NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN HẠC VỸ (DENDROBIUM APHYLLUM (ROXB ) FISHER) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO - Full 10 điểm

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..................................................................................................................... 1
PHẦN I. TỔNG QUAN............................................................................................. 3
1.1 Cơ sở khoa học về nhân giống lan ........................................................................... 3
1.1.1 Bảo tồn hoa lan ...................................................................................................... 3
1.1.2 Các kỹ thuật về nhân giống hoa lan ....................................................................... 3
1.2 Một vài nét về loàiD. aphyllum nghiên cứu ............................................................ 7
1.2.1 Phân loại ................................................................................................................. 7
1.2.2. Một số đặc điểm thực vật chính về lồi lan D. aphyllum ..................................... 7
1.2.3. Phân bố của lan Hoàng thảo Hạc vỹ ..................................................................... 9
1.2.4. Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác loài lan Hoàng thảo Hạc vỹ của Việt
Nam ........................................................................................................................ 9
1.3. Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh với chi Hoàng thảo (Dendrobium) ..................... 10
1.4Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới
và ở Việt Nam ................................................................................................................. 11
1.4.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới . 11
Dendrobium ................................................................................................................... 12
1.4.2Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở Việt Nam ... 13
1.5. Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium .......................... 14
1.5.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium thế giới ............. 15
1.5.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium ở Việt Nam ...... 16
1.6Nghiên cứu về nuôi trồng cây lan Dendrobium sau nuôi cấy mô ........................ 17
1.6.1 Ảnh hưởng của giá thể ......................................................................................... 17
1.6. 2 Ảnh hưởng của dinh dưỡng ................................................................................ 18

PHẦN II- VẬT LIỆU, NỘI DUNGVÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 19
2.1. Vật liệu .................................................................................................................... 19
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................... 19
2.3.1. Phương pháp khử trùng và nuôi cấy tạo vật liệu khởi đầu Lan D. aphyllum .... 19

i

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu nhân nhanh protocorms và chồi ................................ 21
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu tạo cây in vitrohoàn chỉnh.......................................... 22
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................................... 23

PHẦN III- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 24
3.1. Nghiên cứu khử trùng và ni cấy khởi động mẫu lồi lan Hạc vỹ ................. 24
3.1.1. Kết quả nghiên cứu xác định phương pháp khử trùng đối với quả lan............... 24
3.1.2. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến giai đoạn khởi động mẫu tạo
vật liệu ban đầu .................................................................................................... 25
3.2. Nghiên cứu khả năng nhân giống in vitro ............................................................ 26
3.2.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của BA + αNAA đến quá trình nhân nhanh protocorm và
chồi ....................................................................................................................... 27
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây đến khả năng nhân nhanh
protorcom và chồi ................................................................................................ 28
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền cà rốt đến khả năng nhân nhanh
protorcom và chồi................................................................................................. 30
3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của bột tảoSpirulina đến khả năng nhân nhanh
protorcom và chồi................................................................................................. 31
3.3. Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh in vitro................................................................ 32
3.3. 1. Ảnh hưởng của IBA tới giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh....................................... 33

PHẦN 4- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 35
4.1 KẾT LUẬN.............................................................................................................. 35
4.2. ĐỀ NGHỊ ................................................................................................................ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 36
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 42

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AC:

Activated carbon (than hoạt tính)

BA:

Benzyladenine acid

CT:

Cơng thức

CTTN:

Cơng thức thí nghiệm

CV(%):

Hệ số biến động (Correlation of Variants)

CW :

Coconut water (nước dừa)

D:

Dendrobium(lan Hoàng thảo)

Đ/C:

Đối chứng

IBA:

Indolbutyride acid

αNAA :

α - Naphthalene acetic acid

LSD: So sánh theo giá trị khác biệt có nghĩa nhỏ nhất ở mức α  0,05
PLBs: Protocorm like bodies
SH:

Schenk and Hildebrandt

TB:
TCLs:
TDZ:

Trung bình
Thin cell layers
Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)

VW:

Vacin and Went

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng1.1.Đặc điểm thực vật chính của lồi lan nghiên cứu ............................................ 8
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống ....................... 24
và nảy mầm của lan Hạc vỹ .......................................................................................... 24
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tạo chồi từ mẫu
cấy ban đầu ........................................................................................................... 26
Bảng 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA + αNAA đến quá trình nhân nhanh
protocorm và chồi (sau 6 tuần)............................................................................. 28
Bảng 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch khoai tây nghiềnđến quá trình nhân nhanh
protocorm và chồi ( sau 6 tuần)............................................................................ 29
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của dịch nghiền cà rốt đến khả năng nhân nhanh protorcom và
chồi. ...................................................................................................................... 30
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của bột tảo Spirulina đến khả năng nhân nhanh protorcom và
chồi. ...................................................................................................................... 31
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của IBA tới giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh ................................. 33

