phương pháp chiết xuất và phân lập alkaloid báo cáo hết môn dược liệu

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>NGÔ HÀ MINH ANH</b>

<b>PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP ALKALOID</b>

BÁO CÁO HẾT MÔN DƯỢC LIỆU

Thầy hướng dẫn: TS. NGUYỄN THÀNH TRIẾT

<b>Thành phố Hồ Chí Minh – 2024</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

Mục Lục:

CHƯƠNG 1: NGUYÊN TẮC CHUNG...3

CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT...5

2.1. ĐỐI VỚI NHỮNG ALKALOID BAY HƠI...5

2.1.1. Phương pháp chiết bằng Cất keo hơi nước (chiết alkaloid dạng muối)...5

2.1.2.Thăng hoa...6

2.2. ĐỐI VỚI NHỮNG ALKALOID KHÔNG BAY HƠI...7

2.2.1. Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở môi trường kiềm (Chiết xuất alkaloid dạng base)...7

2.2.2. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước (Chiết alkaloid dạng muối)...12

2.2.3.Chiết bằng cồn (Chiết alkaloid dạng muối)...12

2.3. ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP...14

2.3.1. Chiết bằng cất kéo hơi nước...14

2.3.2. Chiết bằng dung môi hữu cơ...14

2.3.3. Chiết bằng dung dịch nước acid cồn...14

CHƯƠNG 3. TINH CHẾ - PHÂN LẬP ALKALOID...15

3.1. KẾT TINH PHÂN ĐOẠN:...15

3.2. KỸ THUẬT GRADIENT pH:...15

3.3. KỸ THUẬT SẮC KÝ:...16

3.3.1.Sắc ký giấy (Paper chromatography)...16

3.3.2. Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography-TLC):...16

3.3.3. Phương pháp sắc ký trao đổi ion:...17

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>CHƯƠNG 1: NGUYÊN TẮC CHUNG</b>

Alkaloid, loại base hữu cơ yếu có chứa nitơ hữu cơ tự nhiên, có tác dụng sinh lý đa dạng và quan trọng đối với con người và các động vật khác, có thể được tìm thấy ở các bộ phận khác nhau của thực vật. Các alcaloid nổi tiếng bao gồm morphine, strychnine, quinine, ephedrine và nicotine.

<b>Hình 1.1. Một số cấu trúc thường gặp trong alkaloid</b>

Vì các alkaloid có cấu trúc đa dạng nên khơng có cách nào loại bỏ chúng khỏi ngun liệu thơ tự nhiên. Hiện nay, các phương pháp để chiết suất alkaloid dựa trên các đặc tính là hịa tan trong dung mơi hữu cơ, nhưng khơng hịa tan trong nước và có xu hướng ngược lại với muối của chúng.

Hầu hết thực vật đều có nhiều alkaloid. Đầu tiên, hỗn hợp của chúng được chiết xuất, sau đó, các alkaloid riêng lẻ được tách ra. Cây được nghiền kỹ trước khi chiết xuất. Hầu hết các alcaloid hiện diện trong thực vật sống ở dạng muối của acid hữu cơ trong cây. Các alkaloid chiết được cũng có thể giữ nguyên muối hoặc chuyển thành base.

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

Các phương pháp chung để phân lập alkaloid phần lớn phụ thuộc vào một số các yếu tố, ví dụ: tính chất kiềm của hầu hết các alkaloid, khả năng và sự dễ dàng hình thành của muối alkaloid với axit và khả năng hòa tan tương đối của muối alkaloid thu được trong dung môi hữu cơ phân cực, ví dụ: ethanol, chloroform, isopropanol hoặc trong mơi trường nước.

Việc chiết xuất alcaloid dựa vào tính chất chung sau:

Alkaloid nói chung là những base yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạng muối của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin; nên phải tán nhỏ dược liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh.

Hầu hết các alkaloid base không tan trong nước nhưng lại dễ tan trong dung mơi hữu cơ ít phân cực (hydrocacbon thơm, chloroform, ether). Trái lại, các muối alkaloid thường tan trong nước, cồn và không tan trong các dung mơi ít phân cực. Mặt khác cịn tùy theo tính chất của alkaloid như loại bay hơi hoặc không bay hơi mà dùng phương pháp chiết xuất cho thích hợp

.

