Xây dựng phương pháp định lượng metoprolol trong chế phẩm bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


LÊ PHƯƠNG NGÂN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG METOPROLOL TRONG CHẾ
PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
QUANG PHỔ HUỲNH QUANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI – 2014





BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




LÊ PHƯƠNG NGÂN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG METOPROLOL TRONG CHẾ
PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
QUANG PHỔ HUỲNH QUANG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





Người hướng dẫn:
Ths. Phạm Lê Minh
Ths. Đặng Thị Ngọc Lan
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2014



LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin được gửi tới thầy, cô giáo – ThS. Phạm Lê Minh,
ThS. Đặng Thị Ngọc Lan lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất. Thầy và cô là
những người đã trực tiếp giao đề tài và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi
trong quá trình hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Hóa Phân tích – Độc chất

trường Đại học Dược Hà Nội, các anh chị kỹ thuật viên đã giúp đỡ, tạo điều
kiện thuận lợi về máy móc, trang thiết bị, cơ sở vật chất cũng như hóa chất,
dụng cụ trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài.
Và tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, các thầy
cô Phòng Đào tạo và các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã hướng dẫn,
cho tôi kiến thức của 5 năm chương trình đào tạo Dược sỹ Đại học để tôi có thể
hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn Bố mẹ và những người thân trong gia
đình tôi, cảm ơn tất cả bạn bè đã luôn động viên, cổ vũ để tôi hoàn thành tốt
khóa luận của mình.

Hà Nội, tháng 05, năm 2014
Sinh viên


Lê Phương Ngân





MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Metoprolol tartrat 2
1.1.1. Công thức cấu tạo 2

1.1.2. Đặc điểm dược lý 2
1.1.3. Các phương pháp định lượng 3
1.2. Phương pháp huỳnh quang 5
1.2.1. Hiện tượng huỳnh quang 5
1.2.2. Sự tạo thành phổ huỳnh quang – Cơ chế của sự phát quang 5
1.2.3. Cường độ huỳnh quang 7
1.2.4. Phổ huỳnh quang 8
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành huỳnh quang 10
1.2.6. Máy quang phổ huỳnh quang 12
1.2.7. Ứng dụng của quang phổ huỳnh quang 13
1.3. Phương pháp HPLC 14
1.3.1. Khái niệm 14
1.3.2. Nguyên tắc 14
1.3.3. Một số thông số đặc trưng của HPLC 14
1.3.4. Ứng dụng của HPLC 17
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu- Nguyên liệu và thiết bị 19
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 19
2.1.2. Nguyên liệu và thiết bị 19


2.2. Phương pháp nghiên cứu 20
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng metoprolol tartrat bằng quang
phổ huỳnh quang…………………………………………… 20
2.2.2. Thẩm định phương pháp 20
2.2.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ huỳnh quang để định lượng
metoprolol tartrat trong chế phẩm …22
2.2.4. Xử lý kết quả thực nghiệm 22
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… ….23
3.1. Kết quả thực nghiệm 23

3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng metoprolol tartrat bằng quang
phổ huỳnh quang ………………… ……………………………… ….23
3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng metoprolol tartrat 25
3.1.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ huỳnh quang để định lượng
trong chế phẩm ……………………………….………….………… 34
3.2. Bàn luận 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO












DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
UV – Vis (Utraviolet – Visble): Tử ngoại – khả kiến
Q (Quencher): Chất làm tắt hóa học
SĐK: Số đăng kí
BQ: Bảo quản
NSX: Ngày sản xuất
NXB: Nhà xuất bản

R: Hệ số tương quan tuyến tính
RSD: Độ lệch chuẩn
S
2
: Phương sai
TB: Trung bình
tt / tt: Thể tích/thể tích










DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của metoprolol
tartrat……………………………………………………………………… 27
Bảng 3.2. Kết quả xác định độ lặp lại của phương
pháp………………………………………………………………………….29
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ
đúng…………………………………………… 30
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống
HPLC…………………………………………………………………… …33
Bảng 3.5. Kết quả xác định hàm lượng metoprolol tartrat bằng phương pháp
HPLC ………………………………………………………………… ……34
Bảng 3.6. Kết quả định lượng metoprolol tartrat trong chế phẩm viên

nén………………………………………………………………………… 36











DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của metoprolol tartrat…………………… … 2
Hình 1.2. Phổ huỳnh quang của vitamin B
1
………………………………… 9
Hình 1.3. Phổ huỳnh quang của Natri salicylat………………………… 9
Hình 1.4. Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang…………………… 13
Hình 3.1. Phổ phát xạ của metoprolol tartrat nồng độ 2000ng/ml………… 24
Hình 3.2. Phổ kích thích của metoprolol tartrat 2000ng/ml…………………25
Hình 3.3. Phổ kích thích của chất thử và chất chuẩn metoprolol tartrat nồng
độ khoảng 2000ng/ml……………… ………………………………… 26
Hình 3.4. Phổ phát xạ của chất thử và chất chuẩn metoprolol tartrat nồng độ
khoảng 2000ng/ml ………………………………………………………… 26
Hình 3.5. Đường hồi quy tuyến tính của metoprolol tartrat……………… 28
Hình 3.6. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn metoprolol tartrat 500µg/ml……… 32
Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch thử metoprolol tartrat khoảng 500µg/ml… 32

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong cuộc sống hiện nay, bệnh tim mạch là bệnh khá phổ biến, là gánh
nặng sức khỏe chính yếu, là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế
giới. Trong đó, tăng huyết áp (hay còn gọi là cao huyết áp) là bệnh rất tiêu biểu
và thường gặp nhất. Nếu không được chẩn đoán và điều trị có thể gây ra các
biến chứng nặng nề như tai biến mạch máu não, suy thận… ảnh hưởng xấu đến
chất lượng cuộc sống của người bệnh, trở thành gánh nặng cho gia đình và xã
hội. Do đó thuốc điều trị tim mạch cũng như tăng huyết áp ngày càng chiếm tỷ
trọng lớn, có vai trò quan trọng trong công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp Dược phẩm trong và
ngoài nước trong nhiều năm gần đây, có rất nhiều loại thuốc được đưa vào sử
dụng với nhiều hàm lượng hoạt chất khác nhau của các nhà sản xuất khác nhau.
Tuy nhiên không phải hoạt chất nào cũng có chuyên luận riêng trong Dược điển
Việt Nam. Một trong số đó là metoprolol tartrat, hoạt chất được sử dụng phổ
biến để điều trị các bệnh tim mạch. Do đó đánh giá đúng và kịp thời chất lượng
các chế phẩm thuốc trên thị trường là yêu cầu bắt buộc. Để góp phần xây dựng
các phương pháp định lượng metoprolol tartrat có khả năng ứng dụng trong
công tác kiểm nghiệm thuốc, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương
pháp định lượng metoprolol trong chế phẩm bằng phương pháp quang
phổ huỳnh quang” với hai mục tiêu:
- Xây dựng phương pháp định lượng metoprolol tartrat bằng phương pháp
quang phổ huỳnh quang, lấy phương pháp HPLC là phương pháp đối chiếu.

- Ứng dụng phương pháp để định lượng metoprolol tartrat trong chế phẩm.



