Định lượng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, màng petrifilm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
🙞🙞🙞🙞🙞

BÁO CÁO TIỂU LUẬN
MƠN: PHÂN TÍCH VI SINH
ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG NẤM MEN, NẤM MỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
KHUẨN LẠC, MÀNG PETRIFILM


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
🙞🙞🙞🙞🙞

BÁO CÁO TIỂU LUẬN
MƠN: PHÂN TÍCH VI SINH
ĐỀ TÀI: Định Lượng Nấm Men, Nấm Mốc Bằng Phương Pháp Đếm Khuẩn Lạc,
Màng Petrifilm

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09, năm 2022

2


3


MỤC LỤC

Chương 1 Tổng quan về nấm men, nấm mốc................................................................5
Chương 2 Định lượng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, màng

Petrifilm......................................................................................................................... 7
2.1. Định lượng nấm men bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.....................................7
2.1.1. Mơi trường và hóa chất.................................................................................7
2.1.2. Quy trình định lượng.....................................................................................9
2.2. Định lượng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp màng petrifilm..................14
2.2.1. Giới thiệu về petrifilm.................................................................................14
2.2.2. Ưu điểm và nhược điểm màng petrifilm......................................................14
2.2.3. Quy trình định lượng...................................................................................15
Chương 3 Kết quả........................................................................................................17
3.1. Tính tốn kết quả...............................................................................................17
3.2. Ví dụ.................................................................................................................. 17
Kết luận....................................................................................................................... 19
Tài liệu tham khảo.......................................................................................................20

4


BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC
ST
T

1

2

3

4

5

Họ, tên và MSSV

Cao Thị Mỹ Hạnh
2005208561

Nguyễn Thị Vân Anh
2005208545

Lê Ngọc Quỳnh Hoa
2005208549

Lê Thị Ngân Em
2005208451

Nguyễn Lê Sơn
2005208397

Lớp

11DHTP1
5

Cơng việc được
giao

PowerPoint,
Word

11DHTP1

5

Tính tốn kết
quả và ví dụ

11DHTP1
5

Định lượng men
mốc bằng
phương pháp
đếm khuẩn lạc

11DHTP1
5

Tổng quan về
nấm men, nấm
mốc

11DHTP1
5

Định lượng men
mốc bằng
phương pháp
màng petrifilm

Cá nhân
tự đánh

giá (%)

Nhóm
đánh giá

100%

Hồn
thành tốt,
đúng thời
hạn

100%

Hồn
thành tốt,
đúng thời
hạn

100%

Hoàn
thành tốt,
đúng thời
hạn

100%

Hoàn
thành tốt,

đúng thời
hạn

100%

Hoàn
thành tốt,
đúng thời
hạn

5


Chương 1 Tổng quan về nấm men, nấm mốc
Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn
400,000 lồi nấm men và nấm mốc đã được mơ tả. Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật,
có vách tế bào là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các lồi nấm men
và nấm mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn dinh dưỡng cung
cấp năng lượng từ mơi trường bên ngồi, vì thế vi sinh vật này thường xuyên được
phân lập từ thực phẩm hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác. Ta có thể phân biệt nấm
men và nấm mốc theo các khái niệm cơ bản như sau:
● Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành một hệ chằng chịt
phát triển rất nhanh gọi là khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm.
● Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, phát
triển thành các khuẩn lạc trịn, lồi viền đều, bóng hoặc mờ trên bề mặt
mơi trường thạch nấm. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và
nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi ni cấy trong mơi
trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn
ty. Trong thực phẩm nếu có thể sinh trưởng và phát triển của nấm men,
nấm mốc có thể làm thay đổi màu của thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ,

làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc của thực phẩm, một số tạo độc tố gây
ngộ độc thực phẩm.
Quá trình tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố
từ môi trường. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt
độ thích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng 20 – 280 oC, một số ít trong
nhóm này ưa lạnh hay ưa nóng. Nước hoạt tính cũng là một nhân tố ảnh hưởng rất
quan trọng đến tăng trưởng. Hầu hết các loài nấm men nấm mốc và nấm men phát
triển tốt trong cơ chất hoạt nước có khoảng 85% hay lớn hơn, một số ít lồi có thể phát
triển trong cơ chất có nước hoạt tính thấp hơn khoảng 60-70%. Nấm mốc và nấm men
có thể tăng trưởng trong vùng pH từ 2-9, trong đó ph thích hợp nhất nằm trong khoảng
4-6,5. Hầu hết nấm men và mốc đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát
triển trong điều kiện vi hiếu khí. Một số lồi có thể tiếp nhận oxy ngun tử từ cơ chất
của chúng, nhưng dù ở dạng nào oxy vẫn là nguyên tố cần thiết cho quá trình phát
triển của nấm men và nấm mốc.
6


Mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu được xác định trong dưới dạng tổng
nấm men và nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trải hộp và đếm khuẩn lạc trên môi
trường Dichloran 18% Grycerol Agar (DG 18) hay Dichloran Rose Bengal
Chloramphecinol Agar (DBRC). Môi trường DBRC được sử dụng cho các loại mẫu
thực phẩm và thức ăn chăn ni có hoạt độ nước hơn 0.95 như thịt, trứng, các sản
phẩm từ sữa (trừ sữa bột) rau quả, các loại pate tươi.... Môi trường DG18 được sử
dụng cho các loại mẫu thực phẩm và thức ăn chăn ni có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc
bằng 0.95 như quả khô, bánh ngọt, mứt, thịt khô, cá đuối các sản phẩm đậu đỗ, bột mì,
quả hạch, gia vị...
Trong thực phẩm, khi có sự hiện diện của mốc và men, chúng phát triển làm
thay đổi màu của sản phẩm phát sinh mùi vị, lạ làm hư hỏng thay đổi cấu trúc của thực
phẩm một số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm.

7


Chương 2 Định lượng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc,
màng Petrifilm
2.1. Định lượng nấm men bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
2.1.1. Mơi trường và hóa chất
❖ Mơi trường PCA

Plate count agar (PCA) là hố chất được sử dụng cho xác định tổng số lượng vi
khuẩn hiếu khí sống trong mẫu. Đây khơng phải là dạng mơi trường chọn lọc. Số
lượng vi khuẩn được biểu hiện như các đơn vị hình thành khuẩn lạc trên gram (CFU/g)
trong mẫu dung dịch. Các mẫu được pha loãng ở mức độ thích hợp sẽ được bổ sung
vào các đĩa petri. Thạch dạng lỏng vô trùng được bổ sung vào những đĩa này và đĩa
được xoay nhẹ nhàng để đảm bảo trộn đều mẫu với thạch. Đĩa được ủ ở 20 hoặc 30°C
trong ba ngày. Sau khi ủ, tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa, con số này
nên nằm trong khoảng 25 - 250 là thích hợp nhất để đưa ra kết quả chính xác. Khi tính
tốn con số vi khuẩn thực tế, việc pha loãng nên được xem xét cẩn thận.
Các sản phẩm từ sữa, nước, nước thải,... Đây là môi trường tương đương với
môi trười kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm do APHA, AOAC, PHLS và ISO khun
dùng.
Mơi trường PCA hiện có dạng gói cân sẵn (pre-weigh) vừa đủ pha 1 lít (hoặc 8
lít) mơi trường giúp tiết kiệm thời gian cân đong hóa chất.
Nó được sử dụng để định lượng psychrotrophic.
Bảng thành phần của môi trường PCA
Thành phần

Gms/L

Casein peptone

5.0

Yeast Extract

2.5

Glucose

1.0

Agar

9-18

❖ Ứng dụng của môi trường PCA:

Chất ức chế các cặn & ăn mòn và chất phân tán cho hàm lượng phosphote siêu
thấp.
8


Xử lý nước lò hơi: Xử lý bùn cặn canxi cacbonat, canxi photphat, silicat.
Được sử dụng rộng rãi trong các hệ thống nước của nhà máy lọc dầu, nhà máy
hóa chất, khoan dầu và nhà máy thép,…
Xử lý nước mỏ khoan dầu để kiểm sốt quy mơ.
Kiểm sốt quy mơ trong thẩm thấu ngược.
❖ Môi trường DRBC

Bảng thành phần và vai trị của mơi trường DRBC

Thành phần

g/l

Vai trị
Cung cấp các hợp chất chứa nitơ, cacbon, các

Peptone

5.0g/l

chuỗi amino acid dài, vitamin và các chất dinh
dưỡng cần thiết cho sinh trưởng
Ức chế sự kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc nhanh,

Thạch

12-15g/l

vì thế cho phép phát hiện những nấm mốc mọc
chậm.

