Nghiên cứu mô hình ung thư buồng trứng thực nghiệm và ảnh hưởng của virus vaccin sởi trên ung thư

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.08 MB, 167 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

NGUYỄN THÙY LINH

NGHIÊN CỨU MƠ HÌNH UNG THƯ BUỒNGTRỨNG THỰC NGHIỆM VÀ ẢNH HƯỞNGCỦA VIRUS VACCIN SỞI TRÊN UNG THƯ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2023

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

NGUYỄN THÙY LINH

NGHIÊN CỨU MÔ HÌNH UNG THƯ BUỒNGTRỨNG THỰC NGHIỆM VÀ ẢNH HƯỞNGCỦA VIRUS VACCIN SỞI TRÊN UNG THƯ

Chuyên ngành: Giải phẫu bệnh và pháp y Mã số: 9720101

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Văn Đô

2. PGS.TS. Trần Ngọc Dũng

HÀ NỘI – 2023

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chânthành tới:

Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý đào tạo Sau đại học, Bộ môn Y Giảiphẫu bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trongsuốt quá trình học tập.

Đảng ủy, Ban Giám đốc Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân Y, đãluôn quan tâm, giúp đỡ tơi trong q trình học tập và nghiên cứu.

Bộ môn Khoa Giải phẫu bệnh lý – Pháp y, Bệnh viện Quân y 103; Bộmôn Sinh lý bệnh, Học viện Quân y; Khoa Ngoại Phụ khoa– Bệnh viện K TânTriều, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt q trình lấy số liệu,làm thực nghiệm để hồn thành nghiên cứu.

Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Văn Đô và PGS.TS. Trần Ngọc Dũng – là những người thầy đã tậntình hướng dẫn, dìu dắt tơi trong q trình học tập, nghiên cứu và thực hiệnđề tài. Hai thầy đã luôn hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi vượt qua giai đoạnkhó khăn nhất để hồn thành luận án này.

Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị em, bạn bè, đồngnghiệp và người thân trong gia đình đã luôn chia sẻ, động viên và luôn bêncạnh tôi trong suốt quá trình học nghiên cứu sinh.

Hà Nội, ngày 03 tháng 12 năm 2023

Tác giả luận án

Nguyễn Thuỳ Linh

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Tôi là Nguyễn Thuỳ Linh, nghiên cứu sinh khóa 38 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Giải phẫu bệnh và pháp y, xin cam đoan:

1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Văn Đơ và PGS.TS. Trần Ngọc Dũng.

2. Cơng trình này thuộc đề tài Nhà nước “Nghiên cứu điều trị ung thư buồng trứng bằng liệu pháp vi rút tiêu hủy u (Oncolytic Virotherapy)”. Mã số KC.10.27/16-20, đơn vị chủ trì là Học viện Quân y.

3. Các số liệu và thơng tin trong nghiên cứu là hồn tồn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày 08 tháng 12 năm 2023

Người viết cam đoan

Nguyễn Thuỳ Linh

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 3

1.1. Ung thư buồng trứng ... 3

1.1.1. Dịch tễ ... 3

1.1.2. Cơ chế bệnh sinh ung thư buồng trứng ... 4

1.1.3. Phân loại mô bệnh học ung thư buồng trứng theo WHO 2020 ... 6

1.1.4. Hố mơ miễn dịch trong chẩn đốn ung thư biểu mơ buồng trứng . 7

1.2. Phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư buồng trứng ... 10

1.2.1. Phân lập và nuôi cấy tế bào ... 10

1.2.2. Phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư buồng trứng ... 13

1.3. Mơ hình gây ung thư buồng trứng thực nghiệm ... 17

1.3.1. Các dòng chuột thiếu hụt miễn dịch ... 17

1.3.2. Mơ hình tạo khối u buồng trứng người trên chuột thiếu hụt miễn

dịch ... 19

1.4. Virus vaccin sởi và liệu pháp tiêu huỷ khối u (OLV) của virus vaccin sởi trong điều trị ung thư và ung thư buồng trứng ... 23

1.4.1. Virus vaccin sởi (MeV) và thụ thể của MeV trong liệu pháp tiêu huỷ khối u ... 23

1.4.2. Điều trị ung thư và UTBT bằng virus vaccin sởi ... 25

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 31

2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ... 31

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ... 31

2.1.2. Mẫu bệnh phẩm phân lập tế bào UTBT...

2.1.3. Động vật nghiên cứu ... 31

2.1.4. Các dòng tế bào dùng trong nghiên cứu ... 32

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

2.2. Phương pháp nghiên cứu ... 32

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ... 32

2.2.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu và tiêu chí đánh giá kết quả ... 32

2.3. Tiến hành nghiên cứu và các quy trình được thực hiện trong nghiên cứu. 34 2.3.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm nghiên cứu ... 34

2.3.2. Phân lập tế bào từ mô u và dịch cổ trướng của bệnh nhân ... 35

2.3.3. Gây mô hình ung thư buồng trứng thực nghiệm ... 38

2.3.4. Đánh giá hiệu quả điều trị ung thư buồng trứng trên mô hình thực nghiệm ... 43

2.3.5. Thực hiện quy trình kỹ thuật tế bào học, mơ bệnh học và hố mô miễn dịch ... 44

2.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ... 51

2.5. Phương pháp phân tích kết quả và xử lý số liệu ... 52

2.6. Đạo đức nghiên cứu ... 53

2.7. Sơ đồ nghiên cứu ... 53

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ... 51

3.1. Kết quả gây ung thư buồng trứng thực nghiệm ... 51

3.1.1. điểmĐặc mô bệnh học và HMMD ung thư biểu mô buồng trứng . . . 51

3.1.2. Kết quả phân lập tế bào từ 50 bệnh nhân UTBM buồng trứng ... 57

3.1.3. Kết quả phân lập dòng tế bào M4 từ khối u của bệnh nhân UTBM buồng trứng ... 63

3.1.4. Kết quả gây ung thư buồng trứng thực nghiệm trên chuột nude bằng cấy ghép dòng tế bào OVCAR-3 và M4 ... 68

3.2.Kết quả tác động của virus vaccin sởi trên mơ hình ung thư buồng trứng

thực nghiệm ... 82

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

3.2.2. Tác động của virus vaccin sởi lên tình trạng tại chỗ khối u thứ phát ở 4 nhóm nghiên cứu ... 86

Chương 4: BÀN LUẬN ... 90

4.1. Kết quả gây thư buồng trứng thực nghiệm ... 90 4.1.1. Đặc điểm mô bệnh học và HMMD ung thư biểu mô buồng trứng 90 4.1.2. Phân lập tế bào từ 50 bệnh nhân UTBM buồng trứng ... 95 4.1.3. Phân lập tế bào dòng M4 từ khối u của bệnh nhân UTBM thanh dịch độ cao ... 101 4.1.4. Kết quả tạo khối ung thư buồng trứng trên chuột nude ... 108 4.2.Tác động của virus vaccin sởi trên mơ hình ung thư buồng trứng thực nghiệm ... 121

4.2.1. Tác động của virus vaccin sởi lên tình trạng toàn thân và các cơ quan gan, thận của chuột nude ở 4 nhóm nghiên cứu. ... 121 4.2.2. Tác động của virus vaccin sởi lên tình trạng tại chỗ khối u của chuột nude ở 4 nhóm nghiên cứu ... 123

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Bảng 1.1. Kiểu hình miễn dịch của các typ ung thư biểu mô buồng trứng ... 9

Bảng 1.2. Các dấu ấn dùng để phân biệt ung thư buồng trứng nguyên phát với di căn UTBM tuyến đường tiêu hoá thấp. ... 9

Bảng 1.3. Các dòng tế bào ung thư buồng trứng ... 15

Bảng 1.4. Các thử nghiệm điều trị ung thư bằng virus vaccin sởi trên mơ hình động vật tạo khối ung thư người tại Việt Nam ... 29

Bảng 3.1. Đặc điểm đại thể khối u ... 51

Bảng 3.2. Đặc điểm vi thể UTBM buồng trứng ... 53

Bảng 3.3. Biểu lộ các dấu ấn miễn dịch của UTBM buồng trứng ... 55

Bảng 3.4. Tỷ lệ tế bào sơ cấp bám đáy theo thời gian ... 57

Bảng 3.5. Hình thái tế bào sơ cấp trong môi trường nuôi cấy ... 58

Bảng 3.6. Đếm số lượng tế bào sơ cấp và tỷ lệ tế bào sống chết ... 58

Bảng 3.7. Kết quả biểu hiện thụ thể CD46 của tế bào sơ cấp được phân lập.

