Định lượng e coli bằng phương pháp màng lọc

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
-----☯-----

MƠN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI
Định Lượng E.Coli Bằng Phương Pháp Màng Lọc

TP.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2022


BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
-----☯-----

BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI
Định Lượng E.Coli Bằng Phương Pháp Màng Lọc
TP.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2022


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên cho nhóm đề tài xin gửi lời cám ơn chân thành nhất đến Ban Giám
Hiệu và tồn thể q thầy cơ Trường Đại học Cơng Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM.
Quý thầy cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm cùng với tri thức và tâm huyết của
mình đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học
tập tại trường. Và trong học kỳ này Khoa đã tổ chức cho chúng em được tiếp cận
với mơn học rất hữu ích đối với sinh viên. Đó là mơn học “Phân tích vi sinh thực

phẩm”.
Nhóm đề tài chúng em gửi lời cám ơn chân thành nhất đến GV Cô Đinh Thị
Hải Thuận đã tận tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học, từng buổi thảo
luận hết sức bổ ích và những kiến thức cần thiết mà Cơ đã mang đến cho mơn học
này.
Nhóm đề tài cũng xin cảm ơn bạn bè, anh chị đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ
trong q trình hồn thành bài tiểu luận, tạo cho chúng em hiểu thêm về những
kiến thức.
Đề tài tiểu luận do nhóm chúng em tìm hiểu là “Định lượng E.coli bằng
phương pháp màng lọc”. Do kiến thức cịn hạn chế và cịn nhiều bỡ ngỡ, khơng
tránh khỏi những thiếu xót là điều chắc chắn. Vì thế, nếu có thiếu xót mong q
Thầy Cơ và các bạn bỏ qua. Nhóm đề tài rất mong nhận được những ý kiến đóng
góp q báu của Cơ và các bạn để bài tiểu luận có thể hồn thiện hơn.
Lời cuối cùng, chúng em xin kính chúc Cơ có thật nhiều sức khỏe, thành
công trong mọi việc và luôn hạnh phúc.


Nhóm chúng em xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

5

1. GIỚI THIỆU

6

1.1.

Đặc điểm của E.Coli

6

1.2.

Tính chất sinh hóa

6

1. ĐỘC TỐ VÀ CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ CỦA E.COLI

7

1.1.

Giới thiệu chung về độc tố E.Coli

7

1.2.

Tình hình ngộ độc thực phẩm

7

2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.1.

Phương pháp phân tích truyền thống

2.2.

Phương pháp hiện đại

8
8
12

2.2.1.

Kỹ thuật RPLA

12

2.2.2.

Phương pháp Elisa

13

2.2.3.

Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction )

14

3. ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC

15

3.1.

Định nghĩa và ngun tắc

15

3.2.

Mơi trường và hố chất

16

3.3.

Quy trình tiến hành.

17

3.3.1.

QĐ/TCVN/ISO

17

3.3.2.

Quy trình

18

3.3.2.1.

Chuẩn bị mẫu

18

3.3.2.2.

Lọc

19

3.3.2.3.

Ủ và phân biệt

19

3.3.2.4.

Biểu thị kết quả

20

3.3.2.5.

Màu của khuẩn lạc

20

3.4.

Định lượng

20

3.4.1.

Nguyên tắc

20

3.4.2.

Tiến hành

21

3.4.3.

