Định danh mẫu cây bình vôi (stephania spp ) thông qua đặc điểm hình thái, giải phẫu và dna barcode

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––– </b>

<b>PHẠM THỊ NGỌC KHÁNH </b>

<i><b>ĐỊNH DANH MẪU CÂY BÌNH VƠI (Stephania spp.) THƠNG QUA </b></i>

<b>ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ DNA BARCODE </b>

<b>LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC </b>

<b>THÁI NGUYÊN - 2021</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––– </b>

<b>PHẠM THỊ NGỌC KHÁNH </b>

<i><b>ĐỊNH DANH MẪU CÂY BÌNH VƠI (Stephania spp.) THƠNG QUA </b></i>

<b>ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ DNA BARCODE Ngành: Sinh học thực nghiệm </b>

<b>Mã số: 8 42 01 14 </b>

<b>LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC </b>

<b>Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Thị Thanh Nhàn </b>

<b>THÁI NGUYÊN - 2021 </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>LỜI CAM ĐOAN </b>

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi dưới sự hướng dẫn của TS Phạm Thị Thanh Nhàn. Các kết quả nghiên cứu là trung thực chưa được ai cơng bố ở bất cứ cơng trình nào khác.

<i>Thái Nguyên, tháng 7 năm 2021 </i>

<b>Tác giả </b>

<b>Phạm Thị Ngọc Khánh </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>LỜI CẢM ƠN </b>

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị Thanh Nhàn, khoa Sinh học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên là người đã chỉ bảo, hướng dẫn em suốt q trình nghiên cứu và hồn thành luận văn này. Em xin cảm ơn sự hỗ trợ của đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinh học, bộ môn Di truyền học & CNSH, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Ngun, thầy cơ các phịng ban chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường.

Em xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp và ban giám hiệu trường THPT Chuyên Bắc Giang đã tạo điều kiện giúp đỡ trong thời gian học tập.

Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè và gia đình đã ln quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em.

<i>Thái Nguyên, tháng 7 năm 2021 </i>

<b>Tác giả </b>

<b>Phạm Thị Ngọc Khánh </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

2. Mục tiêu nghiên cứu ... 2

3. Nội dung nghiên cứu ... 2

<b>Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 3 </b>

<b>1.1. Cây Bình vơi ... 3 </b>

1.1.1. Vị trí của cây Bình vơi trong hệ thống phân loại ... 3

1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Bình vơi ... 3

1.1.3. Giá trị y học của cây Bình vơi ... 6

1.1.4. Vấn đề bảo tồn cây Bình vơi ... 9

<b>1.2. Một số phương pháp định danh thực vật ... 14 </b>

1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu ... 14

1.2.2. Phương pháp phân loại học phân tử ... 15

<b>Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 21</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<b>2.2. Phương pháp nghiên cứu ... 22 </b>

2.2.1. Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu mẫu cây Bình vơi 22 2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA ... 22

2.2.3. Phương pháp PCR ... 23

2.2.4. Phương pháp xác định trình tự nucleotid ... 24

2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ... 24

<b>Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ... 25 </b>

<b>3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu mẫu cây Bình vơi nghiên cứu ... 25 </b>

3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu cây Bình vơi nghiên cứu ... 25

3.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu mẫu cây Bình vơi nghiên cứu ... 27

3.2 Kết quả định danh mẫu cây Bình vôi bằng DNA barcode ... 29

<i>3.2.1. Kết quả tách chiết và khuếch đại đoạn gen matK và vùng ITS ... 29 </i>

<i>3.2.2. Đặc điểm trình tự đoạn gen matK ... 30 </i>

<i>3.2.3. Đặc điểm trình tự vùng gen ITS ... 35 </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT </b>

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool DNA : Deoxyribose nucleic acid

Đtg : Đồng tác giả

ITS : Internal Transcribed Spacer

matK : Maturase K

NCBI : <i>The National Center for Biotechnology Information </i>

PCR : Polymerase Chain Reaction rpoC1 : RNA polymerase beta' subunit

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<b>DANH MỤC CÁC BẢNG </b>

Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của một số alkaloid tách chiết từ cây Bình vơi .... 8

<i>Bảng 1.2. Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS trong phân </i> loại thực vật ... 17

<i>Bảng 2.1. Trình tự nucleotide mồi matK, ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR ... 21 </i>

<i>Bảng 3.1. BLAS trình tự đoạn gen matK của </i>

<i>Stepphania</i>

... 31

<i>Bảng 3.2. Đa hình nucleotide của đoạn gen matK ... 32 </i>

<i>Bảng 3.3. Hệ số sai khác về trình tự nucleotide của các đoạn gen matK ... 33 </i>

<i>Bảng 3.4. BLAS trình tự vùng gen ITS của </i>

<i>Stepphania</i>

... 36

<i>Bảng 3.5. Đa hình nucleotide(SNP) của vùng gen ITS ... 36 </i>

<i>Bảng 3.6. Hệ số sai khác về trình tự nucleotide của các vùng gen ITS ... 38 </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<i>Hình 1.8. Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS ... 17 </i>

Hình 3.1. Hình ảnh mẫu cây Bình vơi nghiên cứu ... 26

Hình 3.2. Đặc điểm hình thái một số phận của mẫu cây Bình vơi nghiên cứu. 26 Hình 3.3. Bình vơi nhị ngắn ... 27

Hình 3.4. Hình ảnh cấu tạo giải phẫu thân mẫu cây Bình vơi ... 27

Hình 3.5. Hình ảnh cấu tạo giải phẫu lá tẩy diệp lục mẫu cây Bình vơi ... 28

Hình 3.6. Hình ảnh cấu tạo giải phẫu cuống lá mẫu cây Bình vơi. ... 28

Hình 3.7. Hình ảnh cấu tạo giải phẫu mặt cắt ngang phiến lá mẫu cây Bình vơi ... 29

Hình 3.8. Hình ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số ... 29

Hình 3.9. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩn PCR ... 30

Hình 3.10. Hình ảnh cây phân loại mẫu cây Bình vơi dựa vào trình tự đoạn gen <i>matK...34</i>

Hình 3.11. Hình ảnh cây phân loại mẫu cây Bình vơi dựa vào trình tự vùng gen <i>ITS...37 </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>PHỤ LỤC </b>

<b>Phụ lục 1. Hình ảnh BLAST trình tự đoạn gen matK... 46 </b>

<b>Phụ lục 2. Hình ảnh so sánh trình tự đoạn gen matK với trình tự trên Genbank...47 </b>

