Nhóm 3 ứng dụng real time pcr trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh phong

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

ỨNG DỤNG REAL TIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VI
KHUẨN GÂY BỆNH PHONG

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện : NHÓM 3
Lớp : CHIỀU THỨ 6
Niên khóa : 2021 – 2025

TP. Thủ Đức, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

ỨNG DỤNG REAL TIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VI
KHUẨN GÂY BỆNH PHONG

Hướng dẫn khoá học Sinh viên thực hiện
TS. Huỳnh Văn Biết Nguyễn Minh Khôi
Ths. Trương Quang Toản Ngơ Hồng Mai
Lê Thị Ngọc Loan

TP. Thủ Đức, 10/2023

DANH SÁCH THÀNH VIÊN

Họ và tên MSSV Ký tên
Nguyễn Minh Khôi 20126271
Ngô Hoàng Mai 21126405
Lê Thị Ngọc Loan 21126394

MỤC LỤC

MỤC LỤC ........................................................................................................................i
DANH SÁCH CÁC HÌNH............................................................................................. ii
DANH SÁCH CÁC BẢNG .......................................................................................... iii
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ..............................................................................iv

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU...................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài ..........................................................................................................1
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................2

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3
2.1. Giới thiệu về bệnh phong .........................................................................................3
2.2. Tình hình bệnh phong và các nghiên cứu liên quan.................................................3
2.3. Vi khuẩn phong ........................................................................................................4
2.4 Các phương pháp phát hiện bệnh phong ..................................................................4

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................5

3.1. Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................................5

3.1.1. Nguồn mẫu ..................................................................................................5

3.1.2. Mẫu phân lập vi khuẩn và DNA tổng hợp ..................................................6

3.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................6

3.2.1 Đánh giá đường cong chuẩn và giới hạn phát hiện 95% ..........................6

3.2.2 Phương pháp Real time PCR ......................................................................6

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ .................................................................................................8
4.1.Hiệu suất phân tích ....................................................................................................8
4.2 Sự ổn định................................................................................................................10
4.3 Hiệu suất chẩn đoán.................................................................................................11
4.4 Xác nhận xét nghiệm................................................................................................13
4.5 Thảo luận .................................................................................................................13

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................15

i

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1 Đặc điểm lâm sàng và nhân khẩu học của tất cả bệnh nhân...............................5
Hình 2 Đường cong tiêu chuẩn khuếch đại của các mục tiêu 16S rRNA và RLEP ....8
Hình 3 Giới hạn phát hiện phân tích 95% (LoD 95%) đối với 16S rRNA và RLEP .....9
Hình 4 Độ đặc hiệu phân tích với các phản ứng ghép kênh 16S rRNA và RLEP........10
Hình 5 Độ ổn định của các phản ứng trong 5 tháng .....................................................11

Hình 6 Hiệu suất chẩn đốn của qPCR ghép kênh mới..............................................12
Hình 7 Phân phối giá trị Cp thu được............................................................................12

ii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1. Trình tự primer và loại probe phát huỳnh quang...............................................7

iii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

PCR: Polymerase Chain Reaction
qPCR: Real time PCR
GMP: Good Manufacturing Practices
MB: MultiBacillary
PB: PauciBacillary
ODD: Other Dermatological diseases
PPV: Positive Predictive Value
NPV: Negative Predictive Value

iv

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Bệnh phong là một bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn phong (Mycobacterium

leprae) bị bỏ quên nhưng vẫn là một vấn đề sức khỏe cộng đồng với hơn 200.000 ca

mắc bệnh mỗi năm trên toàn thế giới. Chẩn đốn thường muộn và mặc dù đã có

phương pháp điều trị cụ thể và hiệu quả nhưng có khả năng lây truyền xảy ra trước

khi bệnh nhân được chẩn đoán và điều trị đầy đủ, do đó góp phần duy trì sự lây truyền.