Trường hợp chung

21

KẾT LUẬN

23

TÀI LIỆU THAM KHẢO

24

TỔNG HỢP CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM

25

PHÂN CÔNG VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG

35



MỞ ĐẦU
Ngày nay, khi cuộc sống của con người tiếp tục được cải thiện, vệ sinh khi ăn
uống là điều rất quan trọng đối với họ. Hàng năm có hàng trăm vụ ngộ độc thực
phẩm xảy ra, để lại hậu quả nặng nề cho sức khỏe của người dân. Điều này khơng
chỉ phổ biến ở Việt Nam mà cịn ở các nước khác trên thế giới. Một trong những
nguyên nhân gây ra tình trạng này là sự hiện diện quá mức cho phép các vi sinh vật
gây hại trong thực phẩm, tùy theo mức độ mà hậu quả của chúng để lại khác nhau.
Vi khuẩn sinh sôi, phát triển với sức sống mạnh mẽ, trong ruột của người,
một số động vật. Theo nghiên cứu, hầu hết các dạng vi khuẩn E.coli khơng chỉ vơ
hại đối với sức khỏe mà cịn góp phần giúp sức khỏe ổn định hơn. Những vi khuẩn
này được coi là vi khuẩn có lợi, cơng việc chính của chúng là giúp hệ tiêu hóa hoạt
động hiệu quả hơn, trong trường hợp này, các nhà khoa học nói đến mối quan hệ
cộng sinh. Tuy nhiên, vẫn có một số dạng E.coli có khả năng gây bệnh cho chúng
ta. Vì vậy, nếu khơng có những kiến thức cần thiết về cách phòng tránh cũng như
các biểu hiện triệu chứng và cách điều trị, mọi người sẽ gặp rất nhiều khó khăn.
Vì những lý do trên mà suốt những năm qua con người luôn cố gắng nghiên

cứu, sử dụng nhiều biện pháp khác nhau để định lượng E.coli, trong đó có phương
pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là “Định lượng E.Coli bằng phương pháp
màng lọc”. Để có các biện pháp phòng tránh, ngăn chặn và làm giảm bớt số ca ngộ
độc thực phẩm, chúng em sẽ tiến hành tìm hiểu sâu hơn về phương pháp định
lượng này.


1. GIỚI THIỆU
1.1.

Đặc điểm của E.Coli

- Là trực khuẩn nhỏ uốn cong gram âm, không sinh bào tử và di động, kỵ khí
khơng bắt buộc, có mặt trong mơi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu
cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường, trong các loại thực phẩm
như cá hồi, phô mai, thịt, sữa. Chúng có khả năng tạo enterotoxin và có khả
năng gây bệnh rất nặng ở người. Độc tố của chúng rất nhạy cảm với nhiệt.
Ngoài độc tố nhạy cảm với nhiệt chúng cịn có khả năng tạo ra loại độc tố
bền nhiệt. Chúng có nguy cơ rất lớn đối với trẻ em đặc biệt là những bệnh
liên quan đến hội chứng dung huyết hoặc phân có máu. Một nghiên cứu tại
Việt Nam cho thấy trên 80% số mẫu dụng cụ bát đũa thường dùng khơng
được vệ sinh đúng cách và do đó bị bẩn. Trên 85% số mẫu tay người bán
hàng bị nhiễm khuẩn E.coli. Liều gây khoảng 106-9 tế bào ở người trưởng
thành sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm khuẩn.
1.2.

Tính chất sinh hóa

- E.Coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi. Hầu hết E.Coli
đều lên men lactose và sinh hơi, trừ E.Coli trơ (inactive) (trong đó có EIEC)

khơng hoặc lên men rất chậm. Một số chi khác trong họ vi khuẩn đường ruột
cũng có khả năng lên men nhanh lactose (như Kiebsiella, Enterobacter,
Serratia cà Citrobacter) được gộp vào một nhóm vi khuẩn có tên chung là
Coliform.
- E.Coli có khả năng sinh indole. Khơng sinh H 2S. Không sử dụng được
nguồn carbon cua citrate trong mơi trường Simmons. Có decarboxylase, vì
vậy có khả năng khử carboxyl của lysin, ornithin, arginin và acid glutamic.
Betagalactosidase dương tính. Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24h
âm tính, sau 48 giờ có thể dương tính.


1. ĐỘC TỐ VÀ CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ CỦA E.COLI
1.1.