<b>Phụ lục 3. Hình ảnh BLAST trình tự vùng ITS...51 </b>

<b>Phụ lục 4. Hình ảnh so sánh trình tự vùng ITS với trình tự trên Genbank... 52 </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài </b>

<i>Cây Bình vơi có tên khoa học là Stephanta spp., họ Tiết dê (Menispermaceae), là một loài dây leo, phần rễ phát tiển thành củ to, bám vào núi </i>

đá. Cây có mặt tại tỉnh Hà Giang, Tun Quang, Hịa Bình… Trong y học cổ truyền, Bình vơi là dược liệu có vị đắng, tính lương, được quy vào hai kinh là Tỳ và Can có tác dụng chính là trấn kinh, an thần, tuyên phế. Trong y học hiện đại, cây bình vơi có chứa rất nhiều alkaloid có tác dụng an thần, ổn định huyết áp, chống co giật và chữa nhức đầu, sốt nóng…

<i>Ở Việt Nam, chi Bình vơi (Stephanta) có khoảng 14 đến 16 lồi, trong đó một số lồi như Bình vơi hoa đầu (Stephania cepharantha Hayata), Bình vôi vàng (Stephania rotunada Lour), Thiên kim đằng (Stephania japonica Miers) ... đang </i>

được khai thác, hàm lượng rotundin của các lồi Bình vơi tùy thuộc từng loài và điều kiện sinh thái. Hiện nay, cây Bình vơi đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (V). Tuy nhiên, việc định loại có thể gặp khó khăn do sự giống nhau về hình thái, giải phẫu nên ảnh hưởng đến công tác bảo tồn nguồn gen cây này.

Thực vật có thể nhận diện bằng nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp thường dùng như nghiên cứu và so sánh các đặc điểm về hình thái, giải phẫu, sinh lý, hóa sinh... hướng nghiên cứu này đã thành công trên một số đối tượng cây trồng như Hà thủ ơ đỏ, Sóng rắn, Phong lữ thảo… Tuy nhiên, phương pháp nhận diện này sẽ kém hiệu quả nếu như cây khơng cịn nguyên vẹn.

Công nghệ sinh học hiện đại phát triển đã bổ sung vào hệ thống phân loại phương pháp nhận diện dựa vào các chỉ thị phân tử. Trong đó, mã vạch DNA được lựa chọn là một trong các phương tiện nhận biết mới. Một số mã vạch DNA được

<i>nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân loại các cây dược liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó, gen matK nằm trong lục lạp được xác định mang lại những thành tựu nhất định trong nhận diện cây trồng. Vùng gen ITS nằm trong nhân tế bào, bao gồm trình tự ITS1-5.8S-ITS2 cũng là đối tượng được nghiên </i>

cứu nhiều trong định danh thực vật. Các nghiên cứu xác định mối quan hệ của các

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<i>loài thực vật dựa trên trình tự vùng gen ITS ở cây gỗ Sưa, gỗ Trắc, gỗ Cẩm lai, hay các chi Erica, Scrophularia, Potamogeto và nhiều thực vật khác là minh chứng cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng. </i>

<b>Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Định </b>

<i><b>danh mẫu cây Bình vơi (Stephania spp. ) thông qua đặc điểm hình thái, giải </b></i>

<b>phẫu và DNA barcode”. 2. Mục tiêu nghiên cứu </b>

Định danh được mẫu cây Bình vơi thu tại Lào Cai thơng qua đặc điểm hình thái, giải phẫu và DNA barcode nhằm góp phần vào cơng tác bảo tồn và khai thác nguồn gen, dược chất của cây này tại Việt Nam.

<b>3. Nội dung nghiên cứu </b>

3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Bình vơi thu tại Lào Cai.

<i>3.2. Nghiên cứu đặc điểm trình tự vùng ITS, đoạn gen matK từ mẫu cây Bình vơi </i>

thu tại Lào Cai.

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<b>Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cây Bình vơi </b>

<i><b>1.1.1. Vị trí của cây Bình vơi trong hệ thống phân loại </b></i>

Cây Bình vơi phân bố ở những vùng có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Vùng phân bố kéo dài từ Nepal, Ấn Độ, Thái Lan, miền nam Trung Quốc, phía nam Nhật Bản, Việt Nam, Lào, … đến phía đơng Australia. Số lượng loài đa dạng nhất tập trung tại các tỉnh phía bắc của Việt Nam, Lào, Thái Lan, nam Trung Quốc. Tại Trung Quốc có khoảng 20 lồi, tại Thái Lan có khoảng 11 lồi [11]. Các lồi Bình vơi có sự khác nhau về hình thái, hàm lượng và thành phần của alkaloid.

Những lồi Bình vơi hiện có ở Việt Nam rất đa dạng và phong phú. Chúng sinh trưởng nhiều trên núi đá. Chi Bình vơi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp

<i>khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền </i>

đông và nam châu Á cũng như Australasia. Tên gọi dân dã nhất trong tiếng Việt là Bình vơi. Về mặt phân loại, cây Bình vơi thuộc:

<i>Chi Bình vôi, hay chi Thiên kim đằng (Stephania spp.), là một chi thực vật có </i>

hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay cịn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền đông và nam châu Á cũng như Australia. Tên gọi dân dã nhất trong tiếng Việt là Bình vơi. Tuy nhiên, nhiều lồi có các tên gọi địa phương có thể trùng nhau.

<i><b>1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Bình vơi </b></i>

Bình vơi là cây dây leo, thân thảo, sống lâu năm, phần gốc thường hóa gỗ. Chồi và thân non thường nhẵn, có màu xanh đậm, xanh nhạt hay xanh bóng. Vỏ

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

ngồi thân có những rãnh nứt dọc theo thân hay gờ, những mụn cóc xù xì. Thân già có màu xám tro, nâu sẫm, nâu nhạt hay nâu đất sáng.

Lá mọc so le, cuống lá dài khoảng 5 - 10 cm, đính vào phiến lá khoảng 1/3 - 1/6 chiều dài lá. Phiến lá mỏng, thường nhẵn, có hình khiên nhọn, hình trịn hoặc hình tam giác tròn, mép lá nguyên hay hơi chia thùy. Gân lá dạng chân vịt gồm từ 8 - 11 gân xuất phát từ đỉnh của cuống lá. Chóp lá nhọn hoặc gần tròn, gốc lá trịn hoặc có hình tim. Phiến lá màu xanh đậm, xanh vàng nhạt hoặc xanh sáng, mặt dưới có màu xanh nhạt hay hơi bạc [12], [60].

