Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.35 MB, 141 trang )
MỤC LỤC
MỤC LỤC ............................................................................................................................. 3
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………………………………………14
1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ......................................................................................... 16
1.1
1.1.1
Listeria monocytogenes .................................................................................................... ……16
Đặc điểm L. monocytogenes .......................................................................... 16
1.1.2. Vai trò của internalin J (inlJ) trong quá trình gây bệnh của L. monocytogenes……20
1.1.3
Tình hình nhiễm tạp trong thực phẩm và gây bệnh của L. monocytogenes .. 23
1.1.4
Quy định kiểm soát L. monocytogenes .......................................................... 24
1.2
Dịch tễ học phân tử của L. monocytogenes ....................................................................... 25
1.2.1
Đặc điểm dịch tễ các dòng giống (lineage) L. monocytogenes ..................... 25
1.2.2
Đặc điểm dịch tễ các dòng phức hợp (clones complex) L. monocytogenes .. 25
1.2.3
Đặc điểm dịch tễ các kiểu huyết thanh L. monocytogenes ............................ 26
1.2.4
Các phƣơng pháp phân loại sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử . 27
1.2.4.1. Phương pháp điện di xung trường (PFGE).......................................................27
1.2.4.2. Phương pháp ribotyping.................................................................................28
1.2.4.3. Phương pháp đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD).......28
1.2.4.4. Phương pháp đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc
(AFLP)…………………………………………………………………………………………………….29
1.2.4.5. Phương pháp đa hình chiều dài các đoạn sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme giới
hạn (PCR-RFLP)..............................................................................................29
1.2.4.6. Phương pháp khuếch đại các trình tự lặp (REP-PCR)......................................29
1.2.4.7. Phương pháp phân tích vùng lặp đối xứng của nhiều locus (MLVA) .............. .30
1.2.5. Phƣơng pháp phân loại dựa trên trình tự của nhiều locus (MLST)…….………….30
1.2.5.1. Phương pháp phân loại dựa trên trình tự nhiều locus gen độc (MVLST)...........31
1.2.5.1. Phương pháp phân loại dựa trên trình tự các gen giữ nhà ..............................31
1.2.6. Cơ sở dữ liệu về phƣơng pháp phân loại dựa trên trình tự nhiều locus
(MLST)…………………………………………………………………………….34
1.3
1.3.1
Một số phƣơng pháp phân tích phát hiện L. monocytogenes ....................................... 34
Phƣơng pháp nuôi cấy ................................................................................... 34
1.3.1.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình tăng sinh........................35
1.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình tăng sinh..............................................37
3
1.3.1.3. Ảnh hưởng của mẫu thực phẩm đến quá trình tăng sinh...................................37
1.3.1.4. Ảnh hưởng của thành phần vi sinh vật đồng nhiễm trong mẫu .........................38
1.3.2
Phƣơng pháp miễn dịch ................................................................................. 40
1.3.3
Phƣơng pháp khuếch đại DNA (PCR, real-time PCR).................................. 41
1.4. Kỹ thuật nhân gen đẳng điện tạo cấu trúc vòm (LAMP)……………………… .43
1.4.1
Nguyên tắc của kỹ thuật LAMP .................................................................... 43
1.4.2
Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP ................................................................ 45
1.4.3.
Phát hiện sản phẩm LAMP.............................................................................46
1.4.4.
Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả phản ứng LAMP…………………..47
1.4.5.
Các nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp LAMP để phát hiện L. monocytogenes
trên thế giới………………………………………………………………………………..48
1.5. Một số kỹ thuật tách chiết thu nhận nhanh DNA cho các phản ứng khuếch đại
DNA………………………………………………………………………………………50
1.5.1. Các yêu cầu đối với DNA sử dụng cho các kỹ thuật nhân gen………………….50
1.5.2. Tách chiết và tinh sạch DNA…………………………………………………….51
1.5.3. Kiểm tra hiệu suất thu hồi và chất lƣợng DNA...............................................54
2
CHƢƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
56
2.1
Địa điểm nghiên cứu ................................................................................................................ 56
2.2
Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................................................. 56
2.3
Phƣơng pháp nghiên cứu......................................................................................................... 57
2.3.1 Phân lập L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm .......................................................... 57
2.3.2. Phản ứng Real-time PCR…………………………………………………………..56
2.3.3 Phản ứng PCR ……………………………………………………………………....57
2.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen…………………………………….58
2.3.5 Phân loại các kiểu trình tự ST……………………………………………………….59
2.3.6 So sánh trình tự 7 đoạn gen của các chủng phân lập đƣợc với một số chủng trên ngân
hàng dữ liệu………………………………………………………………………………..59
2.3.7. Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP………………………………….……………..59
2.3.8. Lựa chọn mồi LAMP………………………………………………………………59
2.3.9. Tối ƣu hóa phản ứng LAMP …………………………………………………..…..59
2.3.10. Điện di DNA………………………………………………………………………60
4
2.3.11. Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm của phản ứng LAMP……………………….60
2.3.12. Xác định độ nhạy của phản ứng LAMP………………………………………….60
2.3.13. Xây dựng quy trình tăng sinh L. monocytogenes nhanh…………………………60
2.3.14. Xây dựng quy trình tách chiết nhanh DNA của L. monocytogenes……………….62
2.3.15. Xây dựng quy trình phân tích L. monocytogenes trên mẫu thực phẩm………….63
2.3.16 Kiểm định bộ sinh phẩm…………………………………………………………..64
2.3.17 Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm………………………………………………64
3
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 66
3.1
. Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập
từ một số thực phẩm Việt Nam ............................................................................................................. 66
3.1.1
Phân lập L. monocytogenes từ các mẫu thực phẩm ....................................... 66
3.1.2
Nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập ..... 709
3.1.2.1 Giải trình tự các gen abcZ, bglA, cat, dapE, dat, ldh và lhkA của các chủng L.
monocytogenes phân lập………………………………………………………………….70
3.1.2.2 Phân tích tính đa hình về trình tự nucleotid của các gen abcZ, bglA, cat, dapE, dat,
ldh và lhkA từ các chủng L. monocytogenes đã phân lập đƣợc………………………….70
3.1.2.3. Phân loại các chủng L. monocytogenes đã phân lập đƣợc.................................72
3.1.2.4. So sánh các chủng L. monocytogenes đã phân lập đƣợc với các chủng gây bệnh
dịch trên thế giới……………………………………….…………………………………77
3.2
Xây dựng quy trình phân tích nhanh L. monocytogenes trong thực phẩm dựa trên
kỹ thuật LAMP .......................................................................................................................................... 80
3.2.1
Xây dựng phản ứng LAMP ........................................................................... 82
3.2.1.1 Thiết kế mồi LAMP khuếch đại gen inlJ..................................................................81
3.2.1.2 Lựa chọn bộ mồi LAMP cho độ nhạy khuếch đại cao nh t.....................................83
3.2.1.3 Tối ưu phản ứng LAMP...................................................................................86
3.2.2
Xây dựng quy trình tăng sinh ........................................................................ 93
3.2.2.1 Ảnh hưởng của loại môi trường cơ bản đến sự sinh trưởng L. monocytogenes…94
3.2.2.2 Ảnh hưởng của một số thành phần môi trường đến sự sinh trưởng của L.
monocytogenes.................................................................................................95
3.2.2.3 Ảnh hưởng của acriflavin và acid nalidixic đến sự sinh trưởng của một số loài vi
khuẩn khác................................................................................................................97
3.2.2.4 Thử nghiệm tăng sinh trên mẫu thực phẩm.......................................................98
3.2.3
Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA ........................................................... 100
5
3.2.3.1. Khả năng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes khi sử dụng Triton X100 kết
hợp siêu âm và gia nhiệt ở 95 oC................................................................................99
3.2.3.2. Khả năng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes khi sử dụng NaOH kết hợp
siêu âm và gia nhiệt ở 95 oC.......................................................................................101
3.2.3.3. So sánh các phương pháp tách chiết nghiên cứu đối với canh trường L.
monocytogenes thuần.................................................................................................103
3.2.3.4. Đánh giá hiệu quả tách chiết DNA của các phương pháp đối với mẫu thực phẩm
tăng sinh.........................................................................................................104
3.2.3.5. Ảnh hưởng của lượng mẫu l y tách chiết DNA cho phản ứng LAMP..............106
3.2.3.6. Thử nghiệm phản ứng LAMP trên các nền mẫu khác nhau..............................107
3.2.4
Đề xuất quy trình phân tích ......................................................................... 110
3.2.5
Xác định độ nhạy của toàn bộ quy trình ...................................................... 111
3.2.6. Thiết kế, sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP phát hiện L.
monocytogenes……………………………………………………………………………...112
3.2.6.1. Thiết kế bộ sinh phẩm.....................................................................................112
3.2.6.2. Sản xu t thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO.......................................114
3.2.7. Kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO………………………………………116
3.2.8. Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO………………………….118
4 CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN ............................................................................................ 123
KIẾN NGHỊ....................................................................................................................... 124
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN…………...124
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………….………………………..………..125
PHỤ LỤC ............................................................................ Error! Bookmark not defined.
