Đề cương ôn tập Điện di và các phương pháp sắc ký

ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP ĐIỆN DI VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
Lớp D4. Học kỳ II. Năm học 2017 – 2018
---*--Câu 1: Các thông số sắc ký, các bài tập liên quan?
Thời gian lưu (tR): là thời gian từ lúc chất tan được nạp vào cột tách ở bộ phận tiêm
mẫu cho đến lúc chất ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại.
+ Có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất.
+ Thể tích lưu VR là thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan từ thời điểm
đưa mẫu vào, đi qua cột và đến detector
VR = tR.FC
L = u.tR (L= u.tM)
Với: FC là tốc độ thể tích dịng (thể tích pha động trên một đơn vị thời gian)
u là tốc độ tuyến tính trung bình của pha động/ chất tan
+ Thể tích lưu hiệu chỉnh hoặc thời gian lưu hiệu chỉnh được cho bởi:
V’R = VR – VM hoặc t’R = tR - tM
+ Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
 Bản chất của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp của hạt nhồi.
 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động
 Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế
 pH của pha động, nồng độ chất tạo phức
- Hệ số phân bố (K): đặc trung cho sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha
tĩnh
𝑪𝑺
K=
𝑪𝑴

Với: CS, CM là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động tương ứng
+ K càng lớn, sự di chuyển chất tan qua pha tĩnh càng chậm.
+ Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách
chất diễn ra càng dễ dàng hơn.
- Hệ số dung lượng (k’): là đại lượng cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan phân
bố vào pha tĩnh và pha động.

𝑽𝑺.𝑪𝑺
𝑽𝑺
𝒕′𝑹
𝒕𝑹−𝒕𝑴
𝑽𝑹−𝑽𝑴
k’=
= K.
=
=
=
𝑽𝑴.𝑪𝑴

𝑽𝑴

𝒕𝑴

𝒕𝑴

𝑽𝑴

Với: K là hệ số phân bố
VS, VM là thể tích pha tĩnh và pha động
tR, tM là thời gian lưu của chất cần phân tích và chất khơng lưu giữ
Cần chọn điều kiện sắc ký sao cho k’ nằm trong khoảng 1 ≤ 𝑘 ′ ≤ 5
- Hệ số chọn lọc (): đặc trưng cho tốc độ di chuyển của hai chất.
𝑡′𝑅𝐵
𝑘′𝐵
𝐾𝐵
=
=

=
𝑡′𝑅𝐴

𝑘′𝐴

𝐾𝐴

Theo quy ước, B là chất lưu giữ mạnh hơn A nên  luôn lớn hơn 1.
Như vậy để tách riêng hai chất A và b thì  phải >1 (1,05- 2)

1


Câu 2: Lý thuyết đĩa và lý thuyết động học trong phân tách sắc ký
- Lý thuyết đĩa
o Mặc dù quá trình xảy ra trong cột là một quá trình xảy ra liên tục nhưng theo mơ
hình của Craig, ơng cho rằng đó là những bước nối tiếp riêng biệt. Các bước này tái
lập lại tuần hoàn theo sự di chuyển của các cấu tử trong cột. Mỗi bước tương ứng
với một trạng thái cân bằng mới gọi là đĩa lý thuyêt
o Có thể giả định cột sắc ký được chia thành N phần mỏng/ N lớp/ N đĩa tách. Ở mỗi
đĩa có sự phân bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng mới
o Khả năng tách các cấu tử của một hỗn hợp của một cột được cải thiện nếu giảm
chiều cao một đĩa lý thuyết. Các chất tan khi dịch chuyển qua cùng một cốt tách có
chiều cao đĩa lý thuyết khác nhau bởi vì chúng có hệ số khuếch tán khác nhau
o Chiều cao đĩa lý thuyết H là một hằng số giữa phương sai σ2 của dải chất tan và
khoảng cách x mà nó di chuyển. Tên gọi này là từ lý thuyết đĩa trong đó sự tách
được thực hiện trong những giai đoạn rời rạc được gọi là đĩa tách
H=

σ2

𝐿

Chiều cao một đĩa lý thuyết khoảng 0.1 đến 1mm trong sắc ký khí và khoảng 10µm trong
sắc ký lỏng hiệu năng cao và nhỏ hơn 1µm trong sắc ký điện di mao quản
- Lý thuyết động học
o Lý thuyết đĩa chưa xem xét đến các yếu tố trong và ngoài cột ảnh hưởng đến pic sắc
ký, làm giãn pic
o Sự dỗng pic phụ thuộc nhiều vào q trình độc học và nhiệt động học xảy ra trong
cột: chất tan khuếch tán ngang và dọc theo pha động, tốc độ thiết lập cân bằng phân
bố của chất tan vào hai pha, sự khuếch tán chất tan trong pha tĩnh, sự không đồng
nhất của các dòng chảy…
o Ảnh hưởng của dòng chảy và các thông số động học khác được mô tả bằng phương
trình Van Deemter có dạng như sau:
H=A+

𝐵
𝑢

+ C.u

H là chiều cao đĩa lý thuyết
u là tốc độ dòng tuyến tính của pha động
A mơ tả ảnh hưởng của sự khuếch tán xốy do các dịng chảy khơng đều của pha
động qua pha tĩnh, kích thước hạt pha tĩnh to và khơng đều thì A lớn dẫn đến sự
dỗng pic lớn
B/u mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán dọc theo cột của chất tan trong pha động, B
phụ thuộc vào kỹ thuật nhồi cột
C.u mô tả sự chuyển khối ( do ảnh hưởng của sự di chuyển không đều của chất tan
trong lòng pha động, ở vùng tiếp giáp 2 pha và trong lịng pha tĩnh
* Khuếch tán xốy: Hệ số khuếch tán xoáy A = 2.λ.dp