Giới thiệu chung về độc tố E.Coli

- Nhóm này khơng sinh độc tố ruột như nhóm sinh độc tố ruột. Nhưng chúng
xâm nhập và nhân lên ở các tế bào biểu mô ruột, rồi chúng lan sang các tế
bào bên cạnh theo cách giống ngộ độc do lỵ trực khuẩn và gây ra tiêu chảy
nặng có thể khơng có máu hoặc có máu giống lỵ, viêm ruột tan huyết, có thể
dẫn đến tử vong. Nhóm này hay gây bệnh ở trẻ em và người già.
1.2.

Tình hình ngộ độc thực phẩm

- Trên thế giới, các vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn chiếm tới 70%. Tại các
nước châu Á, vi khuẩn Salmonella, E.coli, Listeria Monocytogenes và S.
aureus là nguyên nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Tại Việt
Nam, ngộ độc thực phẩm đang là vấn đề nóng bỏng của xã hội và đã trở
thành mối lo cho sức khỏe cộng đồng và ngày càng diễn biến phức tạp. Hơn

thế nữa, theo thông báo của Bộ Y tế, tình trạng ngộ độc thực phẩm đang có
xu hướng gia tăng và ảnh hưởng không nhỏ tới sức khỏe cộng đồng. Trong
năm 2021, toàn quốc ghi nhận 81 vụ ngộ độc thực phẩm làm 1942 người
mắc và 18 trường hợp tử vong. So với năm 2020, số vụ giảm 58 vụ (41,7%),
số mắc giảm 1152 người (37,2%), số tử vong giảm 12 người (40,0%). Tính
chung 7 tháng năm 2022, cả nước xảy ra 27 vụ ngộ độc thực phẩm với 357
người bị ngộ độc, trong đó có 2 người tử vong.
- Trong đó, rất nhiều người bị ngộ độc E.coli do sử dụng đồ uống và thực
phẩm có chứa loại vi khuẩn này. Khi xâm nhập vào trong cơ thể, chúng sẽ
bám vào lớp tế bào của niêm mạc thành ruột và bắt đầu sinh trưởng. Do vi
khuẩn tăng sinh quá nhanh nên chúng sẽ giải phóng độc tố đủ mạnh để gây
ra sự tổn thương đối với niêm mạc ruột và gây tiêu chảy, đau quặn bụng. Cụ
thể:


● Năm 2020: Giám đốc sở y tế tỉnh Bình Phước cho biết đã xác định được
nguyên nhân vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra tại một tiệc cưới vào ngày 7.6
khiến 150 người nhập viện (tại thôn Hưng Lập, xã Phước Tín, TX Phước
Long) là do vi sinh vật, vi khuẩn E.coli có trong thực phẩm.
● Năm 2021: Trung tâm Y tế huyện Pác Nặm đã gửi 11 mẫu phẩm để xét
nghiệm, gồm: năm mẫu thực phẩm, một mẫu nước và năm mẫu bệnh
phẩm. Đến cuối giờ chiều 3-3 đã có kết quả xét nghiệm của Chi cục An
tồn vệ sinh thực phẩm tỉnh. Theo đó, 5 mẫu thực phẩm đều có vi khuẩn
E.coli, Coliform và S.aureus (tụ cầu).
2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.1.

Phương pháp phân tích truyền thống
2.1.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc

- Khuẩn lạc của một loại vi khuẩn được định nghĩa là một cụm (Colony), có
thể nhìn thấy được bằng mắt thường, sinh khối của vi khuẩn đó khi chúng
phát triển trên bề mặt của một giá thể cứng.
- Đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU (viết tắt từ chữ Colony form units) là đơn
vị được dùng để ước tính số lượng vi khuẩn hoặc tế bào nấm trong 1 mẫu
thử nghiệm nhất định. Khi kiểm tra vi sinh vật trong một mẫu thử nghiệm
bằng cách đếm khuẩn lạc có trên đĩa petri hoặc đĩa mơi trường chuẩn bị sẵn
(ví dụ đĩa Compact Dry), đơn vị thể hiện khuẩn lạc thường là CFU/mL,
CFU/g, CFU/25g.
- Đơn vị CFU/g, CFU/25g thường dùng cho mẫu thử nghiệm dạng rắn (thực
phẩm, nguyên liệu thực phẩm…)
- Đơn vị CFU/mL dùng cho mẫu thử nghiệm ở dạng dung dịch như mẫu nước
nuôi trồng thủy sản, nước trái cây…
- Đếm khuẩn lạc là đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi trường, thường
chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 30 – 300, dùng bút để đếm các


