Định tính v cholerae và v parahaemolyticus

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
----------

TIỂU LUẬN MƠN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: Định Tính V.Cholerae Và
V.Parahaemolyticus

NHĨM 13

TP.
HCM, tháng
11 năm
BỘ CÔNG
THƯƠNG
2022

PAGE \*
MERGEFORMAT iv


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
-----------

TIỂU LUẬN MÔN: VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: CƠ CHẾ VẬN CHUYỂN CÁC CHẤT
QUA MÀNG TẾ BÀO VI SINH VẬT

Nhóm: 13

PAGE \*
MERGEFORMAT iv


DANH MỤC HÌNH ẢNH, BẢNG BIỂU
Hình
1.1
1.2
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
Bảng
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9

3.10

Nội dung
Vi khuẩn V.cholerae
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Môi trường APW
Môi trường TCBS agar
Khuẩn lạc V.Cholerae trên mơi trường TCBS
Kết quả thử nghiệm tính di động
Thử nghiệm oxidase
Thử nghiệm TSI
Thử nghiệm ONPG
Thử nghiệm Indol
V.Parahaemolyticus trên môi trường TCBS
V.Parahaemolyticus trên môi trường TSTA
Nội dung
Thiết bị và dụng cụ
Môi trường và hóa chất
Thành phần mơi trường APW
Thành phần mơi trường thạch TCBS
Các phép thử nhận dạng giả định
Thử nghiệm khẳng định
Thiết bị và dụng cụ
Mơi trường và hóa chất
Thành phần môi trường TSTA
Thử nghiệm khẳng định

PAGE \*
MERGEFORMAT iv

MỤC LỤC
BẢNG ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC CƠNG VIỆC NHĨM

i

DANH MỤC HÌNH ẢNH, BẢNG BIỂU

ii

MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ V.CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS
4
1.1. V.Cholerae

4

1.1.1. Đặc điểm sinh học

4

1.1.2. Nguồn nhiễm

4

1.1.3. Tác hại

4

1.2. V.Parahaemolyticus

5

1.2.1. Đặc điểm sinh học

5

1.2.2. Nguồn nhiễm

6

1.2.3. Tác hại

6

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH

7

2.1. Truyền thống

7

2.1.1. Phạm vi áp dụng

7

2.1.2. Nguyên tắc

7

2.2. Hiện đại

7

2.2.1. Phương pháp miễn dịch học – ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assays) 7
2.2.2. Phương pháp PCR

7

CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH

9

3.1. Truyền thống

9

3.1.1. V.Cholerae

9

3.1.2. V.Parahaemolyticus

18

3.2. Hiện đại

25

3.2.1. Phương pháp miễn dịch học – ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assays)
25
3.2.2. Phương pháp PCR
KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO

26
PAGE \*
MERGEFORMAT iv

28
29


MỞ ĐẦU
Giống Vibrio thuộc vào họ Vibrionaceae. Chúng là những vi khuẩn hình que hơi cong
như dấu phẩy, Gram âm, không sinh nha bào, di động nhờ một lông ở một đầu,
oxydase dương tính ...
Kể từ năm 1817 cho đến nay trên thế giới đã xảy ra 7 đại dịch tả. Sáu đại dịch tả đều
do V.cholerae sinh type cổ điển gây nên. Đại dịch tả lần thứ 7 do V.cholerae sinh type
El Tor gây nên, bắt đầu từ năm 1961 kéo dài cho đến ngày nay. V.cholerae El Tor đề
kháng với tác nhân hóa học, tồn tại lâu hơn ở người và sống trong thiên nhiên lâu
hơn V.cholerae sinh type cổ điển. Ngoài ra đối với vùng bệnh tả El Tor lưu hành thì
những trường hợp nặng thường ít hơn và những trường hợp nhẹ không triệu chứng lại
nhiều hơn. Bắt đầu từ năm 1992 dịch tả xảy ra ở Madras và nhiều nơi khác thuộc Ấn
Độ và Bangladesh do Vibrio cholerae O139 gây nên với cơ chế bệnh sinh hồn tồn
giống như Vibrio cholerae O1. Sau đó dịch tả do chủng O139 đã lây lan ra các nước