Số lượng lớn bệnh nhân trẻ tuổi (dưới 15 tuổi) và bệnh nhân khuyết tật do bệnh đã ở

giai đoạn muộn càng khẳng định giả thuyết này. Hơn nữa, các dạng lâm sàng rất khác

nhau, từ dạng cục bộ (bệnh lao) đến dạng lan tỏa (bệnh phong), khiến việc chẩn đốn

trở nên khó khăn. Bằng chứng cho thấy chẩn đốn sớm có thể ngăn ngừa lây truyền

và giúp kiểm soát dịch tễ học.

Các phương pháp như phát hiện chỉ số vi khuẩn bằng kính hiển vi và kiểm tra mơ
bệnh học là những cơng cụ bổ sung chính để chẩn đốn bệnh phong. Các phương pháp
vi khuẩn học cổ điển không thể xác nhận bệnh phong vì M. leprae khơng phát triển
in vitro. Ngồi ra, khơng có dấu hiệu đáng tin cậy nào để ước tính nguy cơ tiến triển
của bệnh. Về vấn đề này, trình tự của M . leprae Genome là một cột mốc quan trọng
hướng tới sự cải thiện trực tiếp M. leprae, không chỉ giúp mô tả đặc điểm tốt hơn các
mục tiêu gen duy nhất của M. leprae mà còn so sánh rộng rãi các loại vi khuẩn
mycobacteria khác nhau.

1.2. Mục tiêu đề tài
Trong vài năm qua, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện bằng kỹ thuật PCR để

phát hiện M. leprae DNA trong mẫu bệnh phẩm. PCR đã được sử dụng đặc biệt
trong các chẩn đốn khó khăn như bệnh ít vi khuẩn không rõ ràng hoặc theo dõi
những người tiếp xúc trong gia đình. Trong bối cảnh này, một số mục tiêu khác
nhau đã được mô tả nhằm cố gắng thiết lập xét nghiệm nhạy cảm và cụ thể nhất.
Tuy nhiên, hầu hết các quy trình PCR đều được phát triển, đánh giá và xác nhận
bằng cách sử dụng thuốc thử hoặc xét nghiệm được sản xuất khơng có quy trình
thực hành sản xuất tốt (GMP). Ngồi ra, hầu hết các nghiên cứu chỉ tuyển chọn bệnh
nhân phong và không tuyển chọn bệnh nhân mắc các bệnh da liễu thông thường

1

khác được chẩn đốn phân biệt với bệnh phong. Vì vậy, việc phát triển và xác nhận
một xét nghiệm ở các phịng thí nghiệm khác nhau đã trở nên cần thiết.
1.3. Nội dung thực hiện

Ở đây, tác giả trình bày sự phát triển và xác nhận xét nghiệm Realtime PCR đa
kênh nhằm mục đích chuẩn hóa xét nghiệm chẩn đốn phân tử bệnh phong. Giao thức
được thiết kế để phát hiện đồng thời hai gen mục tiêu của M. leprae (gen 16S rRNA
và RLEP), trước đây được sử dụng trong một số nghiên cứu và một mục tiêu ở động
vật có vú (gen 18S rRNA), đóng vai trị kiểm sốt phản ứng. Phản ứng chéo được
đánh giá bằng cách sử dụng DNA từ 20 loài vi khuẩn mycobacteria và các loài gây
bệnh da khác có liên quan và khơng tìm thấy kết quả trùng khớp. Xét nghiệm mới đã
được xác nhận bằng cách sử dụng 97 mẫu sinh thiết da và một hội đồng độc lập tuyển
chọn 50 mẫu được lấy từ các bệnh nhân trước đây được đặc trưng bởi khám lâm sàng
và mô bệnh học, cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao. PCR ghép kênh mới cũng được
đánh giá theo các tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng và dữ liệu chỉ ra rằng xét nghiệm
này ổn định và có thể tái sản xuất. Các kết quả được trình bày ở đây là cơ sở của một
công cụ mới và mạnh mẽ có khả năng tăng độ chính xác của chẩn đốn bệnh phong
trong các phịng thí nghiệm thơng thường.

