Đặc điểm dịch tễ học phân tử về gen độc lực và gen kháng kháng sinh của Enterococus faecalis phân lập từ người, động vật, thực phẩm, ngoại cảnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HOÀNG THỊ AN HÀ

ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VỀ

GEN ĐỘC LỰC, GEN KHÁNG KHÁNG

SINH CỦA ENTEROCOCCUS

FAECALIS

PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI, ĐỘNG VẬT,

THỰC PHẨM, NGOẠI CẢNH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HOÀNG THỊ AN HÀ

ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VỀ
GEN ĐỘC LỰC, GEN KHÁNG KHÁNG
SINH CỦA ENTEROCOCCUS FAECALIS

PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI, ĐỘNG VẬT,
THỰC PHẨM, NGOẠI CẢNH

Chuyên ngành: Vi sinh. Ngành: Khoa học y sinh
Mã số: 9720101

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS – TS Nguyễn Vũ Trung
2. TS Trần Huy Hoàng

HÀ NỘI - 2023

LỜI CẢM ƠN

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.BS Nguyễn Vũ Trung, Viện
trưởng Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ, động viên và hướng
dẫn tơi trong suốt q trình học tập nghiên cứu.

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS.BS Trần Huy Hồng, Trưởng phịng
Kháng Kháng sinh, Phó Trưởng khoa Vi khuẩn, Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ương, người
thầy ln có những ý tưởng sáng tạo về nội dung, phương pháp nghiên cứu, đã luôn lo
lắng, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tơi hồn thành luận luận án này.
Trân trọng biết ơn Thầy.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh, Trường
Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện thn lợi nhất cho tơi trong
suốt q trình học tập tại Bộ mơn đồng thời có những ý kiến đóng góp q báu giúp bản

luận án này được hồn thiện hơn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương,
lãnh đạo và tập thể khoa Vi khuẩn, đặc biệt là các anh chị em phịng thí nghiệm Kháng
kháng sinh đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian
nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn quỹ NAFOSTED đã hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số:
108.02-2017.320 do tiến sỹ Trần Huy Hoàng làm chủ nhiệm để chúng tơi có thể hồn
thành nghiên cứu này.

Với tất cả sự kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cơ Ban
Giám hiệu, Phịng Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Y Hà Nội đã luôn giúp đỡ các
học viên với thái độ nhiệt tình, vơ tư và thân thiện. Cảm ơn cơ Đồn Thị Thu Huyền đã
song hành cùng nghiên cứu sinh khóa 37 chúng em.

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y khoa Vinh, các phịng
ban liên quan, các giảng viên bộ mơn Vi sinh, Ký sinh trùng đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi về chế độ và thời gian giảng dạy để tôi có thể tập trung hồn thành luận án.

Xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã chia sẻ, động viên khuyến
khích và giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập.

Cuối cùng tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ của bố mẹ hai
bên và sự ủng hộ, động viên, thương u, chăm sóc, khích lệ của chồng, con và các em,
những người luôn ở bên và là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập và hoàn thành
luận án này.

Hà Nội, ngày 2 tháng 8 năm 2023
Nghiên cứu sinh

Hoàng Thị An Hà

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Hồng Thị An Hà, nghiên cứu sinh khóa 37, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên
ngành Vi sinh y học, xin cam đoan:

1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy
Nguyễn Vũ Trung và Thầy Trần Huy Hoàng

2. Cơng trình này hồn tồn khơng trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam

3. Các số liệu và thơng tin trong nghiên cứu là hồn tồn chính xác, trung thực và
khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.
Hà Nội, ngày 2 tháng 8 năm 2023
Người viết cam đoan

Hoàng Thị An Hà

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
Chương 1......................................................................................................................... 3
TỔNG QUAN.................................................................................................................3

1.1. Tổng quan về E. faecalis....................................................................................3

1.1.1. Đặc điểm sinh học của E. faecalis...................................................................3
1.1.2. Khả năng gây bệnh........................................................................................15
1.1.3. Phân bố của Enterococcus.............................................................................20
1.1.4. Các cơ chế kháng kháng sinh của Enterococcus faecalis..............................25
1.1.5. Tiếp cận một sức khỏe...................................................................................35