khác. V.cholerae là nguyên nhân gây bệnh tả ngay cả khi ở điều kiện bình thường, là
một bệnh rất nguy hiểm lây lan rất nhanh trong cộng đồng từ người sang người qua
đường thực phẩm cả nước uống. Nguồn nhiễm V.cholerae chủ yếu từ nước, động vật
có vỏ, hoặc các thực phẩm khác bị ô nhiễm bởi phân của những người có triệu chứng
hoặc khơng có triệu chứng.
V.parahaemolyticus được phân lập lần đầu ở Nhật Bản năm 1950 từ phân bệnh nhân
tiêu chảy do ăn cá biển. V.parahaemolyticus là một trong những nguyên nhân gây
nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn. Người mắc bệnh chủ yếu là do ăn phải thức ăn hải sản
chưa được nấu chín hoặc bị nhiễm khuẩn trong quá trình chế biến và bảo quản. Thời
gian ủ bệnh ngắn từ 2 – 6 giờ.
Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm do nhóm vi khuẩn Vibrio rất thấp, có thể ở mức 10
tế bào/g sản phẩm. Do vậy cần được kiểm sốt rất nghiêm ngặt trong thực phẩm, địi
hỏi các phương pháp kiểm nghiệm phải rất nhạy, các quy trình kiểm sốt phải chặt
chẽ. V.Cholerae và V.Parahaemolyticus có thể được phát hiện bằng cách nuôi cấy một
lượng mẫu xác định vào mỗi trường lỏng khơng chọn lọc, sau đó được chuyển vào môi
PAGE \*
MERGEFORMAT 8

trường tăng sinh chọn lọc. Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn được cấy phân lập trên ít
nhất 2 loại mơi trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc khác nhau. Khuẩn lạc nghi ngờ
được kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.


Để làm rõ quy trình định tính và phân lập V.Cholerae và V.Parahaemolyticus, nhóm
13 chúng em xin trình bày đề tài“Định tính V.Cholerae và V.Parahaemolyticus” bằng
những hiểu biết cũng như một số tài liệu nghiên cứu và sưu tầm được để giải đáp thắc
mắc và những vấn đề cấp thiết được đặt ra.
Nội dung nghiên cứu:
Nghiên cứu tổng quan về V.Cholerae và V.Parahaemolyticus.
Nghiên cứu phương pháp,quy trình định tính V.Cholerae và V.Parahaemolyticus.

Ngoài phần mở đầu, kết luận đề tài gồm 3 chương:
-

Chương 1: Tổng quan về V.Cholerae và V.Parahaemolyticus

-

Chương 2: Phương pháp định tính

-

Chương 3: Quy trình định tính

Để phân tích, nghiên cứu về vần đề “Định tính V.Cholerae và V.Parahaemolyticus”,
nhóm đã sử dụng một số phương pháp như phân tích và nghiên cứu tài liệu.
Nguồn dữ liệu thứ cấp:
-

Các số liệu, tài liệu đã có sẵn về V.Cholerae và V.Parahaemolyticus trong

nước và ngoài nước.
-

Một số bài báo khoa học, tiêu chuẩn sẵn có.

Nguồn dữ liệu sơ cấp:
Đề tài được thực hiện bằng phương pháp nghiên cứu định tính: Sử dụng các số liệu, tài
liệu thống kê thông qua thu thập dữ liệu có sẵn từ sách vở, báo đài, các phương tiện
truyền thơng, tiến hành phân tích, so sánh và đánh giá nội dung cần tập trung nghiên
cứu.

Bố cục bài tập nhóm
Chương 1: Tổng quan về V.Cholerae và V.Parahaemolyticus
1.1.

V.Cholerae

1.1.1. Đặc điểm sinh học
1.1.2. Nguồn nhiễm
1.1.3. Tác hại
1.2.

V.Parahaemolyticus

1.2.1. Đặc điểm sinh học
1.2.2. Nguồn nhiễm

PAGE \*
MERGEFORMAT 8


1.2.3. Tác hại
Chương 2: Phương pháp phân tích định tính
2.1. Truyền thống
2.1.1. Phạm vi áp dụng
2.1.2. Nguyên tắc
2.2. Hiện đại
2.2.1. Phương pháp miễn dịch học – ELISA
2.2.2. Phương pháp PCR
Chương 3: Quy trình định tính
3.1. Truyền thống

3.1.1. V.Cholerae
3.1.2. V.Parahaemolyticus
3.2. Hiện đại
3.2.1. Phương pháp miễn dịch học – ELISA
3.2.2. Phương pháp PCR

PAGE \*
MERGEFORMAT 8


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ V.CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS
1.1.

