Chẩn đoán bệnh dịch tả lợn cổ điển bằng phương pháp elisa nhóm 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ELISA

MÔN HỌC : THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CNSH
GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : TS HUỲNH VĂN BIẾT
NHÓM SINH VIÊN THỰC HIỆN : NHÓM 3
NIÊN KHÓA : 2021-2025

TP Thủ Đức, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ELISA

Nhóm sinh viên thực hiện 21126230
Nguyễn Thị Ngọc Tuyền 21126245

Nguyễn Phan Bảo Vy 21126441
Nguyễn Lương Thảo Nhi

TP Thủ Đức, 10/2023

MỤC LỤC

MỤC LỤC ...................................................................................................................... i
DANH SÁCH HÌNH ẢNH........................................................................................... ii
CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU VỀ DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN VÀ PHƯƠNG PHÁP
ELISA .............................................................................................................................1

1.1 Giới thiệu về dịch tả lợn cổ điển .....................................................................1
1.2 Giới thiệu về phương pháp Elisa ....................................................................3
CHƯƠNG II. NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BỘ KIT TEST (DỤNG CỤ
XÉT NGHIỆM ĐƠN GIẢN) VÀ QUY TRÌNH THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM......4
2.1 Nguyên lý hoạt động của bộ Kit Test (dụng cụ xét nghiệm đơn giản) ............4
2.2 Mơ tả q trình hoạt động của Kit Test.............................................................4
2.3 Nguyên vật liệu .....................................................................................................5
2.4 Quy trình thực hiện ..............................................................................................6
2.5 Đọc và xử lý kết quả ............................................................................................6
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................7

i

DANH SÁCH HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc của Pestivirus ....................................................................................1
Hình 1.2 Hình ảnh của Pestivirus ...................................................................................1
Hình 1.3 Hình ảnh lợn lười vận động .............................................................................1

Hình 1.4 Hình ảnh hậu mơn lợn chảy máu .....................................................................1
Hình 1.5 Hình ảnh lợn bị xuất huyết...............................................................................2
Hình 1.6 Hình ảnh da lợn từ trắng chuyển sang màu đỏ ................................................2
Hình 1.7 Hình ảnh lợn được kiểm tra tại chuồng ...........................................................2
Hình 1.8 Hình ảnh minh họa 4 phương pháp Elisa.........................................................3
Hình 2.1 Hình minh họa phương pháp Elisa Sandwich .................................................4
Hình 2.2 Hình ảnh mơ tả hoạt động của bộ Kit Test ......................................................5

ii

CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU VỀ DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN

VÀ PHƯƠNG PHÁP ELISA

1.1 Giới thiệu về dịch tả lợn cổ điển

CSF ( Classical swine fever ) – dịch tả lợn cổ điển gây ra bởi 1 loại virus RNA sợi đơn
thuộc chi Pestivirus, thuộc họ Flaviviridea và bệnh được xếp vào nguy hiểm bậc nhất
cho tới nay.Bệnh dễ lây lan và thường xuyên gây tử vong cho lợn với đặc điểm là sốt,
xuất huyết và có thể diễn biến thứ cấp hoặc mãn tính. Pestivirus được bao bọc mã hóa
cho một polyprotein duy nhất. Ba glycoprotein liên kết với vỏ E0, E1, E2 (gp 55) theo
sự sắp xếp của chúng trong glycoprotein. Bệnh có 5 thể biểu hiện phụ thuộc vào độ độc
lực của căn nguyên, giống và lứa tuổi lợn, sức đề kháng của lợn và hình thức chăn ni
lợn.

Hình 1.1 Cấu trúc của Pestivirus Hình 1.2 Hình ảnh của Pestivirus

Triệu chứng: nơn mửa, tiêu chảy, thiếu phối hợp vận động, viêm kết mạc, sốt cao, đột
tử, dị dạng, heo con mới sinh rất yếu.

Hình 1.3 Hình ảnh lợn lười vận động Hình 1.4 Hình ảnh hậu mơn lợn chảy máu
1

Ngun nhân lây bệnh: nguồn lây chính của bệnh thơng qua đường tiêu hóa hay đường
hơ hấp của lợn nhiễm bệnh cịn khỏe mạnh, cụ thể thơng qua nước tiểu, nước mắt, rơm
rác, qua nước rửa thịt và long lợn ốm ở ao hồ hoặc chim, chuột, chó, mèo,.. Có thể xâm
nhập vào đàn qua thịt bị vấy nhiễm (lây qua thịt heo chưa nấu hoặc thịt đã qua xử lý).
Lây truyền cơ học phổ biến qua ủng, quần áo,..

Hình 1.5 Hình ảnh lợn bị xuất huyết Hình 1.6 Hình ảnh da lợn từ trắng chuyển sang màu đỏ

Hình 1.7 Hình ảnh lợn được kiểm tra tại chuồng
2

1.2 Giới thiệu về phương pháp Elisa
Phương pháp Elisa có 4 loại chính : trực tiếp, gián tiếp, sandwich, cạnh tranh.

Hình 1.8 Hình ảnh minh họa 4 phương pháp Elisa

Dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể - kháng nguyên, phát hiện bằng kháng thể
đánh dấu. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản
ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Phương pháp này được thiết
kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies,
hormone,.. Kĩ thuật này nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc
kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml).