khuẩn lạc đã đếm sau đó tính tốn kết quả (dựa trên số khuẩn lạc đếm được
và độ pha loãng để tính ra số khuẩn lạc vi sinh vật trong dung dịch ban đầu)
- Có 2 phương pháp đếm khuẩn lạc:

❖ Phương pháp đếm khuẩn lạc thủ công: Với phương thức đếm khuẩn lạc thủ
công, mỗi chấm khuẩn lạc đặc trưng cho loại vi khuẩn đích được đếm một
lần. Để dễ kiểm sốt q trình đếm, người ta thường đặt đĩa petri lên một
lưới ơ. Sau đó đếm các khuẩn lạc trong mỗi ô và đánh dấu khuẩn lạc đếm
được ở đằng sau của đĩa petri. Để đảm bảo chính xác, mỗi mẫu thử nghiệm
cần được ni cấy ít nhất 3 đĩa và lượng khuẩn lạc thích hợp cho đếm thủ
cơng là 30 tới 300 khuẩn lạc. Các đĩa có q nhiều hoặc q ít khuẩn lạc đều
khơng thích hợp và cần pha loãng và cấy lại mẫu.
❖ Phương pháp đếm khuẩn lạc tự động: Đếm khuẩn lạc thủ công thường mất

rất nhiều thời gian và có thể mắc phải sai số chủ quan của người đếm. Để cải
thiện tình trạng này, hiện nay các phòng lab đã trang bị thêm các thiết bị
đếm khuẩn lạc tự động. Nguyên lí cơ bản của máy đếm khuẩn lạc tự động là
máy đếm khuẩn lạc sẽ chụp một ảnh của đĩa (petri hoặc đĩa compact dry),
ứng dụng sau đó sẽ sử dụng một thuật toán để tách và đếm các khuẩn lạc có
trên đĩa. Thuật tốn cũng có thể gặp khó khăn trong việc phân biệt các khuẩn


lạc khi có quá nhiều khuẩn lạc chồng lấn. Trường hợp này cần mơt ứng dụng
có khả năng phân tích hiệu quả và mạnh mẽ. Đây cũng là thách thức của các
chuyên gia trong việc phát triển ứng dụng này.

Figure 1: Máy đếm khuẩn lạc tự động
❖ Ưu, nhược điểm của phương pháp đếm khuẩn lạc:
● Ưu điểm
- Cho phép xác định số tế bào sống
- Định lượng chọn lọc vi sinh vật
● Nhược điểm:
- Độ chính xác của việc tính mật độ vi khuẩn từ số khuẩn lạc thực sự có một
số hạn chế. Các đơn vị hình thành khuẩn lạc có thể là một tế bào đơn, một
chuỗi tế bào hoặc cả một cụm tế bào. Giả thiết rằng một khuẩn lạc đại diện
cho một tế bào, như vậy mật độ tính tốn được có thể thấp. Các vi khuẩn
khác nhau cần các điều kiện sinh trưởng khác nhau, và khuẩn lạc trên đĩa chỉ
thể hiện những vi khuẩn mà phát triển trên môi trường cấy dưới những điều
kiện ủ đó. Hơn nữa, đếm khuẩn lạc khơng tính được tế bào chết, cần phải
cân nhắc kỹ khi bạn cần mật độ tế bào trong mẫu ban đầu.
2.1.2. Phương pháp MPN


- MPN là viết tắt của Most Probable Number, nghĩa là số có xác suất lớn nhất.