59Bảng 3.8. Kết quả phát triển của tế bào sơ cấp trong môi trường nuôi cấy

... 60

Bảng 3.9. Đặc điểm của các mẫu tế bào sơ cấp phát triển tốt ... 61

Bảng 3.10. Tỷ lệ chuột xuất hiện u của nhóm OVCAR-3 và M4 ... 69

Bảng 3.11. Đặc điểm vi thể khối u thứ phát sau cấy ghép dòng tế bào M4 trên chuột nude ... 72

Bảng 3.12. So sánh đặc điểm hình thái tế bào và kiểu hình miễn dịch khối u nguyên phát, dòng tế bào M4 và khối u thứ phát ... 75

Bảng 3.13. Tỷ lệ tế bào biểu lộ thụ thể CD46 trên bề mặt tế bào u ở khối u

nguyênphát, dòng tế bào M4 và tế bào u thứ phát trên chuột nude 76

Bảng 3.14. Kết quả chỉ số công thức máu ở 4 nhóm nghiên cứu ... 83

Bảng 3.15. Kết quả chỉ số sinh hoá máu của 4 nhóm nghiên cứu ... 84

Bảng 3.16. Kết quả mô bệnh học gan, thận của 4 nhóm ... 84

Bảng 3.17. Các đặc điểm trên vi thể khối u thứ phát của 4 nhóm ... 87

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

Biểu đồ 3.1. Tốc độ tăng sinh của dòng tế bào M4 theo thời gian ... 66 Biểu đồ 3.2. Trọng lượng khối u cấy ghép dòng M4 và OVCAR-3 trên

chuột nude. ... 69 Biểu đồ 3.3. Thể tích khối u cấy ghép dòng M4 và OVCAR-3 trên chuột nude. 70Biểu đồ 3.4. Trọng lượng chuột nude cấy ghép dịng M4 và OVCAR-3 nhóm

chứng và nhóm điều trị bằng virus vaccin sởi ... 82 Biểu đồ 3.5. Thể tích khối u cấy ghép dịng M4 và OVCAR-3 trên chuột nude

nhóm chứng và nhóm điều trị bằng virus vaccin sởi ... 86

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Hình 1.1. Cơ chế bệnh sinh của ung thư buồng trứng ... 6

Hình 1.2. Các giai đoạn phát triển của tế bào được nuôi cấy. ... 12

Ảnh 2.1. Cấy ghép dòng tế bào UTBT dưới da sườn lưng chuột nude. ... 40

Ảnh 3.1. Đại thể của ung thư biểu mô buồng trứng ... 52

Ảnh 3.2. Vi thể các typ mô bệnh học UTBM buồng trứng ... 54

Ảnh 3.3. Nhuộm HMMD ung thư biểu mô buồng trứng typ thanh dịch độ cao . 56

Ảnh 3.4. Nhuộm HMMD x 200 với dấu ấn p53 của UTBM buồng trứng 57

Ảnh 3.5. Kết quả tế bào được sơ cấp phân lập từ bệnh nhân trên máy đếm tế

Ảnh 3.9. Ảnh đại thể và vi thể của khối u nguyên phát của bệnh nhân UTBM buồng trứng typ thanh dịch độ cao, mã M4. ... 64

Ảnh 3.10. Sự tăng sinh dòng tế bào M4 phân lập từ bệnh nhân theo thời gian (ngày – N) trên kính hiển vi ánh sáng ngược x 200 ... 66

Ảnh 3.11. Đặc điểm hình thái và kiểu hình miễn dịch của dòng tế bào M4 68

Ảnh 3.12. Tạo mơ hình ung thư buồng trứng người trên chuột nude bằng cấy

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

Ảnh 3.16. Siêu cấu trúc của tế bào u thứ phát cấy ghép dòng tế bào M4 ... 78 Ảnh 3.17. Sự tăng sinh và hình thái tế bào phân lập từ khối u thứ phát theo

thời gian (ngày – N) trên kính hiển vi ánh sáng ngược x 200 ... 79 Ảnh 3.18. Bộ nhiễm sắc thể của tế bào dòng M4 phân lập từ khối ung thư

buồngtrứng typ thanh dịch độ cao của bệnh nhân ... 80 Ảnh 3.19. Bộ nhiễm sắc thể của tế bào phân lập từ khối u thứ phát cấy ghép

dòng M4 trên chuột nude. ... 81 Ảnh 3.20. Vi thể mô gan và thận ... 85 Ảnh 3.21. Vi thể khối u thứ phát cấy ghép dòng OVCAR-3 và M4 ... 88 Ảnh 3.22. Siêu cấu trúc của tế bào u thứ phát cấy ghép dòng M4 khi điều trị

bằng virus vaccin sởi ... 89

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Chữ viết tắtTiếng AnhTiếng Việt

AJCC American Joint Committee on Cancer

Hiệp hội ung thư Hoa kỳ

ATCC American Type Culture

DMSO Dimethyl sulfoxide

Môi trường nuôi cấy

DNA Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic

FIGO International Federation of Gyne-cology and Obstetrics

Liên đoàn quốc tế về phụ

MeV Measles vaccine virus Virus vaccine sởi MeV-CEA Measles vaccine virus producing

carcinoembryonic antigen

Virus vaccine sởi có biến đổi gen tạo ra CEA

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

iode kiềm tuyến giáp

Measles vaccine virus expressing green fluorescent protein

Virus vaccine sởi biến đổi gen biểu hiện protein huỳnh quang màu xanh lá

PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch đệm phosphat RPMI Roswell Park Memorial Institute Môi trường nuôi cấy SATB2 Special AT-rich sequence

bind-ing protein 2

Protein 2 liên kết trình tự gen giàu AT đặc biệt

SCID Severe combined

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2019, tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong do ung thư tăng cao. Ung thư được xếp hàng đầu và hàng thứ hai về nguyên nhân gây tử vong cho người dưới 70 tuổi ở 112 nước trên tổng 183 nước được thống kê.1 Số liệu ghi nhận ung thư toàn cầu (GLOBOCAL) năm 2020, số ca mới mắc và số ca tử vong do ung thư lần lượt là 2.261.419 và 684.996. Trong đó ung thư buồng trứng (UTBT) đứng thứ 20 với số ca mới mắc và tử vong tương ứng là 313.959 và 207.252 (chiếm 1,6% tổng số ca ung thư mới mắc và 2,1% tổng số ca tử vong do ung thư).2 Dự kiến năm 2030 số ca UTBT mới mắc tăng 55% và số ca chết vì UTBT tăng 67%.

Ung thư buồng trứng được cơng nhận là một bệnh có nền tảng phân tử riêng biệt và có cơ chế bệnh sinh phức tạp. Dù đã có những tiến bộ đáng kể trong chẩn đốn và điều trị, nhưng tỷ lệ sống thêm của bệnh UTBT vẫn chưa được cải thiện trong nhiều thập kỷ qua.3 Để tối ưu hố điều trị UTBT thì cần phải hiểu rõ về nguồn gốc tế bào u, cơ chế phát triển của UTBT và sự khác biệt về đặc tính sinh học giữa các loại mơ bệnh học UTBT.4 Các dịng tế bào có nguồn gốc từ khối UTBT đóng vai trị quan trọng trong các nghiên cứu

in vitro về sinh học ung thư; tuy nhiên các mơ hình cấy ghép UTBT trênđộng vật in vivo có thể mang lại những hiểu biết chính xác hơn về đặc điểm

phân tử của các khối u nguyên phát và trở thành nền tảng cho các thử nghiệm tiền lâm sàng.5 Hiện nay, điều trị UTBT mang tính cá thể hố và áp dụng nhiều phương pháp điều trị tiên tiến như liệu pháp điều trị nhắm trúng đích, liệu pháp miễn dịch tế bào và đặc biệt là liệu pháp sử dụng virus gây ly giải tế bào khối u (oncolytic virus, OLV). Tại Việt Nam, liệu pháp OLV sử

dụng vaccine virus sởi để nghiên cứu điều trị ung thư trên in vitro và in vivo

với nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như ung thư gan, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư máu, ung thư đầu mặt cổ, ung thư tiền luyệt tuyến.6-14 Còn đối với UTBT thì hiện chưa có mơ hình cấy ghép dị lồi với dịng tế bào UTBT phân lập từ bệnh nhân

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

(ex vivo) được công bố cũng như chưa có nghiên cứu nào đánh giá tác động

của virus vaccin sởi trên mơ hình thực nghiệm đó. Do vậy tạo mơ hình UTBT

ex vivo cho từng bệnh nhân là cơ sở quan trọng để thử nghiệm liệu pháp OLV

của virus vaccine sởi trên ung thư và là sự cần thiết nhằm cá thể hố trong điều trị UTBT.

