Word tbvktcnsh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CƠNG NGHỆ SINH HỌC

CHẨN ĐỐN BỆNH SÁN MÁNG BẰNG
REAL-TIME PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Nhóm sinh viên thực hiện: NHÓM 6
Niên khóa: 2021 - 2025

TP. Thủ Đức, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CƠNG NGHỆ SINH HỌC

CHẨN ĐỐN BỆNH SÁN MÁNG BẰNG
REAL-TIME PCR

Giáo viên hướng dẫn Nhóm sinh viên báo cáo
TS. Huỳnh Văn Biết Nguyễn Thị Hà - 21126320
Th.S Trương Quang Toản Võ Uyên Chi - 21126292
Phạm Thị Thúy Nguyên - 21126431

TP. Thủ Đức, 10/2023

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Bệnh sán máng là một bệnh ký sinh trùng do ốc sên gây lo ngại lớn trên toàn thế giới,
xảy ra chủ yếu ở Châu Phi, Châu Á và ở mức độ thấp hơn ở Nam Mỹ và Trung Đông.
Hơn 200 triệu người bị nhiễm bệnh và khoảng 200.000 người có thể chết vì căn bệnh
này mỗi năm. Trên quy mơ tồn cầu, cứ 30 người thì có một người mắc bệnh sán
máng. Sự di chuyển của người tị nạn, sự di dời của người dân và những sai lầm trong
quản lý nước ngọt thúc đẩy sự lây lan của bệnh sán máng. Việc chẩn đoán bệnh sán
máng tiết niệu và đường ruột hiện nay dựa vào các thủ thuật kính hiển vi (Kato – Kaz)
tốn nhiều thời gian, đòi hỏi người thực hiện được đào tạo và độ nhạy kém, đặc biệt khi
gánh nặng ký sinh trùng thấp. Vì vậy các nhà khoa học suy nghĩ ra các biện pháp thay
thế, phương pháp phát hiện các kháng thể đặc hiệu là phương pháp chẩn đoán đang
phổ biến hiện nay những cũng có hiệu quả thất vọng trên chủng Schistosoma
haematobium. Nên việc phát hiện và phát hiện phương pháp chẩn đoán bằng Real-time
PCR sẽ là phương pháp đầy hứa hẹn, có tính độ đặc hiệu và độ nhạy cao.

1.2. Mục tiêu

Đánh giá hiệu quả việc chẩn đoán bệnh sán máng cụ thể là hai chủng Schistosoma
haematobium (Sh) và Schistosoma mansoni (Sm) bằng phương pháp Real-time PCR
so với phương pháp soi dưới kính hiển vi thơng thường và đánh giá mức độ phù hợp
lâm sàng của DNA Schistosoma trong huyết thanh để chẩn đoán bệnh đang hoạt động
và để theo dõi hiệu quả điều trị

1.3. Nội dung

Trình bày tóm tắt về vật liệu, phương pháp về quy trình chẩn đoán bệnh sán máng
bằng phương pháp Real-time PCR.

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Bệnh sán máng
Bệnh sán máng là một bệnh kí sinh trùng cấp tính và mãn tính do sán lá thuộc chi
Schistosma gây nên. Gồm nhiều chủng khác nhau nhưng các chủng gây nên bệnh sán
máng ở người là có các chủng theo hai con đường là đường ruột: Schistosoma
mansoni, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Schistosoma
guineensis và S. intercalatum và tiết niệu sinh dục: Schistosoma hematobium. Nhưng
ở bài này quan tâm tới hai chủng là Schistosoma mansoni (Sm) và Schistosoma
hematobium (Sh).
2.2. S. mansoni và S. hematobium
2.2.1. S. mansoni
S. mansoni lây truyền qua đường nước ở người, con trưởng thành sống trong mạch
máu (tĩnh mạch mạc treo) gần ruột người. Là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh sán
máng trên thế giới

Hình 1.1. Con S.mansoni cái và đực
2.2.2. S. hematobium
Phổ biến ở nhiều nước châu Phi, là bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất ở người, chúng
lắng đọng trong các mạch máu xung quanh đường tình dục dẫn đến viêm và để lại sẹo
– chính là nguyên nhân gây ung thư bàng quang

Hình 1.2. S. hematobium
2.2.3. Con đường lây nhiễm

Lây qua da do bơi hoặc lội ở những vùng nước bẩn, nhiễm vào mạch máu của hệ tiêu
hóa hoặc hệ tiết niệu. Các triệu chứng cấp tính là viêm da, sau vài tuần sau đó là sơt,

ớn lạnh, buồn nơn, đau bụng, tiêu chảy, khó chịu và đau cơ.