2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Metoprolol tartrat
1.1.1. Công thức cấu tạo [19]
O
CH
3
O NH CH
3
CH
3
H
OH
2

H OH
CO
2
H
OH
H
CO
2
H

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của metoprolol tartrat.
- Tên khoa học: 2-propanol,1-[4-(2-methoxyethyl)phenoxy]-3-[(1-
methylethyl)amino]-, (±)-, [R- (R
*
, R
*
)]-2,3-dihydroxybutandioat (2 : 1)
- Công thức hóa học:
















- Khối lượng phân tử: 684,81
- Tính chất: Bột màu trắng hoặc gần như trắng, hay tinh thể không màu
Dễ tan trong nước và alcol.
1.1.2. Đặc điểm dược lý [1]
1.1.2.1. Dạng dùng và hàm lượng
Viên nén 50mg, 100mg metoprolol tartrat. Viên nén giải phóng chậm 50

mg, 100mg, 200mg metoprolol tartrat, metoprolol succinat.
Ống tiêm (metoprolol tartrat) 5mg/5 ml. Mỗi ống tiêm chứa 45mg natri
clorid.
1.1.2.2. Dược động học
Sau khi uống, metoprolol tartrat được hấp thụ gần như hoàn toàn, nhưng
khả dụng sinh học tương đối thấp (khoảng) do sự chuyển hóa ban đầu.
Nồng độ của thuốc trong huyết tương thay đổi trong phạm vi rộng (tới 17 lần),
3

có lẽ do những khác biệt di truyền trong tốc độ chuyển hóa. Metoprolol chuyển
hóa mạnh bởi hệ thống monooxygenase ở gan, và chỉ  thuốc đã uống được
đào thải dưới dạng không biến đổi trong nước tiểu. Nửa đời của metoprolol từ
3 đến 4 giờ.
1.1.2.3. Tác dụng
- Metoprolol là một thuốc đối kháng chọn lọc beta1 - adrenergic không có
hoạt tính nội tại giống thần kinh giao cảm. Tuy nhiên tác dụng không tuyệt
đối trên thụ thể beta1 - adrenergic nằm chủ yếu ở cơ tim và metoprolol khi
dùng liều cao cũng ức chế cả thụ thể beta2 - adrenergic nằm chủ yếu ở hệ
cơ phế quản và mạch máu.
- Metoprolol không có những tính chất chủ vận - beta, và có rất ít tác dụng ổn
định màng. Thuốc có tác dụng giảm lực co cơ và nhịp tim.
1.1.2.4. Chỉ định
- Tăng huyết áp
- Đau thắt ngực
- Phòng ngừa nhồi máu cơ tim
- Loạn nhịp tim
- Suy tim trung bình hay nhẹ
1.1.2.5. Độ ổn định và bảo quản
- Bảo quản viên nén metoprolol ở nhiệt độ 15 – 30
°

C và chống ẩm mốc. Ðựng
thuốc trong lọ kín, tránh ánh sáng.
- Bảo quản thuốc tiêm ở nhiệt độ không quá 30
°
C. Tránh ánh sáng.
1.1.3. Các phương pháp định lượng
Phương pháp
Đặc điểm
Tài liệu tham
khảo
Quang phổ UV
Định lượng metoprolol trong chế phẩm:
Dung môi: Ethanol tuyệt đối
[10]
4

Đo quang tại bước sóng 274nm
Định lượng metoprolol tatrat trong chế
phẩm:
Tạo phản ứng trong methanol của
metoprolol và clorodinitrobenzen và đo
quang trong hợp chất màu vàng tại λ =
425nm
[13]
HPLC

Định lượng đồng thời metoprolol tatrat và
hydroclothiazid trong chế phẩm:
Pha động: acid phosphoric 0,5%: methanol
: acetonitril = 35 : 15 : 50
Cột: LiChrosorb C18 10µm, 250mm ×
4,6mm
Tốc độ dòng: 1ml/phút
Detector: 280nm
[17]
Định lượng metoprolol tartrat trong chế
phẩm:
Tạo dẫn xuất trước cột bởi metoprolol
tartrat và phức Cu (II) – dithiocarbamat
Pha động: methanol : đệm phosphat pH 5,8
= 80 : 20
Cột: C18 10µm; 3,5nm×300nm

Tốc độ dòng: 1,5ml/phút
Detector: 275nm
[15], [18]
Định lượng metoprolol tartrat trong huyết
tương:
[16]
5