6
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
AFLP
ALOA
UVM
Tên đầy đủ tiếng anh
Tên tiếng Việt
Amplified Fragment Length
Polymorphism
Chromogenic
Listeria
Agar
according to Ottaviani and Agosti
Đa hình chiều dài các đoạn DNA
University
of
Enrichment Broths
Vermont
Môi trƣờng chọn lọc Listeria có
chỉ thị màu đƣợc phát triển bởi
Ottaviani và Agosti
Môi trƣờng tăng sinh UVM
Môi trƣờng tăng sinh BLEB
BLEB
Buffered
Broth
Listeria
Enrichment
HF
Half Fraser Broth
Môi trƣờng Half Fraser
aw
Water activity
Hoạt độ nƣớc
bp
Base pair
Cặp bazơ
CAMP
Christie, Atkins, Munch-Petersen
Phản ứng CAMP
CDC
CFU
Center for Disease Control and
Prevention
Colony forming unit
Trung tâm phòng chống và kiểm
soát dịch bệnh
Đơn vị hình thành khuẩn lạc
DNA
Deoxyribonucleic acid
Axit Deoxyribonucleic
dNTP
Deoxynucleotide
Deoxynucleotide
EDTA
Ethylen Diamine Tetraacetic Acid
Axit Ethylen Diamine Tetraacetic
EtBr
Ethidium Bromide
Ethidium Bromide
ISO
Tổ chức quốc tế về tiêu chuẩn
hóa
Bộ Nông nghiệp và dịch vụ kiểm
soát an toàn thực phẩm Mỹ
kDa
International Organization for
Standardization
United States Department of
Agriculture-Food
Safety
Inspection Service
U.S.
Food
and
Drug
Administration
Association of Official Analytical
Chemists
Kilo Dalton
LAMP
Loop-Mediated
Khuếch đại đẳng nhiệt tạo cấu
USDA-FSIS
FDA
AOAC
Isothermal
Cục quản lý dƣợc phẩm và thực
phẩm Mỹ
Hiệp hội các nhà hoá phân tích
chính thống
Kilo Dalton
7
Amplification
trúc vòm
MLST
Multi-virulence-locus sequence
typing
Multi-locus sequence typing
PBS
Phosphate Buffered Saline
Phân loại dựa trên trình tự nhiều
locus gen gây độc
Phân loại dựa trên trình tự nhiều
locus
Đệm muối phosphate
PCPLC
PCR
Phosphatidylcholine
phospholipase C
Polymerase Chain Reaction
Phosphatidylcholine
phospholipase C
Phản ứng tổng hợp chuỗi ADN
PEG
Polyethylene glycol
Polyethylene glycol
PFGE
Pulsed-field gel electrophoresis
Kỹ thuật điện di xung trƣờng
RAPD
TAE
Randomly amplified polymorphic
DNA
Tris - Acetate - EDTA
Đa hình dựa trên khuếch đại ngẫu
nhiên các đoạn DNA
Tris - Acetate - EDTA
TE
Tris - EDTA
Tris - EDTA
PA
Positive agreement
Tƣơng đồng về mẫu dƣơng tính
NA
Negative agreement
Tƣơng đồng về mẫu âm tính
ND
Negative deviation
Sai khác về mẫu âm tính
PD
Positive deviation
Sai khác về mẫu dƣơng tính
AC
Relative accuracy
Độ chính xác tƣơng đối
SP
Relative specificity
Độ đặc hiệu tƣơng đối
SE
Relative sensitivity
Độ nhạy tƣơng đối
PCR-RFLP
PCR-restriction fragment length
polymorphism
rep-PCR
Repetitive element PCR
Đa hình chiều dài các đoạn sản
phẩm PCR đƣợc cắt bởi enzyme
giới hạn
Khuếch đại các trình tự lặp
MOX
Modified Oxford Agar
Môi trƣờng Oxford Agar cải biến
MLVA
Multiple-locus variable number of
tandem repeat analysis
Pulsed-field gel electrophoresis
Phân tích vùng lặp đối xứng của
nhiều locus
Điện di xung trƣờng
MVLST
PFGE
MLEE
Multilocus
electrophoresis typing
CC
Clones complex
enzyme Phân loại theo phổ điện di nhiều
enzyme
Dòng phức hợp
8
EC
Epidemic clones
Dòng gây bệnh
DI
Simpson's Diversity Index
Chỉ số phân loại Simpson
VNTRs
Variable
repeats
ST
Sequence type
Kiểu trình tự
TSBYE
Tryptic Soy Broth Yeast Extract
Môi trƣờng dịch chiết nấm men
và trypton từ đậu tƣơng
numbers
of
tandem Đa hình các đoạn DNA chứa
vùng lặp đối xứng
9
DANH MỤC HÌNH
Hình 1-1 Hình thái vi khuẩn L. monocytogenes ..................................................................... 16
Hình 1-2 Cơ chế xâm nhiễm của L. monocytogenes vào tế bào người ........................... 19
Hình 1-3. C u tạo của 3 nhóm internalin từ L. monocytogenes EGDe ............................ 21
Hình 1-4. Trình tự axit amin của inlJ . ........................................................................................ 23
Hình 1-5 Tốc độ sinh trưởng của chủng L. monocytogenes 1340 và chủng L.
innocua11288 trong canh trường hỗn hợp và canh trường riêng biệt, môi trường
được sử dụng là TSBYE ........................................................................................................... 39
Hình 1-6 Mô hình phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh L. monocytogenes
............................................................................................................................................................... 40
Hình 1-7 Nguyên tắc kỹ thuật LAMP .......................................................................................... 44
Hình 1-8 Các phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP ....................................................... 46
Hình 1-9 Ảnh hưởng của nồng độ ion Mg2+đến phổ h p thụ của HNB trong dung dịch
phản ứng LAMP ......................................................................................................................... 47
Hình 3-1 Kết quả phân lập L. monocytogenes sử dụng môi trường RAPID’L.mono. .. 66
Hình 3-2 Kết quả khẳng định bằng PCR các khuẩn lạc L. monocytogenes giả định
phân lập được trên môi trường RAPID’L.mono................................................................ 67
Hình 3-3 Mối liên hệ về mặt di truyền của L. monocytogenes đã phân lập được từ thực
phẩm ............................................................................................................................................... 79
Hình 3-4 Kết quả sàng lọc các bộ mồi LAMP dựa trên khả năng khuếch đại DNA của
L. monocytogenes ....................................................................................................................... 84
Hình 3-5 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của
phản ứng LAMP. ......................................................................................................................... 87
Hình 3-6 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP .. 89
Hình 3-7 Độ bao trùm của phản ứng LAMP với các chủng L. monocytogenes ............. 89
Hình 3-8 Độ chọn lọc của phản ứng LAMP với các loài Listeria khác và các vi khuẩn
thường nhiễm tạp trong thực phẩm ....................................................................................... 90
10
Hình 3-10 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu với HNB .............................. 91
Hình 3-11 So sánh độ nhạy của phản ứng LAMP phát triển trong nghiên cứu này với
các phương pháp LAMP phát hiện L. monocytogenes đã được công bố ................... 93
Hình 3-12 Ảnh hưởng của nồng độ cao n m men đến sự sinh trưởng của L.
monocytogenes trong môi trường BLEB (canh trường thuần) ...................................... 97
Hình 3-13 Ảnh hưởng của nồng độ pyruvat đến đến sự sinh trưởng của L.