2

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về bệnh phong
Bệnh phong là một bệnh nhiễm trùng mãn tính thường do trực khuẩn ưa axit

Mycobacterium leprae hoặc sinh vật có liên quan chặt chẽ M. lepromatosis gây ra.
Những sinh vật này có hướng tính độc nhất đối với các dây thần kinh ngoại vi, da và
màng nhầy của đường hô hấp trên. Triệu chứng là rất đa dạng và bao gồm nhiều loại
hình tổn thương da và bệnh lý thần kinh ngoại vi. M. leprae là nguyên nhân gây ra
bệnh phong duy nhất cho đến năm 2008, khi một loài thứ hai, M. lepromatosis được
xác định ở Mexico. Cùng với nhau, hai sinh vật này được gọi là phức hợp M. leprae.

Ở nhiều nơi trên thế giới, bệnh phong rất hiếm gặp. Đây là một bệnh nhiễm trùng
phức tạp, chưa hiểu biết rõ và khó nghiên cứu. Mặc dù bệnh phong không lây nhiễm
cao (trái với suy nghĩ thơng thường), hiếm khi gây tử vong và có thể được điều trị
hiệu quả bằng thuốc kháng sinh, nhưng bệnh vẫn tiếp tục gây ra sự kỳ thị xã hội đáng
kể. Sự hiểu lầm về bệnh có thể tồn tại bởi vì bệnh phong là khơng thể chữa khỏi trước
khi sự ra đời của liệu pháp kháng sinh hiệu quả vào những năm 1940. Những người
mắc bệnh sẽ bị biến dạng và thường bị khuyết tật nghiêm trọng, làm cho họ sợ và
tránh xa người khác. Vì sự kỳ thị xã hội này, tác động tâm lý của bệnh phong là rất
nghiêm trọng.
2.2. Tình hình bệnh phong và các nghiên cứu liên quan

Trên toàn cầu, số ca bệnh phong đang giảm. Vào năm 2020, khoảng 130.000
trường hợp mắc mới đã được báo cáo, và khoảng 73% trường hợp xảy ra ở Ấn Độ,
Brazil và Indonesia. Năm 2020, 159 trường hợp mới được báo cáo ở Mỹ; khoảng ba
phần tư xảy ra ở 6 tiểu bang: California, Florida, Hawaii, Louisiana, New York, and
Texas. Hầu hết các trường hợp mắc bệnh phong ở Hoa Kỳ liên quan đến những người

di cư từ hoặc làm việc tại các quốc gia nơi thường có bệnh phong. Hầu hết các trường
hợp mắc phải ở bản địa liên quan đến những người sống ở các bang miền nam, nơi
tìm thấy những con giáp chín dải với các kiểu gen độc nhất của M. leprae. Những
kiểu gen độc đáo này được tìm thấy ở những bệnh nhân Hoa Kỳ có khả năng mắc
bệnh phong ở Hoa Kỳ, và nhiều bệnh nhân trong số này cho biết đã tiếp xúc trực tiếp
với armadillos. Bệnh phong có thể phát sinh ở mọi lứa tuổi. Tuổi cao là một yếu tố

3

nguy cơ, nhưng bệnh thường xảy ra nhất ở những người từ 5 đến 15 tuổi hoặc > 30
tuổi.
2.3. Vi khuẩn phong

Vi sinh vật gây ra bệnh phong là loài vi khuẩn Mycobacterium leprae (M. leprae)
thuộc chi Mycobacterium họ Mycobacteriaceae. M. leprae là một trực khuẩn hiếu khí,
kháng axit, được bao quanh bởi các lớp phủ sáp dày. Con người là vật chủ chính tự
nhiên cho M. leprae. Armadillos là nguồn duy nhất được xác nhận khác với con người,
mặc dù ở các động vật và mơi trường khác cũng có thể có. M. leprae phát triển chậm
(tăng gấp đôi trong 2 tuần). Thời kỳ ủ bệnh thông thường từ 6 tháng đến 10 năm. Khi
nhiễm trùng phát triển, có thể xảy ra hiện tượng lan truyền trong máu.
2.4 Các phương pháp phát hiện bệnh phong