Rễ củ rất đa dạng, củ thường có dạng hình cầu, hình trụ hay hình bất định. Kích thước và trọng lượng củ cũng rất khác nhau, có lồi chỉ khoảng 1 - 3 kg, có lồi củ rất nặng tới 80 kg. Ruột củ màu vàng nhạt, vàng chanh, trắng ngà hoặc nâu đỏ [12].

Cây Bình vơi có hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa có dạng tán kép, tán đơn, sim tán kép, dạng hình đầu và tán ngù, có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh cuối cùng đôi khi không đều hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa. Hoa đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa trịn, đài 6 - 8 rời, xếp thành 2 vòng; 3 - 4 cánh hoa, dạng vỏ sị, màu vàng, đơi khi trắng xanh; nhị 2 - 6, thường 4, chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy x thành đĩa tròn. Hoa cái thường chỉ gồm 1 lá đài và 2 cánh hoa (rất ít khi có 3 - 4 lá đài và 3 - 4 cánh hoa), bầu hình trứng có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi [12], [30].

Quả hạch, dạng hình gần trịn, hình trứng, trứng bầu, 2 bên dẹt. Bầu 2 nỗn, nhưng chỉ có 1 phát triển thành hạt, cịn 1 thối hóa. Ở quả chín, vỏ ngồi thường có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng. Hạt hình móng ngựa, hình trứng dẹp hoặc hơi tròn, 2 mặt bên lõm, ở giữa có lỗ thủng hoặc không, dọc theo gờ lưng bụng thường có 4 hàng vằn hoặc gai [12].

Nhìn chung, chi Bình vơi rất đa dạng về hình thái, phụ thuộc vào điều kiện đất đai, khí hậu nơi sinh sống và đặc tính của từng lồi.Các lồi thuộc chi Bình vôi thường sinh trưởng trong các rừng nguyên sinh hay rừng thứ sinh. Sống thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21 - 23<small>o</small>C, lượng mưa 2000 – 2500 mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH = 6,5 - 7. Một số lồi có thể phân bố ở độ cao 2000 - 2800 m so

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

với mực nước biển. Hầu hết các lồi Bình vơi đều ưa sáng, ưa đất có độ ẩm vừa

<i><b> Hình 1.1. Hình ảnh các cơ quan chính của cây Bình vơi tím </b></i>

<i>(a) Cây Bình vơi; (b) Mặt trước và mặt sau lá cây Bình vơi tím; (c) Củ Bình vơi; (d) </i>

<i><b>Quả Bình vơi (nguồn website: www.24h.com.vn) </b></i>

Các lồi Bình vơi hiện ở Việt Nam thường có 2 thời vụ chồi chính trong năm. Vụ chồi đông xuân, bao gồm các chồi xuất hiện (trên thân và trên đầu củ) ngay từ tháng 11 - 12. Những chồi này ở trạng thái "chồi ngủ" cho đến mùa xuân (tháng 1 - 2) thì bắt đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh. Chỉ trong vòng 1 - 2 tháng, chồi đã dài tới hơn 1m. Chồi đông xuân là lứa chồi quan trọng nhất của cây Bình vơi, vì

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

từ chồi này cây sẽ ra lá, hoa, quả và mọc ra lứa chồi xuân hè (chồi cấp II). Số lá của chồi cấp II nhiều hơn gấp bội so với chồi đơng xn (tính trên cùng một đơn vị chiều dài của chồi). Sự tái sinh chồi mạnh mẽ của cây Bình vơi cịn thể hiện ở khả năng mọc mầm trên các mảnh bổ ra từ củ đem vùi xuống đất. Những mảnh ở đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt hơn những mảnh khác. Người ta có thể lợi dụng khả năng này để nhân giống cây Bình vơi. Trong tự nhiên, hoa Bình vơi được thụ phấn chéo chủ yếu nhờ côn trùng [15], [24].

Hạt Bình vơi hình móng ngựa, rất nhỏ, khối lượng trung bình 1000 hạt khoảng 10 – 29 g. Hạt thường phát tán nhờ nước. Các cá thể Bình vơi trồng từ hạt thường sinh trưởng, phát triển nhanh hơn [15], [24].

<i><b>Hình 1.2. Hạt bình vôi </b></i>

<i>a. Hạt tươi; b. hạt tươi bỏ vỏ; c. Hạt khô (nguồn website: www.24h.com.vn) </i>

Bình vơi là một loại cây dạng leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện nước ta. Cây khơng địi hỏi tốn cơng chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao. Cây Bình vơi sẽ là cây có tiềm năng lớn trong y học. Tuy nhiên, loại cây quý này đang dần cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên trước việc khai thác tàn phá rừng của người dân [1], [11].

<i><b>1.1.3. Giá trị y học của cây Bình vơi </b></i>

Cây Bình vơi có giá trị về mặt kinh tế, có tiềm năng lớn trong y học, được coi là cây trồng “xóa đói giảm nghèo” của người dân tộc vùng cao nếu được sự quan tâm của các cấp lãnh đạo.

Cây Bình vơi chứa nhiều hoạt chất có giá trị về dược liệu. Trong củ Bình vơi chứa một lượng chất alkaloid rất đa dạng cả về hàm lượng và thành phần cấu tạo

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

(Bảng 1.1). Theo y học cổ truyền, củ Bình vơi được dùng dưới dạng thuốc sắc hay ngâm rượu để chữa các bệnh mất ngủ, ho hen, kiết lỵ, sốt, đau bụng [14], [15], [56].

Đối với những alkaloid của củ bình vơi chỉ có alkaloid A (tức là roemerin) do Ngô Vân Thu tách chiết được Dương Hữu Lợi thí nghiệm dược lý và đã đi tới những kết luận: Dung dịch có tác dụng gây tê niêm mạc và phong bế. Tính theo cơng thức G. Valette, dung dịch 0,5% có tác dụng gây tê niêm mạc tương đương với dung dịch 1,8% clohydrat cocain. Theo thí nghiệm của Mak và Nelson, dung dịch có tác dụng gây tê phong bế mạnh hơn dung dịch clohydrat cocain 1% và dung dịch novocain 3% [30]. Dung dịch alkaloid A có tác dụng đối lập với tác dụng gây tăng trương lực và nhu động co bóp ruột của dung dịch axetylcholin. Dung dịch alkaloid A có tác dụng an thần gây ngủ với liều lượng nhẹ nhưng với liều cao kích thích thần kinh hệ trung ương, gây co giật và chết. Ngồi ra, alkaloid A có tác dụng giãn mạch hạ huyết áp, giảm cả huyết áp tối đa và tối thiểu [15].

