - 1996

2004

Robin phát hiện
hình thái sợi nấm

Malassez mô tả tác
nhân gây
bệnh

Gordon đã nuôi cấy
thành công nấm P.

ở thương tổn bệnh
nhân lang ben,
đặt
tên
là
Microsporum

furfur.

lang ben là những
tế bào hình trịn
hoặc bầu dục, vỏ
dày, xung quanh
có viền kép, tập
trung
thành
đám
,đặt tên là

orbiculare
và
P.
ovale.
dưới tên
chung là M. furfur.

Ứng dụng thành
công công nghệ
sinh hoc phân tử
giải mã trình tự bộ
gen các lồi nấm
phụ thuộc lipid,
đặt tên chung là

Các nhà khoa học
Nhật Bản cơng bố
một số lồi mới: M.

dermatis;
M.
japonica;
M.
yamatoensis;...

Malassezia spp.

Malassezia furfur.

=> Và cho đến nay tổng số lồi Malassezia được y văn cơng nhận lên
tới 14 loài.
6


1.2. Đặc điểm của nấm
Malassezia
Đặc điểm
Phân loại khoa
khọc
Cấu trúc

Nội dung
Thuộc ngành Basidomycota, phân
Malasseziales, họ Malasseziacae.

ngành

Ustilaginomycotina,

lớp

Exobasidomycetes,

Đơn bào, có nhân chuẩn.

Hình dạng

Hình trịn hoặc hình bầu dục, vách ngăn rộng, khơng màu, đơi khi gặp dạng sợi hoặc vơ định hình.

Kích thước

Dao động từ 3-10 mm, thông thường lớn hơn gấp 10 lần so với vi khuẩn.

Khả năng thích
nghi

bộ

+ Thích nghi mơi trường đường cao
+ Tồn tại trong thiên nhiên, trong các môi trường chứa đường như hoa quả, rau dưa, mật mía.

Sinh sản

Sinh sản vơ tính theo phương thức nảy chịi. Khi bào tử chòi được sinh ra theo dạng tuyến tính
khơng phân cắt thì hình thành nên cấu trúc goi là giả sợi nấm.

Các lồi

Có 14 lồi Malassezia trên da người và động vật, trong đó 3 lồi gặp nhiều nhất là M. globosa, M.

sympodialis, M. Furfur.

7


1.3. Tác động của Malassezia trong
bệnh da
• Có thể tồn tại vi hệ ở da.
• Tác động chức năng tế bào sắc tố dẫn đến sự thay đổi màu sắc dát
của da.
• Kích thích q trình viêm qua đáp ứng miễn dịch dịch thể.
• Gây ra các đáp ứng miễn dịch dịch thể .
• Kích thích tế bào viêm và phá hủy nang lông.
8


1.4. Một số bệnh lý do nấm Malassezia

Hình 1.1. Bệnh viêm da
đầu

Hình 1.3. Bệnh viêm nang
lơng

Hình 1.2. Bệnh viêm da cơ
địa

Hình 1.4. Bệnh nấm
móng

9


CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ BỆNH
LANG BEN

10


CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ BỆNH LANG
BEN
2.1. Khái niệm bệnh lang ben
2.2. Chẩn đoán bệnh lang ben
2.3. Xác định Malassezia trong bệnh lang
ben
11


2.1. Khái niệm bệnh lang
ben

Lang ben (Pityriasis versicolor) là bệnh
nấm

nông

ở

da,

căn

nguyên

do

Malassezia spp.
Đặc trưng bởi dát hình trịn hoặc bầu
dục, thay đổi màu sắc da trên có vảy da
ẩm mỏng, các tổn thương có thể đứng
rải rác hoặc liên kết với nhau thành đám,
tập trung chủ yếu ở vùng da giàu bã
nhờn ở phần trên cơ thể kèm theo ngứa.