Vì vậy chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên cứu mơ hình ung thưbuồng trứng thực nghiệm và ảnh hưởng của virus vaccin sởi trên ung thư”

với hai mục tiêu sau:

1. Đánh giá kết quả gây ung thư buồng trứng thực nghiệm.

2. Bước đầu đánh giá tác động của virus vaccin sởi trên mơ hình ungthư buồng trứng thực nghiệm.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1. Ung thư buồng trứng

1.1.1. Dịch tễ

Thuật ngữ UTBT không phải chỉ dùng cho một loại ung thư đơn lẻ mà nó dùng chung cho sự đa dạng các loại ung thư ảnh hưởng đến buồng trứng, vòi trứng và khoang ổ bụng. Ước tính có khoảng hơn 30 loại UTBT khác nhau, mỗi loại UTBT cũng có nhiều biến thể khác nhau và mỗi bệnh nhân được chẩn đốn UTBT cũng có hình thái khác nhau.15

Theo số liệu của Ghi nhận ung thư toàn cầu (GLOBOCAL) năm 2018, UTBT chỉ chiếm 2,5% trong tổng số các ca ung thư ở phụ nữ nhưng chiếm 5% nguyên nhân tử vong do ung thư ở nữ giới vì tỷ lệ sống thêm của bệnh nhân UTBT rất thấp. Nguyên nhân lớn nhất được ghi nhận là do có 4/5 bệnh nhân UTBT khi được chẩn đốn đã ở giai đoạn tiến triển với sự xâm lấn lan tràn của khối u trong ổ bụng. Nếu bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn sớm (khối u phát triển tại chỗ trong buồng trứng) thì 90% sống thêm sau 5 năm, ngược lại nếu ở giai đoạn tiến triển thì tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ là 29%.16

Tuy tỷ lệ sống sau 5 năm của bệnh nhân UTBM buồng trứng ở giai đoạn đầu rất cao, nhưng với bệnh nhân UTBM buồng trứng giai đoạn tiến triển thì đáp ứng điều trị với liệu pháp dựa trên Taxan và Platinum còn hạn chế. Hơn nữa, do thiếu các cơng cụ chẩn đốn và tiên lượng hiệu quả làm cho UTBT trở nên khó quản lý và hầu hết bệnh nhân đều kháng hóa trị và tái phát.17,18

Có sự khác biệt về tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết do UTBT giữa các nước kém phát triển và các nước phát triển. Trong khi ở các nước phát triển tỷ lệ mắc UTBT và tỷ lệ chết do UTBT trên 100.000 dân là 9,2 và 5,0 thì ở các nước kém phát triển hai tỷ lệ này tương ứng là 5,0 và 3,1. Riêng ở Mỹ năm 2018, có

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

khoảng 22.240 bệnh nhân mới được chẩn đoán UTBT và 14.070 ca UTBT tử vong.16

1.1.2. Cơ chế bệnh sinh UTBT

Trong nhiều năm qua, ung thư biểu mô (UTBM) buồng trứng được cho là phát sinh chủ yếu từ biểu mô bề mặt buồng trứng. Tuy nhiên, hai giả thuyết mới về cơ chế bệnh sinh của ung thư biểu mô thanh dịch độ cao của buồng trứng đã được đề xuất. Trong cơ chế đầu tiên, sự đột biến gen xảy ra trong tế bào biểu mô bề mặt buồng trứng bình thường hoặc các u nang dẫn đến hình thành khối UTBM thanh dịch độ cao trực tiếp mà không qua bước trung gian hoặc thông qua con đường hình thành khối u độ thấp bao gồm một số bước

lành tính và khơng xâm lấn (Hình 1.1). Giả thuyết đầu tiên này được đưa ra

vào những năm 1970 và đề xuất rằng các tế bào biểu mô bề mặt buồng trứng phải trải qua những tác động được lặp đi lặp lại qua nhiều đợt rụng trứng, dẫn đến viêm, tổn thương DNA và bắt đầu hình thành khối u. Giả thuyết này một phần được hỗ trợ bởi bằng chứng về việc giảm nguy cơ UTBT khi sử dụng thuốc tránh thai, ức chế sự rụng trứng hoàn toàn. Các bằng chứng khác cũng ủng hộ mối tương quan giữa số chu kỳ rụng trứng trong toàn bộ thời gian sống với sự gia tăng tỷ lệ mắc UTBT. Tương tự như vậy, UTBT hiếm gặp ở các lồi linh trưởng khác có chu kỳ rụng trứng ít hơn con người. Trên thực tế, Godwin và cộng sự là những nhà nghiên cứu đầu tiên thiết lập một thử nghiệm về biểu mô bề mặt buồng trứng chuột và người trong đó sử dụng mơ hình rụng trứng khơng ngừng trong ống nghiệm như một cơ chế biến đổi và tạo khối u. Sự bất hoạt của p53 và Rb1 trong tế bào bề mặt buồng trứng chuột cũng dẫn đến sự biến đổi và hình thành khối u.19

Giả thuyết thứ hai, đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học trong thập kỷ qua, là mơ tả một mơ hình tiến triển của UTBT từ các tổn thương tiền ung thư phát triển trong buồng trứng từ ung thư thanh dịch nội biểu mô ống dẫn

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

trứng, sau đó di căn đến buồng trứng. Do tính chất tăng sinh tích cực của các khối ung thư thanh dịch độ cao và sự hiện diện sớm của sự bất ổn định về bộ gen, người ta giả thuyết rằng các khối ung thư thanh dịch độ cao của buồng

trứng là các tổn thương di căn từ các tế bào biểu mơ của ống dẫn trứng (Hình1.1). Để giảm nguy cơ UTBM thanh dịch buồng trứng độ cao ở phụ nữ mang

đột biến BRCA1/2 là phẫu thuật cắt bỏ vòi trứng hai bên thay vì chỉ cắt bỏ vịi trứng với buồng trứng cùng bên. Giảm nguy cơ chính đối với UTBT typ thanh dịch sau phẫu thuật cắt bỏ vòi trứng được nhắc đến trong nhiều nghiên cứu. Những nghiên cứu này không chỉ cho thấy nguồn gốc từ ống dẫn trứng đối với các khối u thanh dịch mà còn khuyến cáo việc áp dụng phương pháp cắt bỏ vòi trứng như là biện pháp điều trị dự phịng cho những bệnh nhân có nguy cơ cao, từ đó đã thơi thúc các nhà nghiên cứu và nhà giải phẫu bệnh khơng ngừng tìm kiếm và nghiên cứu về UTBT sớm hoặc các tổn thương tiền u. Các lát cắt vi thể biểu mô ống dẫn trứng sau khi cắt bỏ vịi trứng từ những bệnh nhân có khuynh hướng bị UTBT thấy có các tổn thương với sự thay đổi BRCA1/2 và TP53 giống với khối u thanh dịch độ cao. Để theo dõi, đánh giá rộng rãi cả ống dẫn trứng và bề mặt buồng trứng từ bệnh nhân đột biến BRCA cũng cho thấy các tổn thương tiền u thường gặp ở bóng loa vịi chứ không phải bề mặt buồng trứng. Trong các mô hình di truyền trên chuột, sự bất hoạt có điều kiện của các gen UTBT thường bị đột biến (BRCA1, TP53 và RB1) trong các tế bào biểu mô bề mặt buồng trứng dẫn đến sự hình thành các u bạch huyết chứ không phải UTBM thanh dịch độ cao sau khi được cấy vào bao cơ của chuột. Cùng với sự thay đổi gen, các tổn thương ở ống dẫn trứng từ bệnh nhân BRCA cho thấy kiểu biểu lộ gen như ung thư thanh dịch độ cao. Ngược lại với các tế bào biểu mô bề mặt buồng trứng, sự bất hoạt biểu lộ các gen BRCA1/2, TP53 hoặc Pten, trong khi PAX8 biểu lộ ở các tế bào tiết của ống dẫn trứng chuột dẫn đến sự phát triển của UTBM thanh dịch độ cao. Các thay đổi bộ gen khác thường gặp

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

trong bệnh UTBM thanh dịch độ cao như khuếch đại gen CCNE1 và các thay đổi số lượng bản sao khác cũng được tìm thấy trong các tổn thương ung thư thanh dịch nội biểu mô ống dẫn trứng và có thể là một bước đầu trong sự tiến triển của UTBM buồng trứng thanh dịch độ cao.19