V.Cholerae

1.1.1. Đặc điểm sinh học
V.cholerae là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu khơng đều nhau tạo hình hình dấu
phẩy, di động, sống kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men glucose nhưng khơng sinh hơi,
khơng sinh H2S.
V.Cholerae có phản ứng oxidase (+), ADH(-), LDC(+), lên men được sucrose, có thể
tăng trưởng trong mơi trường có chứa 0 – 3% NaCl, khơng phát triển được trong các
mơi trường có chứa 6,8,10% muối.
Cấu trúc kháng nguyên:
-

Kháng nguyên thân O: bản chất là lipopolysaccharide. Nó quyết định tính sinh

miển dịch của vaccine tả cổ điển (vaccine tả chết). Người ta phân biệt thành nhiều
nhóm huyết thanh “O”. V.cholerae sinh type cổ điển và sinh type El Tor thuộc nhóm
huyết thanh O1. Trong nhóm O1 có 3 type huyết thanh : Ogawa, Inaba và Hikojima.

-

Kháng ngun lơng H: Khơng có giá trị trong thực tiễn.

-

Kháng nguyên độc tố ruột bản chất là protein, độc tố ruột của V.cholerae 01

kích thích cơ thể sinh kháng độc tố.

Hình 1.1. Vi khuẩn V.cholerae
1.1.2. Nguồn nhiễm
Nước, động vật có vỏ, hoặc các thực phẩm khác bị ơ nhiễm bởi phân của những người
có triệu chứng hoặc khơng có triệu chứng.
1.1.3. Tác hại

PAGE \*
MERGEFORMAT 8

Gây bệnh tả cho người. Bệnh tả là một bệnh nhiễm trùng nhiễm độc cấp tính, lây rất
mạnh gây thành dịch lớn.


Thời gian ủ bệnh từ 2 đến 5 ngày. Dấu hiệu đặc trưng của thời kỳ toàn phát của bệnh
là tiêu chảy và nôn, phân lỏng và trắng như nước vo gạo. Bệnh nhân mất nước, mất
muối rất nhanh, có thể mất 1 lít nước trong 1 giờ do đó chỉ vài giờ là xuất hiện hội
chứng mất nước cấp tính làm cho tồn thân sút đi rất nhanh và rất nặng. Nếu không
được điều trị, tỷ lệ chết rất cao (50 đến 60%).
Lâm sàng bệnh tả có nhiều biểu hiện rất khác nhau từ thể nhẹ dễ bỏ qua cho đến thể
nặng với hội chứng tả điển hình.

1.2.

V.Parahaemolyticus

1.2.1. Đặc điểm sinh học
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là một loại vi khuẩn trong cùng một nhóm với
những vi khuẩn gây ra bệnh tả, vi khuẩn có hình que hơi cong như dấu phẩy và ngắn,
là vi khuẩn gram âm, không sinh nha bào, di động nhờ một lông ở một đầu.
V.parahaemolyticus bị chết ở 65oC sau 10 phút, chúng không phát triển được ở nhiệt
độ dưới 15oC. Phát triển mạnh ở 37oC.
Có oxidase (+), lên men D-mannitol, maltose, L.arabinose, khơng lên men saccharose.
Vi khuẩn có 3 loại kháng nguyên :
-

Kháng nguyên thân O : chịu nhiệt, được chia thành 12 type.

-

Kháng nguyên lông H.

-

Kháng nguyên vỏ K : không chịu nhiệt, được chia thành 59 type.

PAGE \*
MERGEFORMAT 8

Hình 1.2. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

1.2.2. Nguồn nhiễm
V.parahaemolyticus tồn tại trong nước biển và các động vật biển như cá, tơm, sị, ốc ;
hải sản chưa được nấu chín hoặc bị nhiễm khuẩn trong quá trình chế biến, bảo quản.
1.2.3. Tác hại
V.parahaemolyticus là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng nhiễm độc thức
ăn.
Thời gian ủ bệnh bệnh ngắn từ 2 – 6 giờ. Bệnh biểu hiện các triệu chứng nôn và tiêu
chảy kiểu tả nhẹ hoặc tiêu chảy kiểu lỵ trực khuẩn.

