Tạo vật liệu phục vụ chọn dòng chịu hạn ở giống đậu xanh VN93 - 1 và VC1973A bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BÙI HỒNG XUYẾN

TẠO VẬT LIỆU PHỤC VỤ CHỌN DÒNG
CHỊU HẠN Ở GIỐNG ĐẬU XANH VN93 – 1 VÀ VC1973A
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Thái Nguyên – 8/2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Mậu
đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành
công trình nghiên cứu này.
Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Tâm, TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh
và các anh chị Nguyễn Thị Thủy (Phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào),
CN Hoàng Văn Mạnh (Viện khoa học Sự sống – ĐH Thái Nguyên) đã giúp
đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm –
Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp
và các thầy cô giáo, cán bộ của khoa.
Tôi xin cảm ơn Bộ môn hệ thống canh tác – Viện Ngô Trung ương
đã cung cấp các giống đậu xanh làm vật liệu nghiên cứu trong luận văn.

Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè trong suốt
thời gian học tập và hoàn thành luận văn.

Tác giả

Bùi Hống Xuyến

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
2,4D

Axit 2,4 – Dichlorphenoxyacetic

ADN

Axit deoxyribonucleic

AVRDC

Trung tõm Nghiờn cứu và Phỏt triển rau quả chõu Á

Cs

Cộng sự

ha

Hecta

NAA

Axit naphthyl acetic (Naphthyl acetic acid)

NSG

Ngày sau gieo

Kb

Kilobase

MS

Murashige and Skoog (Môi trường theo Murashige và Skoog)

PCR

Polymerase Chain Reaction

RADP
Random Amplified polymorphic ADN ( Đa hỡnh cỏc phõn đoạn
ADN được nhân bản ngẫu nhiên)
TAE
Tris acetate EDTA
SDS
Sodium Dodecyl Sulphat

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Đặc điểm nông học và năng suất của hai giống đậu xanh nghiên cứu....... 17
Bảng 2.2. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RADP được sử dụng trong nghiên
cứu............................................................................................................................................................ 24
Bảng 3.1. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi sử lý bằng thổi khô (%
khối lượng tươi). ......................................................................................................................... 26
Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô 1 tuần nuôi
phục hồi. ...................................................................................................... ....................................... 28
Bảng 3.3. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý
bằng thổi khô............................................................................................................................

30

Bảng 3.4 Mức biến động di truyền quần thể R 0, R1 của giống đậu xanh
VC1973A..................................................................................................................................

33

Bảng 3.5. Thời gian sinh trưởng và phát dục của cây (ngày) ..............................

34

Bảng 3.6. Các dòng chọn lọc từ R1............................................................................................. 37

Bảng 3.7. Độ tinh sạch và hàm lượng ADN của 6 mẫu đậu xanh................................

40

Bảng 3.8. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản của 6 mẫu đậu xanh khi phân
tích với 10 mồi ngẫu nhiên............................................................................................

42

Bảng 3. 9. Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu
nhiên..............................................................................................................................................

43

Bảng 3.10 Hệ số sai khác di truyền của các dòng chọn lọc và giống
gốc.....................................................................................................................................................

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



49


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý bằng thổi khô ............. .........

27

Hình 3.2. Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô và nuôi phục hồi

trên môi trường tái sinh..........................................................................................................

28

Hình 3.3. Khả năng tái sinh cây của các mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý
bằng thổi khô. .......................................................................................................................... .
Hình 3.4. Ảnh mô sẹo khi xử lý thổi khô (Giống VC1973A) ...................................................

30
35

Hình 3. 5. Một số hình ảnh cây tái sinh sau khi xử lý thổi khô (Giống VC1973A) ........ 35
Hình 3.6. Một số hình ảnh quần thể R0, R1 ngoài đồng ruộng ......... .................................. 38

Hình 3.7. Một số hình ảnh các dòng cây tái sinh và Quần thể cây VC1973A đối
chứng...................................................................................................................................................... 38
Hình 3.8. Kết quả điện di ADN tổng số tách từ 6 mẫu đậu xanh......... ................................... 40
Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M1.... 44
Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M2 ... 45
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M3... 45
Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M5.... 46
Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M6......46
Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M7.... 47
Hình 3.15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP của 6 mẫu đậu xanh với Mồi M8... 48
Hình 3.16 Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các dòng chọn lọc và giống
gốc

.................................................................................................... ..................................................

