Đánh giá hiệu quả li giải tế bào ung thư biểu mô buồng trứng của virus vaccine sởi in vitro

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>HỌC VIỆN QUÂN Y HỘI NỘI KHOA VIỆT NAM</b>

<b>BÁO CÁO KHOA HỌC</b>

<b>ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ LI GIẢI TẾ BÀO UNG THƯBIỂU MÔ BUỒNG TRỨNG CỦA VIRUS VACCINE SỞI </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>NỘI DUNG BÁO CÁO</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN</b>

<b>Tình hình Ung thư trên TG và Việt Nam</b>

<b>• Globocan 2018: </b>~ 18,1 triệu ca K mới; 9,6 triệu ca tử vong vì K.

<b>• Ở Việt Nam 2018 </b>:164.671 ca ung thư mới và 114.871 ca tử vong

• Tỷ lệ mắc ung thư mới ở Châu Á là 48,4%

<b>Ung thư buồng trứng (UTBT)</b>

<b>• TG: UTBT 295.414 ca mắc mới </b>

(1,6%); 184.799 ca tử vong (1,9%)

<i><b>• Việt Nam: </b></i>năm 2018 có 1.500 TH UTBT mới mắc; 856 TH tử vong và tỷ lệ sống trên 5 năm: 7,67%

<i><small>* Nguồn: Globocan 2018</small></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<i><small>Freidman et al., 2012; Liu T-C et al. (2007) Nat Clin Pract Oncol; Kirn D et al. (2001). Nat Med</small></i>

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN</b>

<i><b>Cơ chế tác dụng của liệu pháp Oncolytic virus</b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN</b>

<i><b>Cơ chế tác dụng của liệu pháp Oncolytic virus</b></i>

<i><small>*Nguồn: Nature reviews/Drug Discovery (2015)</small></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<b>MeV trong liệu pháp virus điều trị ung thư </b>

<i><small>* Nguồn: Moss, W.J. and D.E. Griffin, Global measles elimination. Nat Rev Microbiol, 2006</small></i>

<b>Virus vaccine sởi:</b>

<small>-Vaccine giảm độc lực dòng MV-Edm</small>

<small>-MeV sử dụng 3 thụ thể chính: CD150, CD46 và nectin-4 để xâm nhập vào tế bào đích</small>

<small>-MeV: có tính lựa chọn các khối u cao, ổn định về mặt di truyền và không có nguy cơ gây bệnh cho cộng đồng</small>

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

• Chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “<b>ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ LY GIẢI TẾ BÀO UNG THƯ BIỂU MÔ BUỒNG TRỨNG CỦA </b>

<i><b>VIRUS VACCINE SỞI IN VITRO” </b></i>nhằm 2 mục tiêu:

1. Đánh giá tác dụng li giải tế bào ung thư biểu mô buồng

<i>trứng của virus vaccine sởi in vitro</i>

2. Đánh giá khả năng gây chết tế bào ung thư biểu mô buồng trứng theo chương trình (apoptosis) của virus

<i>vaccine sởi trên hệ thống FACS – Lyric</i>

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<b>ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC</b>

<b>1. Đối tượng và chất liệu nghiên cứu</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>Dụng cụ, thiết bị </b>

<b>ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>Hóa chất</b>

<b>ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>2. Phương pháp nghiên cứu:</b>

Tiến hành theo phương pháp thực nghiệm, tiến cứu, chọn thời điểm so sánh đánh giá q trình điều trị

<b>ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC</b>

<b><small>Ni cấy tế bào ung thư buồng trứng người Ovac Tăng sinh virus vaccine sởi</small></b>

<b><small>Chuẩn độ virus (TCID50)</small></b>

<b><small>Mục tiêu 2: Đánh giá khả năng </small></b>

<b><small>gây chết tế bào apoptosis </small></b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<b>PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU</b>

<b>1. Kỹ thuật nuôi cấy và tăng sinh tế bào Ovac, Vero</b>

• B1: Lấy tế bào Ovac, Vero bảo quản trong nitơ lỏng -196⁰C. • B2: Rã đơng ở 37⁰C.

• B3: Rửa TB, ly tâm loại bỏ môi trường để thu cặn tế bào. • B4: Chuyển vào chai ni cấy 75 cm².

• B5: Kiểm tra tế bào trên KHV

• B6: Cho chai nuôi vào tủ nuôi cấy tế bào có 5% CO₂, 37⁰C. • B7: Kiểm tra tế bào sau 24 giờ ni cấy

• B8: Kiểm tra và thay môi trường 2 - 3 lần/tuần

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<b>PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU</b>

<i><b>2. Xác định nồng độ virus bằng pp chuẩn độ TCID50</b></i>

<small>Giếng chứng: Giếng nhiễm virus</small>

• Đưa tế bào Vero vào các giếng trên phiến 96 giếng

• Nhiễm MeV với dải nồng độ từ 10^-2 đến 10^-7 vào các giếng của phiến 96 giếng.

• Quan sát thấy hình ảnh TB Hep2 nhiễm virus thì tiến hành nhuộm xanh methylen 15%

• Đọc kết quả sau nhuộm xanh methylen

• Tính TCID₅₀

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU</b>

<b>3. Thử nghiệm MTT </b>

<small>• Chuyển tế bào OVac vào các giếng của phiến 96.</small>

<small>• Sau 24 giờ, thay môi trường mới, </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

<b>PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU</b>

<b>44. PP flow cytometry đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình </b>

<i><small>Nguyên lý</small></i>

<small>- Để kiểm tra tỉ lệ tế bào chết theo chương trình và tế bào hoại tử NC sử dụng anti-annexin V gắn chất phát huỳnh quang là FITC và chất nhuộm nhân tế bào phát huỳnh quang là </small>

<small> 7-Amino Actinomycin D (7AAD).</small>

<small>- Annexin V có khả năng tương tác với phosphatidyl serine nhờ chất xúc tác là ion Ca</small>^2+.