PAGE \*
MERGEFORMAT 8


CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH
2.1. Truyền thống
2.1.1. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này được tham chiếu theo TCVN 8988:2012; TCVN 7905 – 1:2008
, ISO/TS 21872-1:2007 được áp dụng phát hiện V.Cholerae và V.Parahaemolyticus
trong các sản phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi và các mẫu môi trường trong
khu vực chế biến và vận chuyển thực phẩm.
2.1.2. Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng chọn lọc. Từ môi trường nuôi cấy
này phân lập lên môi trường rắn chọn lọc, sau thời gian ủ, những khuẩn lạc nghỉ
ngơi và được kiểm tra khẳng định thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.
2.2. Hiện đại
2.2.1. Phương pháp miễn dịch học – ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent
Assays)
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorben Asa) hay EIA (Enzyme Immunosorbent) là
một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm.
Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng

nguyên và kháng thể và gồm các bước cơ bản sau:
-

Kháng nguyên chưa biết được gắn trên một bề mặt.

-

Kháng thể biết trước được “rữa” qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn

enzyme.
-

Thêm vào cơ chất (substance): Enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu

có thể xác định được. Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ
mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên –
kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác
định sự có mặt hay không cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu.
2.2.2. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR (Polymer Chain
Reaction)
được Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát
PAGE
\*
8 to lớn đối với các nghiên cứu sinh
minh năm 1985 và kể từ đó đã MERGEFORMAT
tạo nên một tác động

học trên toàn thế giới. Đây là phương pháp intro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số
lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa vào hoạt động của các dNTP

tự do là enzyme polymerase, sau 20 – 35 chu kì có thể nhân được khi biết rõ các trình
đặc hiệu ở 2 đầu DNA cần nhân gen (đoạn khuôn) để có thể thiết kế các cặp mồi đặc
hiệu.
Hiện nay có thể sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để chuẩn đoán nhanh bệnh do
Vibrio spp trong vài giờ mà không mất nhiều thời gian đê phân lập vi khuẩn.
Nguyên tắc của phương pháp này là phát hiện một DNA đặc hiệu cho Vibrio spp.

PAGE \*
MERGEFORMAT 8


CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH
3.1. Truyền thống
3.1.1. V.Cholerae
3.1.1.1. Ngun tắc
Phát hiện V. Cholerae trong thực phẩm được thực hiện bằng cách cân một lượng mẫu
xác định và nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc. Từ đây dịch khuẩn được cấy
chuyển sang môi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc giống V.Cholerae sẽ được thử
nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.
3.1.1.2. Thiết bị và dụng cụ
Bảng 3.1. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị
Kính hiển vi
Máy lắc ổn nhiệt
Tủ sấy
Nồi hấp
Tủ cấy
Tủ ấm

Dụng cụ
Đĩa petri
Que cấy ria, que cấy vòng
Que trải
Lam kính
Ống nghiệm thạch nghiêng
Bình tam giác

3.1.1.3. Mơi trường và hóa chất
Bảng 3.2. Mơi trường và hóa chất
Mơi trường và hóa chất
Mục đích
APW (Alkaline Phosphate Water)
Tăng sinh chọn lọc
TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose)
Phân lập
NA/TSA
Phục hồi
TSI/KIA
Đĩa giấy Oxidase
Khẳng định sơ bộ
Dung dịch NaCl
KOH 3%
Thử String test để khẳng định sơ bộ
Arginine dehydrolase
Ornithine decarboxylase
Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định
Lysine decarboxylase
TW (Tryptone Water)

ONPG
Kowac’s
Thuốc thử Indol
HCL và NaOH (KOH) 10%
Điều chỉnh pH
3.1.1.4. Quy trình định tính
Đồng nhất 25g mẫu với 225ml
APW
Tăng sinh lần 1

Phân lập trên
TCBS


6 – 8 giờ

Ủ ở 37,0 0,50C trong khoảng 24 giờ

3.1.1.5. Các bước tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Cân vô trùng 25 g mẫu vào một túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu lớn thành các mảnh
nhỏ rồi thêm 225 ml nước peptone kiềm APW vào túi, dập mẫu 60 giây, ủ ở 37 0C
trong 16 – 24 giờ.
Mục đích: Chuẩn bị cho q trình tăng sinh chọn lọc.