Pha động: acetonitril : nước : triethylamin
= 18 : 81 : 1
Cột: C18 250mm × 4mm, 10µm
Tốc độ dòng: 1ml/phút
Detector: 254nm
Quang phổ
huỳnh quang
đồng bộ
Định lượng đồng thời metoprolol tartrat và
felodipin trong chế phẩm:
Dung môi: Nước
Δλ = 70nm
λ
max
= 260nm
[14]
Sắc ký khí
ghép khối phổ
Định lượng metoprolol trong nước tiểu
người :

Tạo dẫn xuất metoprolol tartrat với
N- Methyl- N- trifloroacetamid
Pha động: ethylacetat : diethylether =
2 : 1 (tt/tt)
Cột: HP-5 MS 0,25µm, 30m × 0,25mm
Tốc độ dòng: 1ml/phút
[8]

1.2. Phương pháp huỳnh quang
1.2.1. Hiện tượng huỳnh quang [5],[6]
Một chất khi hấp thụ năng lượng ở giới hạn nào đó sẽ làm kích thích hệ
electron của phân tử. Ở trạng thái kích thích phân tử chỉ tồn tại 10
-8
giây, nó lập
tức trở về trạng thái cơ bản ban đầu và giải tỏa năng lượng dưới dạng ánh sáng,
hiện tượng này gọi là phát quang. Khi tác nhân kích thích là các tia tử ngoại
hoặc phần có bước sóng ngắn của ánh sáng khả kiến ta có hiện tượng phát
quang quang học hay còn gọi là huỳnh quang.
6

1.2.2. Sự tạo thành phổ huỳnh quang – Cơ chế của sự phát quang [2],[5],[6]
Theo thuyết lượng tử, mỗi hạt sơ cấp (ion, nguyên tử, phân tử) có một hệ
thống duy nhất các trạng thái năng lượng. Trạng thái năng lượng thấp nhất gọi
là trạng thái cơ bản (S
0
). Khi bị kích thích, như được hấp thụ photon ánh sáng
thì năng lượng của photon sẽ được truyền sang hạt và hạt sẽ được chuyển sang
năng lượng cao hơn gọi là trạng thái kích thích S
1
, S

2
…(ở mỗi trạng thái phân
tử có thể tồn tại ở các phân mức năng lượng khác nhau 0, 1, 2, 3…) sau một
thời gian rất ngắn (10
-9
-10
-6
giây) các hạt ở trạng thái kích thích sẽ trở về trạng
thái cơ bản ban đầu theo một trong các hiện tượng dưới đây:
- Hiện tượng bất hoạt: Các phân tử ở mức năng lượng cao của trạng thái này
trở về mức năng lượng thấp nhất của trạng thái và giải phóng ra năng lượng
dưới dạng nhiệt năng do va chạm giữa các phân tử làm tăng nhiệt độ môi
trường, gọi là hiện tượng phục hồi không bức xạ hay là sự thư giãn để phục
hồi dao động sau khi bị kích thích (thời gian phục hồi là nhỏ hơn 10
-12
giây).
- Hiện tượng chuyển nội: Các nguyên tử từ mức thấp nhất của trạng thái kích
thích chuyển về trạng thái cơ bản giải phóng ra năng lượng bằng cách bức
xạ ra các photon ánh sáng, gọi là sự phục hồi có bức xạ, ánh sáng có bức xạ
này chính là sự huỳnh quang (kéo dài từ 10
-9
 10
-6
giây).
- Hiện tượng vượt nội hệ: Các phân tử trạng thái kích thích S
1
không chuyển
về trạng thái cơ bản S
0
mà chuyển sang trạng thái siêu bền T