monocytogenes trong môi trường BLEB (canh trường thuần) ...................................... 97
Hình 3-14 Ảnh hưởng của nồng độ acriflavin và axít nalidixic đến sự sinh trưởng của
L. monocytogenes trong môi trường BLEB (canh trường thuần)................................. 98
Hình 3-15 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường
thuần của các quy trình sử dụng NaOH, Triton X100 và sinh phẩm thương mại
GeneJET Genomic DNA Purification Kit..........................................................................104
Hình 3-16 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường
tăng sinh mẫu xúc xích khi sử dụng quy trình tách chiết NaOH, Triton X100, sinh
phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit và quy trình tách chiết
thông thường ..............................................................................................................................105
Hình 3-17 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường
tăng sinh mẫu xúc xích khi sử dụng quy trình tách chiết bằng đệm Glycine-Tris pH
8,3 và Triton X 100 ..................................................................................................................107
Hình 3-18 Ảnh hưởng của thể tích mẫu canh trường tăng sinh được sử dụng đến
khả năng khuếch đại đoạn gen inlJ của phản ứng LAMP...........................................108
Hình 3-19 Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh và nền mẫu đến khả năng phát hiện L.
monocytogenes dựa trên kỹ thuật LAMP khuếch đại gen inlJ .................................110
Hình 3-20 Sơ đồ quy trình phát hiện nhanh L. monocytogenes được phát triển trong
nghiên cứu này ..........................................................................................................................111
Hình 3-21 Kết quả thử nghiệm quy trình phát hiện nhanh L. monocytogenes dựa trên
kỹ thuật LAMP ...........................................................................................................................113
Hình 3-22 Hình ảnh bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO .........................................................114
Hình 3-23 Sơ đồ qui trình sản xu t bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện nhanh L.
monocytogenes trong thực phẩm .........................................................................................116
11
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1-1 Đặc tính sinh hóa của các loài thuộc chi Listeria ............................................... 17
Bảng 1-2 Các tổ hợp kháng nguyên bề mặt (O và H) trong các kiểu huyết thanh của
Listeria .......................................................................................................................................... 18
Bảng 1-3 Thống kê một số vụ dịch listeriosis tại Mỹ trong khoảng thời gian từ 2011
đến 2015 ....................................................................................................................................... 23
Bảng 1-4 Ảnh hưởng của một số ch t nhiễm tạp đến phản ứng LAMP và PCR .......... 52
Bảng 1-5 Các ch t ức chế phản ứng PCR thường gặp trong một số loại thực phẩm và
biện pháp loại bỏ ....................................................................................................................... 53
Bảng 2-1 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR khẳng định L.
monocytogenes ............................................................................................................................ 58
Bảng 2-2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen
giữ nhà ........................................................................................................................................... 59
Bảng 3-1 Tổng hợp kết quả phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại
Việt Nam trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015 ........................................................ 67
Bảng 3-2 Tổng hợp kết quả phát hiện L. monocytogenes theo loại thực phẩm tại Việt
Nam trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015 ................................................................. 68
Bảng 3-3. Tính đa hình về trình tự nucleotide của các gen các gen abcZ, bglA, cat,
dapE, dat, ldh và lhkA từ các chủng L. monocytogenes đã phân lập được ............... 72
Bảng 3-4 Tổng hợp các kiểu trình tự (ST), dòng phức hợp (CC) và dòng giống
(lineage) của 48 chủng L. monocytogenes phân lập được từ thực phẩm ................... 73
Bảng 3-5 Phân loại các chủng L. monocytogenes đã phân lập được theo kiểu trình tự
.......................................................................................................................................................... 76
Bảng 3-6 Kết quả so sánh trình tự gen inlJ của chủng L. monocytogenes EGD-e với các
trình tự gen của L. monocytogenes........................................................................................ 82
Bảng 3-7. Trình tự các bộ mồi LAMP được thiết kế để khuếch đại gen inlJ ................... 83
Bảng 3-8 Kết quả kiểm tra các điểm sai khác của bộ mồi LAMP với các trình tự gen
inlJ trên ngân hàng gen NCBI ................................................................................................ 86
12
Bảng 3-9 Trình tự mồi LAMP sau suy biến ............................................................................... 86
Bảng 3-10 Ảnh hưởng của loại môi trường cơ bản đến sự tăng sinh của L.
monocytogenes trong canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm ...................................... 95
Bảng 3-11 Ảnh hưởng của hai loại môi trường cơ bản BLEB và HF đến sự sự tăng
sinh của L. monocytogenes trong canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm ................ 96
Bảng 3-12 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh đến sự sinh trưởng của một số loài vi
sinh vật chỉ thị trong môi trường BLEB (canh trường thuần) ....................................... 99
Bảng 3-13 Ảnh hưởng của nồng độ acriflavin và axít nalidixic đến sự tăng sinh của L.
monocytogenes trong môi trường BLEB có bổ sung cao n m men, pyruvate và với
sự hiện diện của hệ vi sinh vật trong mẫu xúc xích ........................................................100
Bảng 3-14 Ảnh hưởng của nồng độ Triton X100 đến khả năng tách chiết DNA thể gen
L. monocytogenes. ....................................................................................................................101
Bảng 3-15 Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến khả năng tách chiết DNA thể gen
L. monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X100 ..............................................101
Bảng 3-16 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến khả năng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X100 . .................................................102
Bảng 3-17 Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến khả năng tách chiết DNA thể gen
L. monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH. ........................................................102
Bảng 3-18 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến khả năng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes. .........................................................................................................................103
Bảng 3-19 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến khả năng tách chiết DNA thể gen L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH. .............................................................104
Bảng 3-20 Ảnh hưởng của thể tích mẫu canh trường tăng sinh được sử dụng đến khả
năng phát hiện L. monocytogenes bằng kỹ thuật LAMP và real-time PCR ............107
Bảng 3-21 Độ nhạy quy trình phát hiện L. monocytogenes theo kỹ thuật LAMP ........112
Bảng 3-22 Kết quả kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện L.
monocytogenes ..........................................................................................................................117
Bảng 3-23 Kết quả ứng dụng bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện L.
monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội ..119
13
MỞ ĐẦU
Listeria monocytogenes là loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm rất nguy hiểm, đặc biệt
với tỷ lệ tử vong lên đến 30%. Bệnh do L. monocytogenes gây ra đƣợc gọi chung là
listeriosis. Đối tƣợng có nguy cơ bị nhiễm bệnh này thƣờng là những ngƣời có hệ thống
miễn dịch bị suy yếu nhƣ trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, ngƣời lớn tuổi. Nếu không đƣợc
điều trị kịp thời bằng kháng sinh, bệnh nhân có thể bị nhiễm trùng máu, viêm màng não,
sẩy thai và tử vong.
Vi khuẩn L. monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh. Chúng đƣợc tìm thấy ở nhiều nơi
nhƣ đất, nƣớc, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, trong phân ngƣời hoặc phân động vật.
Chúng có thể sống và tăng trƣởng chậm ở các điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, hàm
lƣợng khí oxy, pH và hoạt độ nƣớc. Đặc biệt loài vi khuẩn này có khả năng sinh trƣởng ở
nhiệt độ lạnh (0-10oC). Chính vì những lý do đó mà khả năng nhiễm L. monocytogenes
trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm đƣợc bảo quản lạnh trong thời gian dài.
Nhiều loại thực phẩm đƣợc bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn. Thêm
nữa càng ngày ngƣời ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm không có chất bảo quản
hoặc không bị gia nhiệt để giữ đƣợc nguyên vẹn hƣơng vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu.
Những sản phẩm nhƣ vậy thƣờng đƣợc bảo quản lạnh trƣớc khi sử dụng. Vì vậy, các sản
phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cao. Rất nhiều các vụ
ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L. monocytogenes trên khắp thế giới đã
đƣợc thông báo.
Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ các
vụ dịch lớn trên thế giới cho thấy, có những chủng L. monocytogenes có khả năng gây
bệnh và gây bùng phát dịch rất lớn, bên cạnh đó cũng có những kiểu huyết thanh hầu nhƣ
không có khả năng gây bệnh và gây dịch. Cho đến thời điểm này chƣa có công bố nào về
dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập từ thực phẩm tại Việt Nam. Khả
năng gây bệnh và gây dịch của L. monocytogenes nhiễm trong các thực phẩm tại Việt Nam
vẫn là một ẩn số.
Phƣơng pháp ISO 11290-1:1996 phát hiện L. monocytogenes là phƣơng pháp nuôi cấy.
Một số các phƣơng pháp sinh học phân tử nhƣ PCR, real-time PCR hoặc các phƣơng pháp
miễn dịch (ELISA) cũng đã đƣợc tiêu chuẩn hóa. Mấy năm trở lại đây, cùng với sự ra đời
của một số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt axit nucleic, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật
gây bệnh đã đƣợc đơn giản hóa thêm một bƣớc. LAMP là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt
đƣợc sử dụng phổ biến hơn cả. Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản
ứng LAMP không cần điện di là một trong các ƣu điểm nổi trội của phƣơng pháp này, giúp
14
đơn giản hóa và rút ngắn thời gian phân tích. Kỹ thuật này đã nhanh chóng đƣợc ứng dụng
để phát hiện L. monocytogenes trong thực phẩm ở nhiều nghiên cứu trên thế giới.
