KHỐI PHỔ & LC-MS pot

KHỐI PHỔ & LC-MS
Mass Spectrometry & LC-MS
Phạm gia Huệ
Hà nội 07-08-2009
 Công cụ PT hay dùng nhất hiện nay.
 Kỹ thuật cung cấp thông tin về:
1. Khối lượng và công thức phân tử 1 hợp chất
2. MS cùng với NMR và IR cho phép nghiên cứu cấu trúc phân
tử
3. Thành phần định tính và định lượng của một hỗn hợp.
4. Máy MS chuyển các Phân tử thành các ion ở thể khí và tách
chúng theo tỷ số m/z và ghi lại cường độ từng ion, cho một
phổ khối.
5. PT được mẫu rất nhỏ, dạng rắn, lỏng, khí của các chất PTL
nhỏ cỡ (một số Da) tới các protein (cỡ trên 300 000 Da).
(Dalton (Da) = amu)
Khối phổ (MS) là gì?
Khối phổ (MS) là gì?
Nguyên lý cơ bản là
• sự tạo thành các ion,
• các ion này được tách hay lọc theo
tỷ lệ m/z (khối lượng/điện tích) của chúng,
• và được phát hiện.
Các thành phần một máy MS
Nguồn ion PT khối
Detector
ion
Phổ Khối
m/z
Signal Intensity
Nạp mẫu

R
R
L
L
K
K
Chân không
cao
X
X
ử
ử
lý
lý
v
v
à
à
l
l
ư
ư
u
u
d
d
ữ
ữ
li
li

ệ
ệ
u
u
Tránh ion PT va chạm với các
phân tử trong không khí
Cường độ tín
hiệu
1. Nguồn ion hoá
 Biến đổi chất PT, tạo thành các ion phân tử
(molecule) và các ion mảnh (fragment)
 Hai kỹ thuật chính hay dùng:
• Bắn phá electron (Electron Impact - EI):
tạo ion dùng chùm electron năng lượng
cao: phương pháp “cứng”
• Ion hoá hoá học (chemical ionization -CI)
tạo ion thông qua phản ứng với các ion
thuốc thử: phương pháp “mềm”
• Ví dụ: Electron bắn phá methanol:
tạo cation gốc methanol, một ion phân tử:
CH
3
OH + 1 e
-
 CH
3
OH
+.
+ 2 e-
• Chỉ một số (~0.01%) phân tử chất PT (M) được

ion hoá
• Phần lớn các ion phân tử bị phá thành các mảnh
nhỏ hơn (cation, gốc, phân tử trung hoà nhỏ
hơn)
1.1. Bắn phá electron (EI)
+
+
Sợi đốt
Khu vực
Gia tốc ion
PT
khối
Chùm electron
1.1. Bắn phá electron (EI)
Chỉ các mảnh tích
điện được phát hiện
M
e
-
2e
-
M
+•
Mẫu
Cation gốc
/ Ion phân tử
• •
Bắn phá / ion hoá
[Mẹ]
70 eV

F
1
+•
NF
1
F
2
+
Mảnh
cation gốc
F
2
•
[Mảnh Con]
+
Phân mảnh
F
1
+
F
1
•
Mảnh
trung hoà
+
+
Mảnh
cation
Mảnh
cation

Mảnh
gốc
Gốc
Các LK dễ gãy là các LK yếu nhất, tạo các mảnh bền
Phổ MS của
pentobarbital,
bắn phá
bằng electron
• Ion phân tử M+., có m/z 226, mất gần hết.
• Tạo thành các mảnh m/z 197, 156, 141, 112, 98, 69, and 55,
• Các pic này là dấu vết các mảnh trong cấu trúc của phân tử M.
• Pic lớn nhất trên phổ MS là pic cơ bả n (coi như có cường độ 100%) . Cường độ pic khác tính theo
% của pic cơ bản.
Pic cơ bản
Molecular ion peak M
+
.
Pic ion phân tử
Khối lượng phân tử =226
1.2. Ion hoá học (CI) – PHƯƠNG PHÁP mềm
• Tạo ít mảnh.
• Dùng thừa thuốc thử dạng khí như CH
4
.
• Chùm electrons (100–200 eV) chuyển CH
4
thành các SP như CH
5
+
CH

5
+
là chất cho proton mạnh, phản ứng hoá học với
chất phân tích tạo ra phân tử proton hoá MH
+
, có nhiều trên phổ
MS ion hoá hoá học dùng methan
3544
44
2
CHCHCHCH
eCHeCH

.