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Lan Hạc vỹ .................................................................................................... 8
Hình 2.1. Quả lan Hạc vỹ đưa vào ni cấy in vitro .................................................... 20
Hình 3.1. Sự nảy mầm của hạt lan Hạc vỹ.................................................................... 25
Hình 3.2. Nhân nhanh protocorm và chồi .................................................................... 32
Hình. 3.3. Tạo cây in vitro hồn chỉnh ......................................................................... 34

v


MỞ ĐẦU
Chi Hoàng thảo (Dendrobium) là một trong những chi lớn nhất của họ Lan
(Orchidaceae), ước tính có khoảng 1.184 loài (Leitchet al., 2009) và được phân bố
từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á Thái Bình Dương đến New Zealand
(Govaerts et al., 2011). Lan Hoàng thảo Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.)
Fisher) thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) là lồi lan rừng đẹp, có giá trị y học và
giá trị thương mại cao. Trên thế giớichúng phân bố ở Ấn Độ, Nepan, Butan, Trung
Quốc, Mianma, Nepal, Sri Lanka,Thái Lan, Lào, Camphuchia, Malaixia...Ở Việt
Nam, Hạc vỹ thường mọc ở một số vùng:Lâm Đồng, Khánh Hòa, Lào Cai, Sơn La,
Bắc Cạn, Ninh Thuận…(Averyanov et al., 2005; Sách đỏ Việt Nam, 2007).Theo y
học cổ truyền Trung Quốc, Lan D. aphyllum có tác dụng chữa bệnh như: Dùng trị
ho, đau họng, bỏng lửa; toàn cây trị kinh phong trẻ em, ăn uống bị ngộ độc (Sách
Đỏ Việt Nam, 2007).
Do nhu cầu sử dụng làm cây hoa cảnh và dược liệu tăng mạnh trong thời gian
gần đây nên loài D. aphyllumđã bị khai thác kiệt quệ.Mặt khác, tỷ lệ nảy mầm từ
hạt trong tự nhiên rất thấp và vùng phân bố của D. aphyllumbị tàn phá nghiêm
trọng nên lồi cây này lâm vào tình trạng gần như tuyệt chủng và được đưa vào
Sách Đỏ Việt Nam, 2007 và hạng mục IUCN (Romand-Monnier, 2013) cần phải
được bảo vệ. Do vậy cần có các biện pháp kỹ thuật để nhân giống, bảo tồn và phát
triển loài lan dược liệu có giá trị này của Việt Nam. Nhằm góp phần làm phong
phú nguồn dược liệu quý của Việt Nam, làm đẹp môi trường cảnh quan, nâng cao
thu nhập cho người trồng lan, chúng tôi thực hiện đề tài:“Nghiên cứu nhân giống
lan Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) bằng kỹ thuật nuôi cấy in
vitro”.
1. Mục tiêu của đề tài
Nhân nhanh được loài lan Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum(Roxb.) Fisher)

bằng kỹ thuật ni cấy in vitro, nhằm góp phần bảo tồn và phát triển loài Lan dược
liệu quý hiếm của Việt Nam.
2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.
2.1.Ý nghĩa khoa học
1


* Kết quả của đề tài có thể được sử dụng làm tài liệu tham khảo cho việc
nghiên cứu, giảng dạy về hoa lan nói chung và chi lan Hồng thảo nói riêng.
* Góp phần xây dựng quy trình nhân giống in vitrolan D. aphyllum vốn chưa
được nghiên cứu ở Việt Nam
* Cung cấp số liệu và thông tin khoa học cho các nhà nghiên cứu khoa học
tham khảo
2.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
* Góp phần bảo tồn và phát triển cây dược liệu, cây cảnh có giá trị của Việt Nam.
Giúp bà con vùng núi cao xóa đói giảm nghèo, ổn định cuộc sống, khơng chặt phá
rừng.
* Góp phần phát triển khu du lịch sinh thái.
* Đề xuất phương pháp nhân nhanh giống với số lượng lớn, sạch bệnh, giá
thành phù hợp, đáp ứng nhu cầu của thị trường cung cấp nguyên liệu cho ngành
Dược phục vụ nội tiêu, nâng cao sức khỏe cộng đồng và tiến tới tham gia xuất
khẩu.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
* Quả lan Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum) thu thập từ Khánh Hịa và được đưa
vào ni cấy in vitro tại phịng ni cấy mơ tế bào thực vật của Phịng thí nghiệm
Phát triển Ứng dụng Y sinh Cơng nghệ- Viện Ứng dụng Công nghệ - Bộ KH&CN.
* Các nghiên cứu được tiến hành tại Phịng thí nghiệm Phát triển Ứng dụng Y
sinh Công nghệ - Viện Ứng dụng Công nghệ- Bộ KH&CN.

2

PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1 Cơ sở khoa học về nhân giống lan
1.1.1 Bảo tồn hoa lan
Trên thế giới nhiều loài lan đang có nguy cơ tuyệt chủng, hiếm và được liệt kê
trong phụ lục II của CITES, do nhiều nguyên nhân như biến đổi khí hậu, khai thác
q mức, bn bán bất hợp pháp và lấn chiếm đất đai. Hoa lan được biết đến như
là cây cảnh quan trọng ở Việt Nam, đặc biệt là lan rừng. Các loài lan rừng của Việt
Nam nổi tiếng với vẻ đẹp và tính năng riêng biệt của chúng và đang có nhu cầu sử
dụng làm cảnh và làm thuốc cao trên toàn thế giới. Do đó cần có các biện pháp kỹ
thuật để nhân giống, bảo tồn và phát triển lồi lan có giá trị của Việt Nam.
Hoa lan, có thể được duy trì trong tự nhiên (bảo tồn in situ) và chuyển khỏi môi
trường sống của chúng (bảo tồn ex situ). Bảo tồn in situ là cách tốt nhất để bảo tồn
sự đa dạng di truyền các lồi lan, nhưng nó rất khó khăn để duy trì trong một thời
gian dài và có nguy cơ bị mất do bị sâu bệnh, sinh học và stress phi sinh học.
Ngoài ra, rất tốn kém do sử dụng lao động và đất (Montakarn Pimsen, 2014). Bảo
tồn nguồn gen bằng nuôi cấy in vitro và bảo quản lạnh được sử dụng để bảo tồn đa
dạng di truyền của chúng. Đây là cơ sở khoa học để đề tài ứng dụng kỹ thuật này
trong công tác bảo tồn loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ.
1.1.2 Các kỹ thuật về nhân giống hoa lan
1.1.2.1 Nhân giống hữu tính
Hạt lan rất nhỏ, có cấu tạo khơng hồn chỉnh. Một quả lan có thể chứa 1.300
-4.000.000 hạt. Hạt lan có hình dạng, kích thước và màu sắc rất khác nhau. Hầu
hết các hạt lan có chiều rộng 0,09 - 0,27 mm và chiều dài 0,25 -1,2 mm. Trọng
lượng hạt từ 0,0003 - 0,0014 mg (0,3 - 1,4 µg). Các hạt có chứa một phơi nhỏ,
thiếu nội nhũ, do đó muốn hạt nảy mầm phải tạo đủ điều kiện dinh dưỡng và môi
trường. Mặt khác, trong tự nhiên hạt lan phải được nhiễm nhiều loại nấm kí sinh
thuộc chi Rhizoctonia mới có thể nảy mầm được (Montakarn Pimsen, 2014).
Phương pháp nảy mầm hạt lan in vitro là một phần quan trọng của trương trình