Thơng thường, bệnh phong có thể được chẩn đoán dựa trên các dấu hiệu lâm sàng
của bệnh. Ngoài ra, bác sĩ sẽ thực hiện một số sinh thiết như lấy một mảnh da/dây
thần kinh từ người bệnh và gửi đến làm xét nghiệm. Các xét nghiệm da để chẩn đoán
bệnh phong cũng sẽ được tiến hành để xác định loại bệnh bằng cách tiêm một lượng
nhỏ vi khuẩn gây bệnh (nhưng đã bị bất hoạt) vào da, điển hình là ở cẳng tay trên.
Những người mắc bệnh phong ở mức độ 1 hoặc mức độ 2 sẽ có kết quả dương tính
tại vị trí tiêm.

Ngoài ra các phương pháp như phát hiện chỉ số vi khuẩn bằng kính hiển vi và
kiểm tra mô bệnh học là những công cụ bổ sung chính để chẩn đốn bệnh phong, tuy
nhiên những phương pháp này khơng thể xác nhận bệnh nhân có bị bệnh phong hay
khơng vì M. leprae khơng phát triển in vitro và khơng có dấu hiệu đáng tin cậy nào
để ước tính nguy cơ tiến triển của bệnh.

4

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU

3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Nguồn mẫu

Trong nghiên cứu này, nguồn mẫu được lấy từ Bệnh nhân phong đã được ghi
danh tại phòng khám Oswaldo Cruz Foundation ở Rio de Janeiro, Brazil và sinh thiết da
được thu thập từ họ từ năm 2010 đến năm 2018.Các mẫu sinh thiết da được lấy bằng
cách dùng một dụng cụ cắt trịn có đường kính 6 mm và được bảo quản trong ethanol
70% ở nhiệt độ -20˚C cho đến khi xử lý.

Chín mươi bảy mẫu (53 mẫu sinh thiết da từ bệnh nhân phong và 44 mẫu sinh
thiết da từ bệnh nhân mắc các bệnh về da khác) đã được sử dụng cho xét nghiệm qPCR.
Đặc điểm lâm sàng và nhân khẩu học của tất cả bệnh nhân được thể hiện trong Hình 1.

Các bệnh nhân phong được xác định theo phân loại lâm sàng, vi khuẩn học và
giải phẫu bệnh học của Ridley-Jopling (R&J) và phân loại hoạt động thành các dạng
nhiều bacilli (MB) hoặc ít bacilli (PB) theo WHO. Các bệnh nhân phong hoặc các bệnh
da khác (ODD) được điều trị theo tình trạng bệnh của họ.

Hình 1 Đặc điểm lâm sàng và nhân khẩu học của tất cả bệnh nhân

5

3.1.2. Mẫu phân lập vi khuẩn và DNA tổng hợp
Các mẫu phân lập chính trong nghiên cứu này bao gồm: M.leprae Thai-53 được

tách sạch từ chân chuột BALB/c khơng có tuyến ức. DNA tinh khiết từ M.leprae được
sử dụng làm đối chứng dương tính và trong các nghiên cứu độ nhạy phân tích. DNA
từ 21 mẫu đã được sử dụng cho nghiên cứu độ đặc hiệu phân tích. Ngồi ra cịn có
các mẫu khác bao gồm L.amazonensis và L.braziliensis, và DNA từ nhiều loài vi
khuẩn mycobacteria khác nhau.