Nước cất hoặc nước

1000 ml

đã loại bỏ ion

Cung cấp độ ẩm thích hợp cho vi sinh vật sinh
trưởng.

Là kháng sinh, có tác dụng kìm khuẩn, nhưng có

Choloramphenicol

0.1g/l

thể diệt khuẩn ở nồng độ cao hoặc đối với những
vi khuẩn nhạy cảm cao.
Ức chế sự phát triển của vi khuẩn và hạn chế

Rose Bengal

0.025g/l

kích thước khuẩn lạc của nấm mốc phát triển
nhanh.

Dichloran (2,6-

0.002g/l

dicloro-4-nitroanilin)
Magie sulfat
(MgSO4.H2O)
Kali dihydro
phosphate (KH2PO4 )
Dextrose

Tác nhân kháng nấm, làm giảm đường kính của
khuẩn lạc nấm khi phát triển rộng ra.

0.5g/l
1.0 g/l
10.0 g/l

Cung cấp ion dương và sulfate.
Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi
trường.
Nguồn cung cấp carbohydrate.

❖ Môi trường DG18 (dichloran-glycerol)
9


Thành phần

g/l

Vai trò
Ức chế sự kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc

Thạch

12-15g/l

nhanh, vì thế cho phép phát hiện những nấm
mốc mọc chậm

Magie sulfat
(MgSO4.H2O)

Dichloran (2,6dicloro-4-nitroanilin)

0.5g/l
0.002g/l

Kali dihydro
phosphate

1.0g/l

(KH2PO4)

Cung cấp ion dương và sulfate.
Tác nhân kháng nấm, làm giảm đường kính
của khuẩn lạc nấm khi phát triển rộng ra.
Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH
môi trường.
Là chất rắn, tinh thể không màu, dễ tan trong
nước, có vị ngọt nhưng khơng ngọt bằng

D-Glucoza

10,0g

đường mía, cũng hay được sử dụng trong mơi
trường ni cấy mô thực vật, động vật và môi
trường vi sinh vật.

Glycerol khan ( 2,6dicloro-4-nitroanilin )
Nước cất hoặc nước

0,0002g
1 000 m/l

đã loại ion

Có đặc tính kháng khuẩn và kháng vi rút.
Cung cấp độ ẩm thích hợp cho vi sinh vật
sinh trưởng
Là kháng sinh, có tác dụng kìm khuẩn, nhưng

Choloramphenicol

0.1g/l

có thể diệt khuẩn ở nồng độ cao hoặc đối với
những vi khuẩn nhạy cảm cao.

2.1.2. Quy trình định lượng
❖ Yêu cầu chung

Nấm men và nấm mốc thường được định lượng bằng một kỹ thuật đổ đĩa để dễ
dàng định lượng hơn hoặc bằng kỹ thuật cấy ria bề mặt để các tế bào có thể tiếp xúc
tối đa với oxy trong khơng khí và tránh bị q nhiệt từ mơi trường thạch nóng chảy.
Các đĩa thạch đã rót sẵn cần được làm khơ trước khi nuôi cấy [TCVN 8128 (ISO
11133)]
10


Một số loại nấm men và nấm mốc có thể bị lây nhiễm hoặc có thể gây dị ứng,

ngay cả với người khỏe mạnh. Do đó, cần thận trọng khi xử lý chúng. Tốt nhất, đĩa
được giữ trong tủ ấm, khơng để trong phịng mở. Chỉ mở nắp đĩa khi cần, ví dụ: để
chuẩn bị phiến kính để kiểm tra dưới kính hiển vi; Kim cấy phải để nguội trước khi
thực hiện việc cấy truyền, để tránh phát tán các bào tử và các tế bào khác. Bàn làm
việc và tủ ấm phải được khử trùng thường xuyên.
Các đĩa Petri cần được để trong ủ ấm theo hướng thẳng đứng và khơng bị xáo
trộn cho đến khi đếm, vì nếu di chuyển làm giải phóng các bào tử nấm mốc hoặc bào
tử và dẫn đến phát triển tiếp các khuẩn lạc vệ tinh làm cho số đếm bị tăng cao.
Sơ đồ quy trình định lượng nấm men, nấm mốc
bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
❖ Cách tiến hành

Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích
10mL/25mL đối với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%,
cho vào túi nhựa vơ trùng (bình tam giác). Cho dung dịch pha lỗng SPW
90mL/225mL (sai số cho phép ± 5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu.
Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc
lắc đều bình tam giác có mẫu và dịch pha lỗng trong 2÷3 phút. Để vi sinh vật không
bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của dịch pha lỗng trong suốt
q trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng. Do các bào tử lắng xuống
nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được làm đầy
với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha lỗng thích hợp.
Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh
các phần tử có vi sinh vật lắng xuống.
Bước 2. Pha lỗng mẫu
Dùng pipet vơ trùng lấy 1 mL huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một
ống nghiệm chứa 9 mL dịch pha loãng SPW vơ trùng ở nhiệt độ thích hợp. Trộn kỹ
bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với các
loại mẫu làm từ ngun chất thì thu được dung dịch pha lỗng là 10 -1). Nếu cần, lặp lại

11


thao tác trên để có được dung dịch pha lỗng 10 -3, 10-4, 10-5,... cho đến khi thu được
lượng vi khuẩn thích hợp.
Bước 3. Cấy và ủ mẫu
Dùng pipet vơ trùng chuyển 0,1mL mẫu thử dạng lỏng hoặc 0,1mL huyền phù
ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào đĩa thạch DRBC hoặc DG18.
Dùng pipet vô trùng mới để chuyển 0,1 mL dung dịch pha loãng thập phân thứ
nhất

(10-1) (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 0,1 mL dung dịch pha loãng thập phân 10 -2

(sản phẩm ở dạng khác) cho vào đĩa thạch DRBC hoặc DG18 thứ hai. Để thuận tiện
cho việc định lượng các lượng nhỏ nấm men và nấm mốc, lấy các lượng đến 0,3mL
dung dịch pha loãng 10-1 của mẫu hoặc của mẫu thử dạng lỏng, dàn đều trên ba đĩa.
Lặp lại các thao tác này với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vơ
trùng mới cho mỗi dung dịch pha lỗng. Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch
bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến khi dịch lỏng hấp thu hết vào mơi trường.
Có thể sử dụng kỹ thuật cấy bằng phương pháp đổ đĩa nhưng trong trường hợp
này sự tương đương của các kết quả phải được đánh giá bằng cách so sánh với kết quả
được cấy trên bề mặt đĩa. Phương pháp cấy bề mặt có thể cho kết quả định lượng cao
hơn. Kỹ thuật dàn đĩa tạo điều kiện cho các tế bào tiếp xúc tối đa với oxi của khơng
khí và tránh mọi nguy cơ bị bất hoạt do nhiệt của chồi nấm. Các kết quả có thể phụ
thuộc vào từng loại nấm.
Ủ các đĩa đã chuẩn bị trong mơi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thế
thẳng đứng trong tủ ấm ở 25 ± 1oC trong 3÷5 ngày. Khuyến cáo ủ các đĩa trong túi
chất dẻo để không làm nhiễm bẩn tủ ấm trong trường hợp nấm mốc lan ra ngoài đĩa.
Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định
Đếm các đĩa trong khoảng thời gian ủ từ 3÷5 ngày. Chọn các đĩa chứa ít hơn

150 khuẩn lạc và đếm chúng. Nếu trên các đĩa có nấm mốc mọc quá nhanh thì có thể
đếm các khuẩn lạc sau khi ủ 2 ngày và đếm lại sau khi ủ 5 ngày.
Tiến hành kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt giữa các tế bào nấm men
hoặc nấm mốc và vi khuẩn từ các khuẩn lạc, nếu cần.
Đếm các khuẩn lạc nấm men và nấm mốc riêng lẽ, nếu cần.
12


Để nhận biết nấm men và nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra để
kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc cấy trên mơi trường phân lập hoặc nhận dạng thích
hợp.
Đếm các đĩa chứa từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc. Nếu hệ nấm gồm chủ yếu
là các nấm mốc, thì chọn các đĩa có vùng phát triển thấp hơn; nếu hệ nấm gồm chủ yếu
là các nấm men, thì chọn các đĩa có số đếm lên đến giới hạn trên để đếm.
Nếu việc nhận biết các khuẩn lạc cịn có sự nghi ngờ, thì kiểm tra bằng cách soi
tươi hoặc nhuộm màu tế bào từ ít nhất năm khuẩn lạc trên mỗi mẫu để khẳng định sự
khơng có mặt của vi khuẩn.