<b>Hình 1.2. Sơ đồ chiết suất alkaloid</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT </b>

Các alkaloid trong tự nhiên là ở dạng alkaloid tự do hoặc muối. Việc chiết xuất các alkaloid dựa trên đặc tính cơ bản và kiểu hòa tan của chúng. Việc chiết xuất thường được thực hiện bằng một trong các phương pháp chung sau đây:

<b>2.1. ĐỐI VỚI NHỮNG ALKALOID BAY HƠI </b>

Đối với những alcaloid bay hơi được như coniin (trong cây Conium maculatum), nicotin (trong cây thuốc lá), spactein (trong cây Cytisus scoparius)… cất kéo được bằng hơi nước hoặc thăng hoa

Tuy nhiên phương pháp này không phù hợp với các alkaloid có trọng lượng phân tử cao.

<b>2.1.1. Phương pháp chiết bằng Cất keo hơi nước (chiết alkaloid dạng muối)</b>

Sau khi sấy khô dược liệu, tán nhỏ, cho kiềm vào để đẩy alkaloid dạng muối ra dạng base rồi lấy alkaloid ra khỏi dược liệu theo phương pháp cất kéo bằng hơi nước, người ta thường hứng dịch cất được vào trong dung dịch acid và từ đó thu được muối alkaloid.

Chưng cất bằng hơi nước: Phương pháp này được sử dụng đặc biệt cho các alkaloid lỏng dễ bay hơi như coniine, sparteine và nicotin.

Tuy nhiên phương pháp này khơng phù hợp với các alkaloid có trọng lượng phân tử cao.

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<b>Hình 2.1. Alkaloid được chiết qua bộ dụng cụ chưng chất hơi nước</b>

<b>2.1.2.Thăng hoa</b>

Thăng hoa có thể thực hiện trực tiếp trên dược liệu như tách caffein từ chè hoặc có thể sử dụng để tách và tinh chế các hợp chất có trong dịch chiết thơ.

Các thiết bị hiện đại cho phép sử dụng áp suất giảm và kiểm soát được nhiệt độ trong quá trình thăng hoa.

<b>Hình 2.2. Chiết alkaloid bằng phương pháp thăng hoa</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>2.2. ĐỐI VỚI NHỮNG ALKALOID KHÔNG BAY HƠI </b>

<b>2.2.1. Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở môi trường kiềm (Chiết xuất alkaloid dạng base)</b>

Chiết xuất bằng dung môi không trộn lẫn với nước.Trên thực tế, phương pháp chiết bằng dung môi không trộn lẫn với nước được sử dụng rộng rãi nhất dung mơi để chiết alkaloid.

- Bước 1: kiềm hố dược liệu

Tán nhỏ dược liệu rồi tẩm bột dược liệu với dung dịch kiềm trong nước.

Thường dùng amoni hydroxyd, cũng có thể dùng carbonat kiềm nhưng chỉ thích hợp với alkaloid có tính base mạnh. Vơi, NaOH chỉ dùng khi cần thiết để đẩy các base mạnh, đặc biệt đối với những alcaloid tồn tại trong cây ở dạng kết hợp với tanin; hoặc dùng để biến các alcaloid có nhóm chức phenol thành phenat tan trong nước, khơng tan trong các dung môi hữu cơ. Người ta sử dụng tính chất này để lấy riêng morphin trong phương pháp định lượng morphin trong nhựa thuốc phiện.

<b>Hình 2.3. Dược liệu được làm ẩm bằng kiềm thích hợp và vừa đủ ẩm</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

- Bước 2: chiết bằng dung mơi hữu cơ thích hợp

Chiết bột dược liệu sau khi đã kiềm hố như trên bằng dung mơi hữu cơ khơng phân cực thích hợp, dung mơi này hồ tan các alcaloid base vừa được giải phóng. Ở phịng thí nghiệm thường dùng benzen, cloroform, ether + cloroform. Trong sản xuất công nghiệp người ta phải chú ý dùng dung mơi rẻ tiền, ít độc, khó cháy. Có thể chiết nguội trong bình ngấm kiệt hoặc chiết nóng trong các dụng cụ kiểu Sốc-lết (Soxhlet) hoặc Kumagawa.