Hình 1.1. Cơ chế bệnh sinh của UTBT.19

1.1.3. Phân loại mô bệnh học UTBT theo WHO 2020

Ấn bản thứ 5 của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) về phân loại các khối u sinh dục nữ được xuất bản vào năm 2020. Mặc dù việc phân loại các khối u buồng trứng và ống dẫn trứng phần lớn không thay đổi so với ấn bản lần thứ 4 xuất bản năm 2014 nhưng trong bảng phân loại mới tổng hợp những điểm quan trọng nhất và những thay đổi trong phân loại của các khối u thanh dịch, khối u không phải thanh dịch và các khối u mô đệm dây sinh dục. Điểm mới quan trọng nhất của ấn bản thứ năm của WHO về phân loại khối u bộ phận sinh dục nữ liên quan đến việc tích hợp các tiêu chuẩn chẩn đốn hiện đại với các thuật toán phân tử miễn dịch để có định nghĩa tốt hơn và khả năng phân tích chẩn đốn cao hơn các typ mơ bệnh học chính của UTBT.20

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Các nghiên cứu gần đây đã mang lại những hiểu biết sâu sắc hơn về bệnh sinh, sự thay đổi phân tử, các vị trí khác nhau về nguồn gốc của UTBT, mở ra cơ hội cho phương pháp điều trị được cá nhân hóa hơn và các phương pháp điều trị nhắm mục tiêu.21-23 Đặc biệt, các nghiên cứu đặc điểm phân tử quy mô lớn đã cải thiện khả năng hiểu biết về bộ gen UTBM buồng trứng, xác định những thay đổi trong từng loại mô bệnh học. Dù có những tiến bộ đạt được trong bệnh học phân tử đến điều trị UTBT, ấn bản thứ năm của phân loại khối u sinh dục nữ của WHO vẫn duy trì hầu hết các chẩn đốn của ấn bản trước, làm phong phú thêm với những phân loại mơ bệnh học mới, dữ liệu hóa mơ miễn dịch và phân tử. Theo phân loại mới nhất của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2020, ít nhất năm loại UTBM buồng trứng chính được xác định dựa trên mô bệnh học, kiểu hình miễn dịch và phân tích phân tử đó là UTBM thanh dịch độ cao (70%), UTBM dạng nội mạc tử cung (10%), UTBM tế bào sáng (6–10%), UTBM thanh dịch độ thấp (5%) và UTBM tuyến nhày (3– 4%).20,24 Một số thực thể hiếm gặp đã được đưa vào (ví dụ: UTBM dạng trung thận và UTBM hỗn hợp), trong khi những thực thể khác đã bị loại bỏ (ví dụ: UTBM nhày thanh dịch).

1.1.4. Hố mơ miễn dịch trong chẩn đốn UTBM buồng trứng

Mơ bệnh học UBTM buồng trứng rất đa dạng và phong phú, trong nhiều trường hợp rất khó phân định typ mơ bệnh học UTBT trên tiêu bản nhuộm H.E vì chúng có nhiều cấu trúc tế bào và mơ học giống nhau. Hóa mơ miễn dịch có giá trị trong những trường hợp khối u có sự chồng chéo về kiểu hình miễn dịch và các dấu hiệu trên mô bệnh học không đặc hiệu. Hơn nữa, ngoài các khối u ở buồng trứng rất cần chẩn đoán phân biệt với ung thứ từ nơi khác di căn đến. Do đó HMMD có vai trị hỗ trợ định typ mô bệnh học và xác định nguồn gốc khối

u. 25

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

Các nghiên cứu gần đây đã khảo sát giá trị của kháng thể kháng cytoke-ratin trong việc phân biệt giữa UTBM buồng trứng nguyên phát và UTBM di căn, đặc biệt là có nguồn gốc từ đại trực tràng. Trong UTBM tuyến nguyên phát của buồng trứng gồm UTBM tuyến nhày và tuyến dạng nội mạc tử cung thường có CK7(+), CK20 thường là âm tính, trong khi UTBM tuyến trực tràng nói chung thường có CK7(-)/CK20(+). Tuy nhiên, cần thận trọng vì đơi khi UTBM tuyến trực tràng có CK7 dương tính và một số UTBM tuyến buồng trứng nguyên phát, đặc biệt là loại UTBM tuyến nhày âm tính với CK7. Khi sử dụng các kháng thể kháng CK để hỗ trợ phân biệt giữa UTBM tuyến ngun phát và thứ phát, ln phải có mối tương quan chặt chẽ với các đặc điểm hình thái. Giá trị của kháng thể kháng cytokeratin có thể tăng lên khi được sử dụng như là một phần trong bảng các dấu ấn chẩn đoán, bao gồm các kháng thể đối với giúp chẩn đoán nguồn gốc đường tiêu hoá như CDX2, SATB2, CEA và các kháng thể giúp chẩn đoán nguồn gốc buồng trứng, phần phụ như CA125, PAX8, ER, PR.26

Các phân typ mô bệnh học UTBM buồng trứng khác nhau có kiểu hình

miễn dịch khác nhau, được tóm tắt trong Bảng 1.1.27,28 HMMD gợi ý sự phân

biệt giữa UTBM nguyên phát buồng trứng và khối u di căn buồng trứng có

nguồn gốc từ đường tiêu hố thấp được thể hiện ở Bảng 1.2.29

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

Bảng 1.1. Kiểu hình miễn dịch của các typ UTBM buồng trứng.

-Bảng 1.2. Các dấu ấn dùng để phân biệt UTBT nguyên phát với di căn UTBM tuyến đường tiêu hoá thấp.

Dấu ấnUTBM tuyến

UTBM tuyến đườngtiêu hoá thấp di căn

buồng trứng

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

1.2. Phân lập và nuôi cấy tế bào UTBT

1.2.1. Phân lập và nuôi cấy tế bào

1.2.1.1. Khái niệm

- Phân lập tế bào là quá trình được thiết lập để tạo ra dòng tế bào bằng cách đưa các tế bào khỏi cơ thể động vật hoặc thực vật vào môi trường nhân tạo với đầy đủ các yếu tố thuận lợi cho sự tăng trưởng của tế bào. Các tế bào được lấy ra trực tiếp từ mô sau đó được phân tách bằng các phương tiện cơ học hoặc enzym trước khi ni cấy. Q trình này bao gồm phân tách tế bào từ mô hoặc dịch cơ thể, nuôi cấy, tăng sinh và cấy chuyển, thu hoạch và bảo quản mẫu tế bào.30

- Nuôi cấy tế bào là một phần của quá trình phân lập tế bào trong đó các tế bào được phát triển trong các điều kiện được kiểm soát, thường là bên ngồi mơi trường tự nhiên của chúng. Ni cấy tế bào cịn gồm q trình đưa các dịng tế bào có sẵn vào mơi trường ni cấy.

- Tế bào sơ cấp: Là tế bào trong giai đoạn đầu của quá trình phân lập sau khi các tế bào được phân tách khỏi mô và được nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp cho đến khi chúng chiếm hết chất nền sẵn có. Khi đó, các tế bào được tách ra và chuyển chúng sang một đĩa/chai nuôi cấy mới với môi trường nuôi cấy mới để cung cấp thêm không gian cho tế bào tiếp tục tăng trưởng.30

- Dòng tế bào: Các tế bào sơ cấp thường có đời sống ngắn trong mơi trường ni cấy, nhưng khi trải qua một số lần cấy chuyển, các tế bào có khả năng sinh trưởng cao nhất sẽ chiếm ưu thế tạo thành dòng tế bào. Dòng tế bào có thời gian sống dài và có độ đồng nhất về kiểu gen cũng như kiểu hình trong quần thể.30

- Chủng tế bào: Nếu một quần thể con của một dịng tế bào được chọn lọc tích cực từ q trình ni cấy bằng cách nhân bản hoặc bằng một số phương pháp khác, dòng tế bào này sẽ trở thành một chủng tế bào. Một chủng tế bào

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

thường được nhận những thay đổi di truyền bổ sung từ dòng tế bào gốc ban đầu.30

1.2.1.2. Các giai đoạn phát triển của tế bào được phân lập, nuôi cấy

Các dòng tế bào đã phân lập thuộc loại đơn lớp hoặc loại tế bào nổi. Các tế bào trong quá trình ni cấy có thời gian nhân đơi duy nhất được xác định bởi chu kỳ tế bào và các yếu tố sinh lý khác. Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều trải qua các giai đoạn phát triển khác nhau, bao gồm pha chậm, pha tăng trưởng, pha duy trì, pha thối triển. Pha tăng trưởng với sự gia tăng số lượng tế bào theo cấp số nhân sẽ cung cấp cho chúng ta những tế bào khỏe mạnh nhất và vật liệu tế bào tốt nhất cho nhiều nghiên cứu về tế bào.31

Điều quan trọng là phải ghi lại các đặc điểm tăng trưởng của dòng tế bào được sử dụng trước khi bắt đầu bất kỳ thí nghiệm nào. Một sự thay đổi trong sự phát triển của tế bào có thể chỉ ra một vấn đề nghiêm trọng trong dòng tế bào và nếu chúng không được phát hiện sẽ dẫn đến những tác động bất lợi cho kết quả thí nghiệm.