 MHCHMCH
45
(M+1) peak
Pic của ion phân tử MH+ ở m/z 227 (M+1) là pic lớn thứ nhì.
Ít các pic của mảnh so với phổ EI
Phổ ion hoá hoá học của
pentobarbital
Ion hoá
Hoá học
Cường độ tương đối
2. Bộ Phân tích Khối

• Trái tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách
các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần
riêng biệt.
• Phân loại:
Bộ phân tích từ,
Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)
Bộ phân tích bãy ion tứ cực (Ion trap)
Bộ phân tích thời gian bay (TOF)
•Sau đây là bộ phân tích từ
m/z = B
2
r
2
e/2V
Focused ion M
+
Ion M
+
Ionizing
voltage
2.1 Bộ phân tích từ
Sample
inlet
Low vacuum
Detector
Magnetic field
B
Focusing slits
Accelerating
voltage V

Where m = mass,
e = electron charge,
z = # of charges/ion
r = radius of curvature
Increase B
Radius r
zeB
mV2
r
2

Ion Beam
Detector
Magnetic Field
2.2 Bộ phân tích tứ cực
(Quadrupole)
• Một số ion có tỷ số m/z xác
định cộng hưởng với thế xoay
chiều xác định có thể đi thẳng qua
khoảng không đến detector. Trong
khi đó.
•Các ion khác không sẽ có quĩ đạo
không ổn định, va chạm với các
cực và bị giữ lại ở đó.
•Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các ion có tỷ số m/z khác
nhau có thể vượt qua khoảng không để đến detector.
2.2 Bộ phân tích tứ cực
Bẫy ion (Quadrupole Ion trap)
• Bẫy ion tứ cực hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tích
khối tứ cực; chỉ có một điểm khác là các ion được lưu giữ

và đưa dần ra khỏi bẫy
• Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các
ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vượt qua khoảng không
để đến detector.
2.3 Bộ phân tích tứ cực Chập Ba (Triple Quadrupole)
Ba bộ tứ cực nối tiếp nhau:
Ở Q1: Ở các ion được tách
Ở Q2: Với áp suất cao, các ion bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt
như nitơ, argon, heli. Bộ Q2 tạo ra phân ly do va chạm chúng bị phân
mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions).
Ở Q3: làm nhiệm vụ tách các ion con





Detector
Q
1
2
Q
3
Q
Độ phân giải của máy khối phổ
• Đó là khả năng của máy có thể phân biệt được 2 pic có
khối lượng gần nhau m1 và m2. Độ phân giải R là:
R = m 2 / (m 2 - m 1)
• Hai pic cạnh nhau đươc coi là đã tách riêng khi phần chồng lấp giữa
hai pic đó nhỏ hơn 10% pic nhỏ.
• Bộ phân tích từ hội tụ đơn có trị số R khoảng 5000.

• Cần có máy với độ phân giải cao hơn để phân biệt các
ion có khối lượng gần nhau.
• Ví dụ: để phân biệt 2 ion có m1= 280,2881 và m2= 280,2768
máy MS cần có R= 25 000
2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight)
Nguyên tắc:
• Dùng bộ phận gia tốc ion đẩy ion bay tới
detector, đo thời gian bay
• Thời gian bay được chuẩn hóa theo tỷ lệ
m/z
2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight)
Ưu điểm:
• Độ phân giải rất cao (>10.000)
• Độ chính xác rất cao ( 2- 5 mDa)
Ứng dụng:
• Xác định chất mới (xác định công thức)
• Yêu cầu xác định khối lượng chính xác
• Xác định được tạp
• Đo tỷ lệ các pic đồng vị
Xác định tạp
3. Detector
Nhân electron (electron multiplier):
Tác động của một ion lên bề mặt các
dynode khác để tạo ra các electron
ngày càng nhiều electron.
1  10
6
(hình bên)
Nhân quang (photomultiplier):
Các electron tạo ra theo cách trên va

chạm với một bề mặt phát quang
để tạo ra photon. Các photon này
được thu nhận và số lượng của
chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu
WS 2005
Máy MS tứ cực chập 3 (Trip Quad)
TSQ
(Thermo)
Waters Micromass Q-Tof Premier
1
2
3
4
Waters Micromass Q-Tof Premier
1. Phun: Z-spray sạch hơn
2. T-Wave = ion optics = ion guide: tạo thành
hình ống hướng ion vào giữa, ít mất mát
ion trên đường đi
3. T-Wave thứ hai: cho MS
2
4. TOF: Lựa chọn V mode/ W mode