MPN thường được dùng để biểu thị số lượng vi khuẩn có trong một thể tích
nhất định của mẫu chất lỏng.
- CFU là đơn vị hình thành khuẩn lạc có trong 1 mẫu thử nghiệm nhất định.
CFU thường được tính từ phương pháp đổ đĩa hoặc cấy trang trong khi đó
MPN thường được tính toán bằng phương pháp lên men. Đối với CFU, vi
khuẩn phát triển trên mơi trường đặc (ví dụ như thạch), sau đó, các khuẩn lạc
được đếm thủ cơng bằng mắt hoặc ứng dụng hiện đại. Đối với phép đo
MPN, các mẫu được ni cấy trong mơi trường lỏng, (ví dụ như lên men).
Kết quả không dùng phương thức đếm mà là so sánh với bảng xác suất.
- Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vi sinh
vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Mỗi độ pha lỗng được ni
cấy lập lại nhiều lần (3 – 10 lần). Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho
trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính. Số
lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê.
❖ Có hai hệ thống MPN:
● Hệ thống 9 ống
● Hệ thống 15 ống
❖ Đặc điểm:
- Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi
cấy như:
- Sự tạo hơi: Coliforms …
- Sự đổi màu: S. aureus
- Cho phép định lượng được mật độ vi sinh vật thấp trong thể tích mẫu lớn.


Figure 2: 2 hệ thống MPN
❖ Quy trình thực hiện:
❖ Bước 1: Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa mơi trường thích hợp cho sự tăng
trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng.
❖ Bước 2: Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng

bậc 10 liên tiếp.
❖ Bước 3: Đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợp.
❖ Bước 4: Quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của vi sinh vật cần
kiểm định.
❖ Bước 5: Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha lỗng.
Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ vi sinh vật.
2.2.

Phương pháp hiện đại

2.2.1. Kỹ thuật RPLA
- Kĩ thuật RPLA được ứng dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm rong kĩ
thuật này, hạt nhựa được phủ kháng thể của độc tố trước khi cho vào giếng.
Cho mẫu vào để tạo phản ứng. Nếu có độc tố trong mẫu thì phản ứng giữa
độc tố và kháng thể sẽ tạo ra sự ngưng kết, tùy mức độ ngưng kết mà xác


định được lượng độc tố Bộ kit RPLA được giới thiệu bởi công ty Denka
Seiken, Niigata, Nhật Bản và được bán tại Mỹ (Merlin S Bergdoll, 2000).
2.2.2. Phương pháp Elisa
- Phương pháp elisa ( Enzyme – Linked Immuno Sorbent Assay)
Những tiến bộ của khoa học trong những năm gần đây đã thúc đẩy sự phát
triển của các kỹ thuật chuẩn đoán bằng huyết thanh . Các phương pháp này
tỏ ra rất hiệu quả trong việc chuẩn đốn nhanh và chính xác các vi sinh vật
gây bệnh . Ngày nay phương pháp này còn được phát triển để xác định chất
độc hại trong môi trường như độc tố, dư lượng kháng sinh... Nguyên tắc của
phương pháp Elisa dựa trên phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên với một
kháng thể đặc hiệu. Phản ứng miễn dịch xảy ra được phát hiện bằng cách sử
dụng những kháng thể đã được đánh dấu ( bằng chất nhuộm phát huỳnh
quang, đồng vị phóng xạ, hay enzyme).

- Phương pháp Elisa là phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme
( enzyme-linked immunosorbent assay). Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA là
sử dụng kháng thể đơn dòng ( kháng thể sơ cấy ) phủ bên ngoài những giếng
well ) nhỏ nhằm mục đích thu giữ những kháng nguyên mục tiêu . Những
kháng nguyên thu giữ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ hai
có gắn với enzyme phát tính hiệu ( thường là horseradish peroxidase hay
alkaline phosphatase ) . Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất đặc hiệu
của enzyme, phản ứng xảy ra và tạo ra các sản phẩm làm đổi màu phản ứng .
Như vậy , chúng ta có thể phát hiện được sự hiện diện của kháng nguyên
- Hiện nay ELISA đã được sử dụng rộng rãi để phân tích Salmonella, E . coli
gây bệnh ( các dòng EHEC , STEC ,IEHEC…) , Listeria , độc tố
Staphylococus , thuốc trừ sâu, dư lượng kháng sinh … đối với vi sinh vật ,
phương pháp Elisa có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực
phẩm sau vài giờ tăng sinh nhằm tăng độ nhạy của phương pháp