<i>Những cây thuộc chi Stephania (họ Menispermaceae) phân bố rộng. Hơn </i>

150 hợp chất alkaloid cùng với flavonoids, lignans, steroids, terpenoids và coumarins đã được tách chiết và xác định cấu trúc có hoạt tính sinh học cao [24]. Năm 1940, Bùi Đình Sang đã chiết từ củ Bình vơi mọc ở Việt Nam các chất tinh bột, đường khử oxy, malic acid, men oxydaza và một alkaloid với tỷ lệ 1,2 đến 1,5% (tính trên củ tươi) được đặt tên là rotundin [15] Rotundin là tinh thể màu trắng hay hơi vàng, không mùi, không vị, bị chuyển thành màu vàng khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiệt. Rotundin tan trong cloroform, hơi tan trong ethanol và ether, không tan trong nước, dễ tan trong sulfuric acid loãng. Điểm nóng chảy của rotundin ở 141<small>o</small>C đến 144<small>o</small>C. Tiến hành đo độ hấp thụ (A) của dung dịch chế phẩm có nồng độ 30 g/ml trong dung dịch acid sulfuric 0,5 % ở bước sóng 281 nm từ 150 đến 160 [24].

Rotundin có tên khoa học là L - tetrahydropalmatin (5,8,13,13a-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy - 6H dibenzo quinolizine, C<small>21</small>H<small>25</small>NO<small>4</small>). Đây là một alkaloid, thu được lần đầu tiên vào năm 1902 nhờ phương pháp hydro hóa palmatin. Do được tách chiết từ các chi họ khác nhau, mà trước đây hợp chất này còn mang một số tên gọi khác như: caseanin, rotundin và hyndarin. Rotundin có tính kiềm yếu, được giải

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

phóng bằng kiềm trung bình và mạnh như NH<small>4</small>OH, cacbonat kiềm, NaOH… Người ta sử dụng tính chất này để định lượng L - tetrahydropalmatin trong nguyên liệu thực vật hay để tủa trong quá trình chiết alkaloid toàn phần. Chất này thường được người ta sử dụng dạng muối clorat hoặc sulfat và bảo quản trong lọ màu hổ phách [24].

<i><b>Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của một số alkaloid tách chiết từ cây Bình vơi [14] </b></i>

Chống sốt rét

Dehydroroemerine, cepharanthine, dicentrinone, tetrahydropalmatine, aloe - emodine, corydine, Nmethylliriodendronine, liriodenine, 2 - O, N dimethylliriodendronine,

Kháng sinh

<i>Glabradine (dịch chiết từ củ loài S. glabra (Roxb.) Mies, dịch chiết từ rễ loài S. japonica), cepharanone </i>

D, N formyl - asimilobine, N – formylannonain Diệt giun sán <i>Dịch chiết từ rễ loài S. glabra (Roxb.) Miers </i>

Chống virus <i>Dịch chiết từ củ loài S. cepharantha Hayata </i>

Chống ung thư

Dl - tetrandrine, fangchinoline, d - tetrandrine,

<i>d - isochondrodendrine, dịch chiết từ củ loài S. venosa </i>

(Blume) Spreng, aporphine, cepharanthine, cepharanoline, isotetrandrine

An thần. (−) Stepholidine, L - tetrahydropalmatin Kích đẻ cho phụ sản Tetrandrine

Đảo chiều đa kháng Insotrilobine và trilobine

Chống viêm, giảm đau ^{Tetrandrine, fangchinoline, L - tetrahydropalmatin,}

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

<i><b>Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của L – tetrahydropalmatine </b></i>

(Nguồn website: Tác dụng dược lý của rotundin đã được nghiên cứu trong nước, Liên Xô cũ và Trung Quốc [15]:

(1) Rotundin rất ít độc, tiêm vào tĩnh mạch máu một con thỏ với liều cao hơn 30 mg/1kg, con thỏ chỉ mệt trong 1-2 ngày, đồng tử bị liệt nhất thời rồi lại hết.

(2) Tác dụng thần kinh rõ rệt trên nhu động vị tràng, trên mẩu ruột lấy riêng nó gây hiện tượng giảm khuẩn rõ rệt mà vẫn duy trì sự co bóp điều hịa và kéo dài, có thể dùng chữa những trường hợp tăng nhu động ống tiêu hố.

(3) Tác dụng điều hồ đối với tim.

(4) Tác dụng điều hồ hơ hấp, có thể dùng chữa hen hay chữa nấc

(5) Rotundin có tác dụng an thần, gây ngủ và chống co quắp, hạ huyết áp Trên lâm sàng rotundin được áp dụng rộng rãi từ năm 1944 và trong suốt kháng chiến chống Pháp [15].

Mantsch John nghiên cứu cơ chế giảm đau của L - tetrahydropalmatin cho thấy thuốc có tác dụng ức chế receptor dopamin D2, ứng dụng này đã được sử dụng trong bài thuốc cai nghiện [42]. Một số bài thuốc quý được tuyên truyền phổ biến trong dân gian để chữa bệnh bằng cây Bình vơi [61].

<i><b>1.1.4. Vấn đề bảo tồn cây Bình vơi </b></i>

Bảo tồn đa dạng sinh học đặc biệt các loài thực vật làm thuốc là vấn đề tồn cầu, khơng chỉ riêng các quốc gia mà của các tổ chức quốc tế (IUCN, WWF, FAO, WHO,…). Vấn đề bảo tồn cây thuốc ở các quốc gia chính là sự nhận biết và bảo tồn giá trị sử dụng chúng trong y học dân tộc. Đề cập đến bảo tồn những lồi cây thuốc đang bị đe dọa khơng có cách nào khác là phải nắm vững về phân bố, tình hình hiện trạng để thiết lập các khu vực bảo tồn nội vi hay bảo tồn nguyên vị (in - situ) và bảo

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

tồn ngoại vi hay bảo tồn chuyển vị (ex - situ). Vấn đề bảo tồn đa dạng sinh học nói chung, cây thuốc nói riêng, gắn với bảo tồn tri thức bản địa ở Việt Nam đã và đang được quan tâm đặc biệt [6].