bảo tồn và nhân giống các lồi lan quý hiếm, cung cấp cây con cho chương trình
3


phục hồi tái sinh rừng.
1.1.2.2 Nhân giống vơ tính
Một số phương pháp nhân giống vơ tính bằng tách chồi vượt, giâm hom nhưng
đều cho hệ sống nhân giống thấp, cần diện tích lớn, cần nhiều cây mẹ, cây dễ bị
bệnh, nhanh bị lão hóa, khả năng sinh trưởng kém, rất khó sử dụng vào mục đích
thương mại. Kỹ thuật ni cấy mô đang phát triển rộng rãi để nhân giống các loài
lan, nhờ kỹ thuật này, những giống lan quý đã có thể nhân giống dễ dàng với hệ số
nhân giống cao, cây đồng đều, ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh, có sức sống
cao. Có thể dùng nhiều bộ phận của hoa lan làm bộ phận nuôi cấy như: gieo hạt
invitro, đỉnh sinh trưởng, mắt ngủ trên thân, phương pháp lớp mỏng tế bào…
a) Các phương pháp nhân giống in vitro
- Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một trong những kỹ thuật hữu hiệu nhằm đảm bảo
các đặc tính di truyền của mẹ trong các cây tái sinh (Morel, 1960). Khi nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng, mô phân sinh ở vùng đỉnh này, khơng như một số giống cây khác
là hình thành cấu trúc protocorm để sau đó có thể biệt hóa thành cây. Nhân các
protocorm sẽ tạo thành các protocorm mới gọi là protocorm like body (Morel,
1964). Không như trong nuôi cấy mơ sẹo in vitro của những lồi thực vật khác,
việc thiết lập gen của protocorm được xác định ngay từ protocorm hình thành ban
đầu (Neumann et al., 2009).
- Thể tiền chồi (Protocormlike body)
Protocorm like body (PLB) là thuật ngữ đề chỉ những cấu trúc giống với
protocorm và có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro đỉnh sinh trưởng hay mô phân sinh
của chồi bất định ở các loài lan (Joseph& Robert, 1992). Đây là cấu trúc lần đầu
tiên được đặt ra bởi Morel khi nuôi cấy đỉnh chồi của Cymbidium để tạo ra những
cây sạch virus với các protocorm hình thành từ đỉnh sinh trưởng mà không phải là

từ hạt. Như vậy, nuôi cấy mô phân sinh họ Lan sẽ hình thành các protocormlike
body (Morel, 1964). Kỹ thuật này vừa tạo ra cây sạch bệnh virus, đồng nhất về
kiểu gen vừa cho tỷ lệ nhân giống cao.
- Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào
Lớp mỏng tế bào (TCL) bao gồm các mẫu có kích thước nhỏ cắt từ những tổ
4


chức thực vật (thân, lá, phát hoa, sơ khởi hoa hay tổ chức hoa, lá mầm trụ trên/dưới
lá mầm, vùng đỉnh hay phơi). Các lát cắt có thể cắt dọc (lTCL), hay cắt ngang
(tTCL). Các 1TCL chỉ chứa một loại mơ như tầng các tể bào biểu bì nhưng các
tTCL lại bao gồm các tế bào từ các kiểu mô khác nhau: tế bào biểu bì, vùng vỏ,
tầng phát sinh gỗ, quanh mạch và lõi, nhu mô. Nuôi cấy các TCL có thể phân lập
các tế bào, các tầng mơ và phụ thuộc vào trạng thái di truyền, các yếu tố ngồi gen,
các điều kiện sinh trưởng có kiểm sốt (ánh sáng, nhiệt độ, pH, chất điều hòa sinh
trưởng thực vật, các chất bổ sung vào môi trường...) dẫn tới sự cảm ứng in vitro
phát sinh hình thái. Khả năng phát sinh hình thái của một TCL phụ thuộc các yếu
tố như: sự nhận biết các dấu hiệu đúng, sự truyền tính trạng, khả năng di truyền để
đáp ứng và phản ứng với các dấu hiệu này, tình trạng sinh lý và nguồn gốc (mô hay
tổ chức) của TCL, các yếu tố stress, các trạng thái im lặng của gen. Các tế bào
trong TCL có thể phản biệt hóa dẫn đến việc thiết kế các kiểu hình. Trong các
TCL, con đường phát sinh hình thái của những mơ chun trách xuất phát từ các tế
bào, các mơ có thể được điều khiển và kiểm soát rõ ràng, cho phép nghiên cứu về
sự thay đổi phân tử, sinh lý, sinh hóa có thể xảy ra. Các TCL cũng sử dụng trong
tăng cường trao đổi các hợp chất thứ cấp, dược chất qua việc nuôi cấy các tổ chức
chuyển gen, nuôi cấy thực vật tự dưỡng bằng bioreactor (Dương Tấn Nhựt, 2007).
Các lớp tế bào mỏng đã được sử dụng thành công trong thể tiền chồi
(protocorm-like body) và tạo callus ở Aranda, Coelogyne cristata, Cymbidium
spp., Dendrobium spp., Doritaenopsis, Paphiopedilum, Renanthera, Rhynchostylis,
Spathoglottis và Xenikophyton. (Jaime A. Teixeira da Silva, 2013b).