1.2. Các kỹ thuật phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh, gen đề kháng và mối liên hệ
kiểu gen giữa các chủng..............................................................................................36

1.2.1. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh..............................................36
1.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện gen kháng kháng sinh.....................42
1.2.3.Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng vi
khuẩn....................................................................................................................... 48
1.3. Tính thời sự, tính mới của nghiên cứu.................................................................53
1.3.1. Tính thời sự...................................................................................................53
1.3.2. Tính mới........................................................................................................54
Chương 2.......................................................................................................................55
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................55
2.1. Địa điểm nghiên cứu............................................................................................55
2.1.1. Địa điểm lấy mẫu..........................................................................................55
2.1.2. Địa điểm thực hiện các xét nghiệm phân tích vi sinh......................................55
2.2. Thiết kế nghiên cứu.............................................................................................55
2.3. Thời gian nghiên cứu...........................................................................................55
2.4. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................55
2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu..............................................................................................57
2.6. Phương pháp và phương tiện nghiên cứu.............................................................57
2.6.1. Phương pháp lựa chọn mẫu...........................................................................58

2.6.2. Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm.................................................................58
2.6.3. Nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn.........................................................60

2.6.4. Kháng sinh đồ với các vi khuẩn E. faecalis...................................................60
2.6.5. PCR phát hiện các gen liên quan tới độc lực và kháng kháng sinh................62
2.6.6. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE......................................65
2.6.7. Kỹ thuật giải trình tự tồn bộ bộ gen Whole genome sequencing (WGS).....66
2.7. Các chỉ số, biến số nghiên cứu.............................................................................69
2.8. Thu thập và phân tích số liệu...............................................................................71
2.9. Khống chế sai số..................................................................................................72
2.10. Đạo đức nghiên cứu...........................................................................................72
2.11. Sơ đồ tóm tắt nghiên cứu...................................................................................73
Chương 3.......................................................................................................................74
KẾT QUẢ...................................................................................................................... 74
3.1. Đặc điểm dịch tễ học của E. faecalis....................................................................74
3.1.1. Tỷ lệ E. faecalis phân lập được trong nghiên cứu..........................................74
3.1.2. Mức độ nhạy cảm của E. faecalis với các loại kháng sinh.............................74
3.2. Gen liên quan tới độc lực và gen kháng kháng sinh của các chủng E.faecalis.....78
3.2.1. Gen độc lực...................................................................................................78
3.2.2. Các gen độc lực trong các chủng E. faecalis từ các nguồn khác nhau...........78
3.2.2. Gen liên quan đến kháng kháng sinh.............................................................79
3.2.3. Tỷ lệ gen kháng kháng sinh trong các chủng E. faecalis đề kháng theo
nguồn gốc phân lập được.......................................................................................81
3.3. Mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. faecalis bằng kỹ thuật PFGE.................88
3.4. Đặc điểm sinh học phân tử các chủng giải trình tự tồn bộ bộ gen (WGS)..........93
3.4.1. Kiểu ST của các chủng E. faecalis................................................................93
3.4.2. Các gen độc lực.............................................................................................96
3.4.3. Các gen kháng kháng sinh.............................................................................97
3.4.4. Các loại plasmid trong các chủng E. faecalis..............................................103
3.4.5. Mối liên hệ kiểu gen của các chủng mang optrA.........................................104
Chương 4.....................................................................................................................111
BÀN LUẬN.................................................................................................................111
4.1. Đặc điểm dịch tễ học của E. faecalis..................................................................111

4.1.1. Tỷ lệ phân lập E. faecalis............................................................................111
4.1.2. Mức độ nhạy cảm của E. faecalis với các loại kháng sinh...........................115
4.2. Các gen độc lực và gen liên quan đến kháng kháng sinh của E. faecalis...........127
4.2.1. Các gen độc lực...........................................................................................127
4.2.2 Các gen liên quan đến kháng kháng sinh......................................................142
4.2.3. Các plasmid trong E. faecalis......................................................................163
4.3. Mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. faecalis................................................167
4.3.1. Mối liên hệ kiểu gen xác định bằng kỹ thuật PFGE....................................167
4.3.2. Mối liên hệ kiểu gen xác định bằng kỹ thuật MLST và WGS.....................170
4.5. Hạn chế của nghiên cứu.....................................................................................173
KẾT LUẬN.................................................................................................................174
ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
KHUYẾN NGHỊ
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẲT

