GIÁO TRÌNH NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT DI TRUYỀN (DÀNH CHO SINH VIÊN ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (262.3 KB, 10 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

DƯƠNG VĂN CƯỜNG (Chủ biên) NGUYỄN HUY THUẦN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NHÀ XUẤT BẢN NƠNG NGHIỆP Hà Nội – 2017

GIÁO TRÌNH

NGUN LÝ KỸ THUẬT DI TRUYỀN

(Dành cho sinh viên đại học ngành Công nghệ Sinh học)

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

Mục lục ��iii Lời nói đầu ��v

1.1. Tách chiết axit nucleic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.2. Xác định nồng độ axit nucleic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.3. Điện di trên gel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.4. Lai phân tử . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.1. Cắt DNA bằng enzyme giới hạn. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192.2. Nối dna bằng ligase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262.3. Biến đổi đầu phân tử DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.1. Vector plasmid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393.2. Vector dựa trên thực khuẩn thể lambda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473.3. Vector dựa trên thực khuẩn thể m13 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 553.4. Cosmid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 563.5. Vector biểu hiện. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 583.6. Vector dùng cho tế bào nhân chuẩn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603.7. Siêu vector: YAC và BAC. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

trường đại học nông lâm thái nguyên

5.1. Thư viện hệ gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 835.2. Thư viện cDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 895.3. Chọn lọc dòng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97Chương 6 gIẢI TRÌnh TỰ, PhÂn TÍCh gEnE VÀ hỆ gEnE 1076.1. Giải trình tự gene. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1076.2. Giải trình tự hệ gene. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1146.3. Xác định gene thành phần trong hệ gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1206.4. Ứng dụng giải trình tự gene và hệ gene trong nghiên cứu Metagenomics . . . . . 122

7.1. Phân loại biến dị . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1257.2. Nghiên cứu biến dị. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

8.1. Các nhân tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1408.2. Biểu hiện gene ở vi khuẩn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1448.3. Biểu hiện ở tế bào chủ nhân chuẩn. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1528.4. Gắn đi và chuỗi tín hiệu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1568.5. Gây đột biến in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

C

uốn sách “Nguyên lý Kỹ thuật di truyền” được biên soạn cho sinh viên hệ đại học ngành Công nghệ Sinh học. Theo khung chương trình đào tạo ngành Cơng nghệ Sinh học tại một số trường đại học, nhóm tác giả đặt cuốn sách này vào trục dọc

gồm ba học phần có tính chất nối tiếp liên tục, bao gồm Di truyền học đại cương, Sinh

học phân tử và Kỹ thuật di truyền. Với tư duy như vậy và trên cơ sở tham khảo một số

cuốn sách Kỹ thuật di truyền trên thế giới, nhóm tác giả đưa nội dung giáo trình đi thẳng vào khối kiến thức mang tính chất nền tảng và tư duy của các nguyên lý thao tác với axit nucleic và công nghệ DNA tái tổ hợp.

Giáo trình gồm 9 chương với các nội dung như sau: • Chương 1: Tách chiết axit nucleic

• Chương 2: Cắt và nối DNA • Chương 3: Các hệ thống vector • Chương 4: Kỹ thuật PCR • Chương 5: Tách dịng gene

• Chương 6: Giải trình tự, phân tích gene và hệ gene • Chương 7: Phân tích biến dị di truyền

• Chương 8: Biểu hiện protein tái tổ hợp • Chương 9: Phân tích biểu hiện gene

TS. Dương Văn Cường chủ biên, biên soạn các chương 1–5, 7–9 và hiệu đính. TS. Nguyễn Huy Thuần tham gia biên soạn chương 6 và phần Thuật ngữ chuyên ngành.