Loại DNA dùng để tổng hợp là DNA tổng hợp (gBlock) bao gồm một chuỗi
DNA kép chứa trình tự của ba gen mục tiêu (RLEP, 16S rRNA và 18S rRNA)
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Đánh giá đường cong chuẩn và giới hạn phát hiện 95%

Đường cong chuẩn được sử dụng để xác định giới hạn phát hiện và độ ổn định
của xét nghiệm, sử dụng một loạt các độ pha loãng nối tiếp (1:10) từ M.leprae hoặc
DNA tổng hợp. Chuỗi pha loãng dao động từ 0,5 fg/phản ứng đến 5 ng/phản ứng đối
với DNA M.leprae tinh khiết và 1,83 ×107 bản sao/phản ứng đối với DNA tổng hợp.

3.2.2 Phương pháp Real time PCR
Tác giả đã thiết kế và xác thực một phương pháp PCR đồng thời nhiều mục

tiêu, có thể phát hiện cùng lúc hai mục tiêu của M.leprae (gen 16S rRNA và RLEP)
và một mục tiêu của động vật có vú (gen 18S rRNA), để kiểm sốt q trình phản
ứng. Các vùng gen này được chọn vì chúng có độ đặc hiệu cao cho M.leprae hoặc
người, nghĩa là chúng không trùng khớp với các gen của các loài khác. Tuy nhiên, bộ
định vị 16S rRNA có thể nhầm lẫn với M.lepromatosis, một loài vi khuẩn gây bệnh

phong khác, nên cần có một chất đánh dấu khác biệt để loại trừ khả năng này.

Một xét nghiệm qPCR đã được phát triển với các primer và probe phát huỳnh
quang để phát hiện các vùng từ gen RLEP và 16S rRNA của M.leprae, và gen 18S
rRNA của người (Bảng 3.2).

Đối với mỗi phản ứng, 5 μL dung dịch DNA được thêm vào để có thể tích cuối
cùng là 25 μL. Các hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị theo ba lần và được khuếch đại ở
95˚C trong 10 phút, và 45 chu kỳ: 95˚C trong 15 giây và 60˚C trong 1 phút (chọn đọc
kết quả tại bước này), 72°C trong 20 giây.

Bảng 3.2. Trình tự primer và loại probe phát huỳnh quang

6

Mục tiêu Flourophore Trình tự
16S rRNA FAM
Forward: 5´-GCATGTCTTGTGGTGGAAAGC- 3´
RLEP VIC Reverse: 5´-CACCCCACCAACAAGCTGAT- 3´
Probe: 5´-CATCCTGCACCGCA-3´
18s rRNA CY5
Forward: 5´-GCAGCAGTATCGTGTTAGTGAA-3´
Reverse: 5´-CGCTAGAAGGTTGCCGTAT-3´
Probe: 5´CGCCGACGGCCGGATCATCGA-3´

Forward: 5-GAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCA-3´
Reverse: 5´-CCCGTCGGCATGTATTAGCTCT- 3´
Probe: 5´ -GGAGCGAGCGACCAAAGGAACCA- 3´

Tất cả các phản ứng đều bao gồm một đối chứng dương là mẫu DNA có chứa

M.leprae, được dùng để kiểm tra tính chính xác của qPCR và nước làm đối chứng âm
khơng có DNA nào, được dùng để kiểm tra sự nhiễm bẩn của qPCR.

Giai đoạn khởi đầu: đây là giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 95°C và được tiến
hành trong 10 phút.

Giai đoạn biến tính: đây là bước đầu tiên của chu kỳ và là quá trình tăng nhiệt
độ lên 95°C trong 15 giây. ADN được biển tỉnh bằng cách phá vỡ liên kết hydro giữa
các bazo, tạo thành phân tử ADN sợi đơn.

Giai đoạn gắn mối: nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 60°C trong 1 phút để
mỗi gắn vào sợi ADN đơn. Nhiệt độ nảy cần phải đủ thấp để cho phép mỗi bắt cặp
với sợi ADN, nhưng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là, mỗi chỉ nền
gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung trên mạch khn. Nếu nhiệt độ quả thấp. mỗi
sẽ gắn không đặc hiệu. Nếu quả cao, mỗi có thể khơng gắn. Thơng thưởng nhiệt độ
gắn mỗi thường thấp hơn 3-5°C so với Tm của mỗi dung trong phản ứng. Liên kết
hydro bền giữa phân từ ADN- ADN chỉ được hình thành khi mỗi bổ sung hồn tồn
với khn. Polymerase liên kết với các phân tử lại ADN mỗi khuôn và bắt đầu tổng
hợp ADN.

Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ 72°C được sử dụng trong 20 giây tại giai đoạn này
ADN polymerase tổng hợp sợi ADN mới bổ sung với ADN khuôn bằng cách thêm
dNTP theo nguyên tắc bổ sung theo chiều 5' đến 3', phản ứng trùng ngưng xảy ra giữa
nhóm 5' phosphate của NTP với nhóm 3' hydroxyl phía cuối của sợi ADN vừa mới
được hình thành. Thời gian của giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào ADN polymerase và
độ dải của đoạn DNA cần khuếch đại.

7

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ

4.1. Hiệu suất phân tích
Các mồi và đầu dò thủy phân được thiết kế để nhắm mục tiêu các chuỗi 16S

rRNA và RLEP của M. leprae đã được thử nghiệm trong các phản ứng đa pha để phát
hiện đồng thời trình tự 18S rRNA của con người. Ngưỡng huỳnh quang tối ưu đã được
chọn dựa trên thông lệ chung là nó phải được đặt ở nửa dưới của biểu đồ đường cong
tích lũy huỳnh quang từ độ pha loãng 10 lần.

Sau khi đặt đường cơ sở cho chức năng tự động, các giá trị ngưỡng huỳnh
quang được chọn để xác định giá trị Cp (Điểm giao nhau) cho từng mục tiêu đã được
đặt và được thiết lập như sau: 0,2 cho RLEP, 0,15 đối với rRNA 16S và 0,16 đối với
rRNA 18S.

Giới hạn phát hiện phân tích 95% (LoD 95% ) được xác định từ một loạt các thử
nghiệm trong đó DNA chiết xuất từ M. leprae được pha loãng từ 5 ng xuống 100 ag/phản
ứng. Các mơ hình Probit được trang bị và LoD 95% thu được cho 16S rRNA và RLEP,
được xác định bằng thực nghiệm là khoảng 450 fg DNA (khoảng 126 bộ gen M . leprae)
đối với gen 16S rRNA và khoảng 4,60 fg DNA (khoảng 4,60 fg DNA (khoảng 126 gen).
1,3 M. leprae ) cho gen RLEP.

Hình 2 Đường cong tiêu chuẩn khuếch đại của các mục tiêu 16S rRNA và RLEP

8

Hình 3 Giới hạn phát hiện phân tích 95% (LoD 95%) đối với 16S rRNA và RLEP

Phản ứng ghép kênh đã phát triển được đánh giá dựa trên tập hợp các vi sinh
vật để đánh giá tính đặc hiệu của mồi và mẫu dò trong các điều kiện này hầu hết các
khuếch đại dương được quan sát đều tương ứng với RLEP, được phát hiện trong hai

trong số ba lần lặp lại ở M. fortuitum và M. kyroniense.

9

Hình 4 Độ đặc hiệu phân tích đối với các phản ứng ghép kênh 16S rRNA và RLEP
Mặc dù một số phản ứng thể hiện tín hiệu 16S rRNA trên ngưỡng, những sự

khuếch đại này rất không đặc trưng và có thể dễ dàng phân biệt được với sự khuếch
đại thích hợp khi so sánh với đối chứng dương với 500 fg/phản ứng của M. leprae .
DNA chiết xuất từ các vi sinh vật được chỉ định (mỗi vi sinh vật 5 ng/μL) được sử dụng
trong các phản ứng ghép kênh được thực hiện ba lần về mặt kỹ thuật trong hai thí nghiệm
độc lập. Kết quả được so sánh với biểu đồ khuếch đại cho 100 fg M . leprae DNA/μL
(bảng trên cùng bên trái). Cấu hình khuếch đại được hiển thị cho từng mục tiêu và mỗi
dòng tương ứng với một giếng riêng lẻ. Các đường chấm chấm biểu thị ngưỡng cho
RLEP (mức cao nhất trong hai mục tiêu M. leprae , ở mức 0,2) .