- Hệ số A độc lập với tốc độ dòng pha động khi đi qua pha tĩnh, nhưng đường kính
của hạt nhồi dp và sự khơng đồng đều về kích cỡ có thể tạo ra dịng pha động có
Với

2


những hướng khác nhau khi đi qua. Đây là nguyên nhân gây ra sự doãng pic và ảnh
hưởng đến sự phân bố giữa hai pha
- λ là hàm số phụ thuộc vào độ đồng thể của chất nhồi, dạng hình học và kích thước
của cột
- Ảnh hưởng này thường xảy ra trong LC và khơng có trong GC với cột WCOT
* Khuếch tán dọc: Hệ số khuếch tán dọc theo cột B=2γ.D
- Hệ số khuếch tán dọc theo cột B mô tả sự khuếch tán dọc theo cột và song song với
đường đi pha động
- Hệ số này ảnh hưởng lớn trong GC do chất tan khuếch tán mạnh trong pha khí
- B phụ thuộc vào γ biểu thị cho hệ số trở kháng của chất nhồi đến khuếch tán dọc và
D biểu thị sự khuếch tán chất tan trong pha động
- Thường γ có giá trị là 1 trong GC và 0.7 trong LC
* Sự truyền khối:
- Hệ số truyền khối C bằng tổng hệ số truyền khối (chất tan) trong pha động và pha
tính
- Với CS là hệ số truyền khối trong pha tĩnh và CM là hệ số truyền khối trong pha
động, ta có: C = CS + CM
- Sự truyền khối trong pha tĩnh:
o Nếu pha tĩnh là chất lỏng thị hệ số phụ thuộc vào bề dày lớp hấp phụ
o Nếu pha tĩnh là chất rắn thì nó phụ thuộc vào khả năng hấp phụ và giải hấp phụ
chất tan xảy ra trên bề mặt
- Hệ số truyền khối trong pha động CM:
o Tỷ lệ nghịch với hệ số khuếch tán chất tan trong pha động DM

o Tỷ lệ thuận với bình phương đường kính hạt nhồi
o Tỷ lệ thuận với bình phương đường kính cột và tốc độ chảy của pha động
Câu 3: Ứng dụng của phương pháp sắc ký
- Phân tích định tính
o Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu (sắc ký rửa giải) hoặc vị trí trên pha tĩnh (sắc ký
khai triển) của chất phân tích cùng với điều kiện sắc ký là những thơng tinh định
tính giúp ta khẳng định sự có mặt của chất phân tích trong mẫu
o Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang phổ thường gặp nhiều khó
khăn. Cho nên sắc ký thường dùng để tách các thành phần trước khi phân tích bằng
quang phổ. Mặc khác, định tính bằng sắc ký khơng cho kết quả dương tính chắc
chắn. Vì hai lý do trên, để định tính các chất trong hỗn hợp người ta kết hợp sắc ký
– phổ IR hoặc sắc ký – khối phổ
o Sắc ký khẳng định đúng kết quả âm tính nên thường được dùng để kiểm tra tạp
chất trong mẫu
- Phân tích định lượng
o Phương pháp chuẩn ngoại:
3


 Cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành trong cùng điều kiện
 So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với mẫu chuẩn sẽ tính được
nồng độ của các chất trong mẫu thử
 Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm:
 Chuẩn hỏa một điểm
𝑆𝑋

Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử CX = CS.

𝑆𝑆

Với : CX, CS là nồng độ mẫu thử, chuẩn
SX (HX), SS (HS) là diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử, chuẩn
 Chuẩn hóa nhiều điểm
- Chuẩn bị một dãy chất chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành
sắc ký
- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mơ tả quan hệ giữa diện
tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ của chất cần xác định : Y = a +
b.CX
Với Y là diện tích pic
a là giao điểm của đường chuẩn với trục tung
b là độ dốc của đường chuẩn
CX là nồng độ của chất thử
o Phương pháp chuẩn nội:
 Chất chuẩn nội là chất được thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng
bằng nhau của một chất tinh khiết rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Tỷ
số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội là thơng số phân tích được
dùng để xây dựng đường chuẩn
 Yêu cầu của chất chuẩn nội:
 Chất chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời
gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử
 Có cấu trúc hóa học tương tự như mẫu thử
 Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử
 Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử
 Phải có hệ số tinh khiết cao và dễ kiếm
Hệ số đáp ứng FX: mối tương quan giữa tỷ số khối lượng (hoặc nồng độ)
của chuẩn và chuẩn nội với tỷ số diện tích của hai pic:
Fx =

𝑚𝐶 .𝑆𝐼𝑆
𝑀𝐼𝑆 .𝑆𝐶

=

𝐶𝐶 .𝑆𝐼𝑆
𝐶𝐼𝑆 .𝑆𝐶

Các sai số sẽ được cực tiểu hóa nếu hệ số FX xấp xỉ 1
- Phương pháp chuẩn một điểm:
o Chuẩn nội được thêm vào cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký
o Lượng hoặc nồng độ của thành phần trong mẫu thử được tính như sau:
4


mT =
CT =

𝑆𝑇
𝑆𝐼𝑆
𝑆𝑇
𝑆𝐼𝑆

mIS.FX
CIS.FX

- Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm:
Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa nồng độ chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng
chứa một nồng độ chuẩn nội. Sau khi sắc ký và thu được dữ kiện diện tích, tiến hành
vẽ đường chuẩn biểu thị sự tương quan giữa tỷ số diện tích (hoặc chiều cao) pic của
chuẩn trên chuẩn nội (SS/SIS) với tỷ số nồng độ chuẩn ngoại trên chuẩn nội (CS/CIS)
Câu 4: Các bước phân tích thực nghiệm và ứng dụng của HPTLC?