Ở Việt Nam, phƣơng pháp tiêu chuẩn TCVN: 7700-1:2007 phát hiện L. monocytogenes là
phƣơng pháp nuôi cấy, sau đó khuẩn lạc đặc trƣng đƣợc khẳng định bằng các phản ứng
sinh hóa. Đã có một số nghiên cứu về phƣơng pháp PCR và que thử sắc ký miễn dịch
nhằm phát hiện vi khuẩn này, tuy nhiên thời gian phân tích còn dài hoặc yêu cầu cao về
trang thiết bị hóa chất nên chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu phân tích phát hiện trong thực tế sản
xuất.
Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi nghiên cứu đề tài có tên là “Nghiên cứu chế
tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ
học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị
trường Việt Nam”.
Luận án này tập trung vào hai mục tiêu chính sau:
Phân tích đƣợc đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L. monocytogenes phân
lập đƣợc từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam.
Xây dựng đƣợc một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L. monocytogenes trong các loại
thực phẩm ăn liền dựa trên kỹ thuật LAMP.
Trong nghiên cứu này đối tƣợng nghiên cứu là L. monocytogenes. Phạm vi nghiên cứu tập
trung phát triển phƣơng pháp phân tích phát hiện nhanh L. monocytogenes trong thực phẩm
dựa trên kỹ thuật LAMP. Qui trình phân tích cần tối ƣu sao cho đơn giản, chính xác, tiện
lợi và nhanh nhất, góp phần kiểm soát chất lƣợng an toàn vệ sinh thực phẩm. Bên cạnh đó
việc nghiên cứu dịch tễ học các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ thực phẩm cũng
giúp chúng ta thấy đƣợc hiện trạng mức độ nguy hiểm của các dòng L. monocytogenes
hiện đang nhiễm trên một số nhóm thực phẩm tại Việt Nam. Từ đó có thể giúp các nhà
quản lý, sản xuất, phân phối và tiêu dùng có các biện pháp thích hợp nhằm nâng cao chất
lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm đối với đối tƣợng vi khuẩn nguy hiểm này.
Tính mới của luận án
Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L.
monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam
Là công trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển kỹ thuật
LAMP cho phát hiện L. monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu của phép phân
tích
15
1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Listeria monocytogenes
Vi khuẩn L. monocytogenes đƣợc Murray mô tả lần đầu tiên vào năm 1926 sau khi phân
lập từ những con thỏ non bị chết đột ngột. Khi đó Murray gọi vi khuẩn này là Bacterium
monocytogenes. Sau đó Harvey Pirie đã đổi tên giống thành Listeria vào năm 1940 [109].
Đến năm 1936, L. monocytogenes đƣợc công nhận là một nguyên nhân gây nhiễm trùng ở
trẻ em và viêm màng não ở ngƣời lớn [109]. Mãi đến những năm 1980, một loạt các vụ
bùng phát dịch bệnh gây ra bởi L. monocytogenes xảy ra, khi đó vi khuẩn này mới đƣợc
xác định là một nguyên nhân gây bệnh listeriosis từ thực phẩm [109]. Từ đó, các trƣờng
hợp bệnh dịch do L. monocytogenes đã đƣợc thông báo thƣờng xuyên và L. monocytogenes
hiện đƣợc công nhận là một vi khuẩn có nguy cơ cao trong ngành công nghiệp thực phẩm
[109],[163].
Chi Listeria bao gồm sáu loài: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri, L.
seeligeri, và L. grayi. Tuy vậy, chỉ có L. monocytogenes và L. ivanovii có khả năng gây
bệnh [157]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, L. monocytogenes có khả năng gây bệnh cho cả
ngƣời và động vật trong khi đó L. ivanovii chủ yếu gây bệnh cho động vật và hiếm khi thấy
chúng gây bệnh cho ngƣời [157].
1.1.1. Đặc điểm L. monocytogenes
Đặc điểm hình thái
Listeria monocytogenes là trực khuẩn Gram dƣơng, tế bào có dạng hình que, trong một số
điều kiện nhất định chúng có thể ở dạng hình cầu. Bề mặt tế bào có các lông roi nên giúp
L. monocytogenes có khả năng di chuyển dễ dàng trong môi trƣờng [157].
Hình 1-1 Hình thái vi khuẩn L. monocytogenes [85]
Đặc tính sinh trưởng
Listeria monocytogenes là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, chúng có khả năng sinh trƣởng
trong các điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, yếm khí và thậm chí trong điều kiện chân không.
L. monocytogenes có khả năng tồn tại trong điều kiện nhiệt độ từ - 4 tới 50°C, nhiệt độ tối
ƣu cho sự sinh trƣởng của chúng là 30-37°C. Nhiệt độ dƣới 0°C sẽ gây ức chế sự phát triển
của L. monocytogenes [157]. Listeria monocytogenes có thể phát triển trong khoảng pH từ
16
4,5 tới 7, sinh trƣởng tốt nhất ở giá trị pH 7. Trong dạ dày, chúng có thể tồn tại một khoảng
thời gian ở điều kiện pH 2,0 - 2,5. Hoạt độ nƣớc (aw) thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát
triển của L. monocytogenes từ 0,97 trở lên. Tuy nhiên, một số chủng có thể sinh trƣởng
trong điều kiện aw thấp hơn 0,9 thậm chí một vài chủng có thể tồn tại trong một thời gian
dài ở aw rất thấp [157]. Listeria monocytogenes sinh trƣởng mạnh trong môi trƣờng có
nồng độ muối vừa phải (6,5%), tuy nhiên nó vẫn có khả năng sinh trƣởng trong môi trƣờng
có nồng độ muối khá cao 10-12%, nhờ có các gen đáp ứng stress nhƣ betL, gbuABC, opuC,
opuB, lmo1421 và bsh [109].
Đặc tính sinh hoá
Listeria monocytogenes có khả năng lên men nhiều loại đƣờng và không sinh khí H2S.
Trong 6 loài thuộc chi Listeria chỉ có L. monocytogenes và L. seeligeri có phản ứng CAMP
dƣơng tính với Staphylococcus aureus và âm tính với Rhodococcus equi trong khi đó, L.
ivanovii lại cho phản ứng CAMP ngƣợc lại [157]. Listeria monocytogene có thể phân biệt
với L. seeligeri và L. ivanovii trong các thử nghiệm khả năng tạo axit từ các loại đƣờng Lrhamnose, D-xylose, β-methyl-D-mannoside (Bảng 1-1) [157]. Đây là cơ sở cho các thử
nghiệm sinh hóa để khẳng định L. monocytogenes trong các phƣơng pháp phân tích dựa
trên kỹ thuật nuôi cấy nhƣ ISO11296-1:1996 và TCVN 7700-1:2007.