13


2.2. Định lượng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp màng petrifilm
2.2.1. Giới thiệu về petrifilm
Đĩa petrifilm là đĩa chứa môi trường làm sẵn thay thế cho môi trường agar
truyền thống. Mỗi đĩa gồm chất gel hòa tan trong nước, dinh dưỡng và chất chỉ thị
được làm khô và cố định trên lớp film mỏng.
Khi tiến hành thí nghiệm, 1ml mẫu được cấy vào petrifilm và ủ. Chất màu đặc
biệt trên đĩa khiến các khuẩn lạc có màu đặc trưng dễ dàng phân biệt bằng mắt thường.
Và các đường kẻ ô vuông sẽ giúp cho việc đếm số lượng khuẩn lạc dễ dàng hơn.
Trong kỹ thuật này, môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định trên

một giá thể mỏng và được phủ bằng một màng bảo vệ.
Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ được tách một phần để có thể bổ sung 1ml dịch
mẫu lên bề mặt mơi trường, sau đó phủ lại bằng màng bảo vệ.
Đĩa petrifilm có thể kiểm tra hầu hết các loại vi sinh vật phổ biến và không cần
qua các bước khẳng định sinh hóa như phương pháp truyền thống.
2.2.2. Ưu điểm và nhược điểm màng petrifilm
❖ Ưu điểm

Dễ thao tác.
Kết quả nhất quán.
Thời gian sử dụng lâu.
Không cần hấp khử trùng môi trường.
Nhanh, loại bỏ các bước chuẩn bị môi trường.
Thiết kế nhỏ gọn, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản.
❖ Nhược điểm

Giá thành cao.
Miếng petrifilm có khả năng làm nhịe khuẩn lạc khi mọc to.
14


Phải lưu trữ lạnh.
Phải sử dụng hết 1 gói trong khoảng thời gian nhất định khi đem ra khỏi tủ lạnh
và khơng được để lại tủ lạnh.
Có khả năng lây nhiễm khéo giữa các đĩa petrifilm với nhau trong quá trình
ni cấy.
2.2.3. Quy trình định lượng
Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10mL đối với
mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện, với sai số cho phép ±5% cho vào bao PE vô

trùng (hoặc bình tam giác).
Cho dung dịch pha lỗng SPW 90mL (sai số cho phép ±5%) vô trùng vào bao
PE (hoặc bình tam giác) chứa mẫu.
Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác có
mẫu và dịch pha lỗng SPW trong 2-3 phút.
Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ
của dịch pha lỗng trong suốt q trình thao tác ln phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ
phịng.
Mục đích: Đồng nhất mẫu.
Bước 2: Pha lỗng mẫu
Dùng pipet vô trùng lấy 1mL huyền phù ban đầu với sai số ±5% cho vào một
ống nghiệm chứa 9mL dịch pha lỗng SPW vơ trùng ở nhiệt độ thích hợp.
Để có độ chính xác tối ưu, khơng nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu hơn
1cm. Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha lỗng vơ trùng.
Trộn đều bằng máy vortex trong 5-10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10 -2
(đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1).
Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha lỗng 10 -3, 10-4, 10-5,… cho đến
khi đạt được nồng độ pha loãng thích hợp.
15


Mục đích: pha lỗng mẫu.
Bước 3: Cấy và ủ mẫu
Đặt đĩa đếm nấm men và nấm mốc lên bề mặt mặt phẳng. Nhất tấm màng mỏng
phía trên ra, giữ pipet vng góc với đĩa và cấy cẩn thận 1 mL huyến phù thử nghiệm
vào chính giữa mảng mỏng. Đậy tấm màng mỏng phía trên xuống chất cấy.
Dùng tay nhấc que dàn mẫu bằng chất dẻo. Dóng thẳng tâm que dán mẫu với
tâm dĩa. Dàn đều huyền phù bằng cách ấn nhẹ que dàn mẫu xuống tâm đĩa. Không gạt
que dàn mẫu từ bên này sang bên kia màng mỏng. Lấy que dàn mẫu ra và để yên đĩa
trong 1giây cho đông đặc lại.