a) Các bước phân tích thực nghiệm:
Chuẩn bị mẫu phân tích

Lựa chọn bảng mỏng

Đưa mẫu lên bảng mỏng

Pre-washing

Khai triển sắc ký

Hoạt hóa bảng mỏng

Phát hiện
Quét và xử lý, lưu trữ

 Lưu chọn bản mỏng: tùy thuộc chất phân tích
- Trên thị trường có các bản mỏng tráng sẵn với các chất hấp phụ đa dạng, phổ biến
nhất là bản mỏng Silica gel 60F, Alumina, Cellulose…
- 80% các phép phân tích sử dụng bản mỏng Silicagel, có 2 loại:
+ Loại G: silica gel có thêm thạch cao CaSO4.1,5H2O
+ Loại F: có chỉ thị huỳnh quang
- Cellulose: phân tích amino acid, dipeptide, đường và các alkaloid
- Bản mỏng pha đảo RP2, RP8 và RP18: các chất không phân cực như các acid béo,
carotenoid, cholesterol
- Bản mỏng kết hợp RPW F254s: phân tích các chất bảo quản, các barbiturat, thuốc
giảm đau, phenothiazine
 Pre – washing bản mỏng:
- Để tránh ảnh hưởng của các tạp chất và hơi nước có thể có trong khơng khí sau khi
mở hộp và cất giữ trong thời gian dài, người ta khuyến cáo bản mỏng nên được làm

sạch trước khi sử dụng. Quá trình này gọi là pre- washing.
- Pre-washing được thực hiện với các kỹ thuật khác nhau như kỹ thuật lên, nhúng,
liên tục…
- Dung môi sử dụng thường là:
+ Chloroform: Methanol (1:1)
+ Methylene chloride: Methanol (1:1)
+ 1% amonia hoặc 1% acid acetic
5


 Hoạt hóa bản mỏng:
- Bản mỏng trong hộp mới mở khơng cần hoạt hóa
- Bản mỏng đặt trong mơi trường ẩm cao hoặc được cầm trên tay trong thời gian dài
cần được hoạt hóa
- Đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ 110-120℃ trong 30 phút
 Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử: nồng độ mẫu 0,1 – 1ug/ul
- Tránh ảnh hưởng của tạp chất và hơi nước
- Tỷ lệ S/N được cải thiện, đường nền càng thẳng thì LOD càng cao
- Thường dùng dung môi pha mẫu:
+ Methanol
+ Chloroform: Methanol (1:1)
+ Ethyl acetat: Methanol (1:1)
+ Methylene chloride: Methanol (1:1)
+ Chloroform: Methanol: Amoniac (90:10:1)
+ 1% amonia hoặc 1% acid acetic
 Đưa chất phân tích lên bản mỏng:
- Chọn mẫu và thiết bị đưa mẫu lên bản mỏng phụ thuộc vào:
+ Thể tích mẫu
+ Số lượng mẫu( số vết chấm)
- Thể tích mẫu: 0.5-5µl (1 điểm) hoặc 10µl (theo dải)

- Chấm theo dải( áp dụng khi lượng mẫu lớn) cho kết quả phân tách tốt hơn, đáp ứng
tốt khi phân tích cường độ.
- Mẫu thường được đưa lên bằng thiết bị tự động/bán tự động qua các mao quản:
+ Thiết bị đưa mẫu bằng tay NANOMAT: dùng mao quản chính xác để đưa mẫu
+ Thiết bị đưa mẫu bán tự động LINOMAT:
 Thích hợp trong phân tích các mẫu thường quy
 Việc thay đổi mẫu cần có thao tác của con người
 Mẫu được phun lên bản mỏng dưới dạng băng hẹp (dạng dải) dưới tác dụng của
khí N2
 Dung mơi của mẫu bốc hơi gần như hoàn toàn, tập trung mẫu thành một dải hẹp
dài
+ Thiết bị đưa mẫu tự động ATS4:
 Mẫu được đưa lên tự động dưới dạng chấm hoặc dải băng hẹp hoặc dạng chữ
nhật bằng kỹ thuật phun dưới dịng khí N2
 Mẫu đưa lên dưới dạng hình chữ nhật cho phép đưa một thể tích mẫu lớn lên bản
mỏng mà vẫn đảm bảo độ phân tách
 Lựa chọn pha động:
- Nguyên tắc: Thử- Lỗi- Thử
- SK pha thuận:
+ Pha động không phân cực, pha tĩnh phân cực
+ Chất không phân cực di chuyển nhanh hơn
- SK pha đảo:
+ Pha động phân cực, pha tĩnh không phân cực
6


+ Chất phân cực di chuyển nhanh hơn
- Tránh sử dụng hệ pha động chứa nhiều dung môi (3-4)
- Pha động đã sử dụng một lần nên tránh sử dụng lại
 Khai triển sắc ký:

- Bão hịa dung mơi:
+ Buồng sắc ký khơng được bão hịa dung mơi làm cho giá trị Rf cao hơn
+ Sử dụng giấy kéo dung môi lên phân bố hơi dung môi trong buồng
+ giảm giá trị Rf
- Khai triển sắc ký bằng thiết bị tự động:
+ Q trình bão hịa dung mơi, theo dõi q trình khai triển và sấy khơ bản mỏng
được cài đặt và tiến hành hoàn toàn tự động.
+ Khai triển đẳng dòng (ADC), khai triển gradient (AMD).
 Phát hiện vết:
- Phát hiện dưới đèn UV: 254nm hoặc 366nm, quan sát được các chất không bắt
huỳnh quang và bên dưới UV (sử dụng silicagel GF)
- Bình phun sắc ký, buồng phun và thiết bị phun sấy bản mỏng.
 Định lượng và lưu dữ liệu:
- Bản mỏng được quét trên dải bước sóng UV được chọn và tín hiệu các vết được
chuyển thành dưới dạng pic.
- Thiết bị chuyển thông tin các dải băng về dạng pic, các thơng số diện tích/ chiều cao
pic tỷ lệ với nồng độ
- Thiết bị video scan hoạt động theo 2 kiểu: đo độ truyền qua hoặc đo độ tán xạ.
- Phần mềm đi kèm thiết bị
b) Ứng dụng của HPTLC:
- Công nghiệp dược phẩm: kiểm tra chất lượng, đồng đều hàm lượng, kiểm tra tạp
chất, độ tinh khiết, độ ổn định.
- Phân tích thực phẩm: quản lý chất lượng thực phẩm, chất phụ gia, thuốc trừ sâu, thử
nghiệm độ ổn định,…
- Ứng dung trên lâm sàng: nghiên cứu chuyển hóa, sàng lọc thuốc, ngộ độc,…
- Kiểm sốt thuốc giả…
- Phân tích dữ liệu: kiểm sốt chất lượng dược liệu, phân lập chất trong dược liệu,
fingerprint, xác định thành phần trong chế phẩm đông dược:
+ Xác định dấu vân tay dược liệu:
 Vấn đề: dữ liệu thu hái từ nhiều địa phương, thời vụ, nhầm lẫn loài, chi, dữ liệu