2.2.3. Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction )
- Phương pháp PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên
khn là một trình tự đích DNA ban đầu , khuếch đại, nhân số lượng bản a
của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme
polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này . Kỹ thuật này được
Karl Mullis phát minh vào 1985
- Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn
DNA riêng biệt. Đây thực sự là phương pháp hiện đại vì thuận tiện cho việc
xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.
- Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của
DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống
trong các suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase khơng có nhiều
khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các
polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến

100oC. Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tính.
❖ Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp PCR
● Ưu điểm.
- Thời gian cho kết quả nhanh.
- Có thể nhận diện những sinh vật khó ni cấy. Việc ni cấy tăng sinh là
đơn giản hơn và có khi khơng cần thiết.
- Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với trường
hợp huyết thanh học. Khơng cần dụng cụ và mơi trường chẩn đốn phức tạp,
có thể thực hiện ở hiện trường.
- Ít tốn kém về mặt nhân sự. Có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí
phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.
● Nhược điểm.
- Thực phẩm chứa chất ức chế enzyme polymerase


- Mật độ vi sinh vật trong mẫu thấp, đôi khi cần tăng sinh
- Không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, có thể dẫn đến dương tính
giả (tuy vậy, có thể phát hiện bào tử, tế bào đã chết của vi sinh vật gây độc)
- Ngày càng được quan tâm nhiều hơn đặc biệt phát hiện virus
3. ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC
3.1.

Định nghĩa và nguyên tắc

- Phương pháp màng lọc là phương pháp thường được dùng để định lượng vi
sinh vật ở mật độ thấp. Bản chất của phương pháp này là tập trung số vi sinh
vật ít ỏi trong một mẫu nước có khối lượng khá lớn trên màng lọc khuẩn và
định lượng chúng theo số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên một
mơi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh vật
cần kiểm. Dựa trên mẫu nước ban đầu và quy ra số lượng vi sinh vật có

trong một đơn vị thể tích nước.

Hình 2. Vi sinh vật trên màng lọc
- Người ta thường dùng màng lọc với kích thước lỗ lọc: 0,45 μm hoặc 2 μm.
Những vật liệu thường dùng để chế tạo màng lọc là sợi thủy tinh siêu mảnh,
sợi amiante, sơi polypropylene,…là những vật liệu có khả năng chịu được
nhiệt độ và áp suất cao của nồi hấp tiệt trùng. Đường kính và hình dạng


màng lọc phụ thuộc vào đường kính phễu lọc, đường kính màng thường là
45mm
- Hiện nay phương pháp màng lọc đang ngày càng cải tiến, thường dùng
màng lọc kỵ nước, màng lọc được in các ô vuông ngăn cản sự mọc lan của
khuẩn lạc. Số ơ vng có khuẩn lạc mọc được đếm và quy về số có xác suất
lớn nhất (MPN) của lượng vi sinh vật có trong một thể tích mẫu theo cơng
thức:

(

N

MPN = N× ln N−x

)

● N: tổng số các ơ vng
● x: số ơ có khuẩn lạc mọc
- Phương pháp màng lọc
● Ưu diểm: xác định được mật độ vi sinh vật cụ thể trong một thể tích mẫu
lớn: 10ml, 100ml,…

● Nhược điểm: khơng thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn
3.2.