1
,

rồi mới từ T
1

chuyển về S
0
và bức xạ các photon ánh sáng làm cho quá trình phát quang
xảy ra chậm gọi là huỳnh quang chậm hoặc lân quang (10
-3
 10 giây).
Trong hiện tượng phát quang, một phần năng lượng của ánh sáng kích
thích bị tiêu tốn chuyển thành nhiệt năng do hiện tượng bất hoạt vì vậy năng
lượng ánh sáng kích thích bao giờ cũng lớn hơn năng lượng ánh sáng phát xạ,
hay nói cách khác bước sóng của ánh sáng bức xạ luôn dài hơn bước sóng của
ánh sáng kích thích, tạo ra sự dịch chuyển cực đại phát quang về phía bước
7

sóng dài hơn so với cực đại hấp thụ, gọi là sự dịch chuyển Stock. Chất nào có
độ dịch chuyển Stock càng lớn thì phép đo huỳnh quang càng chính xác (vì ít
bị ảnh hưởng của phổ hấp thụ).
1.2.3. Cường độ huỳnh quang [2], [5]
Phương pháp huỳnh quang dựa trên nguyên tắc: Khi chiếu một chùm tia
tử ngoại (bức xạ kích thích) vào một số chất, các chất này phát ra bức xạ nhìn
thấy có bước sóng xác định tùy thuộc từng chất và có cường độ phụ thuộc vào
hàm lượng của chúng.
Nếu ta chiếu xạ mẫu bằng một dòng bức xạ đơn sắc chứa photon có năng
lượng ứng với hiệu năng lượng cần thiết cho quá trình hấp thụ thì một phần của
cường độ bức xạ tới I

0
sẽ bị hấp thụ và cường độ bức xạ truyền qua I sẽ nhỏ
hơn cường độ bức xạ tới I
0
.
Trong điều kiện nhất định cường độ bức xạ huỳnh quang I
h
sẽ tỷ lệ thuận
với cường độ bức xạ hấp thụ (I
0
- I) theo:




 




Hằng số k phụ thuộc vào chất phân tích, môi trường và có quan hệ với
hiệu suất phát ra photon của nguyên tử hay phân tử khi từ trạng thái kích thích
về trạng thái cơ bản. Cường độ bức xạ truyền qua có quan hệ với nồng độ chất
phân tích theo định luật Lambert- Beer như sau:










Thế phương trình (1.2) vào phương trình (1.1) ta được:





  







Phương trình (1.3) có thể triển khai thành chuỗi Taylor cho kết quả là:


















 


Nếu εlC < 0,01 thì các số hạng bậc cao có giá trị không đáng kể (< 1%) nên có
thể bỏ qua và:
8










Trong đó:

: Cường độ bức xạ tới
 : Cường độ bức xạ truyền qua


: Cường độ bức xạ huỳnh quang
 : Hệ số hấp thụ mol của chất phân tích
 : Chiều dày của lớp dung dịch (cm)

: Nồng độ chất phát quang trong dung dịch (mol/l)
Tóm lại, trong điều kiện nồng độ bé (tức là, có độ hấp thụ nhỏ εlC <
0,01) thì cường độ bức xạ huỳnh quang sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân
tích và với cuờng độ bức xạ tới 

. Đây là cơ sở của phương pháp huỳnh quang
phân tử dùng xác định nồng độ C của chất phân tích theo cường độ huỳnh quang


. Nếu dung dịch C có nồng độ lớn hơn (εlC > 0,01), thì sẽ xảy ra sự tắt huỳnh
quang, không còn sự tuyến tính giữa nồng độ và cường độ huỳnh quang nữa.
1.2.4. Phổ huỳnh quang [2], [5]
- Phổ kích thích
Là đường biễu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang tương đối theo
bước sóng của ánh sáng kích thích.
- Phổ phát xạ
Là đường biễu diễn sự phụ thuộc cường độ phát quang tương đối (cường độ
huỳnh quang của chất đã được hoạt hóa) theo bước sóng của ánh sáng phát xạ.
- Ví dụ:
9


Hình 1.2. Phổ huỳnh quang của vitamin 

.