b) Môi trường dinh dưỡng trong ni cấy in vitro
Có nhiều loại mơi trường ni cấy thích hợp cho vi nhân giống hoa lan như:
Knuson L (1946), Murashige & Skoog (MS) (1962), Vacin & Went (VW)
(1949)…Mỗi loại mơi trường đều có chất vi lượng và đa lượng, vitamin khác nhau.
Nói chung, sự sinh trưởng và phát triển của cây in vitro đều phụ thuộc vào môi
trường nuôi cấy.
- Các hợp chất hữu cơ tự nhiên
Một số lượng lớn các chất hữu cơ tự nhiên như: peptone, nước ép cà rốt, nước
ép cà chua, chiết xuất từ thịt bò, dịch khoai tây, nước dừa và dịch chuối, dịch bí
ngơ, tảo,…thường được bổ sung vào mơi trường ni cấy có tác dụng rất tốt trong
5


việc phát triển cây giống đã được báo cáo ở nhiều lồi lan như: Nước dừa được bổ
sung vào mơi trường ni cấy hoa lan để kích thích mơ sẹo hoặc hình thành
protocorm và thường được sử dụng là 10 - 25%. Nước dừa 30% cho tỷ lệ phôi nảy
mầm tối đa với lan D. ovatum (Willd.) (Thejaswini et al., 2017).Dịch nghiền của
khoai tây có chứa cacbonhydrat dưới dạng saccaroza, glucose và fructose, amino
axít (21 loại bao gồm cả lysine là một axít amin thường khơng có trong protein
thực vật), các muối khoáng (K, Fe, Mg…) và đặc biệt là các vitamin (C, B1, B6).
Dịch nghiền khoai tây thường được bổ sung vào môi trường vi nhân giống hoa lan
và đặc biệt có hiệu quả với một số lồi như: Phalaenopsis, Doritaenopsis.Nước ép
cà rốt chứa cytokinin, giàu chất khoáng (canxi và kali), vitamin (A, B1, B2, Cvà E)
và glutamin được sử dụng kích thích sự phân chia tế bào của thực vật.
* Bổ sung bột tảo Spirulina ở nồng độ 50 mg/l có tác động hiệu quả đến tỷ lệ
sống của chồi và số chồi đạt của lan Paphiopedilum delenatiiGuillaumin (Nguyễn
Thị Cúc và cs., 2014).
Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường giúp làm giảm độc tố bằng cách
đào thải các hợp chất độc phenolic tiết ra trong thời gian ni cấy. Bổ sung than
hoạt tính có tác dụng hiệu quả lên sự phát sinh và tăng sinh mô sẹo, sự phát sinh

phôi và nhân phôi cũng được đề cập trên đối tượng D. dixanthumLindley(Su et al.,
2014).
Khơng chỉ có các chất hợp chất hữu cơ được bổ sung vào mơi trường ni cấy,
các chất điều hịa sinh trưởng thực vật cũng được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy
hoa lan. Có hai nhóm chính của điều hịa sinh trưởng thực vật: cytokinin và auxin.
Các cytokinin thường được dùng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật: BA,
kinetin và TDZ để kích thích sự phân chia tế bào, gây ra sự hình thành chồi và sự
gia tăng chồi nách và làm chậm sự hình thành rễ. Các Auxin (2,4-D, αNAA, IAA
và IBA) thường được dùng trong nuôi cấy hoa lan để kích thích sự phân chia tế
bào, biệt hố rễ, hình thành mơ sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ
phụ. Ngoài ra, Axit abscisic (ABA) được bổ sung để ức chế hoặc kích thích sự
phát triển mô sẹo, thúc đẩy sự trưởng thành của phôi sinh dưỡng, ức chế sự nhân
phôi thứ cấp, ngăn cản sự nảy mầm sớm của phôi sinh dưỡng (Saad et al., 2012).
- Các hợp chất chứa carbon
Carbon là thành phần rất quan trọng trong môi trường nuôi cấy cho sự tăng
6


trưởng và phát triển của các mô. Hiện nay cacbon được bổ sung vào mơi trường
ni cấy vì thiếu ánh sáng và nồng độ CO2 thấp trong điều kiện in vitro. Đường đã
được sử dụng như một nguồn carbon và như là cơ quan quản thẩm thấu trong môi
trường nuôi cấy. Có nhiều loại đường được sử dụng trong ni cấy in vitro như:
sucrose, glucose, maltose, fructose, lactose và sorbitol. Sucrose ở nồng độ 20 và 30
g/l được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu nuôi cấy mô hoa lan (Montakarn
Pimsen, 2014).
1.2 Một vài nét về loàiD. aphyllum nghiên cứu
Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) được đặt tên vào năm 1799, Dendrobium
được hiểu là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là chi lan Hồng Thảo. Lan
Hồng Thảo có nhiều màu sắc và hình thái khác nhau (Trần Duy Quý,2005).
Chi Hoàng thảo(Dendrobium) là một trong những chi lớn nhất củahọ Lan