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

trường đại học nơng lâm thái ngun

Giáo trình có thể được sử dụng làm tài liệu tham khảo cho các nhà nghiên cứu, giáo viên phổ thông trung học giảng dạy môn Sinh học, sinh viên, học viên cao học các ngành liên quan đến Công nghệ Sinh học, bao gồm: Cử nhân Sinh học, Sư phạm Sinh học, Y dược, Nơng nghiệp, Lâm nghiệp…

Lần đầu xuất bản giáo trình khơng tránh khỏi thiếu sót. Nhóm tác giả chân thành cảm ơn và mong muốn nhận được những góp ý của độc giả để cuốn sách được hoàn thiện hơn trong các lần tái bản.

Ý kiến đóng góp xin gửi về địa chỉ thư điện tử

CáCtáCgiả

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

Chương 1 TÁCHCHIẾTAXITNUCLEIC

Đ

ể bắt đầu một thí nghiệm kỹ thuật di truyền, việc đầu tiên là phải thu được vật liệu di truyền, DNA hoặc RNA, để làm nguyên liệu. Các kỹ thuật hiện đại đã làm cho công việc này trở nên đơn giản hơn so với trước kia. Trong chương này, trước hết chúng ta sẽ cùng xem xét các nguyên lý nền tảng của phương pháp tách chiết và tinh sạch axit nucleic. Tiếp theo, ta sẽ tìm hiểu những phương án dùng để tách riêng từng loại DNA. Sau khi tách chiết, cần phải đánh giá chất lượng của DNA thu được theo các tiêu chí

hàm lượng, độ tinh khiết và độ nguyên vẹn. Các tiêu chí này được đánh giá bằng phương

pháp đo quang phổ kết hợp với điện di. Phần cuối của chương mô tả hiện tượng căn bản của DNA gồm biến tính và hồi tính, đồng thời thảo luận nguyên lý của hiện tượng và ứng dụng trong phản ứng lai phân tử.

1.1. TÁCH CHIẾT AXIT NUCLEIC

Bước đầu tiên của hầu hết các thí nghiệm kỹ thuật di truyền là thu nhận axit nucleic (DNA hoặc RNA) từ tế bào. Quá trình này bao gồm bốn bước cơ bản như sau:

• Phá vỡ tế bào.

• Loại bỏ các thành phần khác của tế bào. • Thu nhận axit nucleic.

• Tinh sạch.

Ngồi việc làm thế nào để phân tách DNA và RNA ra khỏi nhau, nhà nghiên cứu còn phải phân biệt hai loại DNA phổ biến cần tách chiết sao cho loại này khơng lẫn vào loại

kia, đó là hệ gene và plasmid. DNA hệ gene bao gồm toàn bộ DNA của tế bào bao gồm

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

trường đại học nông lâm thái nguyên

DNA nhiễm sắc thể trong nhân, DNA của các bào quan như ti thể, lạp thể. Đặc điểm của

DNA hệ gene là kích thước lớn. Plasmid là các yếu tố di truyền ngồi nhân có ở vi khuẩn.

Chúng là các phân tử DNA dạng vịng, mạch kép với kích thước nhỏ hơn rất nhiều so với DNA hệ gene. Chúng có khả năng tự sao chép độc lập mà khơng phụ thuộc vào sự sao chép DNA trong nhân. Trong thực nghiệm, tách chiết plasmid là một công việc được tiến

hành hàng ngày ở các phịng thí nghiệm sinh học phân tử. DNA phage là toàn bộ hệ gene

của phage xâm nhiễm vi khuẩn. Trong các nghiên cứu về virus thì điều cần thiết là tách chiết được riêng rẽ hệ gene nhỏ bé của virus ra khỏi lượng DNA khổng lồ của vật chủ.