AME Aminoglycoside modifying enzyme
ABC (Enzym biến đổi aminoglycosid)
ABR ATP-binding cassette
AMR (Hệ thống vận chuyển liên kết ATP)
AS Antibiotic resistance
AST (Kháng kháng sinh)
ATCC Antimicrobial Resistance
BSI (Kháng chất kháng khuẩn)
CAUTI Aggregation substance
CLSI (Chất kết tập)

DANMAP Antimicrobial susceptibility testing
(Thử nghiệm mức độ nhạy cảm với kháng sinh)
DAP American Type Culture Collection
ECM (Ngân hàng chủng chuẩn vi sinh vật Hoa Kỳ)
EDTA Bloodstream infections
(Nhiễm khuẩn huyết)
Catheter-Associated Urinary Tract Infection
(Nhiễm trùng đường tiết niệu liên quan đến ống thông)
The Clinical and Laboratory Standards Institute
(Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm)
Danish Integrated Antimicrobial Resistance Monitoring
and Research Programme
Chương trình nghiên cứu và kháng sát kháng thuốc của
Đan Mạch
Daptomycin
Extracellular matrix
Chất nền ngoại bào
Ethylene diamine tetraacetic acid

ESBL Extended-spectrum beta-lactamase
EUCAST (Men beta-lactamase phổ rộng)
European Committee on Antimicrobial Susceptibility
FDA Testing
GRE Ủy ban Châu Âu về Thử nghiệm độ nhạy cảm với
HLAR kháng sinh
HLGR Food and Drug Administration
HLSR (Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ)
LD50 Glycopeptide resistant enterococci
I (Enterococci kháng glycopeptid)
ICU High level aminoglycoside resistance

IE (Kháng aminoglycoside mức độ cao)
KS High level gentamicin resistance
LEADER (Kháng gentamicin mức độ cao)
High level streptomycin resistance
LZD (Kháng g streptomycin mức độ cao)
MDR Lethal Dose 50
Liều chết 50
Intermediary
(Trung gian)
Intensive care unit
(Đơn vị chăm sóc tích cực)
Infective endocarditis
(Viêm nội tâm mạc)
Kháng sinh
Linezolid Experience and Accurate Determination of
Resistance
Thử nghiệm và xác định đề kháng linezolid
Linezolid
Multiple drug resistance
(Đa kháng thuốc)

MDRO Multidrug-resistant organism
MGEs (Vi khuẩn đa kháng)
MFS Mobile genetic elements
MIC Các yếu tố di truyền động
MLSA Major Facilitator Superfamily
MLSB Hệ thống vận chuyển cơ chất
MLST Minimal Inhibitory concentration
MSCRAMM (Nồng độ ức chế tối thiểu)
Macrolide-Lincosamide-Streptogramin A

MRSA Macrolide-Lincosamide-Streptogramin B
NGS Multilocus sequence typing
NIHE (Chuỗi trình tự đa điểm)
NKBV Microbial surface components recognizing adhesive
NKH matrix molecules
NKTN Ma trận phân tử kết dính nhận biết các thành phần bề mặt
PAI của vi khuẩn
PCR Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
PBP (Tụ cầu vàng kháng Methicillin)
Next-generation sequencing
Giải trình tự gen thế hệ mới
National Institute of Hygiene and Epidemiology
(Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương)
Nhiễm khuẩn bệnh viện
Nhiễm khuẩn huyết
Nhiễm khuẩn tiết niệu
Pathogenicity island
Đảo bệnh sinh
Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng khuếch đại gen)
Penicillin binding protein
(Protein gắn penicillin)

PFGE Pulsed Field Gel Electrophoreses
R (Điện di xung trường)
RAPD Resistance
RFLP (Kháng)
S Random Amplified Polymorphic DNA
SNP (DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên)
SOP Restriction Fragment Length Polymorphism