(Orchidaceae), ước tính có khoảng 1.400 lồi (Jin et al., 2009). Số lượng các loài
lan Hoàng thảo Việt Nam có khoảng 110 lồi (Leonid et al.,2013).
1.2.1 Phân loại
Theo các tác giả (Trần Hợp, 1998; Leltch và cs., 2009) cây lan HoàngThảo
thuộc chi Dendrobium, phân loại như sau:
Lan Hạc vỹ có tên khoa học là:Dendrobium aphyllum (Roxb.) C. Fisch
Đồng danh: Limodorum aphyllum Roxb. 1795; Dendrobium pierardii Roxb. ex
Hook. 1822
Chi:lan Hoàng Thảo Dendrobium
Họ:Phong lan Orchidaceae
Bộ:bộ lan Orchidales
1.2.2. Một số đặc điểm thực vật chính về lồi lan D. aphyllum
Một số đặc điểm thực vật chính về lồi lan D. aphyllum (bảng1.1).

7


Hình 1. 1. Lan Hạc vỹ
Bảng1.1.Đặc điểm thực vật chính của loài lan nghiên cứu
Đặc điểm

Lan Hoàng thảo Hạc vỹ

Tên khoa học

Dendrobium aphyllum

Thân
Lá

Hoa

Lan phụ sinh, thân dài 60-80 cm, hình trụ, dầy 0,4-0,5 cm,
lóng dài 2,5-3 cm
Lá hình mác nhọn, dài 6-8 cm, rộng 1,5-2 cm.
Cụm hoa bên, 1-2 hoa, mọc suốt dọc chiều dài thân khơng
cịn lá. Lá bắc hình bầu dục, dài khoảng 0,3 cm, hoa màu tím
nhạt, đường kính khoảng 4 cm, cuống hoa và bầu dài 2,0-2,5
cm. Các lá đài hình mác hẹp, đỉnh nhọn dài 2,4-2,7 cm, rộng
0,6-0,7 cm. Môi màu vàng nhạt, đôi khi pha tím rất nhạt, hình
gần trịn, dài 2,7-3 cm, rộng 2,5-2,6 cm, mép có lơng ngắn, bề
mặt phủ lơng thưa, có 3 đường sống ngắn ở phần gốc, hai bên
8


gốc có vạch chéo màu tía. Cột màu trắng, cao khoảng 0,5 cm;
tuyến mật hình bán nguyệt; răng cột có đỉnh nhọn. Nắp màu
trắng, đỉnh màu tím, phủ nhú mịn
Quả nang hình chùy, vỏ quả dày,quả có 4 khối phấn, chứa rất
nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh.
1.2.3. Phân bố của lan Hoàng thảo Hạc vỹ
Quả

Trên thế giới lan Hoàng thảo Hạc vỹ phân bố ở Ấn Độ, Nêpan, Butan, Trung
Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào, Malaixia.
Ở Việt Nam, lan Hoàng thảo Hạc vỹphân bố tại Lâm Đồng (Lang Bian, Đà
Lạt: Prenn; Đơn Dương), Khánh Hòa (Suối Giao, Yersin, Hòn Bà), Lào Cai, Bắc
Cạn, Ninh Thuận (Averyanov L., Averyanova A, 2005; Sách đỏViệt Nam, 2007),
Chúng mọc bám trên cây gỗ lớn trong rừng ở độ cao 400-1500 m.
1.2.4. Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác loài lan Hoàng thảo Hạc vỹ của

Việt Nam
Với đặc điểm rất đa dạng về kiểu dáng,sặc sỡ về màu sắc hoa và nở hoa
vàonhiều thời điểm khác nhau nên các loài lan Hoàng thảo bản địa ở nước ta bị
khai thác triệt để phục vụ nhu cầu trang trí, thưởng lãm. Hơn thế nữa, một số loài
thuộc chi Hoàng Thảo cũng là vị thuốc dân tộc cổ truyền dùng để chữa bệnh.
Nhiều loài được sử dụng làm thuốc như:D. loddigesii Rolfe., D. fimbriatum Hook.
Var.oculatum Hook., D. candidum Wall. Ex Lindl., D.chrysanthum Wall. ex
Lindl., D.nobile Lindl. (Đỗ Huy Bích, 2004) , D. aphyllum (Sách Đỏ Việt Nam,
2007).
Lan Hạc vỹ (D. aphyllum(Roxb.)Fisch.) được coi là một loại cây thuốc quý,
trong số các ―Thần nông thảo dược‖ và được xếp vào loại sản phẩm cao cấp có tác
dụng bổ âm thanh nhiệt, tạo nước bọt có lợi cho dạ dày, bổ phế và giảm ho. Bằng
phương pháp phân tích quang phổ, các nhà khoa học đã chứng minh các
polysaccharides (đường đa) AP là Acetylglucose - O, chứa liên kết β (l-›4), dạng
vòng của mỗi chất cặn thủy phân có dạng tháp trong đó các mạch chính được cấu
tạo bởi D-manose và D-glucose. Các thí nghiệm lâm sàng tiến hành trên động vật
cho thấy AP có hoạt tính tổng hợp chất miễn dịch tốt (Zhao Yong-Linget al.,
1994).
9