Đặc điểm
L. monocytogene
L.ivanovii
L.innocua
L.welshimeri
L.seeligeri
L.grayi
Bảng 1-1 Đặc tính sinh hóa của các loài thuộc chi Listeria [157]
Phản ứng catalase
+
+
+
+
+
+
Phản ứng oxidase
-
-
-
-
-
-
Khả năng đồng hóa urea
-
-
-
-
-
-
Khả năng đồng hóa NO2
-
-
-
-
-
-
Phản ứng β-haemolysis
+
+
-
-
+
-
Phản ứng CAMP (S. aureus)
+
-
-
-
+
-
Phản ứng CAMP (R. equi)
-
+
-
-
-
-
L-rhamnose
+
-
d
d
-
-
D-xylose
-
+
-
+
+
-
Khả năng tạo axit từ:
17
β-methyl-D-mannoside
+
-
+
+
-
+
Mannitol
-
-
-
-
-
+
Thủy phân Hippurate
+
+
+
+
+
-
Thủy phân Esculin
+
+
+
+
+
+
Ghi chú:
-: 90% số chủng cho phản ứng âm tính
+: 90% số chủng cho phản ứng dương tính
d: 11-89% số chủng cho phản ứng dương tính
Đặc tính kháng nguyên
Chi Listeria có hai loại kháng nguyên bề mặt đặc hiệu, đó là kháng nguyên tế bào
(somatic) O và kháng nguyên tiên mao (flagellar) H. Kháng nguyên O có 15 loại (I đến
XV) còn kháng nguyên H có 4 loại (A đến D). Đây là cơ sở để phân loại các kiểu huyết
thanh của chi Listeria (Bảng 1-2)
Bảng 1-2 Các tổ hợp kháng nguyên bề mặt (O và H) trong các kiểu huyết thanh của Listeria
[176]
Kiểu
thanh
1/2a
huyết Kháng nguyên O
Kháng nguyên H
I, II
A, B
1/2b
I, II
A, B, C
1/2c
I, II
B, D
3a
II, IV
A, B
3b
II, IV
A, B, C
3c
II, IV
B, D
4a
(V), VII, IX
A, B, C
4b
V, VI
A, B, C
4c
V, VII
A, B, C
4d
(V), VI, VIII
A, B, C
4e
V, VI, (VIII), (IX)
A, B, C
7
XII, XIII
A, B, C
5
(V), VI, (VIII), X
A, B, C
6a
V, (VI), (VII), (IX), XV
A, B, C
6b
(V), (VI), (VII), IX, X, XI
A, B, C
18
Đặc điểm lây nhiễm và gây bệnh
Listeria monocytogenes là một loại vi khuẩn gây bệnh nội bào nguy hiểm. Thông qua con
đƣờng ăn uống chúng lây nhiễm vào cơ thể ngƣời [66]. Quá trình xâm nhiễm và gây độc
của L. monocytogenes gồm các bƣớc nhƣ Hình 1-2 dƣới đây: Đi vào cơ thể qua con đƣờng
tiêu thụ thức ăn (bƣớc 1). Tại dạ dày, L. monocytogenes có khả năng kháng lại các enzyme
phân hủy protein của vật chủ, chịu đựng đƣợc môi trƣờng axit của dạ dày (pH 2,0), muối
mật và khi tấn công vào tế bào vật chủ chúng không gây triệu chứng viêm [179]. Sau đó
chúng bám vào tế bào chủ và xâm nhập vào tế bào chủ (bƣớc 2), phá huỷ không bào, di
chuyển trong nội bào và lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác. Để sống sót qua giai
đoạn ban đầu này, L. monocytogenes tham gia nhƣ là một bộ phận của tế bào chủ với sự
giúp đỡ của một nhóm các protein bề mặt đƣợc gọi là các internalin [70]. Đến nay, các nhà
khoa học đã phát hiện đƣợc 8 loại internalin ở L. monocytogenes (A, B, C, E, F, H, I, J),
chúng khác nhau ở cấu tạo và chức năng. Trong đó internalin J (inlJ) là một trong những
protein bề mặt đƣợc xác định liên quan trực tiếp tới tính độc của L. monocytogenes.
Hình 1-2 Cơ chế xâm nhiễm của L. monocytogenes vào tế bào người [109]
Trong đó:
1: L. monocytogenes xâm nhập vào cơ thể thông qua thức ăn vào dạ dày
2: L. monocytogenes xâm nhập vào tế bào chủ ở thành ruột
3-8: L. monocytogenes sinh trƣởng trong tế bào chủ và di chuyển đến các tế bào lân cận
Ngƣời bị mắc bệnh listeriosis, ban đầu sẽ có các triệu chứng giống nhƣ bị cúm nhƣ sốt và
đau mỏi cơ đôi khi có hiện tƣợng tiêu chảy. Sau đó, vi khuẩn có thể xâm nhập đến các cơ
quan khác nhƣ vào máu gây tình trạng nhiễm trùng máu, vào não bộ gây viêm màng não,
đến tử cung gây nhiễm trùng cổ tử cung có thể gây sẩy thai hoặc chết lƣu. Những tổn
thƣơng này có thể dẫn đến chết ngƣời. Tỷ lệ chết do bệnh listeriosis trên ngƣời là khoảng
20-40% [109]. Khả năng mắc bệnh tùy thuộc nhiều yếu tố nhƣ bản thân hệ miễn dịch của
ngƣời bệnh, liều nhiễm, chủng vi khuẩn bị nhiễm. Thƣờng những ngƣời có hệ miễn dịch
kém nhƣ trẻ nhỏ, ngƣời già, ngƣời mắc các bệnh suy giảm miễn dịch (lao, HIV, ung thƣ,
cấy ghép nội tạng, ...) và phụ nữ có thai có khả năng mắc bệnh cao hơn các đối tƣợng khác
19
[109]. Liều nhiễm có khả năng gây bệnh phụ thuộc rất nhiều vào chủng vi khuẩn, có những
chủng độc có khả năng gây bệnh ở liều gây chết trung bình thấp (LD 50 thấp), ngƣợc lại có
chủng ít độc hơn với LD 50 cao hơn [78]. Thử nghiệm liều gây nhiễm qua thực phẩm trên
khỉ cho thấy khi nhiễm 109 tế bào L. monocytogenes, khỉ có dấu hiệu bệnh rõ ràng với triệu
chứng ở gan, dễ bị kích thích, ăn mất ngon và tiêu chảy [78]. Với ngƣời bình thƣờng, khi
sử dụng 50-100 g thực phẩm với mật độ nhiễm ≥ 10 3-10 4 CFU/g là có nguy cơ rõ rệt về
bệnh listeriosis [62].
1.1.2. Vai trò của internalin J (inlJ) trong quá trình gây bệnh của L. monocytogenes
Nhƣ đã trình bày ở trên, quá trình gây bệnh của L. monocytogenes là kết quả của sự xâm
nhập và sinh trƣởng của loại vi khuẩn này trong một số loại tế bào động vật có vú bao gồm
các tế bào không phải là thực bào (non-phagocytic cells) và các tế bào bạch huyết. Trong
quá trình lây nhiễm truyền qua thực phẩm, L. monocytogenes xâm nhiễm vào tế bào biểu
mô ở ruột sau đó sẽ lây truyền đến gan và lá lách thông qua đƣờng máu và hệ bạch huyết,
rồi từ đây sẽ lan đến não và nhau thai.
Khi nghiên cứu chức năng của các gen, protein trong quá trình gây bệnh của L.
monocytogenes, ngƣời ta nhận thấy rằng khả năng bám và xâm nhiễm vào tế bào vật chủ
không phải là thực bào của L. monocytogenes gắn liền với một nhóm protein có tên là
internalin (Inl) [25]. Trong hệ gen của chủng L. monocytogenes EGDe có các khung đọc
mở mã hóa cho 25 loại internalin khác nhau (Hình 1-3). Toàn bộ các thành viên trong gia
đình Inl này đều có cấu trúc chung là:
-
Có một đoạn peptid dẫn đƣờng ở đầu N,
-
Có chứa vùng lặp chứa nhiều leucin ở đầu N (leucine-rich repeats: LRR), vùng lặp
này có thể chứa từ 3 đến 28 trình tự lặp bao gồm 22 axít amin. Các vùng lặp này đã
đƣợc chứng minh là tham dự vào sự tƣơng tác của internalin với thụ thể trên tế bào
vật chủ [25].
Phổ biến nhất là các internalin nhóm I bao gồm 19 thành viên (Hình 1-3) vốn có một trình
tự dẫn đƣờng ở đầu C giúp các protein này có thể biểu hiện trên vách tế bào của vi khuẩn
Gram dƣơng thông qua liên kết cộng hóa trị với lớp peptidoglycan. Chính nhờ đặc tính này
mà internalin có khả năng tƣơng tác với tế bào vật chủ, tạo điều kiện cho quá trình xâm
nhiễm diễn ra. Trình tự dẫn đƣờng này bao gồm một đoạn trình tự peptid LPXTG sau đó là
một vùng kỵ nƣớc gồm khoảng 20 axít amin và một đuôi mang điện tích dƣơng. Trình tự
dẫn đƣờng này sẽ đƣợc phân cắt bởi transpeptidase có tên sortase A (SrtA) tại vị trí giữa
axít amin threonin (T) và axít amin glycin (G) của đoạn trình tự peptid LPXTG. Sau đó
nhóm –COOH của threonin sẽ gắn với các tiền chất của lớp thành tế bào [25].
Các internalin nhóm II bao gồm 2 thành viên (Hình 1-3) là inlB và Lmo0549 có chung đặc
điểm là đầu cuối C có khả năng tƣơng tác với vách tế bào của L. monocytogenes nhờ các
20
liên kết phi cộng hóa trị. Đối với inlB, vùng tƣơng tác với vách tế bào là các đoạn lặp GW
(bao gồm 3 vùng lặp đƣợc bắt đầu bởi một dipeptid có trình tự Glycin (G) – Tryptophan
(W)). Trong khi đó đối với Lmo0549 thì vùng tƣơng tác với vách tế bào đƣợc cho là do
vùng WxL quy định [25].