giả
 Kỹ thuật dấu vân tay: ghi các thơng tin hóa học của dược liệu và chế phẩm với
các sắc ký đồ, phổ và đồ thị khác bằng các kỹ thuật phân tích hóa học
 Có nhiều phương pháp ghi nhận dấu vân tay: sắc ký, phổ tử ngoại, phổ hồng
ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ…
+ Đánh giá chất lượng dược liệu
+ Xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu thuốc:
 Tầm quan trọng: độ ổn định, độc tính
 HPTLC là một trong những PP giúp đánh giá tạp chất trong nguyên liệu.
7


Câu 5: So sánh sắc khí lớp mỏng hiệu năng cao với sắc khí lớp mỏng và sắc khí lỏng
hiệu năng cao?
So sánh sắc khí lớp mỏng hiệu năng cao và sắc khí lỏng hiệu năng cao
Tiêu chí
HPTLC
HPLC
Pha động
Lỏng
Lỏng
Pha tĩnh
Rắn
Rắn/lỏng
Đọc kết quả
Derector/ mắt
Derector
Phân tích
Off – line
On line

Độ phân giải
Trung bình đến cao
Rất cao
Phân tích song song
Có
Khơng
u cầu áp suất cao
Khơng
Có
Thời gian phân tích
2 – 60 phút
1 – 10 phút
Tạo dẫn xuất sau phân
Dễ dàng, đơn giản, thuận Phức tạp, chi phí cao
tách
lợi, chi phí thấp
Thu thập phân đoạn
Dễ dàng
Cần có hệ thống
colletor(SK điều chế)
Tính chọn lọc
Trung bình đến cao
Cao đến rất cao
Phân tích phổ
Có thẻ
Có
u cầu độ sạch của mẫu Khơng q khắt khe
Rất quan trọng
Phân tích dấu vân tay
Dễ dàng

Hạn chế
Giá thành
Thấp
Rất cao
u cầu bảo dưỡng
Ít
Nhiều
So sánh sắc khí lớp mỏng hiệu năng cao và sắc khí lớp mỏng
Tiêu chí
HPTLC
TLC
Loại bản mỏng
Tráng sẵn
Tự chuẩn bị/ táng sẵn
Bề dày lớp hấp phụ
100 𝜇𝑚
250 𝜇𝑚
Kích thước hạt trung bình 4 – 8 𝜇𝑚
5 – 20 𝜇𝑚
Chiều cao đĩa lý thuyết
12 𝜇𝑚
20 𝜇𝑚
Hiệu lực tách
Cao
Thấp
Thời gian phân tách
Giảm quảng đường di
Kéo dài
chuyển nên giảm thời
gian phân tích

Bản chất pha tĩnh
Đa dạng pha thuận, pha
Silicagel, Aumiana
đảo C8, C18…
Chấm sắc khí
Tự động/bán tự động/ thủ Thủ cơng
cơng
Thể tích chấm mẫu
0,1 – 0,5 𝜇𝑙
1 – 5 𝜇𝑙
Đường kính vết chấm
1 – 1,5 mm
3 – 6 mm
ban đầu
Đường kính vết phân
2 – 5 mm
6 – 15 mm
tách
Thể tích mẫu lớn
Chấm dạng băng dài
Gây hiệ tượng quá tải
Số vết chấm tối đa trên
36
10
một bản mỏng
8


Chế độ quét
Pre- washing

LOD(hấp thụ UV)
LOD(huỳnh quang)
Thời gian khai triển
Độ lăp lại của kết quả
Mục đích

UV – Vis/huỳnh quang
Bắt buộc
100 – 500 pg
5 – 10 pg

Không
Không
1 – 5 pg
50 – 100 pg
Tùy thuộc pha động
Tốt
Thấp
Định tính/định lượng/bán Định tính
định lượng

CÂU 6: CẤU TẠO, NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA HPLC:

Cấu tạo cơ bản của hệ thống HPLC:
- Hệ thống cung cấp pha động ( dung môi pha động).
- Bơm.
- Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hoặc tự động).
- Cột và pha tĩnh.
- Detector.
- Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu.