(Cực đại kích thích và phát xạ là 370nm, 425nm)
- Lưu ý
Khi ghi phổ huỳnh quang của một số chất ta thu được ngoài phổ huỳnh
quang còn một số phổ khác như ánh sáng tán xạ, của giải Raman, của dung môi

và cốc đo, của ánh sáng tán xạ thứ cấp hay ánh sáng phản xạ nhưng phổ huỳnh
quang của mẫu vẫn thể hiện rõ rệt nhất và dựa vào phổ này ta có thể xác định
được cực đại bức xạ của chất đó.
Ví dụ: Natri salicylat có cực đại bức xạ 435nm

Hình 1.3. Phổ huỳnh quang của Natri salicylat.
10

1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành huỳnh quang [2], [5], [6]
1.2.5.1. Ảnh hưởng của cấu trúc phân tử đến hiệu suất huỳnh quang
 Cấu tạo phân tử
- Các chất có dây nối đôi liên hợp thì có khả năng phát quang, và càng nhiều
dây nối đôi liên hợp thì khả năng phát quang càng cao. Ví dụ:
Các chất vô cơ hay các chất hydrocarbon no hầu như không phát quang.
Các hợp chất thơm có khả năng phát quang và càng nhiều vòng thơm
ngưng tụ thì hiệu suất huỳnh quang càng lớn.
- Các nhóm chức có khả năng cho điện tử thì làm tăng hiệu suất huỳnh quang.
Ví dụ:,

,

…
- Các nhóm chức có khả năng nhận điện tử thì làm giảm hiệu suất huỳnh
quang. Ví dụ:

,…
- Vị trí các nhóm thế trên nhân thơm có thể làm tăng hoặc giảm hiệu suất
huỳnh quang.
Ví dụ: Vị trí para và ortho làm tăng sự không định vị của điện tử trên nhân
thơm, cũng làm tăng hiệu suất huỳnh quang, ngược lại vị trí meta thì làm

giảm.
- Đồng phân cis làm tăng phát quang và đồng phân trans làm giảm phát quang
của một hợp chất.
 Độ cứng nhắc của phân tử
Các chất có cấu tạo cứng nhắc thì khả năng phát quang cao, và ngược
lại.
Ví dụ: Flourene, Rsamine, Flourescein: Phát quang mạnh
Biphenyl, Malachite, phenophtalein: Không phát quang
 Tạo dẫn chất
Có những hợp chất bình thường phát quang yếu nhưng khi tạo dẫn chất
thì phát quang mạnh. Ví dụ:
11

Không phát quang
Phát quang mạnh
Tetracyclin
Tetracyclin + 

+ Barbiturat
Hydrocortison
Hydrocortison + 




đặc + Ethanol
Vitamin 


Thiocrom

Adrenalin
Adrenochrom

1.2.5.2. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang
 Sự có mặt của các chất tan khác
Có thể gây ra các hiện tượng sau:
- Hiệu ứng lọc nội: Các chất khác có thể không phát quang nhưng lại hấp thụ
ánh sáng của chất phát quang làm giảm cường độ huỳnh quang.
- Sự làm tắt hóa học: Các chất khác làm tắt một phần hay toàn bộ cường độ
phát quang do va chạm hay làm biến đổi hóa học của chất phát quang.
Cơ chế:   




  
Trong đó F là chất phân tích có khả năng phát huỳnh quang




Do
va chạm nên: 

  


Kết quả là Q đóng vai trò là chất làm tắt hóa học (Quencher).
Ví dụ: 


là  của Quinin cho nên trong môi trường  thì Quinin
không phát quang.
 là  của Acridin nên trong các xét nghiệm sinh hóa có thể sử dụng
Acridin trong định lượng
 Nồng độ của ion 

, và vai trò của 
pH có vai trò quan trọng. Một số chất có tính acid yếu hay base yếu thì
cường độ phát quang phụ thuộc nhiều vào pH. Ví dụ:
Ta có acid AH, trong nước AH phân ly theo phương trình:
12