Hình 3.1. Môi trường APW
Bảng 3.3. Thành phần môi trường APW
Thành phần
Peptone

Vai trò
Nguồn cung cấp nitrogen và carbon, các


amino acid chuỗi dài, vitamin và các chất
Muối Sodium chlorie

dinh dưỡng cần thiết khác.
Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu.

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Tăng sinh chọn lọc lần thứ nhất:
-

Ủ huyền phù ban đầu ở 37 0C trong 6 h ± 1 h đối với các sản phẩm đông lạnh

sâu hoặc ở 41,5 0C trong 6 h ± 1 h đối với sản phẩm tươi, khô hoặc sản phẩm đã ướp
muối.
-

Cần chú ý khi áp dụng toàn bộ phương pháp cho các sản phẩm có hàm lượng

muối cao, vì nồng độ muối cuối cùng trong mơi trường có thể làm thay đổi các đặc
tính.
Tăng sinh chọn lọc lần thứ hai:
-

Chuyển 1 ml dịch cấy thu được trong bước tăng sinh chọn lọc lần thứ nhất

được lấy từ bề mặt cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường APW.

-

Ủ trong môi trường APW trong 18 h ± 1 h ở nhiệt độ 41,5 oC.

Bước 3: Phân lập
Sau 24 giờ, dùng que cấy vịng lấy một ít sinh khối trên môi trường ASPW và cấy lên
bề mặt đĩa môi trường thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 370C trong 24 giờ.
Mục đích: Nhận dạng và phát hiện V.cholerae.

Hình 3.2. Mơi trường TCBS agar


Bảng 3.4. Thành phần mơi trường thạch TCBS
Thành phần
Sucrose
Dipeptone

Vai trị
Lên men làm mơi trường có tính acid
Cung cấp nitrogen, vitamins, và các
amino acid trong TCBS agar

Sodium Citrate
Sodium Thiosulfate
Sodium Chloride

Ức chế sự phát triển của Enterobacteria
Cung cấp sự phát triển tối ưu và hoạt
động trao đổi chất của các loài vibrio

Yeast Extract

sống trong môi trường mặn
Cung cấp nitrogen, vitamins, và các
amino acid trong TCBS agar
Làm chậm sự sinh trưởng của

Oxbile (Oxgall)
Sodium Cholate

enterococcic
Ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram

Ferric Citrate
Bromothymol Blue
Thymol Blue
Agar

dương
Sản xuất hydrogen sulfide
Chất chỉ thị pH
Tác nhân làm cứng

Trên môi trường thạch TCBS khuẩn lạc V. Cholerae trơn nhẵn, có màu vàng, đường
kính 2 – 3mm.
Khuẩn lạc có màu vàng do lên men được sucrose sinh ra khí CO 2 khi đó mơi
trường có tính acid (chất chỉ thị bromthymol blue).

Hình 3.3. Khuẩn lạc V.Cholerae trên mơi trường TCBS

Bước 4: Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA
Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ đĩa trên môi trường phân lập TCBS.
Nếu trên một đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ thì lấy tất cả
các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria lên NA/TSA có bổ sung 1,5% NaCl.
Ủ ở 37 ± 1oC trong 24 giờ.
Trường hợp 1: Từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả thử
nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện.
Trường hợp 2: Nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóa khơng phù
hợp thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu, một trong bốn khuẩn lạc
này cho kết qua thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện và ngược lại thì
kết luận khơng phát hiện.
Bước 5: Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh
Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy vào các môi trường thử
nghiệm sau:
Phép thử nhận dạng giả định
Bảng 3.5. Các phép thử nhận dạng giả định
Phép thử
Phản ứng tiêu biểu của V.Cholerae
Tính di động
+
Oxidase
+
- Tính di động: Dùng que cấy lấy vi khuẩn cấy sang ống nghiệm thạch bán lỏng, đâm
thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống môi trường, ủ 37℃ trong 24h. trong 24h.

Hình 3.4. Kết quả thử nghiệm tính di động


- Oxidase: Lấy giấy lọc đã ngâm với chất nền dihydrochloride tetramethyl – pphenylenediamine

Làm ẩm giấy bằng nước cất vô trùng

Chọn khuẩn lạc để

được thử nghiệm bằng que cấy gỗ hoặc bạch kim và bôi trong giấy lọc

Quan sát

vùng giấy được cấy xem sự thay đổi màu thành xanh đậm hoặc tím trong vịng 10 – 30
giây.