1. HỆ THỐNG CUNG CẤP PHA ĐỘNG:
 Bình chứa dung mơi:
- Bình chứa dung mơi là bình thủy tinh khơng màu, trung tính, có thể tích từ 100 – 2000 ml,
kín ( tránh bay hơi dung mơi).
 Dung mơi pha động:
- Yêu cầu của dung môi pha động:
+ Tinh khiết

+ Trơ về mặt hóa học

+ Tương thích với detector

+ Hịa tan mẫu phân tích
9

+ Giá thành thấp


- Dung môi bơm vào phải không được chứa các bụi bẩn hoặc những vật lạ, bởi vì điều
này có thể làm ảnh hưởng đến tuổi thọ của bơm và làm kẹt cột tách.
 Vì vậy, cần phải lọc dung môi qua màng lọc 0,45 hoặc 0,22 𝝁m. Các loại màng lọc như:
+ Nước: màng lọc cellulose nitrat, cellulose acetat.
+ Dung môi hữu cơ: màng lọc teflon.
+ Hỗn hợp DMHC và nước: màng lọc RC, polyamid hay nylon.
- Cần phải loại bỏ hoặc đuổi khí hịa tan hay các bọt khí trong dung mơi vì khí hịa tan
có thể làm biến dạng pic và sinh bọt khí làm nhiễu đường nền. Ta có thể loại khí ngay
trong bình chứa dung mơi ( siêu âm, sục khí trơ) hoặc trên dịng chảy của pha động trước
khi dung môi vào bơm.
+ Siêu âm: đuổi khí thừa khỏi dung mơi.
+ Sục khí trơ ( helium): đuổi khí hịa tan khỏi dung mơi.

+ Khử ngay trên dòng ( online membrane degassing).
- pH của dung mơi pha động:
+ Trong phân tích dược, nhiều trường hợp cần điều chỉnh pH pha động bằng đệm pH.
+ Thường sử dụng: đệm phosphat, perchlorate, sulfat,...Một số acid mạnh như: TCA (
trichloroacetate acid), TFA ( trifloroacetate acid).
+ Ảnh hưởng đến độ phân tách và độ chọn lọc của peak.
 Phương pháp rửa giải:
- Có 2 cách rửa giải:
+ Đẳng dịng: Khơng thay đổi thành phần pha động trong q trình rửa giải.
+ Gradient: Tỷ lệ thành phần pha động thay đổi trong quá trình rửa giải.
- Ưu điểm của rửa giải gradient:
+ Rút ngắn thời gian phân tích.
+ Giảm hiện tượng kéo đi, cải thiện hình dạng pic.
+ Tăng độ nhạy phân tích.
2. HỆ THỐNG BƠM:
 Chức năng:
- Chức năng của bơm là vận chuyển pha động đi qua cột tách với một tốc độ xác định.
 Bơm cần đáp ứng một số yêu cầu khá cao về tính năng như sau:
- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên.
10


- Bền với dung mơi pha động.
- Tốc độ dịng có một khoảng rộng để chọn lựa và dễ thay đổi tốc độ dòng.
- Dễ thay đổi từ việc sử dụng dung môi này đến loại dung môi khác.
- Dễ bảo dưỡng và sửa chữa.
 Một số loại bơm thông dụng:
Bơm hai pittong

Bơm kép đẩy kéo

Bơm tứ phân

- Lưu lượng không đổi

- Hai bơm nối đầu

- Áp suất hằng định

- Chung đường pha động môi từ 4 kênh riêng

- Thể tích khơng giới hạn

và đường đến cột

- Cột ln có áp suất

- Lấy đồng thời 4 dung

- Rửa giải gradient
- Tiết kiệm dung môi

không đổi

3. BỘ PHẬN TIÊM MẪU:
 Sử dụng vòng tiêm mẫu:
- Vòng tiêm mẫu hay được sử dụng và có thể tự động hóa.
- Cho phép đưa mẫu vào cột bằng van bơm với thể tích xác định.
- Van bơm có thể hoạt động dưới áp suất cao
- Vịng chứa mẫu có thể tích nhất định nên thể tích mẫu đưa vào cột lúc nào cũng hằng định.

- Lượng mẫu bơm vào vòng tiêm mẫu thường nhiều hơn thể tích của vịng tiêm mẫu ( 10 –
100 mcl).
 Ưu điểm:
- Bơm có thể làm việc dưới áp suất cao, khơng gián đoạn dịng chảy.
- Khơng tắc cột hay bị bẩn.
- Độ lặp lại cao ( sai số khoảng 0.5%).
 Hệ thống tiêm mẫu tự động:
Ngày nay, trên hầu hết các hệ thống HPLC đều được trang bị bộ phận tiêm mẫu tự động,
cho phép tự động hóa q trình tiêm mẫu, dễ dàng thay đổi thể tích tiêm và điều khiển bằng
phần mềm.
4. CỘT SẮC KÝ, PHA TĨNH:
 Đặc điểm của cột sắc ký:
- Cột HPLC thường làm bằng thép không gỷ hay thủy tinh đặc biệt hoặc chất dẻo.
11


- Chiều dài: 10 – 25 cm.
- Đường kính trong: 4 – 10 mm.
- Cỡ hạt pha tĩnh: 3 – 10 mcm.
- Số đĩa lý thuyết: N = 40,000 – 60,000 đĩa/m.
Gần đây, người ta có loại Cột nhỏ - microcolumn: chiều dài 3 – 7,5 cm, đường kính trong 1
– 2 mm, cỡ hạt 1,5 – 5 mcm, N = 100,000 đĩa/m. Ưu điểm nổi bật của chúng là tiết kiệm
dung môi và rút ngắn thời gian sắc ký.
 Chất nhồi cột sắc ký:
- Silica ( sillic dioxide) kết tụ thành silicagel.
- Silicagel được bao một lớp mỏng hữu cơ liên kết ( hóa học hoặc vật lý) với bề mặt.
- Ngồi ra cịn có các chất nhồi khác: Nhôm oxyd, hạt polyme xốp, hạt nhựa trao đổi ion.
 Bộ phận điều nhiệt:
- Có chức năng ổn định nhiệt độ của cột.
- Độ chính xác ± 0,1độ C.

