Báo cáo thực hành thiết bị và kỹ thuật cnsh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG VI TẢO CHLORELLA
VULGARIS LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT BIODIESEL

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN NGỌC ANH
HOÀNG KHÁNH NHƯ

Mã số sinh viên

: 21126012
21126450

Niên khóa

: 2021-2025

TP.Thủ Đức, 10/2023


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG VI TẢO CHLORELLA
VULGARIS LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT BIODIESEL

Giarng viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

HUỲNH VĂN BIẾT

NGUYỄN NGỌC ANH
HOÀNG KHÁNH NHƯ

TP. Thủ Đức, 10/2023
ii


TÓM TẮT
Vi tảo đang là một đối tượng đầy tiềm năng nghiên cứu phổ biến trên thế giới cho mục
tiêu sản xuất nhiên liệu sinh học. Một trong số các nhiên liệu sinh học đang được
nghiên cứu là biodiesel và phương pháp được quan tâm hiện nay là lấy lipid từ vi tảo
để làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất biodiesel. Vì vậy, các biện pháp nhằm nâng
cao năng suất lipid của vi tảo được đặc biệt chú trọng. Trong đề tài này, khảo sát ảnh
hưởng của các điều kiện ni trồng trong phịng thí nghiệm như tốc độ sục khí CO2,
nồng độ dinh dưỡng Nitơ, cường độ ánh sáng đến năng suất sinh khối và hàm lượng
lipid trên vi tảo Chlorella Vulgaris. Đây là một trong các chủng vi tảo tiềm năng cho

mục tiêu kết hợp xử lý nước thải, tận dụng CO2 từ khí thải và phù hợp với điều kiện
khí hậu Việt Nam. Kết quả ban đầu cho thấy, việc tăng cường độ chiếu sáng và giảm
nồng độ Nitơ có thể tăng hàm lượng lipid nhưng giảm năng suất sinh khối. Đồng thời,
việc bổ sung CO2 vào môi trường cho phép tăng năng suất sinh khối và lipid.

iii


MỤC LỤC
Trang
TÓM TẮT .............................................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................................................. vii
CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ......................................................................................................................... 2
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................................. 3
2.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................................................ 3
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................................... 4
2.2.1. Phương pháp đo mật độ quang OD ........................................................................................... 4
2.2.2. Phương pháp đo nồng độ Chlorophylla ..................................................................................... 4
2.3. Phương pháp bảo quản giống ....................................................................................................... 5
2.4. Phương pháp nuôi trồng ................................................................................................................ 5
2.5. Phương pháp thu hoạch SK .......................................................................................................... 5
2.6. Phương pháp ly trích lipid............................................................................................................. 5
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................................... 6
3.1. Ảnh hưởng của CO2 đến sinh trưởng và tích lũy lipid ............................................................... 6
3.2. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sinh trưởng và tích lũy lipid ....................................... 7

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN ..................................................................................................................... 8
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................................... 9

iv


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
SK: Sinh khối
OD: Optical density

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. SK và lipid của tảo dưới ảnh hưởng của tốc độ sục khí CO2
Bảng 2. Kết quả SK và lipid trong các mẫu nước thải pha loãng

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh tảo Chlorelle Vulgaris
Hình 3.1. Vai trò của CO2 đối với sự sinh trưởng của tảo