Mơi trường và hố chất

- Mơi trường canh Tryptone Soya Agar(TSA) và môi trường Violet Red Bile
Agar(VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh đun chảy và làm
nguội ở nhiệt độ 45 độ C trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng.
- Môi trường canh Escherichia coli broth(EC Broth) được phân phối 10ml
trong mỗi ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng để nguội
và kiểm tra không có sự hiện diện của bọt khí trong ống Durham .
- Môi trường canh Lactose Tryptone Lautyl Sulphate Broth (LST Broth) được
chuẩn bị tương tự môi trường canh EC.
- Môi trường canh Tryptone Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống
nghiệmhấp khử trùng,


- Môi trường c anh MR-VP Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm
hấp khử trùng , để nguội và bảo quản ở 2 -8 0C cho đến khi sử dụng.
- Môi trường thạch Simmon Citrate được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch
nghiêng có màu xanh lục.
- Thuốc thử Kovac’s
- Các sản phẩm thủy phân casein bằng enzyme sẽ là nguồn cung cấp nitrogen,
vitamin, và amino acid trong môi trường TBX.
- Muối mật và nhiệt độ ủ cao 44 0C sẽ ức chế phần lớn vi khuẩn gram dương,
đặc biệt là trực khuẩn và liên khuẩn
- Bởi vì có sự hiện diện của enzyme β- glucuronidaza giúp phân biệt được hầu
hết E.coli từ các Coliforms khác. E.coli hấp thụ chất nền BCIG, enzyme βglucuronidaza tách liên kết giữa 5-bromo-4-clo-3-indol và β- glucuronid,
E.coli sẽ tạo ra màu xanh lam .
- Agar là tác nhân làm cứng hóa mơi trường.

- Nước có tác dụng hịa tan các chất có trong mơi trường
3.3.

Quy trình tiến hành.

3.3.1. QĐ/TCVN/ISO
- TCVN 6187-1:2019 /ISO 9308-1:2014.
- TCVN 6187-1:2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc
gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng
thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
- Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Escherichia Coli
(E.coli) và vi khuẩn Coliform. Phương pháp này sử dụng kỹ thuật lọc màng,
sau đó ni cấy trên mơi trường thạch coliform sinh màu và tính tốn số
lượng vi sinh vật đích có trong mẫu thử. Vì mơi trường thạch phân biệt có
độ chọn lọc thấp nên hệ vi sinh vật nền có thể phát triển gây nhiễm cho số


đếm E.Coli và vi khuẩn Coliform, ví dụ: phương pháp này khơng thích hợp
để áp dụng với mẫu nước bề mặt hoặc nước giếng nông.
- Tiêu chuẩn này đặc biệt thích hợp cho những loại nước có số lượng tổng vi
khuẩn dưới 100 khuẩn lạc trên môi trường thạch coliform sinh màu (CCA)
bao gồm nước uống đóng chai, nước bể bơi khử khuẩn hoặc nước đã qua xử
lý làm nước uống.
- Một vài chủng E.Coli âm tính với β-D-glucuronidase, như Escherichia
Coli O157, sẽ khơng phát hiện được là E.Coli. Vì chúng có enzym β-Dgalactosidase dương tính nên sẽ giống như vi khuẩn Coliform trên mơi
trường CCA.
3.3.2. Quy trình

Chuẩn bị

Lọc
ở (36 ± 2) °C
trong (21 ± 3) h:
Môi trường CCA

Ủ

Chuẩn bị mẫu lọc
để cấy trên môi
trường phân lập
Định lượng vi sinh
vật
Độ chính xác của
phép thử cao hơn

Biểu thị kết
quả
Quy trình Định lượng E.coli bằng phương pháp màng lọc

3.3.2.1. Chuẩn bị mẫu
- Chuẩn bị mẫu lọc và cấy trên môi trường phân lập, theo hướng dẫn TCVN
9716 (ISO 8199). Mẫu thử phải được vận chuyển và bảo quản ở nhiệt độ (5
± 3) °C theo hướng dẫn TCVN 8880 (ISO 19458). Trường hợp đặc biệt mẫu