Hình 3.5. Thử nghiệm oxidase
Thử nghiệm khẳng định
Bảng 3.6. Thử nghiệm khẳng định
Phép thử

Phản ứng tiêu biểu của V.cholerae

ADH

-

ODC

+

LDC

+

ONPG

+

TSI

Vàng/Vàng, khơng H2S và khí

Indol

+

Thử khả năng chịu mặn:
0% NaCl

+

2%

+

6%

-

8%

-

10%

-

- Phép thử ADH: Cấy môi trường dung dịch muối ADH ngay dưới bề mặt. Thêm
khoảng 1 ml dầu khống vơ trùng lên mặt mơi trường. Ủ ở 37 0C trong 24 h ± 3 h. Sau


khi ủ thấy đục hoặc có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính (có vi khuẩn mọc và có
sự dihydro hóa của arginin). Màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính.
- Phép thử ODC: Cấy dung dịch muối lỏng ODC ngay dưới bề mặt. Thêm khoảng 1 ml
dầu khoáng vô trùng lên mặt môi trường. Ủ ở 37 0C trong 24 h ± 3 h. Sau khi ủ thấy
đục hoặc có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính (có vi khuẩn mọc và có sự tách
nhóm cacboxyl (decarboxylation) của ornithin). Màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính.
- Phép thử LDC: Cấy dung dịch muối lỏng LDC ngay dưới bề mặt. Thêm khoảng 1 ml
dầu khống vơ trùng lên mặt môi trường. Ủ ở 37 0C trong 24 h ± 3 h. Sau khi ủ mà
thấy đục hoặc có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính (có vi khuẩn mọc và có sự
tách nhóm cacboxyl (decarboxylation) của lyzin). Màu vàng chứng tỏ phản ứng âm
tính.
- Phép thử TSI: Cấy đâm sâu xuống đáy ống thạch và cấy ria theo mặt nghiêng của
thạch. Ủ ở 37 0C trong 24 ± 3 giờ.
+ Quan sát ở đáy cột thạch:
Màu vàng

Dương tính glucoza (lên men glucoza)

Màu đỏ hoặc khơng đổi màu

Âm tính glucoza (khơng lên men glucoza)

Màu đen

Sinh khí hydro sulfua

Có bọt hoặc rạn nứt

Sinh khí từ glucoza

+ Quan sát trên bề mặt thạch nghiêng:
Màu vàng

Dương tính lactoza và/hoặc sacaroza (sử dụng lactoza
và/hoặc sacaroza)

Màu đỏ hoặc khơng đổi màu

Âm tính lactoza và sacaroza (không sử dụng lactoza
hoặc sacaroza)

Các phản ứng điển hình của V. cholerae ứng với cấy bề mặt nghiêng axit (màu vàng)
và cấy đâm sâu axit (màu vàng) mà khơng sinh hydro sulfua hoặc khí. Thời gian ủ
khơng quá 24 h, vì cấy bề mặt nghiêng thì màu vàng V. cholerae có thể chuyển sang
màu đỏ sau 24 h.


Hình 3.6. Thử nghiệm TSI
-

Phép thử ONPG: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 0,25 ml dung dịch

ONPG. Thêm 1 giọt toluen và lắc ống. Đặt ống vào nồi cách thủy để ở 37 0C và để yên
khoảng 5 phút. Thêm 0,25 ml thuốc thử để phát hiện

– galactoxidase và trộn. Đặt

ống vào nồi cách thủy để ở 37 0C, để yên trong 24 h ± 3 h, kiểm tra liên tục. Màu vàng
chứng tỏ phản ứng dương tính (có mặt

– galactoxidase). Phản ứng thường xảy ra

sau 20 phút. Sau 24 giờ khơng có màu chứng tỏ phản ứng âm tính.

Hình 3.7. Thử nghiệm ONPG
- Phép thử Indol: Cấy khuẩn nghi ngờ vào ống chứa 5 ml môi trường muối tryton –
tryptophan. Ủ ở 37 0C trong 24 h ± 3 h. Sau khi ủ, thêm 1 ml thuốc thử Kovac’s. Việc
hình thành vịng màu đỏ phản ứng dương tính (hình thành indol). Vịng màu nâu –
vàng chứng tỏ phản ứng âm tính.