Nếu dạng phát quang là AH thì khi 

tăng, phản ứng theo chiều nghịch,
 tăng. Nếu dạng phát quang là 

thì  sẽ giảm trong môi trường acid và tăng
trong môi trường kiềm.
 Ảnh hưởng của dung môi
Cường độ phát quang và bước sóng cực đại thay đổi theo dung môi và
những tác động khác nhau.
Ví dụ: Sự tắt huỳnh quang hóa học do dung môi: Quininsulfat phát quang
mạnh trong môi trường 




, nhưng không phát quang trong môi trường HCl;
oxy hòa tan trong dung môi làm biến đổi hóa học chất phát quang.
Độ nhớt làm tăng cường độ phát quang.
Độ tinh khiết của dung môi: Dung môi có tạp huỳnh quang làm sai lệch
kết quả của phép đo.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ tăng làm giảm cường độ phát quang do làm tăng tần số va chạm
của phân tử làm cho hiện tượng bất hoạt tăng lên. Do vậy trong máy quang phổ
huỳnh quang, đèn nguồn có công suất lớn nên phải có kính cách nhiệt hoặc có
bộ phận làm mát đèn.
1.2.6. Máy quang phổ huỳnh quang [2]
Máy quang phổ huỳnh quang cũng có các bộ phận chính như: nguồn
sáng, bộ phận đơn sắc hóa, buồng đo và bộ phận phát hiện.
13


Hình 1.4. Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang.
- Nguồn sáng trong máy quang phổ huỳnh quang có nhiệm vụ tạo ra bức xạ
kích thích cần thiết. Nguồn sáng thường dùng là đèn xenon có khả năng phát
ra bức xạ trong khoảng rộng 200-800nm nhưng phổ bức xạ không đều, các
tia UV mạnh hơn các tia Vis. Ngoài ra người ta còn dùng nguồn cảm ứng
laser.
- Bộ đơn sắc hóa gồm 2 phần đơn sắc hóa bức xạ kích thích và đơn sắc hóa
bức xạ huỳnh quang. Hai bộ phần này bố trí trước và sau buồng đo.
- Buồng đo được bố trí sao cho phương nguồn sáng và phương thu tín hiệu
vuông góc với nhau. Do đó cốc đo phải là cốc có 2 mặt trong suốt vuông
góc với nhau hay cả 4 mặt trong suốt. Để tăng tín hiệu đến bộ phận thu người
ta có thể bố trí thêm gương phía đối diện.

1.2.7. Ứng dụng của quang phổ huỳnh quang [2], [3]
- Định tính: Có thể dựa vào bước sóng kích thích và bước sóng huỳnh quang
để định tính các hợp chất.
- Định lượng: Do phương pháp huỳnh quang có độ nhạy và độ đặc hiệu cao
 Có thể đo cường độ huỳnh quang và dùng phương pháp so sánh để
định lượng các hợp chất có khả năng huỳnh quang lớn.
14

 Với những chất không có huỳnh quang có thể tác dụng với thuốc thử
không huỳnh quang để tạo ra dẫn chất có huỳnh quang hay dùng thuốc
thử có huỳnh quang để đo và sử dụng các cách xử lý thích hợp.
Ngoài ra phương pháp huỳnh quang còn được sử dụng trong bộ phận
phát hiện của sắc ký lỏng vì tính đặc hiệu cao và độ nhạy của nó, với nguồn
sáng laser có thể phát hiện tới 10
-12
g.
1.3. Phương pháp HPLC [2], [3]
1.3.1. Khái niệm
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở
của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển
của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân
bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.
1.3.2. Nguyên tắc
Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất vào hai pha không trộn lẫn
nhưng luôn tiếp xúc với nhau, trong đó pha động là chất lỏng được đẩy qua pha
tĩnh trong cột nhờ bơm cao áp. Dung dịch chất cần phân tích được đưa vào hệ
thống nhờ van tiêm mẫu, được pha động kéo tới cột nhờ áp lực của bơm. Tại
cột xảy ra quá trình phân bố và tách các chất. Những chất có ái lực thấp với pha
tĩnh được rửa giải ra trước, chất có ái lực cao với pha tĩnh rửa giải ra sau. Sau
khi ra khỏi cột, các chất được detector phát hiện và ghi lại dưới dạng pic.