49

Hình 3.17. Các dòng đậu xanh ưu việt ở R1..................................................................................... 53

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC
Trang
Mở đầu .............................................................................................................. .. 1
1. ĐẶT VẤN ĐỀ

.. ............................................................................................................................. ............

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ..........................................................................

1
3

3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU...................................................................................................................... 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................................ ...............4
1.1 Đặc điểm sinh học cây đậu xanh, tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và
Việt Nam....................................................................................................... ..................................................................... 4
1.1.1 Đặc điểm sinh học cây đậu xanh.................................................................................................

4

1.1.2. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam.......................................... 6
1.2. Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật............................................................................................

8

1.2.1. Tính chịu hạn và tác động của hạn đến thực vật............................................................

8

1.2.1.1. Tính chịu hạn của thực vật.........................................................................................................

8

1.2.1.2. Nguyên nhân gây hạn và tác động của hạn đến thực vật...................................

9

1.2.2. Cơ sở sinh lý, hoá sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn .......................

12

1.2.2.1. Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn...........................................................................................

12

1.2.2.2. Cơ sở sinh hoá của tính chịu hạn...................................................................................

13

1.2.2.3. Cơ chế phân tử của tính chịu hạn..................................................................................

16

1.3. Một số thành tựu nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào việc đánh giá khả năng
chịu hạn và chọn dòng biến dị xoma................................................................................................

18

1.4. Sử dụng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) trong nghiên
cứu sự đa dạng di truyền ở mức phân tử .....................................................................................

19

1.4.1. RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA). ..................................................

19

1.4.2. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng RAPD........................................................

20

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................

23

2.1. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................................................

23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu...........................................................................

23

2.2.1. Hóa chất.....................................................................................................................................................

23

2.2.2. Thiết bị........................................................................................................................................................

23

2.2.3. Địa điểm nghiên cứu.........................................................................................................................

23

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu..................................................................................................................

24

2.3.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro............................................... .............................................

24

2.3.1.1. Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh................................................................ ................................

24

2.3.1.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo ...................

26

2.3.1.2.1. Phƣơng pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô..............................................................

26

2.3.1.2.2. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây............... 26
2.3.1.2.3. Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc..................................................................

27

2.3.1.2.4. Phƣơng pháp ra cây............................................... .................................................................

27

2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng..................................................................

28

2.3.3. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu...........................................................

28

2.3.4. Phuơng pháp sinh học phân tử.................................................................................................

28

2.3.4.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số từ lá cây đậu xanh .................................. 29

2.3.4.2. Phân tích đa hình ADN bằng kĩ thuật RADP................................................................. 29
2.3.4.3. Phân tích số liệu RADP.................................................................................................................

30

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................................

31

3.1. THĂM DÕ KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CÂY............................. 31
3.2. ĐỘ MẤT NƢỚC VÀ KHẢ NĂNG CHỊU MẤT NƢỚC CỦA MÔ SẸO PHÔI
CÁC GIỐNG ĐẬU XANH .......................................................................................................................... 31
3.2.1. Mức độ mất nƣớc của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô........................................................

32

3.2.2. Khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo ..................................................................................

33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




3.2.3. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sống sót sau khi xử lý thổi khô ........................ 34
3.2.4. Nhận xét về khả năng chịu mất nƣớc bằng xử lý thổi khô của các giống đậu
xanh nghiên cứu............................................................................................................................................

38

3.3. PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ BIẾN ĐỘNG DI TRUYỀN MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
NÔNG HỌC QUẦN THỂ R0, R1..................................................................................................

38

3.4. ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI ADN GENOME CỦA MỘT SỐ DÕNG ĐẬU
XANH CÓ NGUỒN GÔC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC.......................................... 44
3.4.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số ................................................................................................ 44
3.4.2 Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD...........................................................

46

3.4.2.1. Số phân đoạn, tần số xuất hiện và đa hình về phân đoạn ADN đƣợc nhân
bản........................................................................................................................ .................................................

46

3.4.2.2. So sánh sự khác nhau của các dòng chọn lọc so với giống gốc ở mức độ
phân tử............................................................................................................ ..................................................

53

3.4.3. Nhận xét về kết quả phân tích đa hình ADN trong hệ gen của các dòng đậu
xanh nghiên cứu...........................................................................................................................................

55

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................................................................