Nhóm internalin cuối cùng bao gồm các protein có kích thƣớc nhỏ đƣợc tiết ra bên ngoài
môi trƣờng mà điển hình nhất là inlC [25].
Hình 1-3. C u tạo của 3 nhóm internalin từ L. monocytogenes EGDe [25]
(I): internalin với motif LPXTG;
(II): internalin GW hoặc WxL;
(III): internalin được tiết ra môi trường;
Các vùng trình tự tương đồng được đánh d u cùng màu với chú thích các vùng ở bên phải; các chữ số trong
các hộp màu chỉ số lượng các trình tự lặp.
Chức năng của các internalin trong quá trình gây bệnh của L. monocytogenes ở ngƣời đƣợc
phát hiện lần đầu tiên là ở inlA. Loại internalin này nhận biết và xâm nhiễm vào tế bào
biểu mô ở ruột thông qua tƣơng tác đặc hiệu với E-cadherin (Ecad) vốn là một protein
xuyên màng tế bào cần thiết cho quá trình kiến tạo vùng tiếp giáp bám dính ở lớp tế bào
biểu mô. Ở tế bào động vật, tùy thuộc vào nồng độ Ca2+, các phân tử Ecad có khả năng
tƣơng tác với nhau thông qua đầu N ngoại bào, trong khi đó vùng nội bào của Ecad sẽ
tham dự vào quá trình hình thành bộ khung tế bào (cytoskeleton) nhờ liên kết với các
catenin để tạo vùng tiếp giáp bám dính giữa các tế bào. Khi inlA tƣơng tác với Ecad sẽ
21
kích hoạt bộ máy của tế bào nhằm sắp xếp lại bộ khung tế bào. Chính điều này sẽ tạo điều
kiện cho L. monocytogenes có thể xâm nhập vào tế bào biểu mô ở ruột ngƣời [25].
Một trong những internalin khác cũng đã đƣợc chứng minh là liên quan đến quá trình gây
bệnh của L. monocytogenes là inlJ. Về mặt cấu trúc, inlJ là một protein bao gồm 851 axit
amin với điểm đặc thù là vùng LRR có chứa cystein (C) thay vì leucin (L) tại vị trí axit
amin thứ bảy trong hầu hết 15 đơn vị lặp (Hình 1-4). Ngoài ra, khác với inlA, inlJ có bốn
vùng lặp MucBP (Mucin-Binding Protein) vốn là các vùng protein có khả năng tƣơng tác
với một số glycoprotein ở niêm mạc ruột (Hình 1-4).Trong nghiên cứu đầu tiên về chức
năng của inlJ, Sabet và các đồng tác giả [165] đã chỉ ra rằng việc bất hoạt gen inlJ (hay gen
lmo2821) làm giảm đáng kể độc lực của L. monocytogenes khi tiêm vào tĩnh mạch chuột
hay khi cho lây nhiễm bằng đƣờng miệng. Nghiên cứu tiếp theo của Sabet và các đồng tác
giả vào năm 2007 [166] đã cho thấy protein inlJ không đƣợc tổng hợp khi nuôi cấy L.
monocytogenes trong canh trƣờng BHI (Brain Heart Infusion) cũng nhƣ khi cho loại vi
khuẩn này sinh trƣởng trong tế bào chất của một số dòng tế bào động vật nuôi cấy trong
phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, inlJ lại biểu hiện trên bề mặt của L. monocytogenes trong
máu và trong gan của chuột thí nghiệm đƣợc gây nhiễm. Mặt khác, khi gen inlJ đƣợc biểu
hiện dƣới sự điều khiển của một đoạn khởi động ngoại lai trong L. monocytogenes và L.
innocua giúp cho các vi khuẩn này có thể bám dính vào các dòng tế bào ngƣời nuôi cấy in
vitro. Toàn bộ các kết quả này cho thấy inlJ đóng vai trò quan trọng trong quá trình bám
dính vào tế bào vật chủ của L. monocytogenes khi lây nhiễm in vivo.
Về mặt phân bố, trình tự gen inlJ có tính bảo thủ cao ở L. monocytogenes trong khi đó lại
không tồn tại trong các ở các loài Listeria khác [25]. Khi phân tích sự có mặt của gen inlJ
trong 248 chủng L. monocytogenes phân lập từ thực phẩm tƣơi sống bằng phản ứng PCR,
99,2% số chủng cho kết quả dƣơng tính với gen inlJ [203]. Hai chủng phân lập âm tính
thuộc kiểu nhóm huyết thanh (serogroups) 1/2a-3a (xác định theo phƣơng pháp PCR) vốn
ít khi gây bệnh trên ngƣời. Trong nghiên cứu này, chỉ có gen hly là cho kết quả dƣơng tính
100% (inlB (98.8%), inlA (99.6%), inlC (98.0%)). Tuy nhiên, gen hly cũng tồn tại trong
các loài Listeria khác nhƣ L. ivanovii và L. seeligeri [148]. Do vậy, các phƣơng pháp phát
hiện dựa trên gen mục tiêu hly có nguy cơ mắc phải hiện tƣợng dƣơng tính giả đặc biệt là
khi mật độ vi khuẩn L. ivanovii và L. seeligeri trong mẫu thực phẩm lớn. Từ đây, có thể
nhận thấy rằng việc lựa chọn gen inlJ nhƣ là gen mục tiêu trong các phƣơng pháp sinh học
phân tử sẽ cho phép loại bỏ đƣợc hiện tƣợng dƣơng tính giả cũng nhƣ nâng cao đƣợc độ
nhạy của phƣơng pháp do không bị bó buộc trong việc lựa chọn các trình tự mồi đặc hiệu
cho L. monocytogenes.
22
Hình 1-4. Trình tự axit amin của inlJ [165].
Đoạn peptid tín hiệu đầu N đƣợc in đậm ở đầu trình tự; tiếp theo là trình tự của 15 đoạn lặp LRR, các axit
amin leucin, isoleucin, và valin đƣợc bôi nền đỏ và cystein đƣợc bôi nền màu xanh dƣơng, các vùng bảo thủ
khác in bằng chữ màu; vùng có cấu trúc tƣơng tự Ig (Ig-like)đƣợc bôi nền màu xám; 4 vùng lặp MucBP với
các trình tự bảo thủ đƣợc in đậm; đoạn trình tự peptid LPXTG ở đầu C đƣợc gạch chân, trình tự kỵ nƣớc
đƣợc in chữ nghiêng.
1.1.3. Tình hình nhiễm tạp trong thực phẩm và gây bệnh của L. monocytogenes
Theo các số liệu thống kê trong giai đoạn từ 1996 đến 2000, hơn 60% các vụ triệu hồi thực
phẩm ở Mỹ có nguyên nhân là do nhiễm L. monocytogenes [109]. Một loạt các thực phẩm
nhiễm L. monocytogenes đã gây ra các vụ bùng phát dịch listeriosis ở Bắc Mỹ và Châu Âu
nhƣ coleslaw, sữa, phomat mềm, pate, xúc xích, tôm, cá, … [109]. Theo số liệu thống kê
của CDC, hàng năm ở Mỹ có khoảng 1.600 ngƣời bị bệnh và 260 ngƣời chết do listeriosis
[170]. Tính theo tỷ lệ thì hàng năm cứ 100.000 ngƣời thì có 0,26 ngƣời mắc listeriosis
hàng năm [52]. Nếu so với giai đoạn 1996-1998 thì tỷ lệ ngƣời mắc bệnh listeriosis năm
2012 đã giảm 42 %. Tuy nhiên nếu so với giai đoạn năm 2006-2008 thì con số này năm
2012 không hề giảm [40]. Một số các vụ bùng phát dịch bệnh listeriosis gần đây tại Mỹ
đƣợc thống kê trong Bảng 1-3 dƣới đây.