- Cho kết quả phân tách tốt hơn ( trong một số trường hợp).
 Bảo vệ cột/ tiền cột:
- Cột bảo vệ được đặt sau bộ phận tiêm mẫu và trước cột tách để giúp bảo vệ những cột đắt
tiền khỏi sự xâm nhập của các hạt bẩn nhỏ.
- Cột bảo vệ không làm thay đổi hiệu quả tách của cột.
- Được thiết kế với một thể tích tổng cộng tương đối nhỏ và thể tích chết nhỏ, nhờ vậy khơng
làm dỗng pic.
- Cột bảo vệ được nhổi đầy các hạt nhồi tráng phim mỏng hoặc có pha liên kết như trong
cột phân tích.
 Hạt pha tĩnh trong pha liên kết:
- Pha tĩnh được chế tạo từ silica ( silic dioxyde). Nhóm OH trên bề mặt hạt silica phản ứng
với dẫn chất clorosilane tạo ra dẫn chất siloxan. Liên kết siloxan bền ở pH 2-7.
- Gốc R trong dẫn xuất siloxan quyết định tính phân cực của pha tĩnh và loại hình sắc ký là
pha đảo hay pha thuận:
 Sắc ký pha đảo:
+ Pha tĩnh không phân cực: R = C8, C18, phenyl
+ Pha động tương đối phân cực: Nước, MeOH, MeCN.
12


+ Sắc ký pha đảo được sử dụng rộng rãi vì cho kết quả phân tách tốt với nhiều đối tượng (
75% khối lượng sắc ký).
+ Trong sắc ký pha đảo, chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực của
pha động, thời gian lưu tăng lên.
 Sắc ký pha thuận:
+ Pha tĩnh phân cực: R = cyano, amino, diol.
+ Pha động ít phân cực: Ethyl ether, cloroform, n-hexan.
+ Trong sắc ký pha thuận, chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ phân
cực của pha động, thời gian lưu giảm dần.
5. DETECTOR:

 Chức năng:
- Chức năng của detector là phát hiện pha động đi ra từ cột phân tích. Tín hiệu ra của detector
là tín hiệu điện tỉ lệ thuận với một vài tính chất của pha động hoặc của chất tan trong mẫu.
 Những đặc trưng quan trọng của detector trong HPLC:
- Nhạy
- Tuyến tính
- Đáp ứng chọn lọc hoặc thông dụng
- Đáp ứng không bị tác động bởi những thay đổi của các điều kiện
- Thể tích chết thấp
- Không dễ bị phá hủy
- Rẻ tiền, đáng tin cậy, dễ sử dụng.
5.1 Detector UV – VIS:
Đây là detector được dùng phổ biến nhất trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV
– VIS ( trong khoảng 190 – 800 nm) của các chất phân tích. Tế bào đo ở trong detector là
một ống hình trụ đường kính 1mm, chiều dài 1cm.
a. Nguyên tắc:
- Pha động từ cột chảy qua một ống đo nhỏ có một chùm bức xạ đơn sắc UV- VIS chiếu
qua.
- Sự hấp thụ bức xạ của chất tan là một hàm phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của nó theo
định luật Lambert – beer: D = ElC
b. Ba cấu hình của detector hấp thụ UV – VIS:
13


 Detector đo ở bước sóng cố định:
- Nguồn sáng là đèn thủy ngân và đèn Vonfram cùng với kính lọc để chọn một số bước sóng
như 254 nm, 280 nm, 334 nm và 436nm.
- Nhược điểm của detetor này là kém linh hoạt nhưng rẻ tiền.
 Detector đo ở bước sóng thay đổi:
- Có thể đo ở bất kỳ bước sóng nào trong vùng UV – VIS, cho phép lựa chọn bước sóng có

đáp ứng tối ưu của detector đối với chất phân tích.
- Hệ thống tạo bước sóng đơn sắc bao gồm nguồn sáng đèn D2 và đèn Vonfram cùng thiết
bị đơn sắc hóa để chọn bước sóng.
 Detector mảng diod ( DAD hay PDA):

- Cấu tạo: Có một hoặc hai mảng diod để nhận ra bức xạ đã tán sắc từ một cách tử kẻ vạch
bằng laser.
- Nguyên tắc: Chùm sáng đa sắc được cho đi qua mẫu, sau đó hội tụ vào khe của bộ phận
đơn sắc hóa để tách chùm tia đơn sắc cần đo hướng vào bộ dị tìm. Để đo mật độ quang tại
những bước sóng khác nhau, bước sóng được thay đổi nhờ quay chậm lăng kính hoặc bộ
cách tử trong bộ đơn sắc hóa.
- Ưu điểm:
+ Cung cấp phổ UV – VIS của chất phân tích trong bước sóng đã chọn.
+ Kiểm tra tính tinh khiết của sản phẩm và định danh sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương
ứng của đỉnh sắc ký với phổ của ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước.
+ Phát hiện đồng thời được chất phân tích ở nhiều bước sóng khác nhau, giúp cho việc xác
định được bước song hấp thụ cực đại của một chất, cũng như phát hiện các tạp chất và các
chất gây nhiễu ở bước sóng thấp hơn, không đặc trưng.

14


+ Cung cấp sắc ký đồ 3 chiều giúp cho việc chọn điều kiện thích hợp để định lượng cũng
như định danh các mẫu phân tích.
+ Thích hợp cho việc định lượng đồng thời nhiều thành phần.
- Nhược điểm:
+ Độ nhạy kém hơn detector UV – VIS đo ở bước sóng thay đổi.
5.2 Detector huỳnh quang:
- Ưu điểm:
+ Chọn lọc hơn và nhạy hơn detector UV.