vii


CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

Nhu cầu phát triển nhiên liệu thay thế cho nhiên liệu có nguồn gốc từ nhiên liệu hóa
thạch là xu hướng phát triển của tương lai. Nhiên liệu hóa thạch khơng chỉ làm hạn chế
nguồn tài nguyên mà việc đốt chúng còn tạo ra carbon dioxide, một trong những nguyên
nhân gây ra hiện tượng nóng lên toàn cầu.
Một trong những nguồn năng lượng quan trọng nhất là nhiên liệu lỏng như xăng và dầu
diesel. Động cơ diesel được sử dụng rộng rãi để vận chuyển, cung cấp năng lượng cho
thiết bị và sản xuất điện và Hoa Kỳ sử dụng hơn 50 tỷ gallon dầu diesel mỗi năm. Các
lựa chọn thay thế cho động cơ diesel phải ở dạng lỏng, tương thích với các động cơ được
sử dụng hiện nay, có tính cạnh tranh về mặt kinh tế và có đủ số lượng. Tình cờ thay,
động cơ do diesel thiết kế chạy lần đầu tiên vào năm 1893 và hai trong số các loại nhiên
liệu được đề xuất cho động cơ này là dầu có nguồn gốc từ thực vật (dầu lạc) và than
nghiền thành bột. Dầu có nguồn gốc từ thực vật đã được sử dụng thay thế cho dầu diesel
khi nguồn cung hạn chế nhưng dầu tỏ ra quá nhớt để sử dụng kéo dài. Do đó, dầu thực
vật phải được biến tính trước khi sử dụng, chủ yếu là để giảm độ nhớt của chúng và bốn
phương pháp đã được sử dụng để đạt được điều này; trộn với dầu diesel, hình thành các
vi nhũ tương của dầu, dầu diesel, nước và chất hoạt động bề mặt, nhiệt phân và chuyển
hóa este. Q trình este hóa chéo phân hủy dầu thực vật thành các axit béo cấu thành
của chúng, làm giảm đáng kể độ nhớt của chúng và sản phẩm được gọi là dầu biodiesel.
Hiện nay, nguyên liệu sản xuất biodiesel ở Việt Nam là các nguồn sinh khối (SK) truyền
thống (dầu ăn phế thải, mỡ cá basa, dầu hạt jatropha) có nhiều nhược điểm như thu
hoạch khó khăn, hàm lượng dầu thấp và chiếm nhiều diện tích đất canh tác, đất rừng và
cần nhiều nước tưới.
Để khắc phục các nhược điểm đó, SK vi tảo đã ra đời và được xem là nguồn SK đầy
hứa hẹn để sản xuất biodiesel. Vi tảo là các vi sinh vật đơn bào, sinh trưởng bằng quang
tự dưỡng nhờ quá trình quang hợp, hoặc dị dưỡng, hoặc cả hai hình thức. So với các
nguồn SK truyền thống, vi tảo có những ưu điểm nổi bật như tốc độ sinh trưởng nhanh,
năng suất thu SK và thu dầu cao hơn các loại thực vật có dầu khác; dễ ni trồng, ít cạnh
tranh với đất nơng nghiệp và không cần nguồn nước sạch; thân thiện với môi trường.

Trung bình sản xuất 1 kg SK tảo thì tiêu thụ được 1,83 kg CO2. Ngồi ra, có thể tận
dụng CO2 từ khí thải cơng nghiệp cùng với nước thải để nuôi trồng vi tảo, làm giảm


đáng kể chi phí cho q trình; nguồn SK vi tảo ngồi mục đích sản xuất biodiesel cịn
có nhiều ứng dụng khác,... lượng dầu dao động từ 5-58% khối lượng. Do vậy, với định
hướng là tận dụng nguồn khí thải CO2 và nước thải từ hầm ủ biogas để nuôi trồng vi tảo
sản xuất biodiesel, chọn Chlorella Vulgaris là chủng vi tảo để nghiên cứu ảnh hưởng
của một số điều kiện nuôi trồng đến năng suất thu hồi dầu, đồng thời định hướng nuôi
trong môi trường nước thải.
1.2.

Mục tiêu của đề tài

Sự cạn kiệt của các nguồn năng lượng hóa thạch cùng với sự gia tăng những hậu quả
của ô nhiễm môi trường là động lực thúc đẩy thế giới tìm ra các giải pháp hiệu quả cho
vấn đề năng lượng và mơi trường. Sự ra đời của biodiesel nói riêng và nhiên liệu sinh
học nói chung đều bắt nguồn từ thực tiễn đó.
1.3.

Nội dung thực hiện

Tận dụng nguồn khí thải CO2 và nước thải từ hầm ủ biogas để nuôi trồng vi tảo sản xuất
biodiesel, chúng tôi chọn Chlorella Vulgaris là chủng vi tảo để nghiên cứu ảnh hưởng
của một số điều kiện nuôi trồng đến năng suất thu hồi dầu

2


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Hình 1.1. Hình ảnh tảo Chlorelle Vulgaris

Chủng Chlorella Vulgaris với kích thước tế bào từ 5-10 µm, là một trong các chủng vi
tảo được nghiên cứu nhiều nhất cho mục tiêu sản xuất biodiesel. Chlorella Vulgaris là
một loài vi tảo xanh thuộc bộ phận Chlorophyta.
Sản lượng hàng năm của các loài Chlorella khác nhau trên thế giới là 2000 tấn (trọng
lượng khô) vào năm 2009, với các nhà sản xuất chính là Đức, Nhật Bản và Đài Loan.
C. Vulgaris là ứng cử viên cho sản xuất thương mại do có sức đề kháng cao trước các
điều kiện bất lợi và sinh vật xâm nhập. Ngoài ra, việc sản xuất các đại phân tử hữu cơ
khác nhau được quan tâm (protein, lipid, tinh bột) khác nhau tùy thuộc vào kỹ thuật
được sử dụng để tạo sinh khối và do đó có thể nhắm mục tiêu. Trong những điều kiện
khắc nghiệt hơn, sinh khối giảm nhưng hàm lượng lipid và tinh bột lại tăng. Trong điều
kiện đầy đủ chất dinh dưỡng và ánh sáng, hàm lượng protein tăng lên cùng với sinh
khối. Các kỹ thuật tăng trưởng khác nhau đã được phát triển. Các phương thức tăng
trưởng khác nhau (tự dưỡng, dị dưỡng và hỗn hợp) đã được nghiên cứu đối với Chlorella
Vulgaris ; Sự tăng trưởng tự dưỡng được ưa chuộng vì nó khơng cần cung cấp carbon
3