Số liệu thống kê của ngành Y tế gần đây cho biết, mỗi năm ở nước ta tiêu thụ từ 30.000 - 50.000 tấn các loại dược liệu khác nhau. Ở Việt Nam trong những năm gần đây, mỗi năm đã xuất khẩu từ 5.000 đến gần 10.000 tấn dược liệu, với giá trị khoảng 15 triệu USD… Ngoài ra còn xuất khẩu một số bán thành phẩm thuốc dưới dạng hoạt chất như: Berberin, palmatin, rotundin, rutin,… Một số doanh nghiệp đã xuất khẩu được thuốc hoạt chất như: Artemisinin, artesunat,… và nhiều dạng thuốc Đông dược khác [6].

Nguồn cây Bình vơi làm dược liệu chủ yếu được khai thác từ tự nhiên. Tốc độ khai thác ngày càng gia tăng, cách thức khai thác chủ yếu là khai thác hủy diệt và hầu như khơng có kế hoạch tái sinh, do đó, sự phân bố và số lượng cây Bình vơi trong tự nhiên ngày càng bị thu hẹp và khan hiếm [18]

Trước đây, khi các nhà khoa học khảo sát cây thuốc ở An Giang thấy rằng, bình vôi là loại cây trồng khá phổ biến tại vùng núi Cấm và núi Tô thuộc hai huyện Tri Tôn và Tịnh Biên nhưng hiện nay là đối tượng cây trồng q hiếm rất khó tìm thấy trong tự nhiên. Trong khi đó, bình vơi là cây có hoa đơn tính khác gốc (cây đực và cái riêng). Vì vậy, khi chỉ có một mình hoặc một nhóm chỉ tồn cây đực, hoặc tồn cây cái thì khơng thể thụ tạo hạt được, dẫn đến khả năng duy trì nịi giống có phần hạn chế [4].

Lồi Bình vơi có khu phân bố chia cắt, sống ở vùng núi đá vôi, nơi cư trú bị xâm hại do nạn chặt phá rừng. Cây bị đào rễ để làm thuốc dẫn đễn nguy cơ tuyệt chủng cao. Loài đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (2007) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V). Loại cây quý này đang dần cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên trước việc khai thác tàn phá rừng của người dân [1].

Hiện nay có 4 lồi Bình vơi được đưa vào sách đỏ Việt Nam (1996), Cẩm nang cây thuốc cần bảo vệ ở Việt Nam (2007) và Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001 và 2006) để khuyến cáo bảo vệ. Có tên trong danh mục II.A- Hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại, trong nghị định số 32/2006/NĐ- CP của

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

<i>chính phủ (30/03/2006) là Bình vơi hoa dài (Stepphania cambodica Gagnep), Bình vơi hoa đầu (Stepphania cepharantha Hayata), Bình vơi núi cao hay Bình vơi nhị ngắn (Stepphania brachyandra Diels) [1], [22]. </i>

<i>Lồi Bình vơi núi cao hay Bình vơi nhị ngắn (Stepphania brachyandra Diels) </i>

là loài đặc hữu vùng Nam Trung Quốc- Bắc Việt Nam. Ở Việt Nam, bình vơi nhị ngắn phân bố ở huyện Phong Thổ- tỉnh Lai Châu, huyện Sapa và huyện Bát Xát- tỉnh Lào Cai. Đây là lồi bình vơi duy nhất có thể mọc ở vùng núi cao tới 1800m (hoặc hơn), có hàm lượng hoạt chất L. Tetrahydropalmatin cao nhất so với các lồi

<i>khác trong chi Stepphania. Lồi Bình vơi núi cao đã bị khai thác nhiều cùng với các </i>

lồi bình vơi khác để chiết xuất hoạt chất làm thuốc an thần ở trong nước và xuất

<i>khẩu qua biên giới. Bình vơi núi cao (Stepphania brachyandra Diels) đã được đưa </i>

vào sách đỏ Việt Nam (1996), Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001 và 2006) nhằm tăng cường quản lý và bảo vệ với mức phân hạng như sau:

Sách đỏ Việt Nam (1996): R

Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (2006): EN.A2c,d [22]

<i><b>Hình 1.4. Bình vơi nhị ngắn </b></i>

<i>(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam, trang 258) </i>

<i>Bình vơi hoa dài hay Bình vơi Cambod (Stepphania cambodica Gagnep) là </i>

lồi đặc hữu Đơng Dương. Ở Việt Nam mới chỉ thấy phân bố hạn chế ở một số tỉnh phía nam. Với những tư liệu hiện có và do nạn phá rừng và khai thác rừng có thể

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

<i>xâm hại tới nơi sống của Bình vơi hoa dài (Stepphania cambodica Gagnep) ở Krông Pách – Đăk lăk nên có thể xếp Bình vơi hoa dài (Stepphania cambodica Gagnep) </i>

vào diện những cây thuốc bị đe dọa, cần bảo vệ. Loài cây thuốc này đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam (1996), Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001 và 2006) để khuyến cáo bảo vệ. Có tên trong danh mục II.A- Hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại, trong nghị định số 32/2006/NĐ- CP của chính phủ (30/03/2006) với mức phân hạng như sau:

Sách đỏ Việt Nam (1996): R

Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (2006): VU.A3c,d [22]

<i><b>Hình 1.5. Bình vơi Cambod </b></i>

(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam, trang 259)

<i>Bình vơi hoa đầu (Stepphania cepharantha Hayata) là cây thuốc đặc </i>

biệt quý hiếm và đang có nguy cơ bị tuyệt chủng rất cao ở Việt Nam. Xét về giá trị sử dụng, đây là lồi Bình vơi duy nhất phát hiện thấy có hợp chất cepharatin (có tác dụng chống ung thư). Ở Việt Nam, Bình vơi hoa đầu

<i>(Stepphania cepharantha Hayata) phân bố ở tỉnh Quảng Ninh (huyện Cẩm </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

phả: Quang Hanh); Hịa Bình (huyện Kỳ Sơn), là lồi cực hiếm được đưa vào sách đỏ Việt Nam (1996), Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001 và 2006) để khuyến cáo bảo vệ. Lồi có tên trong danh mục II.A - Hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại, trong nghị định số 32/2006/NĐ- CP của chính phủ (30/03/2006) với mức phân hạng như sau:

Sách đỏ Việt Nam (1996): V

Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (2006): CR.B2a,b(ii,iii,iv,v) [22]