3

CHƯƠNG II. NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BỘ KIT
TEST (DỤNG CỤ XÉT NGHIỆM ĐƠN GIẢN) VÀ QUY

TRÌNH THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM

2.1 Nguyên lý hoạt động của bộ Kit Test (dụng cụ xét nghiệm đơn giản)
Bộ Elisa Ag VDPro CSFV được thiết kế để phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên
trong các mẫu từ tế bào, bạch cầu và dịch chiết mô của lợn bị nhiễm CSFV. Bộ kit test
cung cấp một phương pháp nhanh chóng, đơn giản và cụ thể để phát hiện kháng nguyên
CSFV. Không bao gồm phản ứng chéo với các loại Pestivirus khác như virus tiêu chảy
ở bò và virus bệnh biên giới.
Bộ kit test sử dụng hoạt động dựa trên nguyên lý của Elisa Sandwich. Elisa sandwich
định lượng kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể (kháng thể bắt-capture và phát hiện-
detetion). Các kháng nguyên được định lượng phải chứa ít nhất hai epitop kháng ngun
có khả năng liên kết với các kháng thể, ít nhất là với hai kháng thể hoạt động trong kỹ
thuật sandwich. Các kháng thể đơn dịng hoặc đa dịng đều có thể sử dụng như các kháng
thể bắt và kháng thể phát hiện trong hệ thống Elisa sandwich. Kháng thể đơn dịng có 1
epitop duy nhất cho phép phát hiện và định lượng tốt sự khác biệt nhỏ trong kháng
nguyên. Một kháng thể đa dòng thường được sử dụng như các kháng thể bắt giữ càng
nhiều kháng nguyên càng tốt.

Hình 2.1 Hình minh họa phương pháp Elisa Sandwich trực tiếp

2.2 Mơ tả q trình hoạt động của Kit Test
Trên đáy đĩa được phủ một lớp kháng thể đơn dòng kháng E2
Mẫu được chiết và pha loãng từ bạch cầu, mơ chất đồng nhất hoặc nuối cấy mơ sau đó
cho vào đĩa.
Nếu có kháng nguyên trong mẫu, đĩa sẽ chuyển màu sau khi cho peroxidase.
So sánh kết quả OD để xác định có bị nhiễm bệnh hay khơng.

4

Hình 2.2 Hình ảnh mơ tả hoạt động của bộ Kit Test

2.3 Nguyên vật liệu
Mẫu : huyết thanh có thể chứa kháng ngun
Lấy 1-2g từ các vị trí phổi, gan , não, lá lách, thận,.. thêm 3-5 ml 1X STB (sample
treatment buffer), nghiền nhỏ để 1 giờ trong nhiệt độ phịng. Sau đó ly tâm 12000xg/1
phút, lấy phần dịch nổi.
Anti-CSFV E2 antibody coated plate
10X sample treatment buffer
10X washing buffer
Dilution buffer
20X whole blood treatment buffer
HRPO anti-CSFV conjugate
Strong positive control
Weak positive control
Negative control
TMB (tetrathylbenzidine) subtrate
Stop solution

5

2.4 Quy trình thực hiện

Đáy giếng gắn kháng thể gắn kháng nguyên E2

↓

50 µl dilution buffer để pha lỗng mẫu

↓

50 µl mẫu, đối chứng âm, đối chứng dương
(tỉ lệ pha loãng 1 :2)

ủ 90 phút, 370C ↓ rửa 3-5 lần

100 µl HRPO anti-CSFV conjugate

ủ 60 phút, 370C ↓ rửa 3-5 lần
ủ tối, 10 phút
100 µl TMB substrate (cơ chất)

↓

50µl stop solution

↓

Đọc kết quả
OD 450 nm

2.5 Đọc và xử lý kết quả
% SP = 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 𝑂𝐷−𝑁𝐶 𝑚𝑒𝑎𝑛 𝑂𝐷 𝑋 100

𝑆𝑃𝐶 𝑚𝑒𝑎𝑛 𝑂𝐷−𝑁𝐶 𝑚𝑒𝑎𝑛 𝑂𝐷

% SP ≥ 20% -> dương tính
% SP 15~20% -> nghi ngờ
% SP ≤ 15% -> âm tính

6

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bệnh Dịch TẢ lợn cổ điển (CSF). Available at: />ta-lon-co-dien-csf-nd83603.html (Accessed: 25 October 2023).

2.file:///C:/Users/nguye/Documents/Zalo%20Received%20Files/A%CC%89nh%20ma

% CC%80n%20hi%CC%80nh%202023-03-

23%20lu%CC%81c%2016.44.41%20(1).pdf

3.Tổng Quan VỀ Bệnh dịch TẢ lợn cổ điển (CSF - classical swine fever) HappyVet.
Available at: (Accessed:
25 October 2023).

4. MEDLATEC, B. viện đa khoa (2020) Đối tượng và Cách thức thực
hiện xét nghiệm Elisa, Bệnh viện đa khoa MEDLATEC. Available at:
/>n16722 (Accessed: 25 October 2023).

5. Những điều cơ bản về kỹ Thuật Elisa (no date) Những điều cơ bản về kỹ thuật ELISA.
Available at: />(Accessed: 25 October 2023).

7