4.2 Sự ổn định
Độ ổn định bảo quản được đánh giá bằng cách thực hiện đánh giá hàng tháng các

phản ứng với các nồng độ khác nhau của phân tử DNA tổng hợp trong 5 tháng. Hầu hết
các điểm dữ liệu được kiểm tra đều dao động dưới giới hạn đã thiết lập của ba độ lệch
chuẩn trên mức trung bình của tất cả các điểm thời gian. Hình ảnh dưới đây hiển thị
Cp thu được cho ba mục tiêu được đánh giá (16S rRNA, RLEP và 18S rRNA) ở nồng
độ đại diện cho ngắn gọn, trong khoảng thời gian 5 tháng. Thử nghiệm vẫn đáng tin cậy
đối với toàn bộ phạm vi nồng độ được thử nghiệm.

Mỗi bảng hiển thị các giá trị Cp thu được cho từng mục tiêu (dòng của bảng) và
cho từng nồng độ mẫu (cột của bảng) theo thời gian.

10

Hình 5 Độ ổn định của các phản ứng trong 5 tháng sử dụng DNA tổng hợp làm mẫu
Điểm đại diện cho một bản sao kỹ thuật. Các đường ngang màu đen biểu thị giới

hạn dung sai trên được xác định bằng ba độ lệch chuẩn trên giá trị trung bình Cp cho
mỗi nồng độ mẫu.
4.3 Hiệu suất chẩn đốn

Quá trình thiết lập được triển khai bao gồm việc thẩm vấn hai chuỗi mục tiêu
từ M . leprae để phân loại chính xác các mẫu lâm sàng đồng thời giảm thiểu các kết quả
dương tính giả có thể xảy ra. Để đánh giá hiệu suất chẩn đốn, trước tiên chúng tơi thiết
lập các thơng số tối ưu cho phân tích, xem xét các phản ứng chéo có thể xảy ra trong
quy trình xét nghiệm. Ngưỡng Cp cho cả hai mục tiêu được xác định lặp đi lặp lại bằng
cách phân tích các đường cong đặc tính vận hành máy thu (R°C ) cho mỗi tổ hợp chu
kỳ cắt. Dựa trên những kết quả này, sự kết hợp tốt nhất của các giá trị ngưỡng (35,5 đối
với 16S rRNA và 34,5 đối với RLEP) cho thấy độ nhạy là 91% và độ đặc hiệu là 100%,
các giá trị dương tính và âm tính (PPV và NPV) lần lượt là 100% và 90%.

Hình 6 Hiệu suất chẩn đốn của qPCR ghép kênh mới.

11

Các sự kết hợp khác nhau của các giá trị ngưỡng cho 16S rRNA (bảng) và RLEP
(thang màu) đã được thử nghiệm trên bảng điều khiển bệnh nhân (n = 97). Đối với mỗi
sự kết hợp của các giá trị ngưỡng, độ nhạy và độ đặc hiệu được tính tốn và vẽ dưới
dạng đường cong R°C . Ở đây, chỉ hiển thị các giá trị ngưỡng Cp cho 16S rRNA trong
khoảng từ 35 đến 36,5. Các kết hợp dẫn đến độ đặc hiệu là 1 và độ nhạy cao nhất cho
từng điều kiện sẽ được chú thích.