Một đường cong tăng trưởng điển hình cho các tế bào được ni cấy hiển thị một mơ hình tăng sinh của tế bào theo thời gian. Các pha tăng trưởng liên quan đến các tế bào bình thường được xác định gồm:

1. Pha chậm là giai đoạn các tế bào không phân chia. Trong giai đoạn này các tế bào thích nghi với các điều kiện nuôi cấy và độ dài của giai đoạn này sẽ phụ thuộc vào pha tăng trưởng của dòng tế bào tại thời điểm cấy chuyển và cả mật độ khi nuôi cấy.

2. Pha tăng trưởng là giai đoạn các tế bào tăng sinh tích cực và tăng số lượng tế bào theo cấp số nhân. Quần thể tế bào được coi là phát triển tốt nhất ở giai đoạn này; do đó, nên đánh giá chức năng tế bào ở pha này. Mỗi dòng tế bào sẽ thể hiện động học tăng sinh tế bào khác nhau trong pha tăng trưởng và do đó nó là giai đoạn tối ưu để xác định thời gian nhân đôi của quần thể. Tế bào

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

cũng thường được tách ra và chuyển sang đĩa nuôi cấy mới vào giai đoạn muộn của pha tăng trưởng. Nếu cấy chuyển tế bào quá muộn có thể dẫn đến quá đông tế bào trong một môi trường chật hẹp và nghèo dinh dưỡng do đó các tế bào có thể bị chết và giảm sức sống cho lần cấy chuyển tiếp theo.

3. Pha cân bằng hoặc pha tĩnh là giai đoạn sự tăng sinh tế bào bị chậm lại do tế bào trở nên hợp lưu. Ở giai đoạn này, số lượng tế bào trong chu trình hoạt động giảm xuống 0-10% và các tế bào cũng dễ bị tổn thương nhất.

4. Pha thoái triển là giai đoạn tế bào chết chiếm ưu thế. Trong giai đoạn này có sự giảm đáng kể số lượng tế bào sống sót. Tế bào chết khơng phải do giảm chất dinh dưỡng mà là do tiến trình tự nhiên của chu kỳ tế bào.

Hình 1.2. Các giai đoạn phát triển của tế bào được nuôi cấy.32

1.2.1.3. Các dạng phát triển của tế bào được phân lập, nuôi cấy

Về phương thức sinh trưởng, ni cấy tế bào có hai dạng, phát triển ở dạng huyền phù (dưới dạng tế bào đơn lẻ hoặc cục nhỏ nổi tự do trong môi trường nuôi cấy) hoặc dạng đơn lớp bám vào đáy bình ni cấy. Hình thức sinh trưởng được thực hiện bởi một dịng tế bào phản ánh nguồn gốc mơ mà tế bào được lấy ra ni cấy. Ví dụ, các dịng tế bào có nguồn gốc từ máu (bệnh bạch

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

cầu, ung thư hạch) có xu hướng phát triển ở dạng huyền phù trong khi các tế bào có nguồn gốc từ mơ đặc (phổi, thận) có xu hướng phát triển dưới dạng đơn lớp.

1.2.1.4. Đặc điểm hình thái của tế bào phân lập, ni cấy

Các tế bào ni cấy có các dạng hình thái khác nhau được phân ra dựa vào kiểu hình và hình dáng tế bào, thường có ba dạng chính sau đây.30

- Dạng biểu mơ: Dịng tế bào có hình đa diện, với kích thước khá đồng dạng, loại này thường phát triển bám đáy.

- Dạng nguyên bào sợi: Thường là những tế bào dài, lưỡng cực hoặc đa cực, thường phát triển bám đáy.

- Dạng nguyên bào lympho: Tế bào dạng hình cầu và thường phát triển dạng huyền phù hay dạng tế bào nổi.

- Ngồi ra cịn một số kiểu hình thái khác như dạng tế bào nội mơ, dạng tế bào thần kinh đều thuộc nhóm tế bào bám đáy.

Các dịng tế bào có thể được phân loại là dạng nội mô như BAE-1, dạng biểu mô như HeLa, dạng tế bào thần kinh như SH-SY5Y, hoặc dạng nguyên bào sợi như MRC-5 và hình thái của chúng phản ánh nguồn gốc tế bào trong cơ thể.

1.2.2. Phân lập và nuôi cấy tế bào UTBT

Phân lập tế bào UTBT từ khối u nguyên phát của bệnh nhân hay từ dịch cổ trướng và khối u buồng trứng di căn đã được tiến hành từ rất sớm, tạo ra nhiều dịng tế bào khác nhau có nguồn gốc từ các typ mô bệnh học khác nhau như typ thanh dịch độ cao, typ tuyến nhày, typ tế bào sáng, typ dạng nội mạc tử cung. Các dòng tế bào UTBT được phân lập thành công được sử dụng để nghiên cứu in vitro về những bất thường liên quan đến kiểu hình ác tính, cơ chế phát triển của ung thư và thử nghiệm thuốc. Tuy nhiên phân lập tế bào và các

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

thử nghiệm trong ống nghiệm trên các dịng tế bào UTBT cũng gặp khơng ít khó khăn bởi sự khơng đồng nhất của quần thể tế bào u.3,33-41

Từ những năm 1984, Auersperg và cộng sự khi phân lập tế bào biểu mô bề mặt buồng trứng ở người sử dụng phương pháp cơ học để tách tế bào biểu mô bề mặt khỏi mô buồng trứng.42 Đến năm 2002 Langdon và Lawrie đã viết rõ quy trình phân lập tế bào UTBT trong đó cũng nói rõ cách thức phân tách tế bào từ mẫu mơ u bằng sử dụng các dao mổ có mũi vát rất dễ dàng cắt nhỏ mô u và nếu số lượng các cụm tế bào nhỏ được tạo ra đủ thì đủ để tạo ra một dịng tế bào.43 Sau này các nghiên cứu phân lập thành công các dòng tế bào UTBT từ khối u đặc của bệnh nhân với các typ mô bệnh học khác nhau đã đề cập đến phương pháp sử dụng enztm tiêu huỷ protrin để phân tách các tế bào u trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Trong nghiên cứu của Thanasak Sueblinvong năm 2012 đã đưa ra một phương pháp đơn giản, nhanh chóng và có thể lặp lại để phân lập và xác định đặc điểm của tế bào UTBT từ khối u đặc. Kết quả cho thấy việc phân tách tế bào ung thư bằng enzym trong 30 phút với dispase II thu được tế bào UTBM buồng trứng sống cao nhất, với năng suất đáng kể và khơng có ngun bào sợi. Chúng phát triển lên đến sáu giai đoạn cấy chuyển và duy trì khả năng hình thành các cấu trúc giống như hình cầu trong agarose. Ngồi ra, chúng có thể được sử dụng để nghiên cứu về mặt di truyền và để sàng lọc thuốc. Đáng chú ý, việc phân lập tế bào UTBT từ bệnh phẩm u đặc bằng phương pháp enzym có ưu điểm là cho phép phân lập tế bào ung thư từ giai đoạn đầu của UTBT cũng như lấy tế bào từ các vị trí UTBT nguyên phát và / hoặc khối u di căn.44 Tuỳ vào điều kiện các phịng ni cấy tế bào mà lựa chọn phương pháp tách mẫu tế bào từ khối u đặc cho phù hợp.