hữu cơ tốn kém và dựa vào các nguồn carbon vô cơ (CO2 , cacbonat) và ánh sáng để
quang hợp. Chlorella sp. được trồng trong phân lợn đã được tiêu hóa và xử lý trước
bằng màng có khả năng cải thiện hiệu suất môi trường tăng trưởng của việc nuôi cấy vi
tảo về mặt năng suất sinh khối cuối cùng , cho thấy rằng sự phát triển của tảo phụ thuộc
vào độ đục của dịng tiêu hóa lỏng hơn là vào lượng dinh dưỡng sẵn có của chúng.
Chlorella Vulgaris là vi tảo được lựa chọn cho một số quy trình xử lý sinh học . Nhờ
khả năng loại bỏ nhiều loại chất gây ô nhiễm như chất dinh dưỡng vô cơ (nitrat, nitrit,
photphat và amoni), phân bón, chất tẩy rửa, kim loại nặng, thuốc trừ sâu, dược phẩm và
các chất ô nhiễm mới nổi khác từ nước thải và nước thải, carbon dioxide và các chất ơ

nhiễm khí khác từ khí thải, bên cạnh tốc độ tăng trưởng cao và yêu cầu canh tác đơn
giản, Chlorella Vulgaris còn nổi lên như một loại vi sinh vật tiềm năng trong các nghiên
cứu xử lý sinh học nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
C. Vulgaris được coi là nguồn năng lượng sinh học đầy hứa hẹn . Nó có thể là giải pháp
thay thế tốt cho cây trồng nhiên liệu sinh học như đậu tương, ngơ hoặc hạt cải dầu vì nó
có năng suất cao hơn và không cạnh tranh với sản xuất lương thực. Nó có thể tạo ra một
lượng lớn lipid , gấp 20 lần so với các loại cây trồng có cấu hình phù hợp để sản xuất
dầu diesel sinh học. Loại vi tảo này cũng chứa hàm lượng tinh bột cao , tốt cho việc sản
xuất ethanol sinh học .
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp đo mật độ quang OD
Mục đích định tính nồng độ SK trong môi trường, dựa vào độ hấp thụ quang của các sắc
tố Chlorophyll trong tế bào. Các sắc tố này hấp thụ chủ yếu 2 bước sóng tương ứng là
420 nm và 665 nm
2.2.2. Phương pháp đo nồng độ Chlorophylla
Dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng của các loại sắc tố ở những bước sóng nhất định để
xác định hàm lượng của chúng có trong mẫu. Mẫu được ly tâm 15.000 vòng/phút ở 40oC
trong 5 phút để thu SK mẫu. Phần SK này được bổ sung 1ml acetone vào ống eppendorf.
Sau đó, đem ly tâm 13.000 vịng/phút ở 40oC trong 5 phút. Lấy dịch nổi và đo ở bước
sóng 664 nm, 647 nm. Áp dụng công thức xác định nồng độ chlorophyll a:
Chlorophyll a (µg/ml) = 11,93.E664 – 1,93.E647

4


2.3. Phương pháp bảo quản giống
Giữ giống bằng phương pháp bảo quản trên đĩa thạch dài hơn, đồng thời việc hoạt hóa
giống dễ dàng hơn.
2.4. Phương pháp ni trồng
Tiến hành các thí nghiệm ni trồng vi tảo trong bình Erlen, dung tích ni 1 lít. Thể