2.3. Phương pháp Real-Time PCR

2.3.1. Nguyên liệu

Mẫu DNA/RNA: việc lấy mẫu cũng cần đảm bảo lấy đúng vị trí, lấy đủ lượng mẫu cần
thiết để đảm bảo kết quả của xét nghiệm qPCR. Nguồn mẫu hiện nay rất đa dạng như
mẫu máu, mẫu tế bào nuôi cấy, vi khuẩn, huyễn dịch (huyền phù), mẫu quét bề mặt,
mẫu dịch phết (y tế), … mỗi loại mẫu sẽ có cách xử lý khác nhau để đảm bảo mẫu đầu
vào cho xét nghiệm PCR.
Mồi
Enzyme tổng hợp (DNA polymerase)
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP)
Dung dịch đệm và nồng độ Mg2+
Chất phát huỳnh quang
2.3.2. Nguyên lý hoạt động
Real-TiME PCR có ba giai đoạn cơ bản gồm:
Giai đoạn biến tính: Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 94-950C, lúc này liên kết
hydro giữa các bazơ trong sợi DNA mạch đôi bị phá vỡ, dẫn đến tạo thành 2 sợi đơn
DNA. Mỗi sợi đơn này trở thành khuôn để tổng hợp mạch mới. Thời gian biến tính có
thể tăng lên nếu thành phần khn có nhiều GC.

Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-650C trong 20-40 giây để
probe và mồi gắn lần lượt vào sợi DNA khn và bắt đầu q trình tổng hợp mạch mới
nhờ vào sự hoạt động của DNA polymerase.

Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 720C, đây là nhiệt độ tối ưu cho hoạt
động tổng hợp mạch mới của DNA polymerase. Giai đoạn này không bắt buộc ở một
số chu trình qPCR, do kỹ thuật này thường dùng khuếch đại các đoạn có trình tự ngắn

hơn PCR, vào khoảng <200bp, do vậy chỉ cần hai bước biến tính và bắt cặp là đủ để
khuếch đại đoạn gen mục tiêu trong phản ứng qPCR. Chu trình chỉ gồm 2 bước giúp
tiết kiệm thời gian, nhanh chóng phát hiện và định lượng được DNA.

Các giai đoạn này được thực hiện thông qua sự luân chuyển nhiệt độ giữa các chu kỳ.
Qua mỗi chu kỳ, tín hiệu huỳnh quang sẽ được ghi nhận có sự gia tăng tương ứng với
lượng bản sao DNA nhân lên theo cấp số lũy thừa.

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1. Vật liệu
Lấy mẫu huyết thanh, phân và nước tiểu thu được từ những bệnh nhân nghi ngờ bị
mắc bệnh sán máng
Để đánh giá tính đặc hiệu của qPCR đã được tiến hành trên các mẫu huyết thanh, phân
và nước tiểu thu được từ những tình nguyện viên chưa bao giờ đến các vùng lưu hành
bệnh sán máng.
3.2. Phương pháp
3.2.1. Tách chiết DNA
Đối với máu và nước tiểu, quá trình chiết DNA được thực hiện bằng cách sử dụng
1mL huyết thanh hoặc 1mL viên nước tiểu và rửa giải với thể tích 50 μL, sử dL, sử dụng Bộ
tách chiết axit nucleic MagNA Pure Compact (Roche Diagnostics) trên Thiết bị
MagNA Pure Compact (Roche). chẩn đoán)

Hình 1.3. Thiết bị MagNA
Pure Compact. Hệ thống tách
chiết axit nucleic lâm sàng hoàn
toàn tự động