ST (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn)
TCS Sensitivity
UTI (Nhạy cảm)
VRE Single nucleotide polymorphisms
VSE (Đa hình đơn nucleotid)
WGS Standard operating procedure
ZAAPS (Quy trình thao tác chuẩn)
Sequence type
(Kiểu trình tự)
Two-component regulatory system
(Hệ thống điều tiết hai thành phần)
Urinary tract infections
(Nhiễm khuẩn tiết niệu)
Vancomycin-resistant Enterococci
(Enterococci kháng vancomycin)
Vancomycin-sensitive Enterococci
(Enterococci nhạy cảm vancomycin)
Whole genome sequencing
(Giải trình tự tồn bộ bộ gen)
Zyvox Annual Appraisal of Potency and Spectrum
Đánh giá thường niên hiệu lực và hoạt phổ của Zyvox

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. 1. Cấu trúc vách E. faecalis.................................................................................3
Hình 1. 2. Quá trình tổng hợp vách tế bào E. faecalis......................................................3
Hình 1. 3. Mơ hình cho cơ chế kích hoạt fsr trong E. faecalis và tác dụng của nó đối với
sự tổng hợp gelatinase và serine protease.......................................................................10
Hình 1. 4. Cấu trúc Esp của E. faecalis..........................................................................11
Hình 1. 5. Cấu trúc Ace của E. faecalis..........................................................................13

Hình 1. 6. Cấu trúc các operon van.................................................................................27
Hình 1. 7. Phương pháp pha lỗng trong thạch...............................................................40
Hình 3. 1. Hình ảnh đại diện kết quả điện di xung trường của đại diện..........................88
Hình 3. 2. Mối liên hệ kiểu gen của các chủng E. faecalis.............................................89
Hình 3. 3. Mối liên hệ kiểu gen giữa các sequence type xác định được ở các chủng trong
nghiên cứu và trên thế giới.............................................................................................95
Hình 3. 4. Mối liên hệ ST giữa các chủng và kiểu gen độc lực......................................96
Hình 3. 5. Mối liên hệ ST giữa các chủng và kiểu gen liên quan kháng kháng sinh.......98
Hình 3. 6. Phylogenetic các chủng mang optrA dựa trên sự khác biệt SNP..................105
Hình 3. 7. Genetic context của optrA trên chromosome...............................................106
Hình 3. 8. Genetic optrA trên Tn6647 và các chủng so sánh........................................107
Hình 3. 9. Genetic context optrA trên plasmid.............................................................108
Hình 3. 10. Genetic optrA chứa trình tự chèn IS và các chủng so sánh........................109
Hình 3. 11. Genetic context optrA chưa xác định vị trí................................................110

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. 1. Tính chất sinh vật hóa học của E. faecalis.......................................................7
Bảng 2. 1. Loại mẫu và số lượng mẫu thu thập được.....................................................57
Bảng 2. 2. Trình tự prime phát hiện gen liên quan tới độc lực........................................62
Bảng 2. 3. Trình tự prime phát hiện gen liên quan tới sự đề kháng kháng sinh..............63
Bảng 3. 1. Liên quan giữa kiểu hình kháng linezolid và các kháng sinh khác................75
Bảng 3. 2. Tỷ lệ đề kháng với các loại kháng sinh của các chủng E. faecalis phân lập từ
các nguồn....................................................................................................................... 77
Bảng 3. 3. Tỷ lệ các gen độc lực phân lập được từ các nguồn........................................78
Bảng 3. 4. Tỷ lệ mang gen đề kháng kháng sinh trên các chủng E. faecalis...................79
Bảng 3. 5. Liên quan giữa kiểu hình và kiểu gen kháng linezolid..................................80
Bảng 3. 6. Sự phân bố gen optrA, gyrA và vanC trong các nguồn..................................81
Bảng 3. 7. Tỷ lệ các gen kháng kháng sinh trên các chủng đề kháng theo nguồn...........82
Bảng 3. 8. Phân bố gen optrA trên các chủng E. faecalis kháng kháng sinh...................84

Bảng 3. 9. Kiểu hình kháng kháng sinh của các các chủng E. faecalis...........................85
Bảng 3. 10. Phân bố kiểu sequence type của 47 chủng E. faecalis.................................94
Bảng 3. 11. Các biến thể optrA và vị trí acid nucleic đột biến......................................100
Bảng 3. 12. Liên quan các đột biến gen gyrA, parC và giá trị MIC của ciprofloxacin,
levofloxacin.................................................................................................................. 101
Bảng 3. 13. Liên quan các biến thể optrA và giá trị MIC của linezolid........................102
Bảng 3. 14. Liên quan giá trị MIC của vancomycin và sự có mặt của operon vanC.....102
Bảng 3. 15. Số lượng và loại plasmid có trong các chủng E. faecalis..........................103