Hiện nay, một số lượng lớn các dòng tế bào UTBT được phân lập và sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu khác nhau về UTBT, được tổng hợp theo

Bảng 1.3. Các dòng tế bào này được phân lập từ ba nguồn chính là khối u đặc

nguyên phát, dịch cổ trướng và khối UTBT di căn. Nhiều dịng tế bào trong đó được phân lập trong các giai đoạn bệnh và giai đoạn điều trị khác nhau, typ mô

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

bệnh học khác nhau và có thể cá thể hố cho các tình huống cụ thể của người bệnh. Các dòng tế bào thương mại được bảo quản và lấy ra nuôi cấy nhằm tạo ra số lượng lớn tế bào UTBT dùng cho các thử nghiệm khác nhau.43

1 PE01 vàPE04 UTBM thanhdịch độ cao Dịch cổtrướng Hoá chất Wolf vàcs/1987 2 PE06 vàPE016 UTBM thanhdịch độ cao Dịch cổtrướng Hoá chấtvà xạ trị và cs/1988Langdon

4 PEA2 UTBM tuyếnkém biệt hoá Dịch cổtrướng Hoá chất và cs/1988Langdon

6 PE023 UTBM thanhdịch độ thấp Dịch cổtrướng Hoá chất và cs/1988Langdon

10 OVCAR-3 UTBM thanhdịch độ cao Dịch cổtrướng Hoá chất và cs/1983Hamilton

11 OVCAR-4 vàOVCAR-5 UTBM tuyến Dịch cổtrướng và khơngHố chất

trướng Hố chất Hills vàcs/1989

13 41M UTBM tuyến Dịch cổtrướng điều trịKhông Wilson vàcs/1996

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

21 HTOA và UTBM thanhdịch độ thấp U nguyênphát Không Ishiwata vàcs/1987

23 DO-s UTBM thanhdịch độ thấp Dịch cổtrướng - Briersb vàcs/1989

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

1.3. Mơ hình gây UTBT thực nghiệm

1.3.1. Các dịng chuột thiếu hụt miễn dịch

Bước đột phá tiếp theo trong lĩnh vực tạo mơ hình chuột thực nghiệm là

phát hiện một đột biến tự phát ở chuột chủng C.B17 gọi là “scid” (Prkdcscid,

protein kinase DNA activated catalytic polypeptide). Đột biến scid chủ yếu

ngăn chặn sự phát triển trưởng thành của tế bào lympho T và lympho B của hệ thống miễn dịch đặc hiệu. Một số tác giả đã lai tạo chuột có đột biến scid với một số chủng nền, bao gồm cả chủng NOD/Lt. Chủng NOD có khiếm khuyết miễn dịch bẩm sinh, bao gồm giảm hoạt động của các tế bào diệt tự nhiên, giảm mức độ kích hoạt các đại thực bào, sự bất thường trong phát triển và chức năng của tế bào đuôi gai, và sự thiếu vắng của bổ thể. Kết hợp các khiếm khuyết miễn dịch bẩm sinh với việc cắt bỏ đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

bằng cách sử dụng các đột biến Prkdcscid, Rag1null, hoặc Rag2null sẽ được tạo ra

một chủng chuột thiếu hoàn toàn đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và thiếu trầm trọng miễn dịch bẩm sinh. Sự đột biến này gây suy giảm nghiêm trọng quá trình phát triển và chức năng của tế bào lympho T và B, ngừng quá trình phát triển tế bào NK. Dòng chuột này cũng được sử dụng để ghép các dòng tế bào người với khả năng tránh thải ghép, tiếp nhận nhiều hơn các tế bào tạo máu và

các tế bào khối u chính của người. Dòng chuột lai NOD/Scid được tạo bởi laigiữa hai dòng chuột NOD (gây đái tháo đường) và dòng Scid. Tuy nhiên

chuột này không bị đái tháo đường, khả năng hoạt động của tế bào NK thấp. Chuột có khả năng tiếp nhận các tế bào gốc tạo máu và thường để phục vụ các

nghiên cứu về HIV. Khi so sánh trực tiếp với chuột C.B17-scid, chuột NOD-scid tăng khả năng hỗ trợ cấy ghép với những khối u thể đặc của người cũng

như với u lympho và bệnh bạch cầu. Tuy nhiên, nhiều loại tế bào ung thư và các loại u tạo máu ác tính của người vẫn ghép dị loài thất bại ở chuột

NOD-scid, phần lớn là do tế

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

bào giết tự nhiên vẫn còn hoạt động và chức năng miễn dịch bẩm sinh cịn sót lại.45

Dịng chuột Rag được tạo bởi sự thiếu hụt gen Rag-1 hoặc Rag-2 có vaitrị kích hoạt tái tổ hợp gen. Gen Rag bị bất hoạt dẫn đến mất khả năng biệt

hóa của dịng tế bào lympho T và B. Dòng chuột Rag được áp dụng trong nghiên cứu chức năng các gen của q trình biệt hóa lympho T và B, cũng như nghiên cứu về HIV/AIDS. Và dịng chuột này cũng có thể áp dụng để thay thế chuột nude hoặc Scid.45

Chuột nude khơng có lơng từ khi sinh ra cho đến suốt cuộc đời và hồn tồn khơng có tuyến ức và do đó chúng bị thiếu dịng tế bào lympho T.46

Sự phát triển lông bất thường ở chuột nude đã được Eaton (1976) mô tả. Sự vắng mặt của tuyến ức là do tuyến ức phát sinh từ biểu bì của túi hầu thứ ba khơng phát triển. Do khơng có chức năng miễn dịch phụ thuộc vào tuyến ức, những con chuột nude đã được sử dụng làm động vật cấy ghép khối u ở người. Thiếu tuyến ức ở chuột dẫn đến nhiều khiếm khuyết trong hệ thống miễn dịch, bao gồm sự suy giảm tế bào lympho ở các khu vực phụ thuộc vào tuyến ức như các hạch bạch huyết và lá lách, giảm đáng kể một quần thể tế bào lympho bao gồm gần như toàn bộ các tế bào lympho B, đáp ứng bình thường IgM liên quan đến các kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức, phản ứng rất kém với các kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức, bao gồm cả việc không thải ghép da, khối u dị sinh và ngoại sinh và tăng nguy cơ nhiễm trùng.47-49

Các nghiên cứu ban đầu cho thấy chuột nude rất hữu ích cho việc cấy ghép trực tiếp các khối u đặc của người. Hình thái và chức năng, các đặc điểm của khối u vẫn được duy trì trong quá trình cấy ghép nối tiếp.50 So với những

con chuột nude khác hoặc chuột thiếu hụt miễn dịch, BALB/c-nu có tỷ lệ phát

triển tương đối cao khi ghép khối u.51 Lựa chọn dòng chuột nhắt BALB/c

(chủng

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

chuột có đột biến Foxn1), để tạo mơ hình chuột mang khối ung thư người với

các ưu điểm:

(1) Hệ miễn dịch của chuột chỉ bị thiếu hụt dòng tế bào lympho T, ngồi ra các dịng tế bào khác vẫn còn như các bạch cầu hạt, tế bào NK. Với đặc điểm này, chuột vừa có thể bảo đảm ghép thành công khối ung thư người, đồng thời có khả năng chịu đựng nhất định với việc vận chuyển xa và mơi trường khí hậu mới tại Việt Nam.

(2) Chuột BALB/c có chi phí vừa phải, giá thành bằng 1/3-1/2 so với các dòng chuột khác.

1.3.2. Mơ hình tạo khối u buồng trứng người trên chuột thiếu hụt miễn dịch

Các mơ hình thực nghiệm về bệnh có tầm quan trọng không chỉ để hiểu các yếu tố sinh học và di truyền ảnh hưởng đến các đặc điểm kiểu hình của bệnh mà còn được sử dụng làm cơ sở để xây dựng các chiến lược can thiệp hợp lý. Các dòng tế bào UTBT có nguồn gốc từ dịch cổ trướng hoặc khối u buồng trứng nguyên phát đã được sử dụng rộng rãi và có thể rất hiệu quả để nghiên cứu các quy trình kiểm sốt điều hịa tăng trưởng và hóa trị. Các mơ hình động vật giúp chúng ta hiểu biết thêm về bệnh nguyên, bệnh sinh của UTBT. Một số mơ hình động vật phát triển khối u buồng trứng một cách tự nhiên và một số mơ hình khác kiểm sốt các yếu tố sinh sản khác nhau hoặc tiếp xúc với chất độc môi trường đã được chứng minh là thúc đẩy sự hình thành khối u buồng trứng. Gần đây, các nghiên cứu về promoter thúc đẩy sự biểu lộ gen trong tế bào biểu mô bề mặt buồng trứng đang mang lại cơ hội mới cho việc tạo ra các mơ hình chuột biến đổi gen UTBT.52