+ Đáp ứng với các chất phát huỳnh quang.
+ Có thể tạo dẫn chất phát huỳnh quang với những chất không phát huỳnh quang ( trước
hoặc sau cột)
+ Tương thích với rửa giải gradient.
- Nhược điểm:
+ Không phát hiện được chất không phát huỳnh quang.
+ Bị ảnh hưởng lớn của môi trường: dung môi, pH, nhiệt độ, độ nhớt, lực ion, khí hịa tan.
5.3 Detector chỉ số khúc xạ ( RID):
- Nguyên tắc: Hoạt động của detector theo nguyên lí đo vi sai. Tín hiệu đo là sự khác
nhau giữa chỉ số khúc xạ của pha động và của pha động hòa tan chất phân tích.
- Ưu nhược điểm:
+ Đây là detector vạn năng đáp ứng với hầu hết các chất phân tích nhưng độ nhạy kém hơn
detector hấp thụ UV có thể đến 1000 lần.
+ Detector khúc xạ rất nhạy với nhiệt độ và khó sử dụng cho rửa giải gradient vì khó so sánh
trị số khúc xạ của mẫu và pha động khi thành phần pha động thay đổi.
+ Detector kém nhạy, có khoảng tuyến tính hẹp nên phạm vi sử dụng bị hạn chế.

15


5.4 Detector tán xạ bay hơi ( ELSD):

- Nguyên tắc: Dịch rửa giải từ cột sắc ký đi vào đầu detector được trộn với khí nito ở trong
bộ phận phun sương. Hỗn hợp đi qua một kim nhỏ được phân tán thành đám sương mù kích
thước đều nhau. Ở đây dung môi được bay hơi khỏi hạt sương, hạt rắn mịn được tạo thành.
Các hạt rắn này đi cắt ngang chùm laser. Chùm tia laser bị tán xạ bởi các hạt rắn được phát
hiện nhờ ống nhân quang.
- Đáp ứng của detector liên quan đến khối lượng của chất phân tích, nghĩa là diện tích pic
sắc ký tỷ lệ thuận với khối lượng.
- Ưu, nhược điểm:

+ Đây là detector vạn năng đáp ứng với bất kì chất phân tích nào kém bay hơi hơn so với
pha động của sắc ký lỏng.
+ Khác so với detector khúc xạ: thích hợp với chế độ rửa giải gradient. Khác với detector
UV: độc lập với độ hấp thụ UV và nhóm chức.
16


5.5 Detector điện hóa:
- Detector đo độ dẫn
- Detector đo dòng
STT

Loại detector

Độ nhạy (

Đặc điểm

mg/ml)

1

Rửa giải
gradient

Hấp thụ UV-VIS 10^-7

Sử dụng phổ biến, chọn lọc Dùng được

- Bước sóng cố

với các chất có cấu trúc hoặc

định

nhóm chức chưa bão hịa.

- Bước sóng thay

Ít thay đổi với tốc độ dịng

đổi

và nhiệt độ

- Mảng diod
2
3

4

Huỳnh quang

10^-9

Đặc biệt rất nhạy, chọn lọc

Dùng được

Chỉ số khúc xạ

5.10^-4

Vạn năng, độ nhạy vừa phải. Không dùng
Thay đổi nhiều theo nhiệt độ được

Tán xạ bay hơi

2.10^-4

Vạn năng, độ nhạy vừa phải Dùng được
Đáp ứng với khối lượng

Điện hóa
- Đơ độ dẫn
5

Khơng dùng
10^-5

- Có thay đổi theo nhiệt độ được

10^-9

và tốc độ dịng. Chỉ thích
hợp với chất tan ion.

- Đo dòng

- Rất nhạy, chọn lọc, điện

cực dễ bị nhiễm bẩn

6

Phổ khối

Cực nhỏ

Vạn năng, rất nhạy, đắt tiền

Dùng được

6. BỘ PHẬN XỬ LÝ VÀ GHI TÍN HIỆU:
- Chính xác và đa năng.
- Tự động hóa trong việc phát hiện pic, đo diện tích pic và điều chỉnh đường nền.
- Có khả năng phân tích định tính thành phần của hỗn hợp.
- Xác định được nồng độ của mẫu.
- Có khả năng giữ lại các dữ kiện trong bộ nhớ để có thể lặp lại việc tính tốn kết quả mà
khơng cần đưa mẫu thử qua hệ thống sắc ký nhiều lần.
17


- Hiện nay các hệ thống SK được kết nối với hệ thống máy tính, các máy tính được cài đặt
các phần mềm tiện dụng trong việc tính tốn các phép tính từ đơn giản đến phức tạo một
cách nhanh chóng, chính xác.
CÂU 7: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC:
1. Nguyên tắc chung:
Dựa trên sự so sánh chiều cao hoặc diện tích pic trong mẫu thử với một hay nhiều mẫu
chuẩn.
- Pic hẹp và đối xứng: đo chiều cao hoặc diện tích pic.

- Pic tù hay lệch phương: đo diện tích pic.
2. Phương pháp định lượng:
1. Định lượng so sánh với chuẩn

Chuẩn ngoại 1 điểm ( so sánh trực tiếp)
Chuẩn ngoại nhiều điểm ( đường chuẩn)
Chuẩn nội
Thêm chuẩn

2. Định lượng khơng có chuẩn

Chuẩn hóa diện tích pic ( quy về 100% diện tích
pic)

2.1 Định lượng so sánh với chuẩn.
2.1.1 Phương pháp chuẩn ngoại:
a. Chuẩn ngoại 1 điểm ( so sánh trực tiếp):
- Phân tích bằng chiều cao pic:
𝐂 𝐱 = 𝐂𝟎 ×

𝐡𝐱
𝐡𝟎

𝐡𝟎 : 𝐂𝐡𝐢ề𝐮 𝐜𝐚𝐨 𝐩𝐢𝐜 𝐜ủ𝐚 𝐦ẫ𝐮 𝐜𝐡𝐮ẩ𝐧
𝐡 𝐱 : 𝐂𝐡𝐢ề𝐮 𝐜𝐚𝐨 𝐩𝐢𝐜 𝐜ủ𝐚 𝐦ẫ𝐮 𝐭𝐡ử
- Phân tích bằng diện tích pic:
𝐂 𝐱 = 𝐂𝟎 ×