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3. 1. Tỷ lệ E. faecalis phân lập được từ các loại mẫu........................................74
Biểu đồ 3. 2. Mức độ nhạy cảm của E. faecalis với các loại kháng sinh........................74
Biểu đồ 3. 3. Tỷ lệ các gen độc lực trên các chủng E. faecalis.......................................78
Biểu đồ 3. 4. Tỷ lệ đa kháng trên các chủng E. faecalis phân lập từ các nguồn.............87

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

E. faecalis là vi khuẩn phân bố rộng rãi trong môi trường. Chúng có mặt trong
nhiều loại thực phẩm lên men như pho mát, xúc xích và rau quả, tham gia vào q trình
chín và tạo hương thơm của những thực phẩm này nhờ hoạt động phân giải protein và
lipolytic.1,2 Một số chủng được sử dụng làm men vi sinh cho con người vì chúng có thể
tồn tại và cạnh tranh trong đường tiêu hóa, hỗ trợ phân giải thức ăn.3 Trong công nghiệp
thực phẩm, E. faecalis cũng được sử dụng như một “chất bảo quản” nhờ khả năng tiết
bacteriocin ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây thối rữa khác.4

Vi khuẩn này thuộc vi hệ đường tiêu hóa người và động vật, từng được cho là vơ
hại và khơng có vai trò quan trọng trong y học. Tuy nhiên, cho đến nay, E. faecalis đã nổi

lên với tư cách như một tác nhân quan trọng gây ra viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn
huyết, nhiễm trùng sau phẫu thuật và liên quan đến các thiết bị y tế nhiễm bẩn.5-8 Đây là
vi khuẩn Gram dương hàng đầu phân lập được từ nhiễm trùng đường tiết niệu tại Việt
Nam,9,10 là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện đứng thứ ba, chiếm 14% ở Hoa Kỳ từ
năm 2011 đến 2014.5 Việc sở hữu nhiều gen độc lực giải thích cho sự thường gặp nhất
của loài vi khuẩn này trong số các Enterococcus phân lập được trên lâm sàng.11-14

Bên cạnh đó, sự đề kháng kháng sinh của E. faecalis có xu hướng gia tăng. Ngồi
sự đề kháng tự nhiên với 1 số nhóm kháng sinh như aminogycosid (mức độ thấp),
cephalosporins, sulphonamides, clindamycin và quinupristin/dalfopristin, loại vi khuẩn
này cịn có thể thu nhận các gen đề kháng thơng qua áp lực chọn lọc của kháng sinh
(gyrA, parC kháng quinolone, vanA, vanB kháng vancomycin, …) hoặc các yếu tố di
truyền động plasmid, transposone (ermA, ermB kháng macrolide, otrpA, poxA kháng
linezolid…). Sự xuất hiện đề kháng không chỉ diễn ra trong môi trường bệnh viện mà
ngay cả đối với cộng đồng, đặc biệt ở các trang trại chăn ni có sử dụng kháng sinh.
Đáng lo ngại, vi khuẩn có thể đề kháng với các kháng sinh quan trọng dùng để điều trị
các nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram dương như vancomycin, linezolid. Điển hình là sự
bùng nổ Enterococcus kháng vancomycin (VRE) khi sử dụng avoparcin15 hoặc gần đây,
kháng linezolid liên quan đến sử dụng phenicol, macrolide trong chăn nuôi đã được đề
cập đến.16,17 E. faecalis kháng kháng sinh từ động vật được đào thải ra ngoại cảnh, gây ô
nhiễm thực phẩm và lây lan sang người. Có thể nói, phát sinh vi khuẩn kháng kháng sinh
từ các trang trại chăn ni là nhân tố quan trọng góp phần làm cho tình hình đề kháng
kháng sinh trở nên phức tạp hơn.