1.3.3. Một số thông số đặc trưng của HPLC
1.3.3.1. Thời gian lưu 


Thời gian lưu là thời gian cần thiết để một chất di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc kí, tới detector và cho pic trên sắc kí đồ tính từ lúc tiêm đến
lúc xuất hiện đỉnh của pic.
15

Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính trên sắc kí đồ của một chất
tan. Trong những điều kiện sắc kí nhất định, thời gian lưu của một chất tan là
hằng số.
Thời gian chết (t
0
): thời gian lưu của chất tan không bị giữ lại bởi pha
tĩnh.
Thời gian lưu thực: 



 


Thời gian lưu phụ thuộc:
 Bản chất của pha tĩnh.
 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
 Cấu tạo, bản chất của phân tử chất tan.
 Trong một số trường hợp 

phụ thuộc vào  pha động.

1.3.3.2. Thể tích lưu ( 

)
Thể tích lưu của một chất tan là thể tích của lượng pha động bị đẩy ra
khỏi cột từ lúc bắt đầu tiêm mẫu thử đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên
sắc kí đồ.




  
Trong đó 

: Thời gian lưu
: Lưu lượng của pha động.
1.3.3.3. Hệ số phân bố (K)
Hệ số phân bố là tỷ lệ nồng độ chất tan trong pha tĩnh và nồng độ chất tan
trong pha động





 
Trong đó : Hệ số phân bố.


: Nồng độ chất tan trong pha tĩnh.



:
Nồng độ chất tan trong pha động.
Trong sắc kí phân bố, khi tiến hành tách hỗn hợp 2 chất tan A, B.
16





 Quá trình sắc kí không tách được A, B.




: A, B phân bố khác nhau trong pha tĩnh và pha động, nên sẽ
tách khỏi nhau trong quá trình sắc kí. Hệ số phân bố khác nhau càng
nhiều thì khả năng tách hai chất chất càng lớn.
1.3.3.4. Hệ số dung lượng (k’)





 













Trong đó: 

, 

: lượng chất tan trong pha tĩnh, pha động.


,


: thể tích của pha tĩnh, pha động.
: Hệ số phân bố.
Trị số tối ưu 
1.3.3.5. Số đĩa lý thuyết (N)
 






 





 




Trong đó : Số đĩa lý thuyết


: Thời gian lưu
: Chiều rộng đo ở đáy pic.


: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Ngoài ra, số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau:




Trong đó : Chiều dài cột sắc kí
: Chiều cao của đĩa lý thuyết
Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột. Khi phân tích yêu cầu N ≥ 3000
1.3.3.6. Hệ số đối xứng 




Trong đó:
17

a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu 
1.3.3.7. Độ phân giải (R
S
)
















Phương trình trên thích hợp cho việc tính R
S
khi hai pic tách hẳn nhau (tức
R
S
≥ 1,5).

Trong trường hợp 

nhỏ hơn, tức hai pic bị trùng lấp một phần, thì việc xác
định W
A
, W
B
sẽ khó khăn hơn là 
 


và 
 


lúc này 

sẽ được tính
theo công thức:












 
 



 











  




  




trong đó: 

, 


: thời gian lưu của hai pic liền kề nhau


, 

: chiều rộng đo ở đáy của hai pic
W
1/2(A)
, W
1/2(B)
: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic của chất
A, B.


: Hai pic tách khỏi nhau rõ ràng


: Hai pic chưa tách hẳn, còn xen phủ nhau


 Hai pic chưa tách hẳn.
1.3.4. Ứng dụng của HPLC
- Định tính