<i><b>Hình 1.6. Bình vơi hoa đầu </b></i>

<i>(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam, trang 261) </i>

<i>Củ dịm hay Bình vơi tím (Stephania Dielsiana C.Y.Wu) thường ưa mọc ở </i>

những vùng có núi đá tại các tỉnh Hà Sơn Bình, Hà Nam, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hóa... rễ củ dùng làm thuốc an thần, thanh nhiệt, giải độc, tiêu phù, giảm

<i><b>đau... được ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá sẽ nguy cấp (V). </b></i>

Cây rất hiếm ở Việt Nam và có thể bị tuyệt chủng.[22]

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

<i><b>Hình 1.7. Bình vơi tím </b></i>

(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam, trang 262)

Do vậy, hướng nghiên cứu của đề tài là sưu tập, định danh mẫu cây Bình vơi thu được thơng qua đặc điểm hình thái, giải phẫu và DNA barcode nhằm góp phần

<i>vào cơng tác bảo tồn (in situ, ex situ, in vitro) và khai thác nguồn gen, dược chất của </i>

cây này tại Việt Nam.

<b>1.2. Một số phương pháp định danh thực vật </b>

<i><b>1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu </b></i>

Trong lịch sử phát triển thực vật học thì hình thái, giải phẫu thực vật phát triển tương đối sớm. Từ những năm 371-286 TCN, Theo phraste được gọi là người sáng lập mơn thực vật học. Ơng đã cơng bố các dẫn liệu hình thái giải phẫu của cơ thể thực vật trong các tác phẩm “Lịch sử thực vật”, “Nghiên cứu về cây cỏ” [10].

Phương pháp nghiên cứu chủ yếu nhất về thực vật vẫn là quan sát, so sánh trên cơ sở các dữ kiện ngoài thiên nhiên, sau đó tiến hành giải phẫu trong phịng thí nghiệm, so sánh các mẫu thu thập khác đã được lưu giữ, cuối cùng là phân tích, tổng hợp và rút ra nhận xét. Để phân biệt các loại tế bào hay thành phần cấu tạo các loại mô trong cơ quan, thường các lát cắt được nhuộm màu và tùy theo yêu cầu quan sát phần nào mà sẽ nhuộm màu gì cho phù hợp. Trong phịng thí nghiệm thực

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

vật, để nhận biết tế bào có vách bằng celulose sẽ nhuộm đỏ bằng carmin, tế bào có vách tẩm mộc tố sẽ được nhuộm xanh với lục iod, nhân tế bào được nhuộm bằng hematoxylin…[20].

Các nhà sinh học đã sử dụng phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu đối chiếu khóa phân loại và các bản mơ tả trong các thực vật chí để xác định tên khoa

<i>học của các mẫu Hà thủ ô đỏ [10], cây Phong lữ thảo (Pelargonium hortorum L. H. </i>

Bailey) [7], cây Sóng rắn ở Thái Nguyên [25]. Đặc biệt trong nghiên cứu của Nguyễn Quỳnh Nga và đtg (2016) đã mô tả đặc điểm hình thái và xây dựng khóa

<i>định loại cho 8 loài và 2 thứ thuộc chi Paris ở Việt Nam [43]. </i>

Việc sử dụng phương pháp so sánh hình thái đã hỗ trợ trong các nghiên cứu

<i><b>để định lồi Bình vơi (Stephania spp.). 1.2.2. Phương pháp phân loại học phân tử </b></i>

<i>1.2.2.1. Mã vạch DNA </i>

Khái niệm mã vạch DNA được Hebert và cộng sự đưa ra lần đầu tiên vào năm 2003, giúp nhận diện các mẫu sinh vật [44]. Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong genome của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai lồi sinh vật với nhau, nó tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngồi chúng rất giống nhau nhưng thực sự là khác nhau.

Đối với thực vật việc lựa chọn mã vạch DNA cần phải quan tâm đến các yếu tố như:

<i>(1) khuếch đại PCR mang tính tổng thể, thành công trên nhiều loại cây, (2 ) phạm vi đa dạng phân loại, sử dụng được cho nhiều loài khác nhau, (3) có sự sai khác, đặc trưng phân loại các lồi, </i>

<i>(4) sử dụng cơng cụ tin sinh học trong phân tích và ứng dụng [37]. </i>

Sau khi kiểm tra rộng rãi các vùng gen trong hệ gen của ty thể, lục lạp và nhân

<i>thì bốn đoạn gen/vùng gen chính là rbcL , matK, trnH - psbA và ITS được thống </i>

nhất là mã vạch DNA [33], [38], [39], [40], [46], [50].

Quá trình tạo và áp dụng mã vạch DNA thực vật cho mục đích nhận dạng địi hỏi hai bước cơ bản:

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

<i>(1) Xây dựng thư viện mã vạch DNA của các loài đã biết; </i>

<i> (2) So sánh mã vạch DNA của một mẫu chưa biết với thư viện mã vạch DNA. 1.2.2.2. Nghiên cứu trên thế giới sử dụng mã vạch DNA </i>

Các mã vạch DNA đã được phát triển, thử nghiệm và sử dụng để giải quyết các câu hỏi cơ bản về hệ thống sinh thái, sinh học tiến hóa và bảo tồn, bao gồm lắp ráp cộng đồng, mạng lưới tương tác loài, khám phá phân loại và đánh giá các lĩnh vực ưu tiên bảo vệ môi trường.

<i><b>Gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên cây </b></i>

<i>thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen trnK mã hóa cho tRNALys </i>

(UUU) của lục lạp. Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 nucleotit nằm trong intron của

<i>gen trnK và chưa rõ chức năng. Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để xây dựng cây phát sinh loài cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp và do vậy gen matK trở thành gen chỉ thị quan trọng để giúp phân loại </i>

thực vật [48].

<i>Nhóm nghiên cứu do Savolainen và cộng sự (2005) sử dụng gen matK để </i>

nhận dạng 1600 lồi Lan. Trong q trình thực hiện, họ phát hiện một loài trước đây được cho là Lan thực ra lại là hai loài tách biệt. Loài này sống trên những dốc khác nhau trên núi và có hoa hình dạng khác nhau để thích nghi với những lồi cơn trùng thụ phấn khác nhau [46].