Bảng 1-3 Thống kê một số vụ dịch listeriosis tại Mỹ trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015
[41]
Thời gian
Loại thực
phẩm
Số ngƣời
mắc
Số ngƣời
nhập viện
Số nguời
chết
Nơi xảy ra
Dƣa ruột vàng
147
147
33
28 bang
2012
Phomat Ricotta
22
20
4
14 bang
2013
Phomat
6
6
1
5 bang
2011
23
2014
Pho mat
8
7
1
2 bang
2014
Pho mat
5
5
1
4 bang
2014
Giá đỗ
5
5
2
2 bang
2014
Táo Caramel
35
34
7
12 bang
2015
Kem
10
10
3
4 bang
Ở châu Âu, một loạt các nƣớc đã có thông báo về dịch bệnh do L. monocytogenes. Năm
2006 có 23 quốc gia thuộc cộng đồng chung châu Âu có thông báo về các trận dịch
listeriosisvới tổng số 1583 ngƣời mắc bệnh. Trong đó Đức, Pháp, Anh là những quốc gia
chiếm 64 % số ngƣời mắc trên toàn châu Âu [56].
Ở Việt Nam, việc thống kê các vụ dịch nói chung và dịch bệnh do thực phẩm nói riêng
cònchƣa đầy đủ. Hiện nay chủ yếu chỉ các vụ dịch lớn ở các bếp ăn tập thể mới đƣợc thống
kê . Nguyên nhân gây nhiễm độc cũng chƣa đƣợc phân tích cụ thể.
Về nghiên cứu tình trạng nhiễm L. monocytogenes trong thực phẩm Việt nam cho đến nay
đã có một số các công bố. Năm 1996, trong số 215 mẫu thực phẩm các loại gồm sữa chua,
hải sản đông lạnh, thịt tƣơi sống, rau xanh và thực phẩm chế biến ăn liền, Viện Pasteur TP.
HCM đã phân lập đƣợc 2 chủng L. monocytogenes, chiếm tỷ lệ 0,93 %. Đến năm 1999,
Viện Vệ sinh Y tế Công cộng cũng phân lập đƣợc 2 chủng L. monocytogenes từ 20 mẫu
thực phẩm, chiếm tỷ lệ 10 % [11]. Theo tổng kết của Viện Pasteur TP. HCM, các mẫu hải
sản đông lạnh có tỷ lệ nhiễm L. monocytogenes 23,9% (23/138 mẫu) [11].
Nghiên cứu phát hiện L. monocytogenes dựa trên kỹ thuật PCR với 141 mẫu thực phẩm,
các tác giả phát hiện thấy 11 mẫu cho kết quả dƣơng tính, chủ yếu là mẫu thịt hun khói
[12]. Sử dụng phƣơng pháp que thử nhanh, phát hiện đƣợc 11/160 mẫu (xúc xích, pate,
sữa, pho mat) nhiễm L. monocytogenes [8]. Nghiên cứu của Cục Quản lý Chất lƣợng Nông
Lâm sản và Thủy sản cho thấy có 162/485 mẫu (bao gồm 29/120 mẫu nguyên liệu đƣợc
lấy tại cửa nhà máy chế biến, 79/186 mẫu vệ sinh công nghiệp trong quá trình sản xuất và
22/95 mẫu vệ sinh công nghiệp sau khi vệ sinh, 8/28 mẫu tay công nhân, 24/36 mẫu bán
thành phẩm) bị phát hiện nhiễm L. monocytogenes [2].
[1]
Về bệnh do L. monocytogenes gây ra tại Việt Nam, đã xuất hiện những ca bệnh nhiễm
Listeria có bệnh cảnh lâm sàng phức tạp, khó chẩn đoán và tiên lƣợng. Trần Thị Hồng
Châu khi nuôi cấy vi khuẩn trong dịch não tủy đã phát hiện ba ca nhiễm L. monocytogenes
gây viêm màng não tại Bệnh viện Lâm sàng Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh, trong đó
hai bệnh nhận đã tử vong. Bệnh viện Lâm sàng Nhiệt đới Quốc gia năm 2010 cũng phát
hiện đƣợc một ca bệnh nhiễm L. monocytogenes, bệnh nhân may mắn đƣợc cứu sống [8],
[43].
1.1.4. Quy định kiểm soát L. monocytogenes
24
Quy chuẩn về giới hạn nhiễm L. monocytogenes trong thực phẩm cho các nƣớc Châu Âu,
Mỹ hiện nay là 0 CFU/25 g, ml [86].
Ở Việt Nam, theo Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm, tiêu chuẩn về L. monocytogenes nằm
trong chỉ tiêu “không có vi sinh vật gây bệnh” tức là 0 CFU/25 g. L. monocytogenes đƣợc
kiểm soát trong tiêu chuẩn ngành thủy sản đối với thủy hải xuất khẩu sang châu Âu và Mỹ.
Theo Quyết định số 2670 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển nông thôn cấp ngày
29/8/2008 về việc “Công bố danh mục các chỉ tiêu chỉ định kiểm tra đối với l6 hàng thủy
sản”, chỉ tiêu L. monocytogenes quy định giới hạn phát hiện là 0 CFU/25 g đối với hầu hết
các loại sản phẩm thủy sản. Với qui định kiểm soát này, các phƣơng pháp phân tích phát
hiện cần đáp ứng đƣợc độ nhạy tối thiểu là 1 CFU/25 ml, g (khi lƣợng mẫu lấy là 25 g,
ml).
1.2. Dịch tễ học phân tử của L. monocytogenes
Dịch tễ học phân tử là lĩnh vực nghiên cứu có sự kết hợp giữa sinh học phân tử, thống kê
và dịch tễ. Dịch tễ học phân tử xác định đặc điểm của các gen ở mức độ phân tử và xác
định phân bố của các kiểu gen trong quần thể. Từ đó mô tả mối tƣơng quan giữa các kiểu
gen và khả năng gây bệnh, gây dịch của các chủng nghiên cứu. Dịch tễ học phân tử L.
monocytogenes đã đƣợc nghiên cứu nhiều trên thế giới. Tuy vậy ở Việt Nam, cho đến nay,
chƣa có công bố nào sử dụng các kỹ thuật phân tử trong phân loại, xác định đặc điểm phân
tử các chủng L. monocytogenes để đánh giá khả năng gây bệnh, gây dịch của loài vi khuẩn
nguy hiểm này trên thực phẩm cũng nhƣ trên bệnh phẩm.
1.2.1. Đặc điểm dịch tễ các dòng giống (lineage) L. monocytogenes
Các phƣơng pháp phân loại dựa trên kiểu gen chia L. monocytogenes thành 4 dòng giống
chính, gồm dòng giống I, II, III và IV. Các dòng này khác nhau về hệ sinh thái chúng
thƣờng tồn tại, tỷ lệ tái tổ hợp và hệ gen [45] . Dòng giống I có các kiểu huyết thanh 1/2b,
3b, 3c và 4b là dòng thƣờng gây ra các vụ dịch bệnh listeriosis ở nhiều nƣớc trên thế giới.
Dòng giống II có các kiểu huyết thanh 1/2a, 1/2c và 3a, là dòng chủ yếu đƣợc phân lập từ
thực phẩm, nhà máy thực phẩm, môi trƣờng và nông trại. Trong khi đó dòng giống III và
dòng giống IV thƣờng bao gồm kiểu huyết thanh 4a và 4c [80]; [30]. Đây là những dòng
rất ít khi gặp trên ngƣời hoặc thực phẩm mà chủ yếu phân lập đƣợc từ động vật và ít đƣợc
nghiên cứu [198]; [17].
1.2.2. Đặc điểm dịch tễ các dòng phức hợp (CC) L. monocytogenes
Để nghiên cứu dịch tễ học, L. monocytogenes đƣợc phân loại chi tiết hơn các dòng giống
đó là phân loại thành các dòng phức hợp (CC). Một số CC chuyên gây ra các vụ dịch bệnh
L. monocytogenes đƣợc gọi là các dòng phức hợp gây bệnh (EC). Các nghiên cứu cho thấy,
có 4 EC là nguyên nhân gây ra phần lớn các vụ dịch listeriosis, đó là ECI, ECIa, ECII, và
ECIII [198]. Trong đó ECI, ECIa, và ECII là các nhóm riêng biệt trong kiểu huyết thanh
4b. Đây là những dòng gây dịch bệnh listeriosis bùng phát lặp đi lặp lại ở Mỹ và châu Âu.