57

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ.......................................................................................................

58

TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................................................

59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây đậu xanh (Mungbean, Green bean) có tên khoa học là
Vigna radiata (L.) Wilczek đóng vai trò quan trọng thứ ba sau cây đậu tương
và lạc (2 loại cây công nghiệp ngắn ngày). Theo Trung tâm Nghiên cứu và
Phát triển rau quả châu Á (AVRDC), trong phần ăn được của hạt đậu xanh
chứa khoảng 25,98% protein, 1,3% lipit, 4,79% chất xơ, 64,12%
hydratcacbon (trong đó có 51,8% tinh bột), các loại vitamin A, B1, B2, C và
một số nguyên tố khoáng như K, Na, Mg, P, Fe, Ca….[9]. Vì thế hạt đậu xanh
có thể được sử dụng làm bột dinh dưỡng cho người hoặc thức ăn bổ sung cho
gia súc. Ngoài ra, hạt đậu xanh được dùng rộng rãi trong nhân dân để làm
thực phẩm như các loại bánh (bánh tét, bánh đậu xanh, bánh chưng...), chè,
xôi, cháo...Đặc biệt hạt đậu xanh dùng để ủ giá được sử dụng nhiều nhất trong
nhân dân. Không chỉ được coi như nguồn thức ăn mà hạt đậu xanh còn được

xem như một thứ dược liệu có tác dụng giải độc, thanh nhiệt, bớt sưng phù,
điều hòa ngũ tạng. Giá đỗ thường được dùng cho người bị viêm thanh quản
mất tiếng, vận động thể thao bị mỏi cơ, người béo phì, đái tháo đường, bệnh
tim mạch, cao huyết áp, nhồi máu cơ tim, cholesterol máu cao, hiếm muộn, dễ
xảy thai. … chữa bệnh cho con người. Ngoài ra, sản phẩm phụ của cây được
dùng làm thức ăn cho gia súc. Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng chống xói
mòn và cải tạo đất. Chất lượng protein trong hạt đậu xanh được đánh giá dựa
trên chỉ tiêu quan trọng là thành phần axit amin trong protein, cũng như các
cây họ đậu khác, protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ các loại axit amin không
thay thế. Nghiên cứu hàm lượng các loại axit amin không thay thế và các loại
axit amin giới hạn trong protein đạt tiêu chuẩn dinh dưỡng của FAO/WHO là
một trong các hướng của chiến lược chọn tạo giống đậu xanh chất lượng cao
1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




hiện nay.
Cây đậu xanh thuộc nhóm cây trồng chịu hạn trung bình, chịu úng kém
và là loại cây trồng có quả chín không tập trung gây khó khăn cho quá trình
thu hoạch. Cùng với các nguyên nhân khác nên cây đậu xanh được trồng chưa
nhiều ở nước ta, chủ yếu là xen canh, luân canh tăng vụ. Chỉ trong thời gian
gần đây đậu xanh mới được quan tâm phát triển. Tuy nhiên, cây đậu xanh chỉ
được quan tâm trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi, trung du phía Bắc và Tây
Nguyên, nơi có khí hậu khắc nghiệt mà đặc biệt thời gian khô hạn kéo dài nên
năng suất chưa cao. Chương trình chọn tạo giống đậu xanh ở nước ta hiện nay
còn hướng tới mục tiêu tạo giống đậu xanh không chỉ có tiềm năng năng suất
cao, ổn định, sinh trưởng mạnh, thời gian sinh trưởng ngắn mà còn phải chín
tập trung, chất lượng hạt cao, có khả năng chịu hạn, chịu úng, chịu sâu và

chống bệnh tốt.
Cho tới nay, việc ứng dụng công nghệ tế bào để nâng cao khả năng
chống chịu của cây trồng được tiến hành và đạt nhiều thành tựu đáng kể đối với
cây lúa, ngô, đậu tương.... tuy nhiên các công trình tương tự ở cây đậu xanh
còn ít được công bố.
Xuất phát từ những lý do trên, tôi đã lựa chọn đề tài cho luận văn thạc
sĩ là: "Tạo vật liệu phục vụ chọn dòng chịu hạn ở giống đậu xanh VN93 1 và VC1973A bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro".
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Tạọ dòng đậu xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước và xác định sự
thay đổi trong hệ gen của các dòng chọn lọc và giống gốc.

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....



data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not

read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....