Cấy ghép dị lồi các tế bào biểu mô bề mặt buồng trứng được biến đổi trong ống nghiệm đã được nhiều nhà khoa học quan tâm. Các tế bào biểu mô này được coi là tế bào nguồn gốc của phần lớn các bệnh UTBT chủ yếu dựa trên các phân tích mơ học và hóa mơ miễn dịch của các mẫu lấy từ bệnh nhân.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Một số mơ hình thử nghiệm gần đây với việc sử dụng các tế bào này trong ống nghiệm đã cung cấp thêm những thơng tin hỗ trợ cho ý tưởng đó. Ni cấy tế bào sơ cấp của tế bào biểu mô bề mặt buồng trứng ở người được Auersperg và cộng sự lần đầu tiên báo cáo vào năm 1984 và nhóm nghiên cứu

kể từ đó đã phát triển một số mơ hình in vitro về chất sinh UTBM buồng

trứng. Việc đưa virus sarcoma ở chuột Kirsten vào tế bào biểu mô bề mặt buồng trứng của chuột có thể tạo ra các khối u dạng nội mạc tử cung sau khi tiêm dưới da hoặc trong phúc mạc của chuột bị ức chế miễn dịch.42,52

Sự phức tạp và không đồng nhất của UTBT rất khó tái tạo trong các nghiên cứu trong ống nghiệm, điều này không thể làm sáng tỏ đầy đủ các sự kiện phân tử liên quan đến sự hình thành khối u và sự di căn của bệnh. Mặc dù nhiều thể mô bệnh học của UTBT đang được điều trị bằng các liệu pháp và phẫu thuật tương tự nhau, nhưng trên thực tế, chúng được đặc trưng bởi các kiểu hình riêng biệt, tế bào có nguồn gốc từ những thay đổi cơ bản về gen và hệ gen. Do đó, sự phát triển của các phương pháp điều trị được cá thể hóa nhằm cải thiện việc chăm sóc và tiên lượng bệnh nhân, sẽ mang lại rất nhiều lợi ích khi hiểu rõ hơn về sự khác biệt giữa các dưới nhóm bệnh khác nhau. Để thực hiện điều này, các mơ hình động vật của tất cả các phân typ UTBM

buồng trứng cần được tạo để cung cấp nền tảng in vivo chính xác cho nghiên

cứu và thử nghiệm các phương pháp điều trị đích và liệu pháp miễn dịch. Cả mơ hình chuột được biến đổi gen và mơ hình ghép dị lồi đều có khả năng nâng cao hiểu biết của chúng ta về các cơ chế chính sinh ung thư, đồng thời cung cấp cái nhìn sâu sắc về các phương thức điều trị. Trong khi các mơ hình di truyền có thể phù hợp hơn để kiểm tra các chức năng và tương tác gây ung thư trong quá trình hình thành khối u, các phương pháp ghép dị loài lấy từ bệnh nhân có thể là một mơ hình ưu việt để đánh giá hiệu quả của thuốc, đặc biệt là trong các thử nghiệm lâm sàng đồng thời, do chúng tương tự với các khối u ban đầu.

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

Mặc dù các mơ hình này cho phép đánh giá các ung thư mà sự kích hoạt của chúng có thể góp phần vào sự phát triển của UTBM buồng trứng, nhưng phương pháp này khơng cho phép tìm hiểu các sự kiện ban đầu trong việc hình thành khối u ở chuột khi các khối u phát sinh tại chỗ. Tuy nhiên,

việc thiết lập các mơ hình in vitro của các tế bào biểu mơ bề mặt buồng trứng

bình thường và đã được biến đổi, đồng thời sử dụng các phương pháp tiếp cận phân tử như microarray hoặc HSS (Suppression subtractive hybridization) để xác định các kiểu biểu lộ gen, giúp cho phân biệt tế bào biểu mô bề mặt buồng trứng bình thường và tế bào UTBT. Những dữ liệu này sẽ hữu ích cho việc làm sáng tỏ các sự kiện phân tử liên quan đến sự biến đổi tế bào biểu mô bề mặt buồng trứng.52

Mơ hình ghép dị lồi, trong đó các tế bào UTBT được tiêm dưới da hoặc vào khoang phúc mạc đã được sử dụng rộng rãi để thử nghiệm các phương pháp điều trị mới hoặc các phác đồ sửa đổi để sử dụng các loại thuốc hóa trị liệu tiêu chuẩn.53 Một số mơ hình chuột tận dụng lợi thế của sự hiện diện của một túi ở buồng trứng, một cấu trúc giống như túi bao bọc buồng trứng của loài gặm nhấm. Trong nhiều thập kỷ, các nhà nghiên cứu đã sử dụng khơng gian trong túi để cấy ghép dị lồi buồng trứng hoặc để tạo điều kiện cho buồng trứng tiếp xúc trực tiếp với các yếu tố khác nhau. Đối với mơ hình chuột UTBT, việc tiêm tế bào UTBT vào khoang trong túi dẫn đến hình thành khối u có thể được xem là sinh lý hơn, vì tế bào ung thư được đặt trực tiếp trong môi trường nơi các khối u buồng trứng thường phát sinh.54

Từ năm 1989 nghiên cứu của Massazza tạo mơ hình UTBM buồng trứng người (HOC) trên chuột bằng cách tiêm dưới da và tiêm vào khoang màng bụng ở chuột nude để nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các mẫu u ghép dị lồi. HOC8 và HOC18, có nguồn gốc tương ứng từ một khối u nguyên phát của buồng trứng và dịch màng phổi (từ 2 bệnh nhân khác nhau) được cấy ghép bằng

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

cách tiêm dưới da ở chuột nude. HOC10 và HOC22, có nguồn gốc từ dịch cổ trướng của 2 bệnh nhân, sau đó tiêm vào khoang màng bụng ở chuột nude. Các tế bào HOC18, HOC8 và HOC22 tạo ra khối u ngày càng phát triển sau khi tiêm dưới da nhưng tế bào HOC10 từ dịch cổ trướng không phát triển thành khối u sau tiêm dưới da chuột nude. Các tế bào có nguồn gốc từ HOC18 chỉ tạo ra khối ung thư dạng biểu mô sau khi tiêm vào khoang màng bụng cho chuột nude, trong khi các tế bào HOC8 tạo ra cả cổ trướng và khối u dạng biểu mô. Cả hai dòng tế bào từ dịch cổ trướng HOC10 và HOC22 tạo ra cổ trướng ở chuột nude, nhưng chỉ HOC22 hình thành khối u dạng biểu mơ. Các đặc điểm mô bệnh học của khối u nguyên phát của bệnh nhân vẫn tồn tại ở những khối u phát triển trên chuột nude, bất kể vị trí cấy ghép khối u. Thử nghiệm điều trị với cisplatin, adriamycin và cyclophosphamid cho khối u từ các tế bào HOC8 và HOC18 phát triển sau tiêm dưới da và HOC22 và HOC10 phát triển sau tiêm màng bụng. HOC8 cho thấy một phản ứng đáng kể với DDP và hầu như không nhạy cảm với ADR và CTX. HOC18 chỉ cho thấy khối u bị ức chế phát triển mức độ trung bình với cả 3 loại thuốc. Chuột mang HOC10 và HOC22 cổ trướng có thời gian sống sót kéo dài sau khi điều trị DDP và ADR.53

Năm 2012, Học viện Quân y đã thành cơng xây dựng mơ hình thực nghiệm bởi đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng quy trình tạo khối ung thư người trên chuột thiếu hụt miễn dịch bằng kỹ thuật ghép dị loài”. Đây là tiền đề cho các thử nghiệm tiền lâm sàng trên ung thư sau này. Đề tài đã ứng dụng thành cơng quy trình tạo khối ung thư người trên chuột thiếu hụt miễn dịch với các loại ung thư gan, phổi, tiền liệt tuyến, đại tràng và vú.6,7,10,55,56

Phát triển từ kết quả đề tài nhà nước trên, mô hình UTBT người từ dịng OVCAR- 3 trên chuột nude được xây dựng thành công năm 2015.14 Tuy nhiên tại Việt Nam hiện chưa có dòng tế bào UTBT nào được lấy từ bệnh nhân người Việt cho nên cũng chưa có mơ hình UTBT đặc trưng cho người Việt Nam.