<small>- 7-Amino Actinomycin D có khả năng liên kết rất mạnh với ADN của nhân tế bào.</small>

<b><small>7-Amino Actinomycin D</small></b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

<b>PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU</b>

PP flow cytometry đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình

<i>• Chuẩn bị tế bào Ovac nhiễm virus in vitro</i>

<i><small>- Chuyển tế bào Ovac vào các giếng của đĩa 6 </small></i>

<small>giếng </small>

<small>- Sau 24 giờ, thay môi trường mới có bổ sung MeV chia 4 nhóm. </small>

<small>- Thu các mẫu tế bào Ovac trên ở ngày 24; 48; 96 giờ sau điều trị. </small>

<i>• Quy trình chạy flow cytometry theo hướng dẫn của bộ kit Annexin V Apoptosis </i>

<i>Detection (BD) </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

<b>Xử lý số liệu:</b>

<i><b>- Các thuật toán được sử dụng trong nghiên cứu: </b></i>

<small>- Phân phối chuẩn: so sánh trung bình 2 nhóm độc lập bằng T-test, so </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

<i><b>Nuôi cấy tế bào Ovac</b></i>

<b>KẾT QUẢ</b>

<i><b><small>Hình ảnh TB UT buồng trứng người Ovac</small></b></i>

<i><small>(a): 4 giờ; (b): 24 giờ (c): TB phát triển cụm (d): TB bám dính gần kín diện tích đĩa ni cấy</small></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

<i><b>Tăng sinh virus vaccine sởi (MeV)</b></i>

<small>Hình ảnh tế bào Vero nhiễm virus</small>

<small>(A): ngày 1; (B, C): ngày 2,3; (D, E): ngày 4,5 (F,G,H): ngày 6; (I): ngày 7</small>

<b>KẾT QUẢ</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

<i><b>Tế bào Ovac nhiễm virus tạo hợp bào in vitro</b></i>

Hình ảnh tế bào Ovac nhiễm virus tạo hợp bào

<b>KẾT QUẢ</b>

<i><b><small>Ong H.T (2006). Oncolytic measles virus targets high CD46 expression on multiple myeloma cells</small></b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

<i><b>Chuẩn độ virus bằng thử nghiệm TCID</b></i>

<i><b>₅₀</b></i>

<small>Nồng độ pha lỗng có CPE trên 50% gần nhất là 10</small>^-5 <small>Nồng độ pha lỗng có CPE dưới 50% gần nhất là 10</small>^-6

<small>CCID</small>₅₀<small> của MeV= 10</small>^5+0,5<small>/0,2 mL = 5x10</small>^5,5<small>/mL</small>

<b>KẾT QUẢ</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

<b>Liều ức chế 50% (IC</b>

<b>₅₀</b>

<b>) của MeV trên tế bào ung thư OVac</b>

<b>KẾT QUẢ</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

<b>Khả năng li giải tế bào Ovac của MeV và bằng thử nghiệm MTT </b>

<b>KẾT QUẢ</b>

<i><small>p<0,00001 </small></i>

<i><b><small>Yan Y. (2015), Zhao D. (2013): MTT 24 – 72 giờ. Meng X. (2010): 12 - 120 giờ, liều MOI=0,1Msaouel P. (2009): MTT liều MOI = 0,1, 1,0 và 10</small></b></i>

<b><small>Kết quả MTT tế bào Ovac nhiễm MeV ngày thứ 2, 3, 4.</small></b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

<b>Khả năng li giải tế bào Ovac của MeV của MeVbằng thử nghiệm MTT theo thời gian</b>

<b>KẾT QUẢ</b>

<b><small>So sánh kết quả MTT ở 3 thời điểm ngày 2, 3, 4.</small></b>

<i><small>p<0,00001 </small></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

<b>Tỷ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử bằng phương pháp flow cytometry</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

<b>Tỷ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử bằng phương pháp flow cytometry</b>

<b>KẾT QUẢ</b>

<i><b>Tỉ lệ tế bào apoptosis ở các nhóm nghiên cứu</b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

<i><b><small>Kết quả chạy flow cytometry tế bào OVac </small></b></i>

<i><b><small>ở thời điểm 24, 48 và 96 giờ sau điều trị bằng MeV </small></b></i>

<b><small>MeV (1/4 MOI)MeV (1/2 MOI)MeV (1 MOI)CONTROL</small></b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

<b>Tỷ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử bằng phương pháp flow cytometry</b>

<b>KẾT QUẢ</b>

<b>Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở các nhóm nghiên cứu</b>

<b><small>p<0,001</small></b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

<b>KẾT LUẬN</b>

<b>Virus vaccine sởi (MeV) có tác dụng LI GIẢI TẾ </b>

• MeV li giải tế bào Ovac trực tiếp tạo hợp bào từ ngày thứ 2, hiệu quả nhất ở ngày thứ 3 và 4.

• Tỉ lệ tế bào sống ở các nhóm điều trị thấp hơn nhóm chứng.

• MeV ly giải tế bào Ovac thơng qua kích thích apoptosis. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis, apoptosis sớm ở các nhóm điều trị cao hơn nhóm chứng.

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

<small>30</small>

</div>