Zhang, (2008) đã xác định được trong thân lan Hạc vỹ có chứa: moscatilin,
gigantol, batatasin, tristin, moscatin, hircinol, salidroside và phydroxylbenzylacetic acid. Veronika Cakova et al., (2017) cho rằng ngoài
polysaccharides cịn có các hợp chất phenol như moscatin, moscatilin và tricetin 3',
4', 5'-trimetyl ete 7-O--glucopyranoside, ức chế sản xuất NO, có hoạt động điều
hịa miễn dịch.
Các chất chống oxy hố peptide được chiết xuất từ Hạc vỹ (D.
aphyllum(Roxb.) Fisch.)bao gồm superoxidedismutase, catalase và glutathione
peroxidase. Các axit amin: Ala, Val, Ile, Leu, Tyr, Phe, Try, Pro, Met và Cys chỉ ra
rằng peptit DA-P có hàm lượng chất dinh dưỡng cao và có hoạt động chống oxy

hố tối ưu (Huifan Liu et al., 2017).
Từ các nghiên cứu trên cho thấy rất cần thiết phải nhân giống loài lan Hạc vỹ
phục vụ cho sức khỏe con người cũng như bảo tồn nguồn gen quý.
1.3. Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh với chi Hoàng thảo (Dendrobium)
Nhiệt độ
Lan Hồng thảo thuộc loại cây ưa nóng, sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 24-330C.
Dưới 120C và trên 370C đều làm chậm và ảnh hưởng lớn đến sự ra hoa của cây.
Trong thực tế sản xuất tại miền Bắc có mùa đơng lạnh và mùa hè nóng thì cần hạn
chế tác động xấu của nhiệt độ bằng cách vào mùa đơng thì che phủ nilon quanh
nhà trồng lan hoặc thắp điện... còn mùa hè che lưới phản quang, có hệ thống phun
tưới thích hợp và tạo điều kiện thơng thống trong nhà lan sẽ đem lại hiệu quả rõ
rệt (Nguyễn Thị Kim Lý, 2009)
Ẩm độ
Độ ẩm thích hợp giúp cho cây được phát triển nhanh hơn hoa tươi và lâu tàn.
Lan Hoàng thảocũng như đa số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong điều kiện
khơng khí ẩm nhưng thống khí, vào ban ngày cây cần độ ẩm khoảng từ 40-60%,
vào ban đêm độ ẩm thích hợp từ 60-90% thì cây sẽ phát triển tốt hơn. Loại giá thể
quá ẩm và úng sẽ là điều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng của giống Dendrobiumvì
có thể bị thối toàn bộ rễ và biểu hiện là các cây con mọc từ phần ngọn của thân
(Bùi Thị Thu Hiền, 2009).
Ánh sáng
10


Lan Hồng thảolà giống ưa sáng, có thể trồng trong điều kiện ánh sáng trực
tiếp hay khuếch tán. Ánh sáng hữu hiệu cho giống Lan Hồng thảolà 70%, vì thế
giàn che với độ che sáng 30% dưới đất và 40% ở trên cao với cường độ ánh sáng
từ 15.00030.000 lux rất thích hợp cho sự phát triển của Lan Hồng thảo.
Mùa hè của miền Bắc cường độ ánh sáng mạnh, nhu cầu ánh sáng của lan Hoàng
Thảo khoảng 70-80% ánh sáng trực tiếp. Trong điều kiện râm mát cây thường yếu,

mọng nước, rất dễ nhiễm bệnh. về mùa đông cường độ ánh sáng yếu và thời gian
chiếu sáng ngắn, để lan Hoàng thảo sinh trưởng và phát triển tốt và ra hoa được thì
cần bổ sung ánh sáng bằng cách thắp điện cho vườn lan (Bùi Thị Hiền, 2009).
Dinh dƣỡng
Lan Hoàng thảo yêu cầu một lượng dinh dưỡng nhất định để sinh trưởng và phát
triển. Tuy khơng địi hỏi số lượng lớn nhưng phải đầy đủ các thành phần dinh
dưỡng N, P, K và các nguyên tố trung, vi lượng. Tuỳ từng giai đoạn sinh trưởng
mà nhu cầu đối với các thành phần dinh dưỡng có khác nhau (Đào Thanh Vân,
Đặng Thị Tố Nga, 2008)
Giá thể
Giá thể của Lan Hoàng thảocần chậu phải thật thống và khơng úng nước.
Tuy nhiên do bản năng sinh học và cấu trúc thực vật với giả hành có thân, các lồi
thuộc giống Lan Hồng thảocần giá thể hơi ẩm chút ít nhưng khơng được làm thối
căn hành. Vì thế một số lồi Lan Hồng thảo có thể phát triển trên các giá thể là xơ
dừa hay cả quả dừa, dùng như một cái chậu chứa sẵn giá thể. Tuy nhiên nếu giá thể
là xơ dừa phải hạn chế số lần tưới nước, nếu chậu là quả dừa nguyên phải cưa phần
đáy, nếu không cây bị thối vì q ẩm. Cũng có thể trồng cây lan Lan Hoàng
thảovới căn hành cách đáy chậu khoảng 3cm, rồi rải thật thoáng xung quanh căn
hành là một số rễ lục bình giặt sạch. Với cách trồng này thì kích thước chậu và cây
phải thật tương xứng. Tuy nhiên, giá thể than và gạch nung vẫn tỏ ra hiệu quả nhất
đối với các lồi Lan Hồng thảo.
1.4Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế
giới và ở Việt Nam
1.4.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên
thế giới
11