1.1.1. PHÁ VỠ TẾ BÀO VÀ MƠ

Mặc dù có nhiều phương pháp tách chiết axit nucleic nhưng chúng đều có chung những nguyên lý cơ bản. Đầu tiên, người ta cần có vật liệu khởi đầu. Chất lượng của vật liệu khởi đầu có ý nghĩa quyết định tới sự thành cơng hay thất bại của thí nghiệm. Dạng vật liệu khởi đầu thường gặp nhất là dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn hay tế bào nhân chuẩn. Sinh khối tế bào được thu nhận và tách riêng ra khỏi môi trường nuôi cấy bằng cách dễ dàng nhất là ly tâm. Dạng vật liệu khởi đầu thứ hai là các mẫu mô phức tạp của sinh vật bậc cao. Đối với dạng này thì trước hết mẫu cần được đồng nhất hóa. Cho dù là loại vật liệu nào thì tốt nhất là chúng ta nên thu mẫu nhanh chóng, sạch và bảo quản ở nhiệt độ thấp cho tới khi cần sử dụng.

Tiếp theo, tế bào cần được phá vỡ để giải phóng các thành phần nội bào. Các phương pháp phá vỡ tế bào có thể phân chia thành 2 nhóm là cơ học và hóa học. Tùy thuộc từng loại tế bào mà phương pháp phù hợp sẽ được lựa chọn. Đối với vi khuẩn, thành tế bào của chúng có thể bị làm yếu đi bằng lysozyme, acid ethylenediamine tetraacetic (EDTA) hoặc kết hợp cả hai. Lysozyme là enzyme có trong lịng trắng trứng và nước mắt có tác dụng phân hủy các hợp chất polymer cấu tạo nên thành tế bào vi khuẩn. EDTA có tác dụng loại bỏ các ion Mg2+ là nhân tố thiết yếu trong việc duy trì tính ổn định tổng thể của vỏ tế bào vi khuẩn. Một vai trò nữa của EDTA là ức chế hoạt động của DNase để bảo vệ DNA khỏi sự phân huỷ của các enzyme này. Trong một số điều kiện, xử lý tế bào vi khuẩn bằng lysozyme và EDTA là đủ để phá vỡ lớp vỏ của chúng, nhưng thông thường một loại chất tẩy rửa như sodium dodecyl sulphate (SDS) cũng được bổ sung. Chất tẩy rửa có tác dụng hồ tan lớp lipid của màng.

Tế bào thực vật có thành (vách) cấu tạo từ cellulose nên có cấu trúc vững chắc hơn vi khuẩn do đó chúng cần xử lý bằng lực cơ học. Quy trình phổ biến áp dụng trong trường hợp cần tách axit nucleic từ mô thực vật là nghiền trong nitrogen lỏng. Tế bào động vật thì khơng có thành tế bào nên chỉ cần xử lý bằng một chất tẩy nhẹ.

Sau khi phá vỡ tế bào ta sẽ thu được một hỗn hợp các thành phần nội bào bao gồm DNA, RNA, protein, lipid và đường. Cần lưu ý rằng việc phá vỡ tế bào một cách đột ngột thường làm cho DNA nhiễm sắc thể bị đứt gãy. Riêng trường hợp của nhiễm sắc

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

1. Richard J. Reece (2004). Analysis of Genes and Genomes. John Wiley & Sons Ltd.

2. Primrose S.B. and Twyman R.M. (2006). Principles of Gene Manipulation and Genomics.

Blackwell Publishing.

3. Christopher Howe (2007). Gene Cloning and Manipulation. Cambridge University Press.4. Brown, T.A (2010). Gene cloning and DNA analysis: An introduction. Wiley-Blackwell.5. Daniel L. Hartl and Elizabeth W. Jones (2011). Genetics: Analysis of Genes and Genomes.

Jones & Bartlett Learning.

6. Jeremy W. Dale, Malcolm von Schantz and Nick Plant (2012). From Genes to Genomes:

Concepts and Applications of DNA Technology. Wiley-Blackwell.

7. Harvey Lodish và cộng sự (2016). Sinh học phân tử của tế bào. Tập 2: Di truyền học và sinh

học phân tử. Biên dịch: Nguyễn Xuân Hưng và cộng sự. Nhà xuất bản Trẻ.

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">