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

1.4. Virus vaccin sởi và liệu pháp tiêu huỷ khối u (OLV) của virus vaccinsởi trong điều trị ung thư và UTBT

1.4.1. Virus vaccin sởi (MeV) và thụ thể của MeV trong liệu pháp tiêu huỷkhối u

Mặc dù chủng virus sởi hoang dại được ghi nhận là có khả năng tiêu diệt một số loại ung thư nhưng bệnh sởi là một bệnh có khả năng lây lan nhanh tạo nên các vụ dịch lớn và đôi khi gây tử vong do suy hô hấp cấp, nhất là đối với trẻ em.57,58 Vì sự an tồn cho cộng đồng nên việc sử dụng chủng virus sởi hoang dại để điều trị các bệnh ung thư thường không được hội đồng y đức chấp thuận. Hơn nữa, hầu hết các khối u ác tính của người thiếu thụ thể đặc hiệu đối với virus sởi hoang dại.59,58 Trong liệu pháp OLV hiện nay, sử dụng các chủng MeV thuộc các dòng Edmonston bao gồm một số chủng biến đổi thích nghi trong thí nghiệm, liên quan chặt chẽ nguồn gốc từ một chủng lâm sàng lấy từ họng của một đứa trẻ có tên David Edmonston (năm 1954) được cấy truyền rộng rãi trong nuôi cấy tế bào, kết quả là giảm độc lực và ít khả năng gây bệnh.57 Ban đầu, các MeV chủng Edmonston (MeV-Edm) đã được cấp phép vào năm 1963, nhưng lại là tác nhân gây sốt và phát ban bệnh sởi ở trẻ em.60 MeV-Edm này đã được cấy truyền trong các tế bào khác nhau, tạo ra chủng MeV giảm độc lực hơn và không gây bệnh. MeV là một virus RNA sợi đơn, không phân đoạn và âm tính thuộc giống Morbillivirus của họ Paramyxoviridae.61 Vaccin MeV sống giảm độc lực, chẳng hạn như chủng Schwarz, được tạo ra từ một phân lập lâm sàng bằng cách truyền rộng rãi qua nuôi cấy nguyên bào sợi phôi gà.62 Loại vaccin này đã được sử dụng cho hàng trăm triệu trẻ em kể từ những năm 1970 và được coi là một trong những loại vaccin an toàn và hiệu quả nhất cho con người. Hơn nữa, bộ gen MeV rất ổn định và chưa bao giờ quan sát thấy sự chuyển ngược của các chủng vaccin sang dạng gây bệnh.63

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

Virus ly giải ung thư (Oncolytic virus - OLV), một liệu pháp chống ung thư đã được chứng minh lâm sàng là có thể làm giảm khối u bằng cách tiêu diệt có chọn lọc các tế bào khối u (được gọi là oncolysis). Khi OLV giải phóng ra khỏi tế bào ung thư gây ly giải và phá hủy tế bào khối u. Các OLV được giải phóng tiếp tục lây nhiễm vào các tế bào ung thư khác, tạo ra một làn sóng tấn cơng của OLV vào các tế bào khối u. Đồng thời q trình này sẽ kích thích đáp ứng miễn dịch chống ung thư. Dòng MeV là một trong những OLV được nghiên cứu rộng rãi nhất, MeV nhằm vào các tế bào khối u bằng cách liên kết có chọn lọc với protein màng CD46, thường được biểu lộ quá mức trong các khối u ác tính. MeV là một morbillivirus chuỗi âm, có vỏ bọc, xâm nhập vào tế bào thông qua hai protein bề mặt của virus, đó là protein hemagglutinin (H) và protein tổng hợp (F). Khi liên kết glycoprotein H với thụ thể tế bào của MeV, phản ứng tổng hợp màng qua trung gian F được kích hoạt. Các thụ thể tế bào đối với MeV gây bệnh là SLAMF1 (hay CD150) trên tế bào miễn dịch và nec- tin-4 (hay PVRL4) trên tế bào biểu mơ, cịn MeV hoặc các chủng MeV thích nghi trong phịng thí nghiệm thì sử dụng CD46 làm thụ thể.64

Chủng MeV sống, giảm độc lực xâm nhập tế bào có tính chọn lọc, sử dụng các phân tử CD46 là thụ cảm thể đặc hiệu để xâm nhập vào các tế bào, các phân tử CD46 này được thấy rộng rãi và biểu lộ ở mức độ thấp trong các tế bào có nhân.65-67 CD46 và protein điều hòa bổ thể khác (CRP, CD55 và CD35) chặn các dịng hoạt hóa bổ thể ở giai đoạn hoạt hóa C3, sự có mặt của chúng ở mật độ thấp là để bảo vệ các mơ bình thường bởi tổn thương do các bổ thể đã hoạt hóa. Vấn đề này đã được chứng minh khi nhiều loại tế bào khối u biểu lộ các phân tử CD46 để thoát khỏi sự gây độc tế bào phụ thuộc vào bổ thể.68,69 Nhiều loại tế bào ung thư biểu lộ CD46 ở mật độ cao, do đó MeV có một ái tính tự nhiên với các tế bào ung thư và khi đó MeV hình thành ấn lõm để xâm

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

nhập và tiêu diệt những tế bào này, trong khi các tế bào khỏe mạnh có biểu lộ CD46 thấp thì khơng bị tổn thương.67,70

Tất cả các chủng Edmonston của virus sởi biến đổi trong đó sử dụng thụ thể CD46 làm trung gian cho quá trình xâm nhập vào tế bào và thúc đẩy quá tạo hợp bào. Hiệu ứng phá hủy tế bào của MeV đặc trưng bởi sự hình thành hợp bào (tế bào đa nhân khổng lồ) là do sự tương tác các hemaglutinin và protein kết hợp của virus từ các tế bào bị nhiễm virus với các tế bào lân cận.71,72

1.4.2. Điều trị ung thư và UTBT bằng MeV trên mơ hình thực nghiệm

1.4.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới sử dụng liệu pháp OLV của virus vaccinsởi trong điều trị ung thư trên mơ hình thực nghiệm

Trong số các virus có khả năng ly giải tế bào ung thư, MeV được nghiên cứu khá toàn diện. Các nghiên cứu đã cho thấy MeV có khả năng ly giải tế

bào ung thư in vitro, trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư người(in vivo) và đang tiến hành các thử nghiệm lâm sàng trên người mang lại kết

quả đầy hứa hẹn.73-75 Các nghiên cứu tiền lâm sàng đánh giá khả năng OLV của dòng Edmonston giảm độc lực được tiến hành lần đầu tiên vào cuối thế kỷ 20. Sử dụng chủng Edmonston-B biến đổi gen từ một gen của các MeV-Edm và sau đó được tăng sinh trên các tế bào vero. Chủng MeV-Edm-tag biến đổi

gen cũng được chọn lọc để phá hủy các tế bào khối u của người nuôi cấy invitro.76,77 Nghiên cứu của Zhang và cộng sự đã chứng minh hiệu quả điều trị

của MeV với u tế bào gan nguyên phát ở người cả trong in vitro và in vivo.78

Hoạt động của liệu pháp OLV sử dụng MeV biến đổi gen để điều trị ung thư đã được thử nghiệm trên một số mơ hình chuột mang khối ung thư người khác nhau bao gồm: ung thư hạch, đa u tủy, u thần kinh đệm, đại trực tràng, ung thư vú, ung thư gan, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư không tế bào nhỏ của phổi và UTBT đã mở ra nhiều hi vọng trong nghiên cứu điều trị ung thư .78-81

Bảng 1.4. tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về kết quả điều trị bằng

MeV các loại ung

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

thư trên mơ hình gây ung thư người thực nghiệm in vivo trong đó có ung thư

buồng trứng.

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

Bảng 1.4. Các thử nghiệm điều trị ung thư bằng MeV trên mơ hình động vật tạo khối ung thư người trên thế giới

và cs82

2006 Cấy ghép các dòng tế bào ung thư vú dưới da chuột nude Balb C

MeV có biến đổi gen tạo ra CEA (MeV-CEA)

Làm chậm quá trình phát triển khối u có ý nghĩa thống kê ( p=0,005) và kéo dài thời gian sống thêm của chuột ( p=0,001).

và cs83

UTBM tế bào gan Hep- 3B dưới da chuột

MV-Edm không gây độc cho chuột. Liệu pháp MV-Edm tái tổ hợp ức chế sự phát triển của khối u và kéo dài thời gian sống thêm với sự thoái bằng nước muối sinh lý chết vào ngày thứ 48 vì cổ trướng. Thời gian sống thêm trung bình của nhóm chỉ dùng MV-CEA là 59 ngày so với >70 ngày ở nhóm được điều trị bằng MV-NIS

+ MV-CEA.

</div>