Mỗi điểm đại diện cho một mẫu khác nhau (có nghĩa là Cps của một bản

copie). Các vịng trịn được tơ đầy biểu thị các mẫu bệnh phong và các dấu chấm mở
biểu thị các mẫu âm tính, như được xác định trong đánh giá lâm sàng. Các điểm được
căn chỉnh theo lề trên và bên phải biểu thị các mẫu trong đó 16S rRNA hoặc RLEP
tương ứng khơng được phát hiện trong vịng 45 chu kỳ. Chỉ số vi khuẩn được hiển thị
dưới dạng gradient màu (các mẫu khơng có thơng tin chỉ số vi khuẩn sẽ được tô màu
xám). Các mẫu không rõ ràng hoặc phân loại sai được chú thích bằng phân loại hoạt
động (âm tính giả) hoặc chẩn đốn cho các mẫu âm tính tại phòng khám.

Tiếp theo, chẩn đoán phân tử thu được bằng phương pháp PCR ghép kênh mới,
được so sánh với chẩn đoán lâm sàng của từng mẫu. Kết quả cho thấy thuật toán phân

Hình 7 Phân phối giá trị Cp thu được

12

loại và phản ứng qPCR đã mơ tả chính xác 48 trong số 53 mẫu trước đây được mô tả là
"Bệnh phong" theo kết quả lâm sàng. Trong số 5 mẫu bị phân loại sai, một mẫu được
phân loại là âm tính với M. leprae và bốn con nằm trong góc phần tư “khơng rõ
ràng”. Tất cả các mẫu bị phân loại sai đều có chỉ số Vi khuẩn là 0.

Khơng có mẫu nào trong số 44 mẫu được mô tả là "Các bệnh ngoài da khác" được
phân loại là M. leprae -posid bằng thuật toán phản ứng và quyết định của chúng tôi. Ba
mươi tám mẫu trong số này được phân loại là "Âm tính" và 6 mẫu là "khơng rõ ràng"

4.4 Xác nhận xét nghiệm
Sau khi sử dụng thuật toán nghiên cứu thu được 50 mẫu, kết quả là 33 mẫu được

phân loại chính xác là dương tính và 11 mẫu được phân loại chính xác là âm tính. Trong
số bốn mẫu được phân loại là không rõ ràng, hai mẫu âm tính đối với phương pháp đối
chứng và một mẫu dương tính. Độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác tính tốn cho bộ

mẫu này lần lượt là 97,1%, 100% và 98%.

Khi tổng hợp các kết quả về độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác, phản ứng ghép
kênh đối với vùng RLEP và 16S rRNA của M. leprae được chứng minh rằng có thể phân
loại các mẫu một cách chính xác bằng việc kết hợp chỉ số của từng phân tử mục tiêu và
cải thiện việc sử dụng chúng một cách riêng biệt. Phương pháp này cũng có thể đánh
dấu các mẫu có lượng trực khuẩn thấp để theo dõi thêm, tránh điều trị không cần thiết
cho những bệnh nhân không bị nhiễm bệnh và theo dõi những người mang mầm bệnh
M. leprae .

4.5 Thảo luận
Việc sử dụng PCR để chẩn đoán bệnh phong đã được thử nghiệm rộng rãi. Tuy

nhiên, những hạn chế đối với thiết kế thử nghiệm của một số nghiên cứu được công bố
đã được xác định. Chúng tôi nhận thấy hầu hết các nghiên cứu: (i) chỉ xét nghiệm mẫu
bệnh phẩm từ bệnh nhân phong, gây khó khăn trong việc xác định một số thơng số
chẩn đốn như độ đặc hiệu; (ii) được thực hiện trên cỡ mẫu nhỏ; và (iii) khơng có sự
xác nhận độc lập trên cùng một xét nghiệm hoặc đánh giá theo cùng một quy trình ở
các trung tâm khác nhau. Nghiên cứu này đã giải quyết một số vấn đề này bằng cách
(i) phát triển và xác nhận một xét nghiệm dựa trên hai mục tiêu được thử nghiệm nhiều
nhất trong tài liệu với độ chính xác cao hơn cho đến nay (ii) tuân theo các hướng dẫn
để xác nhận xét nghiệm chẩn đoán và (iii) sử dụng thuốc thử đạt tiêu chuẩn GMP.

13