tích giống cho vào chiếm 10% thể tích mơi trường. Giống sử dụng là giống cấp 1 được
nhân trong vịng 7 ngày. Các mẫu thí nghiệm được chiếu sáng bằng ống đèn huỳnh
quang 20W, chu kỳ chiếu sáng 12h sáng:12h tối, quang thông được đo bằng máy
Advance Light Meter. Nhiệt độ thí nghiệm được duy trì ở 27- 280oC. Khảo sát sinh
trưởng bằng cách đo OD cùng một thời điểm trong từng ngày nuôi trồng. Tiến hành thu
hoạch SK khi sinh trưởng đi vào giai đoạn suy vong.
2.5. Phương pháp thu hoạch SK
Mẫu được ly tâm bằng máy ly tâm Hettich ZENTRIFUGEN với tốc độ 6.000 vòng/phút,
trong 10 phút. Sau khi ly tâm, mẫu được sấy khô ở 500oC đến khối lượng không đổi.
2.6. Phương pháp ly trích lipid
Mẫu SK khơ được bổ sung hỗn hợp CH3OH, CHCl3, sau đó được siêu âm để phá vỡ
màng tế bào ở tần số sóng 20 kHz trong 10 phút rồi được bổ sung nước và ly tâm 6.000
vòng/phút trong 10 phút để phân thành 3 lớp: lớp MeOH và nước ở trên, lớp SK ở giữa,
dưới cùng là lớp Chloroform và lipid hòa tan. Phần Chloroform và lipid ở dưới được
chiết và chưng cất để thu lipid. Thể tích tổng dung mơi bổ sung vào mẫu SK được lấy
theo quy tắc 100 ml dung môi trên 1 gam SK. Tỷ lệ thể tích dung mơi bổ sung là
CH3OH:CHCl3:H2O = 10:10:9

5


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của CO2 đến sinh trưởng và tích lũy lipid
Ta khảo sát vai trò của CO2 đối với sinh trưởng bằng cách tiến hành thực nghiệm trên
3 mẫu: (1) hồn tồn khơng sục khí; (2) chỉ sục khơng khí; (3) sục khơng khí và CO2,
dưới ánh sáng 4.000 lux. Kết quả trên hình 1 cho thấy sự có mặt của CO2 trong môi
trường làm tăng tốc độ sinh trưởng cũng như năng suất thu SK và lipid.

Hình 3.1. Vai trị của CO2 đối với sự sinh trưởng của tảo

Để khảo sát chi tiết ảnh hưởng của tốc độ sục khí CO2, ta tiến hành 3 thí nghiệm dưới
ánh sáng 7.000 lux, tốc độ sục khơng khí là 650 ml/phút. Các mẫu khác nhau về tốc độ
sục khí CO2: 20, 40, 60 ml/phút. Kết quả cho thấy chu kì sống của tảo là 17 ngày. Mật
độ SK lớn nhất vào ngày thứ 14, ứng với giá trị cực đại của pha cân bằng.
Kết quả trên bảng 1 cho thấy, SK thu được và hàm lượng lipid đều giảm dần khi tốc độ
sục CO2 tăng từ 20ml/phút đến 60ml/phút. Điều này cũng cho thấy CO2 cũng có ảnh
hưởng ức chế đến sinh trưởng ở nồng độ quá lớn. Khi phân tích thành phần của mẫu
lipid thu được từ mẫu sục CO2 bằng máy phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC

6


Bảng 1. SK và lipid của tảo dưới ảnh hưởng của tốc độ sục khí CO2

3.2. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sinh trưởng và tích lũy lipid
Chu kỳ sáng tối thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và tích lũy lipid đối với Chlorella
Vulgaris là 16h sáng : 8h tối. Cường độ ánh sáng là một trong những yếu tố ảnh hưởng
quan trọng nhất đến sự quang hợp của tảo.

7


CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN
Sự thay đổi các điều kiện nuôi trồng như cường độ chiếu sáng, tốc độ sục khí CO2 và
nồng độ N (NH4+) ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả thu SK và lipid. Kết quả ban đầu cho
thấy, các điều kiện nuôi trồng: Ánh sáng 7.000 lux, 600 mg NH4Cl/lít và tốc độ sục khí
20 ml CO2/phút kết hợp với sục 650 ml khơng khí/phút cho kết quả khả quan. Chất
lượng của lipid thu được khá phù hợp cho mục tiêu sản xuất biodiesel.

8

TÀI LIỆU THAM KHẢO
TUẤN, N. M., LÊ THỊ BÍCH, Y. Ế. N., HẢI, N. P., XUÂN, N. T. T., HOÀNG, Đ. K.,
MINH, N. H., & TUÂN, N. N. Nghiên cứu nuôi trồng vi tảo Chlorella vulgaris.
Tuân, K. N. N. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI TRỒNG
ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ NĂNG SUẤT THU DẦU CỦA VI TẢO CHLORELLA
VULGARIS NHẰM LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT BIODIESEL.
en.wikipedia.org/wiki/Chlorella_vulgaris
/>
9