<i>Gen matK thường được sử dụng trong việc định danh, phân loại ở các lồi </i>

thực vật hạt kín, là lồi chiếm đa số trong các hệ sinh thái hiện nay. Layhaye và

<i>cộng sự (2008) đã lựa chọn gen matK là một mã vạch ưa thích trong phân loại thực vật. Nghiên cứu của Lahaye và đtg (2008) chỉ ra rằng mã vạch DNA thực vật có thể </i>

được sử dụng để đánh giá nhận dạng loài trong các điểm nóng đa dạng sinh học giúp bảo tồn cũng như áp dụng giả thuyết để giám sát thương mại quốc tế trong các loài Lan đang bị đe dọa [39].

<i><b>Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là locus được giải mã phổ biến nhất. </b></i>

<i>Vùng ITS có hiệu quả cao trong nghiên cứu phân loại nhiều đối tượng thực vật và </i>

nấm (ngoại trừ dương xỉ) và đây là một locus được sử dụng đọc trình tự với DNA

<i>ngắn [49]. Ở mức độ lồi, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6% giữa các </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

loài gần gũi) và đã được chứng minh trong hầu hết các nghiên cứu. Thuận lợi của

<i>vùng ITS là có thể nhân bản theo hai đoạn nhỏ hơn (ITS1 và ITS2) nằm hai bên với locus 5,8S, điều này rất có ý nghĩa khi nhân bản các mẫu bị hư hại. Vùng ITS cũng </i>

đã được chứng minh có mức độ biến đổi thấp bên trong lồi [32].

<i>ITS là một đoạn đệm nằm giữa gen mã hóa rRNA của tiểu phần nhỏ và tiểu </i>

phần lớn ribosome (vùng gồm các đoạn ITS1-5,8S-ITS2 (hình 1.8) [63].

<i><b>Hình 1.8. Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS </b></i>

<i><b>( Nguồn website: </b></i>

<i>Vùng ITS nằm trong nhân tế bào được phiên mã trong quá trình tổng hợp rRNA. Tuy nhiên, trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy. Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locut riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locut 5.8S. </i>

<i><b>Bảng 1.2. Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS trong phân loại thực vật </b></i>

<b>Đối tượng phân loại ^{Cấp độ}</b>

<b>phân loại ^Năm^{Tài liệu tham khảo}</b>

<i>Phân tông Saccharinae </i>

<i>Chi Plantago </i>

<i>(Plantaginaceae) </i> ^Loài ²⁰⁰² ^{John Kress và đtg [37]} <i>Chi Tsuga (Pinaceae) </i> Loài 2008 Havill và đtg [35]

<i>Họ Brassicaceae </i> Tông 2010 Warwick và đtg [51]

<i>Chi Erica (Ericaceae) </i> Loài 2011 Pririe và đtg [ 45]

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

<i>Vùng ITS có nhiều ưu thế trong nghiên cứu phát sinh và đánh giá sự đa dạng di truyền của các lồi như trình tự nucleotide vùng gen ITS mang các đặc tính di </i>

truyền của cả bố và mẹ, số lượng trình tự DNA lặp lại thích hợp cho việc khuếch

<i>đại và xác định trình tự DNA ribosome. Trình tự nucleotide vùng gen ITS đã được </i>

nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen thế giới khá phong phú và đa dạng,

<i>thuận lợi cho việc phân tích so sánh. Vùng gen ITS được chứng minh đặc biệt hữu </i>

ích trong việc làm sáng tỏ mối quan hệ ở các loài trong bảng 1.4.

<i>Một ví dụ về sự khác biệt giữa Schisandra chinensis - Ngũ vị tử bắc với các loài khác trong chi Schisandra. Li và đtg (2013) đã thấy sự sai khác tại vị trí 86 bp trên vùng gen ITS, quan sát thấy C thay thế cho A trong các quần thể hoang dã khi so sánh với quần thể người dân trồng. Vùng ITS2 còn phân biệt rõ ràng Schisandra chinensis với Schisandra sphenanthera [40]. </i>

<i>Một nghiên cứu khác nhằm xác định chi Hồng kỳ (Astragalus) gồm nhiều </i>

lồi có sự tương đồng về hình thái. Trong nghiên cứu của Gao và đtg (2009), bốn

<i>gen mã hóa (trnH-psbA, rpoC1, rbcL, matK) và hai vùng gen khơng mã hóa (ITS, ITS2) được so sánh giữa 319 lồi. Mã vạch ITS2 và ITS có hiệu quả cao hơn đối với </i>

việc phân biệt loài [34].

<i>1.2.2.3. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA ở Việt Nam </i>

Việt Nam cũng đã bắt kịp xu hướng khi sử dụng mã vạch DNA vào công cuộc giám định thực vật phục vụ cho cơng tác bảo tồn nguồn gen các lồi thực vật quý hiếm. Những năm gần đây các cơng trình nghiên cứu sử dụng các đoạn gen/vùng gen làm mã vạch DNA trong việc phân tích quan hệ di truyền, phân loại thực vật ngày càng phổ biến.

Năm 2011, Dương Văn Tăng và đtg đã phân lập và xác định trình tự đầy đủ

<i>vùng gen ITS thuộc hệ gen nhân của ba loài gỗ quý Trắc (D. cochinchinensis), Cẩm lai (D. oliveri) và Sưa (D. tonkinensis) ở Việt Nam và bổ sung cho Ngân hàng trình tự DNA gen quốc tế. Qua việc phân tích quan hệ di truyền sử dụng trình tự ITS cho thấy: Sưa (D. tonkinensis) có họ hàng gần nhất với D. sisso và nằm trong một nhóm lớn với các lồi D. frutescens, D. decipularis, D. brasiliensis và D. congestiflora. </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

<i>Loài Trắc (D. cochinchinensis) có mối quan hệ họ hàng gần nhất với Cẩm lai (D. oliveri) [21]. </i>

Năm 2014, Nguyễn Thị Phương Trang và đtg đã sử dụng kết hợp ba vùng

<i>gen lục lạp rbcL, matK, trnH-psbA để nghiên cứu đặc điểm di truyền ba loài Sao (Hopea) đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam gồm Sao Hòn Gai (Hopea chinensis), Sao Hải Nam (H. hainanensis) và Sao Mặt Quỷ (H. mollissima). Mức độ </i>

khác biệt di truyền rất thấp từ 0,2 đến 0,6 giữa các cặp loài nghiên cứu, dùng để nhận biết và so sánh với các loài khác trên thế giới [26].