25
ECI là một dòng gây bệnh phổ biến, là nguyên nhân gây ra một loạt các vụ dịch listeriosis
trên thế giới nhƣ vụ dịch do coleslaw tại Nova Scotia năm 1981, do pho mát mềm tại Thụy
Sỹ từ năm 1983 đến năm 1987, tại California năm 1985, và do sản phẩm lƣỡi lợn tại Pháp
năm 1992 [94]. ECIa là dòng gây ra những vụ dịch do patê tại Anh năm 1988 và do rau và
sữa tại Boston, Massachusetts năm 1983. Dòng ECII gây dịch đƣợc nhận diện lần đầu do
gây ra vụ dịch liên quan đến bánh mỳ kẹp xúc xích ở nhiều tiểu bang tại Mỹ năm 1998 và
1999 [94], dịch do thịt gà tây ở nhiều bang tại Mỹ năm 2002. Mặc dù không có các bằng
chứng cho thấy có sự lan truyền của các dòng này giữa các vụ dịch, tuy nhiên khi phân loại
dƣới loài bằng nhiều phƣơng pháp sinh học phân tử cho thấy các chủng thuộc cùng một EC
rất gần gũi nhau về mặt di truyền. ECIII là một dòng thuộc dòng giống II và có kiểu huyết
thanh 1/2a, dòng này là nguyên nhân gây ra vụ dịch do bánh mỳ kẹp xúc xích tại Mỹ năm
1989 và vụ dịch do thịt gà tây tại Mỹ năm 2000 [94]. ECIII cũng là clone đã tồn tại hơn
một thập kỷ trong một nhà máy sau đó gây ra vụ dịch liên quan đến gà tây ở nhiều bang
Tại Mỹ [198]. Mới đây đã xuất hiện những EC mới có khả năng gây bùng phát dịch rất cao
nhƣ vụ dịch do dƣa ruột vàng cantaloupe tại Mỹ năm 2011 là do ECVI [112].
Có một số giả thuyết đã đƣợc đƣa ra để giải thích nguyên nhân tại sao một số EC có khả
năng thƣờng xuyên gây bùng phát dịch bệnh. Giả thuyết thứ nhất cho rằng các EC này có
khả năng gây độc lớn hơn so với các CC không gây ra các vụ dịch bệnh khác, cụ thể là các
EC này có chứa các trình tự gen gây độc mà các CC khác không có. Mặc dù giả thuyết này
đã đƣợc thử nghiệm bởi nhiều nghiên cứu khác nhau, tuy nhiên không thu đƣợc kết quả
cuối cùng [45]. Giả thuyết thứ hai có thể giải thích một số EC có khả năng gây dịch bệnh
qua thực phẩm thƣờng xuyên hơn là do nó có khả năng tồn tại trong môi trƣờng chế biến
thực phẩm trong khoảng thời gian dài. Giả thuyết này đã đƣợc chứng minh bằng thực tế
khi phân lập thấy chủng thuộc ECIII tồn tại trong cùng một nhà máy chế biến thực phẩm
trong khoảng 11 năm [95]; [198]. Một giả thuyết nữa cho rằng có thể các EC gây dịch cao
là những EC có liều gây bệnh thấp hơn các CC khác, nên chỉ cần nhiễm ở mật độ thấp thì
ngƣời mang mầm bệnh đã phát bệnh và khi đó EC này có khả năng gây bệnh dịch cao [45].
1.2.3. Đặc điểm dịch tễ các kiểu huyết thanh L. monocytogenes
Những số liệu thống kê cho thấy những trận dịch do L. monocytogenes gây ra có liên quan
đến một số kiểu huyết thanh nhất định. Hầu hết các ca gây bệnh trên ngƣời do vi khuẩn
này đều thuộc ba kiểu huyết thanh 4b, 1/2a, 1/2b [66]; [125]; [174]; [175]. Kiểu huyết
thanh 4b thƣờng đƣợc phân lập từ các vụ bùng phát dịch listeriosis [38]. Kiểu huyết thanh
4b gây ra phần lớn các vụ dịch listeriosis trên ngƣời tại Anh [125]. Trong giai đoạn từ
1976- 1985, 70% số ca listeriosis ở ngƣời tại Thụy Điển gây ra bởi các chủng thuộc kiểu
huyết thanh 4b [65]. Trong khi đó, các chủng phân lập từ thực phẩm, chủ yếu thuộc kiểu
huyết thanh 1/2 [66]; [113]. Các kiểu huyết thanh 1/2a, 1/2b trƣớc đây thƣờng đƣợc phát
hiện trong các trƣờng hợp nhiễm bệnh rải rác [183]; [200]. Đây cũng là kiểu huyết thanh
thƣờng phân lập đƣợc từ những ngƣời bị nhiễm trùng huyết hoặc sẩy thai [115]. Các công
26
bố gần đây cho thấy sự phân bố của các kiểu huyết thanh đã thay đổi. Rất nhiều các chủng
thuộc kiểu huyết thanh 1/2 đã đƣợc phân lập trên ngƣời [76]; [126]; [114]. Cụ thể là trong
giai đoạn từ 1986-1999, tại Thụy Điển 45% các chủng phân lập từ ngƣời thuộc kiểu huyết
thanh 4b, 44% thuộc kiểu huyết thanh 1/2a và 10% số chủng thuộc kiểu huyết thanh 1/2b
và 1/2c. Vụ dịch xảy ra tại Bỉ năm 2011 do sản phẩm pho mát, làm 12 ngƣời mắc bệnh
listeriosis là do kiểu huyết thanh 1/2a [205]. Cùng năm đó vụ dịch tại Mỹ do dƣa đỏ làm
146 ngƣời mắc bệnh listeriosis trong đó có 30 ngƣời chết, 1 ngƣời sảy thai cũng là do kiểu
huyết thanh 1/2a và 1/2b [101].
1.2.4. Các phƣơng pháp phân loại sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử
Để nghiên cứu dịch tễ học, cần sử dụng các phƣơng pháp phân loại dƣới loài vi sinh vật.
Phƣơng pháp phân loại hữu dụng là phƣơng pháp có khả năng phân biệt các dòng gây
bệnh, gây dịch, các dòng có khả năng gây bệnh, gây dịch kém hơn hoặc không có khả năng
gây bệnh, gây dịch. Ngoài độ phân biệt của phƣơng pháp, trong thực tế, để chọn đƣợc một
phƣơng pháp thích hợp còn cần quan tâm đến các yếu tố khác nhƣ độ phức tạp của phƣơng
pháp (cách tiến hành và phân tích kết quả), điều kiện phòng thí nghiệm nơi phân tích (trình
độ kỹ thuật viên và thiết bị); chi phí, thời gian thực hiện cũng nhƣ độ lặp lại của phƣơng
pháp [4].
Có hai nhóm phƣơng pháp chính thƣờng đƣợc sử dụng để phân loại dƣới loài hiện nay, đó
là phân loại dựa trên kiểu hình và phân loại dựa trên kiểu gen. Để đánh giá khả năng phân
loại của một phƣơng pháp ngƣời ta thƣờng sử dụng chỉ số phân loại (DI) [87], Chỉ số này
càng lớn thì khả năng phân loại càng lớn, kết quả nghiên cứu càng có ý nghĩa về mặt dịch
tễ học. Các phƣơng pháp phân loại dựa theo kiểu hình (serotyping; Phage typing; MLEE
typing) có chỉ số DI không cao, chính vì vậy, ứng dụng của các phƣơng pháp này trong
nghiên cứu bệnh dịch có phần hạn chế [108]; [145]; [23]; [72]. Các nghiên cứu về dịch tễ
học phân tử thì chủ yếu dựa vào phƣơng pháp phân loại dƣới loài theo kiểu gen. Sau đây là
một số phƣơng pháp phân loại dƣới loài dựa trên kiểu gen thƣờng sử dụng.
1.2.4.1. Phương pháp điện di xung trường (PFGE)
Kỹ thuật điện di xung trƣờng là một phƣơng pháp tiêu chuẩn trong phân loại dƣới loài các
vi khuẩn nói chung và L. monocytogenes nói riêng. Khi sử dụng phƣơng pháp điện di
thông thƣờng, các phân tử DNA có kích thƣớc lớn (>15 kb) sẽ dịch chuyển cùng nhau và
không thể phân biệt đƣợc các phân tử này trên gel. Khi sử dụng PFGE, bằng cách thay đổi
tuần tự chiều chạy điện di, các phân tử ADN có kích thƣớc lớn có thể đƣợc phân tách ra
khỏi nhau.
Kỹ thuật PFGE thƣờng sử dụng 2 loại enzyme giới hạn (AscI và ApaI) để cắt DNA thể gen
của L. monocytogenes thành các đoạn có kích thƣớc dao động từ 40-600 kb. Với kích
thƣớc này không thể điện di theo phƣơng pháp thông thƣờng mà chỉ có thể tách ra bằng kỹ
thuật PFGE, dƣới tác dụng của dòng điện xoay chiều, các đoạn DNA di chuyển qua lại,
27