Đối với mẫu phân sử dụng 250mg - 500mg mẫu

phân được hòa tan trong 1 mL PBS và đơng lạnh ở -20°C trước khi tách DNA. Q

trình chiết xuất được thực hiện trên 200 μL, sử dL huyền phù phân sau khi đập hạt, sử dụng

Bộ chuẩn bị mẫu PCR tinh khiết cao ( Bộ dụng cụ này tinh chế axit nucleic từ các vật

liệu mẫu khác nhau, bao gồm máu tồn phần, tế bào ni cấy và mẫu mô)

3.2.2. Kiểm soát chiết xuất

Các chiết xuất DNA lần đầu tiên được sàng lọc để tìm chất ức chế PCR bằng cách sử
dụng khuếch đại gen beta-globin. Quá trình này được thực hiện trong hỗn hợp phản
ứng 10 μL, sử dL chứa 2,5 μL, sử dL DNA, 10X Taq SyBr, 0,1 μL, sử dM mồi BgO7 và BgO8 và 4 mM
MgCl2. Quá trình khuếch đại được tiến hành trên thiết bị LightCycler 2 (Roche
Diagnostics) trong 40 chu kỳ 15 giây ở 95°C, 10 giây ở 70°C và 20 giây ở 72°C, sau
đó là bước đồng nhất.

Hình 1.4. Thiết bị LightCycler 2. Ứng
dụng chẩn đoán trong ống nghiệm kết hợp
với bộ thuốc thử LightCycler

Miễn là gen beta- globin được phát

hiện, chiết xuất DNA được coi là phù hợp cho xét nghiệm PCR Schistosoma . Trong

trường hợp ức chế PCR (thiếu khuếch đại gen beta-globin), các mẫu được xét nghiệm

lại được pha loãng theo tỷ lệ 1:4 và kết quả được coi là khơng thể giải thích được nếu

beta-globin vẫn khơng bị phát hiện.

3.3.3. Xét nghiệm Real-Time PCR

Để đạt được độ nhạy phân tích cao, trình tự lặp lại song song 121bp đóng góp khoảng
12% tổng trình tự bộ gen Schistosoma mansoni đã được chọn làm gen mục tiêu PCR

Hình 1.3. Vị trí gắn mồi của mồi và mẫu dị trong trình tự gen 121 bp và gen β-actin
của con người.
20 µL phản ứng chứa 3 µL DNA, 2 µL 10X Platinum Taq PCR-Buffer, 1,5 µL MgCl 2
(50 µM), 200 µM mỗi dNTP, 0,8 µg albumin huyết thanh , 500 nM mồi SRA1
(CCACGCTCTCGCAAATAATCT) và SRS2
(CAACCGTTCTATGAAAATCGTTGT), 300 nM đầu dò SRP ( FAM-
TCCGAAACCACTGGACGGATTTTTATGAT-TAMRA ) và 1,25 đơn vị Taq
polymerase. Quá trình khuếch đại được tiến hành trên thiết bị Roche LightCycler® 2
bao gồm: 95°C/5 phút , 45 chu kỳ 58°C/30 giây và 95°C/10 giây. Huỳnh quang được
đo một lần trong mỗi chu kỳ ở cuối đoạn 58°C

Hình 1.5. Máy Real-Time PCR

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ

Xét nghiệm Real-Time PCR thành cơng sẽ phát hiện và đánh giá được tình trạng bệnh
nhân đang mắc bệnh, chia ra làm nhiều loại như bệnh sán máng hoạt động đã được
chứng minh, bệnh sán máng có thể xảy ra, bệnh sán máng huyết thanh nghiêm ngặt,
bệnh sán máng loại trừ. Xét nghiệm PCR đã cải thiện đáng kể việc phát hiện
Schistosoma trong mẫu nước tiểu và phân, làm tăng tỷ lệ chẩn đốn chính xác việc
nhiễm bệnh, hiệu quả và đáng tin cậy hơn so với kiểm tra phân bằng kính hiển vi, đặc
biệt trong trường hợp nhiễm trùng nhẹ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

/> /> /> />%81n-nhi%E1%BB%85m/s%C3%A1n-l%C3%A1/s%C3%A1n-m%C3%A1ng
/>