<i>Phan Kế long và đtg (2014) cũng sử dụng kết hợp hai vùng gen matK và ITS </i>

trong việc phân tích mối quan hệ di truyền của các mẫu Sâm thu ở Lai Châu trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide hai vùng gen đã chọn. Kết quả nghiên cứu đã giải

<i>mã được 1485 nucleotide vùng gen matK và 588 nucleotide vùng gen ITS-rDNA cho tổng số 17 cá thể của 2 loại Sâm ở Lai Châu bao gồm sâm Lai Châu (P. vietnamensis var. fuscidiscus) và Tam thất trắng (P. stipuleanatus). Kết quả phân tích trình tự nucleotide vùng gen matK và ITS-rDNA chỉ ra các lồi Sâm trong chi Panax có cùng nguồn gốc tiến hóa. Hai thứ sâm Lai Châu (P. vietnamensis var. fuscidiscus) và sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis Ha & Grushv. var. vietnamensis) của lồi sâm Việt (P. vietnamensis Ha & Grushv.) có quan hệ chị em [13]. </i>

Trong nghiên cứu của Hà Văn Huân và Nguyễn Văn Phong (2015) đã xác

<i>định đoạn mã vạch DNA cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis). Đoạn gen matK được nhân bản thành công và xác định trình tự nucleotide với kích thước 951 bp. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK xác định được từ cây </i>

Trà hoa vàng Tam Đảo được đăng kí trên ngân hàng gen quốc tế (NCBI) với mã số KP241692 [9].

<i>Vùng gen rpoC1 (RNA polymerase beta' subunit) được Lý Thị Bôn và đtg </i>

(2017) nghiên cứu sử dụng làm mã vạch DNA trong việc định loại loài Hồng trâu

<i>(Capparis versicolor Griff.). Bằng kỹ thuật PCR, vùng gen rpoC1 đã được phân lập </i>

thành công từ DNA lục lạp có kích thước 527 nucleotide, mã hóa 175 amino acid.

<i>Từ kết quả so sánh và phân tích trình tự DNA vùng gen rpoC1 có thể xác định </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

<i>chính xác mẫu nghiên cứu thuộc chi Capparis, và tạm thời xác định thuộc loài Capparis versicolor Griff [2]. </i>

Năm 2017, Nguyễn Thị Hồng Mai và đtg đã nghiên cứu đặc điểm phân tử

<i>vùng gen rpoC của loài Trắc (Dalbergia cochinchinensis Pierre) và Sưa đỏ (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam và ứng dụng phân loại. Chỉ số tương đồng của vùng gen rpoC từ 2 mẫu nghiên cứu với trình tự tương đồng từ hai loài Dalbergia cochinchinensis và Dalbergia tonkinensis tham khảo là 99%. Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy vùng gen rpoC có khả năng dùng trong phân loại các loài của chi Sưa (Dalbergia). Đoạn gen rpoC dài 600 bp của hai loài Dalbergia cochinchinensis và Dalbergia tonkinensis của Việt Nam đã được đăng ký tại </i>

Genbank với mã số lần lượt là KY287755 và KY287750 [16].

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

<b>Chương 2 </b>

<b>VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu </b>

<i><b>2.1.1. Vật liệu thực vật </b></i>

Mẫu cây Bình vơi thu thập được ở tỉnh Lào Cai.

<i><b> 2.1.2. Vật liệu nhân đoạn gen matK và vùng gen ITS </b></i>

<i>Các cặp mồi nhân gen matK, ITS do phòng Công nghệ gen, khoa Sinh học, </i>

trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cung cấp.

<i><b>Bảng 2.1. Trình tự nucleotide mồi matK, ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR </b></i>

Đề tài sử dụng hóa chất của các hãng có uy tín và đảm bảo độ tin cậy như Merck, Invitrogen,... Một số hóa chất chính có sử dụng trong đề tài như: xanh methylene, phèn chua, carmin, chloroform, isoamy alcohol (Merck), mồi nhân gen, PCR Master mix (Invitrogen)...

Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử như máy ly tâm (Nhật Bản), máy điện di (Mỹ), pipet (Eppendorf - Đức), máy PCR, kính hiển vi điện tử Kruss (Đức)... thuộc phịng thí nghiệm khoa Sinh học, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Thái Nguyên cùng các trang thiết bị khác thuộc viện Công nghệ sinh học thuộc viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

<i><b>2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu </b></i>

Đề tài được thực hiện từ tháng 9 năm 2020 đến tháng 6 năm 2021.

Các thí nghiệm và luận văn được thực hiện tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ gen, khoa Sinh học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên.

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

<i>Thí nghiệm xác định trình tự đoạn gen matK, vùng gen ITS được thực </i>

hiện tại viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam.

<b>2.2. Phương pháp nghiên cứu </b>

<i><b>2.2.1. Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu mẫu cây Bình vơi </b></i>

Nhận diện mẫu cây Bình vơi dựa vào đặc điểm hình thái được tiến hành theo Nguyen Quynh Nga và đtg (2016) [43], tài liệu ‘Cây cỏ Việt Nam’ [8], tài liệu ‘Paris Linaeus” [41]. Các chỉ số nhận diện chính gồm: Chiều cao thân chính của cây, màu sắc thân cây; số lượng lá, hình dạng lá, kích thước lá; Hình dạng, màu sắc, số lượng của đài, tràng, nhị, nhụy hoa.

Phân tích cấu tạo giải phẫu các cơ quan dinh dưỡng (cuống hoa, thân cây, rễ cây) bằng phương pháp làm tiêu bản theo hướng dẫn của Hoàng Thị Sản và Nguyễn Thị Phương Nga (2008) [20]. Các bước làm tiêu bản gồm:

+ Cắt ngang thân, rễ, cuống lá thành các lát mỏng, tẩy sạch bằng nước javen, rồi rửa thật sạch bằng nước thường.

+ Nhuộm kép tiêu bản: nhỏ dung dịch xanh methylen lên đĩa đồng hồ có chứa mẫu vật để trong vịng 30 phút sau đó rửa lại thật sạch bằng nước thường. Tiếp đó dùng dung dịch carmin nhỏ vào mẫu vật vừa nhuộm, để trong vòng 30 - 45 phút rồi rửa lại thật sạch bằng nước thường.

+ Lên kính: nhỏ 1 giọt nước lên lam kính, đặt mẫu vật lên trên giọt nước và đậy lamen.

+ Quan sát, chụp ảnh, và phân tích kết quả thu được.

<i><b>2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA </b></i>

Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Gawell và CS

</div>