Hình 2.1. Bệnh lang ben
12


2.2.Chẩn đoán bệnh lang ben

Chẩn
đoán
lâm sàng

Cận
lâm
sàng
13

2.2.1. Chẩn đốn lâm sàng

Hình 2.2. Thay đổi sắc tố da. (a)
Dát tăng sắc tố; (b) Dát giảm sắc

Thương tổn cơ bản: các dát, mảng hình trịn
hoặc bầu dục, bắt đầu bằng những chấm
màu hồng, nâu hoặc trắng trên da. Các chấm
lớn dần, lan rộng và liên kết với nhau thành
mảng ranh giới rõ rệt với da lành.
Thương tổn đặc trưng bởi sự thay đổi màu
sắc da, có thể tăng hoặc giảm sắc tố, đôi khi
dát hỗn hợp tăng và giảm sắc tố. Màu sắc
tổn thương hay gặp nhất là màu nâu (tăng
sắc tố) và trắng (giảm sắc tố)
Triệu chứng: ngứa, ngứa tăng lên khi ra mồ
hôi đôi khi cảm giác ngứa râm ran. Có thể
khơng ngứa hoặc cảm giác ngứa thoáng qua.
14


2.2.2. Cận lâm sàn
XÉT NGHIỆM TRỰC
TIẾP
Dùng KOH 20% +
ParkerTM blue black
ink tỷ lệ (1:2) soi trực
tiếp dưới kính hiển
vi.

NI CẤY, ĐỊNH DANH

PCR SEQUENCING

Ni cấy trên mơi
trường dinh dưỡng
thích hợp và định
danh
loài
Malassezia
gây
bệnh.

Dựa trên đoạn DNA
đặc trưng nhằm xác
định loài nấm.

Nhận định hình thái,
số lượng và mật độ
Malassezia.
15


2.3. Xác định Malassezia trong bệnh lang
ben
2.3.1. Soi trực tiếp tìm nấm
2.3.2. Ni cây, định danh
2.3.3. Phân tích phân tử và PCR

16

2.3.1. Soi trực tiếp tìm
nấm
• Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, kết

quả

nhanh và giúp bác sĩ lâm sàng chẩn đốn sơ
bộ vi nấm gây bệnh.
• Nhược điểm: kết quả còn phụ thuộc vào kinh
nghiệm và kỹ thuật xét nghiệm tìm nấm.
• 2 bước quan trọng nhất: bộc lộ lớp vỏ dày
bao quanh tế bào nấm và nhận định hình
thái vi nấm dưới kính hiển vi.
• Dung dịch kiềm: KOH 10%, KOH 20%, NaOH
10%.
• Thuốc nhuộm: ParkerTM blue black ink,
ParkerTM black ink, Chicago sky blue 6B,
Calcofluor white.

Hình 2.3. ”Spaghettie and meatball”
soi trực tiếp bằng KOH + ParkerTM Ink
17


2.3.2. Nuôi cấy, định danh
Là “tiêu chuẩn vàng” trong xác định căn nguyên vi sinh vật, trong đó đặc biệt
xác định chính xác lồi Malassezia gây bệnh.
Bệnh phẩm: vảy da của bệnh nhân lang ben.

Môi trường nuôi cấy: thạch Sabouraud, thạch m-Dixon, thạch LeemingNotman.

THẠCH SABOURAUD

THẠCH M-DIXON

THẠCH LEEMING - NOTMAN

18


2.3.3. Phân tích phân tử và
PCR
Các phương pháp

So sánh

PCR từ vảy da

PCR từ khuẩn lạc

Phương pháp: “dấu vân

So với nuôi cấy định

Ưu điểm: đơn giản hơn,

Ưu điểm: xác định chính

tay” DNA; RAPD; AFLP;

danh, phương pháp dễ

bệnh phẩm đươc lấy vào

xác loài Malassezia với

DGGE; PFGE; kỹ thuật

thực hiện hơn, giúp xác

dung dịch đặc biệt, sau đó

độ nhạy và độ đặc hiệu

sử dụng các kỹ thuật PCR

cao.

chỉ thị PCR chuỗi đặc
trưng; RFLP; PCR-SSCP;
PCR-Realtime;
Sequencing.

PCR

định

chính

Malassezia.

xác

lồi

khác nhau để xác định
lồi.
Nhược

thời gian, tính thực tiễn
điểm:

độ

nhạy

khơng cao, phụ thuộc vào
môi trường bảo quản bệnh
phẩm.

Nhược điểm: cần nhiều

không cao, có thể áp
dụng trong các cơ sở có
tính nghiên cứu.

19

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU

20