Hoa Lan chiếm một phần lớn trong thương mại toàn cầu về trồng hoa trong
chậu và hoa cắt cành và ước tính khoảng 10% hoa tươi cắt cành được thương mại

trên thị trường quốc tế. Giá trị thương mại trung bình của hoa lan cắt cành từ năm
2007 đến năm 2012 là 483,000,000 $ US. Trong năm 2012, trên thế giới đã có hơn
40 nước xuất khẩu hoa lan và 60 nước nhập khẩu hoa lan và tổng giá trị thương
mại toàn cầu là 504,740,644$ US (Nguồn: Department of Foreign Trade, Thailand
(2013); (Jayarama Reddy, 2016).
Hà Lan là nước dẫn đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan (39. 67%),
tiếp theo Thái Lan (28,41%), Đài Loan (10%), Singapore (10%) và New Zealand
(6%). Các nước nhập khẩu chủ yếu là Nhật Bản (30%), Anh (12%), Ý (10%), Pháp
(7%) và Mỹ (6%). Tổng số lan cắt cành thương mại trên thế giới chủ yếu các loài
lan Dendrobiumchiếm 85% và Phalaenopsis, Cymbidium chiếm 15%.
(Cheamuangphan et al, 2013; L.C. Deet al., 2014).
Thái Lan là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới của các loài lan nhiệt đới.
Trung Quốc là nước tiêu thụ lớn nhất của hoa phong lan cắt từ Thái Lan 7493 tấn,
theo sau là Nhật Bản, Mỹ, Ý, Ấn Độ, Đài Loan, Việt Nam và Hà Lan tại 4407,
2892, 2395, 1830, 983, 793 và 689 tấn. Năm 2012, tại Thái Lan người ta ước tính
rằng 46% sản lượng hoa lan đã được tiêu thụ trong nước và 54% được xuất khẩu(
K. Thammasiri, 2015).
Dendrobium là loài hoa trồng trong chậu và hoa cắt cành phổ biến trên toàn
thế giới, Dendrobium được đánh giá cao vì sự đa dạng đáng kinh ngạc của chúng
với đặc điểm rất đa dạng về kiểu dáng, sặc sỡ về màu sắc hoa và nở hoa vào nhiều
thời điếm khác nhau và độ bền hoa kéo dài. Hawaii, California và Florida là vùng
trồng Dendrobium trong chậu lớn tại Hoa Kỳ. Giá trị mặt hàng này ở Hawaii đã
được tìm thấy trong nhiều thập kỷ và doanh thu tăng từ 2,4 triệu USD năm 1991
lên 5,6 triệu USD trong năm 2000(L.C. De, N.G. Debnath Correct, 2011).
Ở Thái Lan có rất nhiều Cơng ty lớn, sở hữu vài chục ha lan như Công ty
Thái Orchid ở Ratchaburi, Công ty Siam Taiyo ở Samut-sakhon. Các cơng ty này
ngồi diện tích trực tiếp quản lý 15 – 20ha, họ còn liên kết với các công ty, nông
trại nhỏ tạo thành hệ thống vệ tinh; trong đó, họ là hạt nhân trong sản xuất và xuất
khẩu. Khoảng 60 – 70% sản lượng lan cắt cành của Thái Lan được xuất khẩu đến
38 nước trên thế giới, đạt giá trị 104 triệu USD (2009). Trong đó, xuất khẩu sang

12


Việt nam, trong đó: Dendrobium cắt cành: 22.917.059 cành, Dendrobium trồng
chậu: 2.502.178 chậu. (Nguồn: Bộ Nông nghiệp & HTX Thái Lan.)
Tại Hà Lan, việc sản xuất hoa lan Dendrobium trồng trong chậu hiện tăng
phổ biến đạt 40 đến 50 triệu cây. Thái Lan là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới về
các loài lan cắt cành nhiệt đới và nhà cung cấp lớn thứ hai vào thị trường EU,
chiếm 22% nguồn cung vào thị trường EU. Thái Lan nắm giữ một vị thế mạnh
trong sản xuất lan Dendrobium( L.C. Deet al,2014).
Theo Weichao Zhang et al.,(2009) trên thị trường các loại thực phẩm chức
năng có nguồn gốc từ tự nhiên từ lan D.aphyllum, D. devonianum và D. oYcinale
được bán bán với giá rất cao 2.000-4.000 USD/kg.
1.4.2Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở Việt
Nam
Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm cho nên
chủng loại lan rừng rất phong phú, có điều kiện khí hậu thuận lợi có thể thích
hợpphát triển các giống lan thuộc chi Dendrobium, Cattleya, Oncidium. Diện tích
trồng hoa lan ở Việt Nam còn ở mức hết sức khiêm tốn, chỉ chiếm 10% diện tích
các loại hoa đang được trồng. Sản xuất hoa lan ở Việt Nam tập trung theo 2 hướng
chính:
- Sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp các loài lan mới lai tạo hoặc được nhập
nội (lan cơng nghiệp).
- Khai thác và ni trồng các lồi hoa lan bản địa (lan rừng).
Lan bản địa (lan rừng) chủ yếu phát triển nhỏ lẻ và được nuôi trồng ở quy
mơ hộ gia đình, tập trung chủ yếu ở Hà Nội và một số vùng phụ cận. Xã Đông La,
La Phù, La Khê – Hoài Đức – Hà Nội những năm gần đây trở nên nổi tiếng với
nghề trồng lan, đây được coi là trung tâm nuôi trồng phong lan rừng lớn nhất miền
Bắc và chủ yếu là chi lan Hồng Thảo. Bên cạnh Đơng La, một số địa phương như
Gia Lâm, Đông Anh (Hà Nội), Văn Giang (Hưng Yên), Mộc Châu (Sơn La), Phổ

Yên (Thái Nguyên) cũng đang có nhiều hộ gia đình tập trung đầu tư vào sản xuất
và nuôi trồng phong lan bản địa, với quy mô từ 300- 500m2,…(Hoàng Xuân Lam,
2014).