2

Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu đầy đủ nào về sự có mặt của E. faecalis
trong mơi trường trang trại cũng như các đặc điểm phân tử liên quan đến độc lực và khả
năng kháng kháng sinh của loài vi khuẩn này. Ngoài ra, sự lây lan của các chủng đề
kháng trong cộng đồng cũng ít được đề cập. Chính vì vậy, hiểu biết về sự có mặt của E.

faecalis ở đường tiêu hóa người, động vật, ở thực phẩm, môi trường; chứng minh sự tồn
tại gen độc lực, gen kháng kháng sinh, cung cấp bằng chứng ở cấp độ phân tử về sự lan
truyền là cơ sở khoa học để đưa ra các biện pháp toàn diện nhằm hạn chế vi khuẩn kháng
kháng sinh, đặc biệt trong bối cảnh ‘One health’ được đề xuất như một giải pháp tích cực
hiện nay. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Đặc điểm dịch tễ học
phân tử về gen độc lực, kháng kháng sinh của Enterococcus faecalis phân lập từ
người, động vật, thực phẩm, ngoại cảnh” với 3 mục tiêu:

1. Mô tả đặc điểm dịch tễ học Enterococcus faecalis phân lập được từ người, động
vật, thực phẩm, ngoại cảnh

2. Xác định một số gen độc lực, gen kháng kháng sinh của các chủng Enterococcus
faecalis

3. Đánh giá mối liên hệ kiểu gen của Enterococcus faecalis phân lập từ người, động
vật, thực phẩm, ngoại cảnh.

3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về E. faecalis
1.1.1. Đặc điểm sinh học của E. faecalis
1.1.1.1. Cấu trúc tế bào vi khuẩn
Cấu trúc vách: Giống các vi khuẩn Gram dương khác, vách tế bào của E. faecalis được
cấu tạo bởi ba thành phần chính: khung peptidoglycan, các polyme anion (acid teichoic,
polysaccharid) và protein (Hình 1.1). Peptidoglycan và polyme anion chiếm gần 90%,
protein hơn 10% tổng trọng lượng vách tế bào.

Hình 1. 1. Cấu trúc vách E. faecalis18

Peptydoglycan

Peptidoglycan bao gồm disaccharide cấu tạo bởi N-acetylmuramic acid-N-
acetylglucosamine. Các sợi peptydoglycan, thường có kích thước từ 5-30 tiểu đơn vị,
được liên kết với nhau bởi các peptit được gắn vào các gốc MurNAc (NAM). Quá trình
sinh tổng hợp vách bao gồm 3 giai đoạn.18 (Hình 1.2)

Hình 1. 2. Quá trình tổng hợp vách tế bào E. faecalis18

4
Proteins liên kết

Ngoài sự trùng hợp của các sợi glycan và sự liên kết ngang rộng rãi giữa chúng
thơng qua các phản ứng transpeptid hóa thì q trình tổng hợp vách tế bào cịn được điều
chỉnh bởi các enzym tự phân, thường được gọi là muramidases. Những enzyme hoạt
động theo kiểu tương tự như lysozyme có nguồn gốc từ vật chủ, ở đó chúng có thể phân
cắt NAG- NAM dư. Shockman là người đầu tiên mô tả các enzyme này ở enterococci
trong các nghiên cứu từ những năm 1960.19 Ở E. faecalis, có 3 loại muramidase là AtlA,
AtlB và AtlC trong khi ở E. hirae ATCC9790 chỉ có 2 loại là M1 và M2.
Lipoprotein

Lipoprotein bám vào mặt ngồi của màng tế bào thơng qua việc bổ sung cộng hóa
trị của diacylglycerid vào gốc cysteine. Lipoprotein sẽ được định vị trong không gian xác
định này, tạo điều kiện thuận lợi cho việc thu nhận các chất dinh dưỡng, chẳng hạn như
sắt và mangan liên kết với heme, hoặc các enzym giải độc, ví dụ như β-lactamase ở
Staphylococcus và Enterococcus.
Lipoteichoic acid