Đặt các đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang, hướng lên trên, không chồng
cao quá 20 đĩa. Ủ các đĩa này năm ngày ở nhiệt độ từ 20°C đến 25°C.
Mục đích: Giúp dịch lỏng hấp thu được vào bề mặt mơi trường.
Bước 4: Đếm khuẩn lạc
Để tính số nấm men và nấm mốc, nhân số lượng tổng số nấm men và nấm mốc/
đĩa (hoặc số lương tSrung bình các khuẩn lạc/đĩa, nếu đếm các đĩa kép của cùng một
độ pha loãng) với hệ số pha loãng tương ứng. Khi đếm các khuẩn lạc trên các đĩa kép
của các độ pha lỗng kế tiếp, thì tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho mỗi Sđộ
pha lỗng trước khi xác định trung bình số đếm của nấm men và nấm mốc.
Tiến hành kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt giữa các tế bào nấm men
hoặc nấm mốc từ các khuẩn lạc nếu cần.
Mục đích: nhận biết nấm men, nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra
để kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc cấy trên mơi trường phân lập hoặc nhận dạng thích
hợp.

16


Chương 3 Kết quả
3.1. Tính tốn kết quả
Tổng số nấm men hoặc nấm mốc trong 1g mẫu (X) được tính theo cơng thức:
N=

ΣCC
CFU
CFU
hay
g
ml
V × [ n1+ ( 0.1× n2 ) ] ×d

(

)

Trong đó:
N: là số khuẩn lạc trên 1mL (1g) mẫu
C: là tổng số khuẩn lạc nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên 4 đĩa của 2 độ
pha loãng liên tiếp.
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml.
n1: Số đĩa ở độ pha lỗng thứ nhất được giữ lại.
n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại.
d: Độ pha loãng đầu tiên được giữ lại.
Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa (chẳng hạn 2864 làm trịn
thành 2900).
Biểu thị công thức:
a x 10n
a: chữ số thập phân tương ứng có giá trị từ 1.0 đến 9.9
n: số mũ phù hợp của 10
3.2. Ví dụ
Tính kết quả tổng vi sinh vật hiếu khí.
Độ pha lỗng
Số khuẩn lạc

10−3

10−4

168

19

173

15

Số khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí đếm được trên hai độ pha loãng liên tiếp là:
17


Ở độ pha loãng d= 10−3 : đếm được 168 khuẩn lạc và 173 khuẩn lạc.
Ở độ pha loãng d= 10−4: đếm được 19 khuẩn lạc và 15 khuẩn lạc, ta có:
X=

168+173+ 15+ 19
=170454
−3
1 ×⟦ 2+(0,1 ×2) ⟧×10

Làm trịn kết quả là 1,7 ×10 5 CFU/g hoặc CFU/ml

18


Kết luận
Với phương pháp định lượng nấm men và mốc bằng phương pháp đếm khuẩn
lạc và petrifilm giúp chúng ta hiểu sâu và khái niệm nấm mốc và nấm men. Bên cạnh
đó giúp chúng ta chọn được mơi trường và hóa chất thích hợp để ni cấy lồi vi sinh
vật này phát triển. Đếm khuẩn lạc giúp chúng ta biết được cách đếm sao cho đúng và
màng petrifilm để điếm định lượng và đếm nhanh vi sinh vật. Qua đó ta có thể tính

tốn kết quả ít sai số trong việc ghi nhận kết quả.

19


Tài liệu tham khảo
[1] Giáo trình phân tích vi sinh. Khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Công
nghiệp Thực phẩm TP.HCM, 2002.
[2] Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8275-2:2010 (ISO 21527-2:2008) Vi sinh vật trong
thực
phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc – Phần
2:
Kỹ thuật đếm khuẩn lạc trong các sản phẩm có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0,95,
2010.
[3] Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần) Vi sinh vật học
Hướng dẫn chung về việc chuẩn bị các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh vật.
[4] Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7852:2008 Thực phẩm - đếm nấm men và nấm mốc
bằng phương pháp màng khơ có thể hồn nước (phương pháp petrifilm).

20