𝐒𝐱
𝐒𝟎

𝐒𝟎 : 𝐃𝐢ệ𝐧 𝐭í𝐜𝐡 𝐩𝐢𝐜 𝐜ủ𝐚 𝐦ẫ𝐮 𝐜𝐡𝐮ẩ𝐧
𝐒𝐱 : 𝐃𝐢ệ𝐧 𝐭í𝐜𝐡 𝐩𝐢𝐜 𝐜ủ𝐚 𝐦ẫ𝐮 𝐭𝐡ử
18


𝑪𝟎 và 𝑪𝒙 càng gần nhau, kết quả càng chính xác.
b. Chuẩn ngoại nhiều điểm ( đường chuẩn):
- Pha các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau.
- Tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn.
- Thiết lập phương trình hồi quy và vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc chiều cao hay diện tích
pic theo nồng độ.
- Tiến hành sắc ký mẫu thử. Dựa vào phương trình hồi quy suy ra nồng độ mẫu thử.
2.2.2 Phương pháp chuẩn nội:
 Trường hợp áp dụng:
- Kết quả phân tích khơng lặp lại khi áp dụng phương pháp ngoại chuẩn ( xử lý mẫu phức
tạp, thể tích tiêm mẫu khơng lặp lại, nồng độ chất phân tích nhỏ khoảng 1ppm).
 Nguyên tắc:
- Thêm một chất chuẩn khác với chất cần định lượng ( chất chuẩn nội) vào mẫu thử và mẫu
chuẩn.
- Tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số được sử dụng để xây
dựng đường chuẩn.
 Yêu cầu của chất chuẩn nội:
- Chất chuẩn nội phải được tách hồn tồn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất
phân tích.
- Có cấu trúc hóa học tương tự chất phân tích.
- Có nồng độ xấp xỉ nồng độ chất phân tích.
- Khơng phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.
- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.
 Độ nhạy phát hiện của chất chuẩn nội và chất phân tích thường khác nhau.

 Xác định yếu tố hiệu chính Fs của chất chuẩn nội và chất phân tích:
𝐅𝐬 =

𝐒 𝐢 × 𝐂𝐬
𝐒 𝐬 × 𝐂𝐢

𝐂𝐬 : 𝐍ồ𝐧𝐠 độ 𝐜ủ𝐚 𝐝𝐮𝐧𝐠 𝐝ị𝐜𝐡 𝐜𝐡𝐮ẩ𝐧 𝐧𝐠𝐨ạ𝐢
𝐂𝐢 : 𝐍ồ𝐧𝐠 độ 𝐜ủ𝐚 𝐝𝐮𝐧𝐠 𝐝ị𝐜𝐡 𝐜𝐡𝐮ẩ𝐧 𝐧ộ𝐢
𝐒𝐒 : 𝐃𝐢ệ𝐧 𝐭í𝐜𝐡 𝐩𝐢𝐜 𝐜ủ𝐚 𝐜𝐡𝐮ẩ𝐧 𝐧𝐠𝐨ạ𝐢
𝐒𝐢 : 𝐃𝐢ệ𝐧 𝐭í𝐜𝐡 𝐩𝐢𝐜 𝐜ủ𝐚 𝐜𝐡𝐮ẩ𝐧 𝐧ộ𝐢
19


 Nồng độ của mẫu thử có diện tích pic 𝑺𝒙 :
𝐂𝐱 =

𝐒𝐱
× 𝐂𝐢 × 𝐅𝐬
𝐒𝐢

2.2.3 Phương pháp thêm chuẩn:
- Thêm một lượng xác định chất chuẩn vào dung dịch mẫu thử.
- Nồng độ 𝑪𝒙 của mẫu thử có diện tích pic là 𝑺𝒙
- Thêm ∆𝑪làm tăng ∆𝑺:
𝑪𝒙 =

∆𝑪
× 𝑺𝒔
∆𝑺

2.2 Định lượng khơng có chuẩn: Phương pháp chuẩn hóa diện tích:
 Trường hợp áp dụng:
- Hay áp dụng để xác định độ tinh khiết của hoạt chất.
 Yêu cầu:
- Mọi cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích đều phải được rửa giải, phát hiện và tách hoàn
toàn.
- Sự đáp ứng của đầu dò trên các cấu tử là như nhau.
 Cơng thức tính:
%𝑿 =

𝑨𝒙
𝑨𝒙 + 𝑨𝒚 + 𝑨𝒛

% 𝑿: 𝑮𝒊á 𝒕𝒓ị % 𝒄ủ𝒂 𝒄ấ𝒖 𝒕ử 𝑿 𝒕𝒓𝒐𝒏𝒈 𝒉ỗ𝒏 𝒉ợ𝒑 𝑿, 𝒀, 𝒁
𝑨𝒙 , 𝑨𝒚 , 𝑨𝒛 : 𝑫𝒊ệ𝒏 𝒕í𝒄𝒉 𝒑𝒊𝒄 𝒄ủ𝒂 𝒄ấ𝒖 𝒕ử 𝑿, 𝒀, 𝒁
 Áp dụng của phương pháp chuẩn hóa diện tích: xác định độ tnh khiết sắc ký.
- Yêu cầu: tất cả các chất trong mẫu thử đều phải được tách và phát hiện.
- Giả định: mỗi chất trong hỗn hợp tiêm vào máy HPLC cho 1 pic duy nhất.
- Khối lượng của chất trong mỗi pic được tìm thấy:
𝑺𝟏
×𝑴
𝑺𝟏 + 𝑺𝟐 + ⋯ + 𝑺𝟑
M: Tổng khối lượng chất tan trong mẫu tiêm.
- Ứng dụng rất hạn chế khi định lượng đa thành phần.
- Có thể áp dụng để định lượng gần đúng các hợp chất tự nhiên có độ tinh khiết cao.
+ Pic dung mơi và pic chính tương ứng với chất phân tích.
20