Sự khác biệt về cấu trúc lipoteichoic acid (LTA) là cơ sở để Lancefield đưa ra
phương pháp phân loại typ huyết thanh của các loài streptococci quan trọng thường gây

bệnh trên lâm sàng, theo đó E. faecalis được phân vào nhóm D cùng với S. bovis.20 Cấu
trúc LTA của E. faecalis bao gồm một polyme acid teichoic glyxerol photphat với sự thay
thế của kojibiose (disaccarit của 2 monoglucoza liên kết) và D-alanyl hóa xen kẽ dọc theo
khung polyme glyxerol. LTA được gắn vào màng lipid bởi các enzym BgsA và BgsB.
Acid Teichoic vách tế bào (WTA)

Lớp peptydoglycan của vi khuẩn gram dương dày tạo điều kiện cho sự ổn định
màng tế bào và là nơi để nhiều thành phần khác có thể gắn vào, trong đó có acid teichoic
(TA). TA gồm 2 loại: lipo-TAs (LTA), được gắn vào màng tế bào và kéo dài từ bề mặt tế
bào vào lớp peptidoglycan và TA ở vách (WTA), được gắn cộng hóa trị với
peptidoglycan và kéo dài ra ngoài thành tế bào.21,22 WTA của E. faecalis WTA có cấu trúc
phức tạp hơn E. faeccium, bao gồm glucose, galactose, N-acetyl galactosamine, N-acetyl
glucosamine và ribitol phosphate.
Màng tế bào

Tương tự như các vi khuẩn khác, màng tế bào của E. faecalis là lớp màng mỏng và
chun giãn, bao gồm protein, lipid mà đa phần là phospholipid. Các loại phospholipid chủ

5

yếu ở vi khuẩn Gram dương là phosphatidylglycerol (PG) và cardiolipin (CL), có thành
phần tương đối khác nhau giữa các loài.23 Hàm lượng các phospholipid được chứng minh
phụ thuộc vào điều kiện tăng trưởng, cho thấy cơ chế điều hòa phospholipid rất linh động
và thích ứng với mơi trường. Các acid béo khơng no trong phospholipid giúp vi khuẩn
tăng sức đề kháng với muối mật và kháng sinh daptomycin. Ví dụ, acid oleic, bảo vệ E.
faecalis chống lại áp lực lên màng do muối mật gây ra. 24 Trong những năm gần đây, một
số nghiên cứu về vai trò của lipid ở enterococci đối với sự kháng kháng sinh và kháng
các peptide kháng khuẩn cũng đã được báo cáo. Hầu hết đều cho thấy, sự xuất hiện của
kháng daptomycin ở E. faecalis có liên quan đến hàm lượng acid béo cao25 hoặc
phosphatidylglycerol (PG) thấp, glycerophospho-diglucosyl-diacylglycerol (GPDGDAG)

cao.23 Điều này được giải thích bởi PG được biết đến như là điểm gắn của DAP. Ngoài ra,
E. faecalis kháng DAP cũng liên quan đến các đột biến gen chuyển hóa lipid như gdpD,
cls. Chuyển hóa lipid cịn tham gia vào q trình tổng hợp biofilm và cân bằng nội môi.26
Tế bào chất (cytoplasm)

Tế bào chất vi khuẩn dưới dạng gel, 80% là nước và các thành phần hoà tan như
protein, acid amin, vitamin, ARN, ribosom, các muối khoáng (Ca, Na, P…) và một số
nguyên tố hiếm. Ribosom có nhiều trong chất nguyên sinh, là nơi tác động của một số
loại kháng sinh, làm sai lạc sự tổng hợp protein của vi khuẩn, như aminozid,
chloramphenicol… Ngoài các thành phần trên, tế bào chất vi khuẩn còn chứa các hạt vùi
và một số không bào. Đây cũng là nơi thực hiện các chức năng cho sự phát triển, sự tổng
hợp, chuyển hóa các chất và sao chép tế bào.20
Vật chất di truyền

E. faecalis chứa một nhiễm sắc thể mang 1 phân tử DNA dạng vịng trịn khép kín,
có kích thước từ 300-3250kb. Chủng kháng vancomycin đầu tiên phân lập được tại Hoa
Kỳ, E. faecalis V583, đã được giải trình tự cho thấy các phân tử DNA gồm: DNA nhiễm
sắc thể, plasmid vòng và transposon. Nhiễm sắc thể V583 chứa 3.218.031 bp với 87,6%
trình tự mã hóa. Tổng cộng có 3182 gen mã hóa protein với kích thước trung bình 889bp,
12 phân tử rRNA. 519 protein bảo tồn ở các vi khuẩn Gram dương có tỷ lệ G+C thấp
cũng đã được tìm thấy. Chúng tham gia vào việc sao chép, phiên mã, dịch mã. Ngồi ra,
cịn có sự có mặt của các protein vận chuyển.27