13


Ở TP. Hồ Chí Minh chủ yếu trồng các lồi lan (Dendrobium, Mokara,
Vanda, Oncidium…) và diện tích khá khiêm tốn, khoảng 200ha, bằng 5,4% so với
hoa Lan Thái.
Ở miền Bắc, một số cơ quan nghiên cứu như Viện Di truyền Nông nghiệp,
Viện Nghiên cứu Rau quả, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Viện Ứng dụng công
nghệ,... trong những năm vừa qua đã tập trung nghiên cứu phương pháp nhân
giống vô tính in vitro. Kết quả đã sản xuất mỗi năm được hàng vạn cây con giống
hoa lan có giá trị trong đó có lan Hồng thảo.
Năm 2015 Viện Di truyền Nơng nghiệp đã xây dựng mơ hình nhân giống
các giống hoa lan Dendrobiumdiện tích 1.000 m2 quy mơ 30.000 cây/năm, mơ hình
sản xuất hoa thương phẩm diện tích 15.000m2, sản xuất được 60.000 cây giống.
Doanh thu đạt 280 triệu/1.000m2…
Đối với thị trường trong nước, sản lượng hoa phong lan cũng chưa đáp ứng
được nhu cầu của người tiêu dùng. Các cơ sở sản xuất hoa lan cũng chỉ đáp ứng
được 30 – 40% nhu cầu lan cắt cành còn lại phải nhập từ các nước khác. Hiện nay,
mỗi năm Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ đồng để nhập phong lan từ các nước láng
giềng cho nhu cầu nội địa. Thị trường nhập khẩu lan cắt cành chính của Việt Nam
trong thời gian qua là Thái Lan với gần 90% lượng lan cắt cành (Dendrobium) và
lan chậu (Cattleya, Oncidium).
Hiện nay, các loài lan Hoảng thảo bản địa đang bị khai thác ồ ạt,
chúngkhông chỉ được tiêu thụ trong nước mà còn được các
thươngláingườiTrungQuốcthugomvàxuất khẩu theo con đường tiểungạch.Giábán
củacáccâylannàyđượcthugombán

trên
thị
trườngthườngtừ
700900.000đồng/kg cây tươi.
Như vậy, vấn đề sản xuất, kinh doanh, hoa lan ở Việt Nam từ trước đến nay
vẫn ở dạng tiềm năng. Trong khi đó, sức cạnh tranh trên thị trường thế giới là rất
lớn. Những hoạt động kinh doanh và xuất khẩu trong thời gian qua chỉ mới có ý
nghĩa khởi động, hứa hẹn một sự phát triển trong tương lai dựa trên những điều
kiện thuận lợi sẵn có cho sự phát triển ngành trồng lan.
1.5. Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium

14


1.5.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium thế giới
Trong những năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều cơ sở nghiên cứu tìm các
biện pháp nhân giống, bảo tồn và lưu giữ các loài Lan q hiếm có nguy cơ bị tuyệt
chủng.
Dutta et al., (2011) sử dụng hạt của D. aphyllum 15 tuần tuổi được nảy mầm trên
mơi trường MS. Hạt giống hình thành protocorm sau 5 tuần nuôi cấy. Các PLBs
cho tỷ lệ nảy mầm, số chồi và rễ nhiều hơn trên môi trường MS bổ sung IAA +
KN.
Dake Zhao et al., (2013) nghiên cứu nhân giống và tạo hoa trong ống nghiệm
loài lan D. wangliangii G.W.Hu, C.L.Long & X.H.Jin. Xin Qian et al., (2014)
nghiên cứu sản xuất hoa và hạt giống loài lan D. officinale Kimura et Migo trong
ống nghiệm đã tạo được calluses từ các đỉnh chồi trên môi trường MS bổ sung 0,2
mg/l BA + 0,05 mg/l αNAA, nhiều chồi được tái sinh từ các mẫu PLBs khi cấy
trong môi trường MS + 1 mg/l αNAA. Các cây con in vitro cao 2 - 4 cm, có khả
năng ra hoa cao (83,2%) với tỷ lệ hoa bình thường 73,6% khi cấy trên môi trường
MS + 15% nước dừa + 0,1 mg/l TDZ trong 9 tuần.

Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) nghiên cứu nhân giống lan Hạc vỹ
cho rằng môi trường Phytamax (Sigma) + 1 mg/l BA giúp cho hạt nảy mầm tốt
trong lúc hệ số nhân protocorm trên môi trường Phytamax + 1 mg/l BA + 1 mg/l
αNAA khá cao. Đối với loài lan D. jerdonianum Wight (Sagaya Mary et al., 2016)
cho rằng mơi trường MS thích hợp cho ni cấy từ hoa, môi trường KC phù hợp
với nuôi cấy từ lá, môi trường VW phù hợp với nuôi cấy từ đốt thân.
Tapash Kumar Bhowmik et al., (2017) kết luận: mơi trường Phytamax (PM) có
bổ sung 20 g/l sucro đem lại tỷ lệ hạt nảy mầm loài D. palpebra Lindley, cao hơn
so với gluco và fructo. Thejaswini et al., (2017) cho rằng nước ép cà chua và nước
dứa 15% cho tỷ lệ nảy mầm tốt nhất khi gieo hạt in vitro lan D. ovatum (Willd.).
Theo Edy Setiti WidaUtami et al., (2017), bổ sung 2 g/l peptone trong môi trường
VW đã được chứng minh là hàm lượng thích hợp cho sự nảy mầm của hạt, hình
thành chồi với sự phát triển của protocorm.
Nghiên cứu về nuôi cấy cắt lát mỏng đã được các tác giả thực hiện trên một số
đối tượng: nuôi cấy cắt lát mỏng ngang thân cây con in vitro lan D. chrysotoxum
Lindley(chiều dày 2 mm) Saranjeet Kaur, (2017); Paromik Bhattacharyya et al.,
15