E. faecalis chứa nhiều loại plasmid và transposon có liên quan đến việc lan truyền
gen kháng kháng sinh và quy định các yếu tố độc lực, ví dụ, các plasmid pAD1,
pAM322,

6

pCF10 hoặc pPD1. Chúng mã hóa protein bề mặt giúp cho việc kết dính (tiếp xúc trực

tiếp) giữa các tế bào cho và tế bào nhận, nhờ đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận
chuyển chất liệu di truyền, chẳng hạn như các gen kháng kháng sinh thông qua cơ chế
tiếp hợp. Inc18 là plasmid vật chủ rộng, số bản sao thấp (<10 bản sao/tế bào), có kích
thước 25–30 kb. Plasmid đã được chứng minh là cơng cụ hữu ích trong việc lan truyền
các đặc tính kháng kháng sinh, kháng kim loại nặng và các yếu tố độc lực cần thiết cho
nhiễm trùng

Một loạt các transposon cũng được tìm thấy trong Enterococcus. Nhóm transposon
Tn3, composite transposon và transposon liên hợp là các loại transposon thường gặp.
Tn917 và Tn1546 là 2 thành viên tiêu biểu của nhóm Tn3. Tn917 mang gen kháng
macrolides- lincosamide-streptogramin, Tn1546 chứa gen vanA kháng vancomycin.
Transposons liên hợp mã hóa đề kháng ít nhất một kháng sinh và có mặt trong nhiều tế
bào. Chúng tích hợp vào DNA của vật chủ nhờ chuyển vị nhưng sự vận chuyển sang tế
bào khác bởi hình thức tiếp hợp. Các transposon phổ biến cho nhóm này bao gồm Tn916,
Tn918 hoặc Tn1549 chứa vanB, quy định tính kháng vancomycin. Composite transposon
là các trình tự DNA chứa vùng trung tâm mang các gen kháng kháng sinh
(aminoglycosides, vancomycin), kháng thủy ngân, … được chèn giữa 2 đầu là các trình tự
IS. Khoảng một phần tư các trình tự genome của E. faecalis V583 bao gồm các yếu tố di
truyền động và DNA ngoại sinh như transposon, plasmid và 38 loại IS. Sự có mặt một số
lượng lớn các yếu tố này cho thấy các yếu tố di truyền động đóng góp đáng kể trong sự
thu được và tích lũy độc lực cũng như gen đề kháng.
1.1.1.2. Tính chất sinh vật hóa học

E. faecalis là cầu khuẩn Gram dương, hiếu kỵ khí tùy tiện, có thể sắp xếp thành
chuỗi ngắn, theo cặp hoặc riêng lẻ. Giống như streptococci, khơng có enzyme
cytochrome, do đó, catalase âm tính, mặc dù một số chủng sinh pseudocatalas.20 Hầu hết
các chủng trong chi Enterococcus đều có các đặc điểm chung như có thể sinh trưởng ở
NaCl 6,5%, pH 4,6 - 9,9, tối ưu là 7,5, phát triển được ở 100C – 450C, và phần lớn, tồn tại
ở 600C trong 30 phút. Vi khuẩn phát triển và sinh bacteriocin tốt nhất ở pH 6.0-9.0. Ở pH
10, chúng vẫn có thể phát triển ở mức cao nhưng nồng độ bactriocin giảm xuống 50%; ở

pH=4.0-5.0, có phát triển nhưng bactreiocin khơng được tạo ra và ở pH=3.0, hồn tồn bị
ức chế.

Để phát triển trong những điều kiện khắc nghiệt đòi hỏi E. faecalis phải có sự trao
đổi chất linh hoạt. Chúng khơng chỉ có khả năng lên men để tạo ra acid lactic mà cịn có
thể “dị hóa một loạt các nguồn năng lượng từ carbohydrate, glycerol, lactate, malate, acid