<b>Hình 2.4. Dược liệu được chiết bằng dung mơi thích hợp</b>

- Bước 3: cất thu hồi dung môi, chuyển alcoloid dạng kiềm sang dạng muối tan trong nước

Cất thu hồi dung môi hữu cơ dưới áp lực giảm rồi lắc dịch chiết cô đặc với dung dịch acid loãng (2 - 5%), (thường dùng acid hydrocloric, acid sulfuric, đôi khi dùng acid acetic hoặc acid formic). Các alcaloid được chuyển sang dạng muối tan trong

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

nước; còn mỡ, sắc tố, sterol... ở lại dung mơi hữu cơ. Trong phịng thí nghiệm người ta lắc trong bình gạn, trong cơng nghiệp phải có thiết bị thích hợp.

- Bước 4: kiềm hoá để chuyển alcaloid về dạng base:

Gộp các dịch chiết muối alcaloid lại rồi kiềm hoá để chuyển alcaloid sang dạng base, lắc với dung mơi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alcaloid base. Việc chiết bằng dung mơi hữu cơ có thể dùng bình gạn hoặc các dụng cụ chiết chất lỏng theo kiểu bình ngấm kiệt. Sau khi lấy riêng lớp dung môi hữu cơ chứa alcaloid base, người ta thường loại nước bằng muối trung tính khan nước (Na<small>2</small>SO<small>4</small> khan) rồi cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi sẽ thu được cắn alcaloid thơ.

<b>Hình 2.5. Lắc phân bố để thu được alkaloid tinh khiết</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>Hình 2.6. Quy trình chiết alkaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm</b>

Đặc tính hóa học của base alkaloid: Sử dụng chất kiềm mạnh, ví dụ NaOH hoặc KOH nên tránh càng xa càng tốt vì thực tế là một số alkaloid nhất định bị thủy phân khi tiếp xúc kéo dài với bazơ mạnh.

Ví dụ: Thủy phân este-alkaloid, ví dụ:cocain, hyoscyamine

<b>Hình 2.7. Một số alkaloid có cấu trúc ester dễ thị thủy phân bởi kiềm mạnh</b>

Các alkaloid phenolic, ví dụ, cephaelin, morphin. Các alkaloid này thường được hòa tan trong khi tiếp xúc với chất kiềm mạnh và do đó thuốc thử có tính kiềm nhẹ hơn, ví dụ: dung dịch amoniac loãng là cần thiết cho sự giải phóng base yếu của alkaloid Sự hiện diện của các chất béo: Nghiêm cấm sử dụng chất kiềm mạnh trong trường hợp chất béo chứa trong nguyên liệu chứa alkaloid vì hình thành các sản phẩm xà phịng hóa gây nhũ tương. Trong những trường hợp như vậy, tốt nhất nên loại chất béo của dược liệu trước khi tiến hành giải phóng các alkaloid tự do. Các chất thực vật giàu dầu và chất béo, chẳng hạn như: hạt, nhân, những chất không chứa kiềm

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

được loại bỏ hoàn toàn bằng cách chiết bằng phương pháp dùng dung mơi khơng phân cực thích hợp như n-hexane, ete dầu hỏa,...

<b>Hình 2.8. Hiện tượng nhũ khi có tạp chất béo</b>

Dung dịch amoni hydroxit là một trong những dung dịch kiềm chọn lọc nhất được sử dụng thường xuyên nhất để giải phóng các alkaloid từ nguồn thực vật. Đầu tiên, nó có độ kiềm thích hợp để giải phóng hầu hết các alkaloid thơng thường, và thứ hai là tính chất dễ bay hơi của nó để có thể loại bỏ nó bằng cách làm bay hơi dung mơi. Như nó có có xu hướng được chiết bằng ete dung môi từ dung dịch nước, do đó, nó gần như cần thiết để loại bỏ nó bằng cách bay hơi và rửa sạch sau đó nhiều lần.

Cloroform được coi là dung mơi khơng hịa tan trong nước lựa chọn nhất cho phổ rộng các alkaloid có trong giới thực vật và chiết xuất chúng với mức độ dễ dàng khác nhau.

Lưu ý: Cloroform không thích hợp để chiết các alcaloid bậc bốn, ví dụ: tubocurarine.

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<b>2.2.2. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước (Chiết alkaloid dạng muối)</b>

- Thấm ẩm bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất.

- Chiết bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất. Các alcaloid trong dược liệu sẽ chuyển sang dạng muối và tan trong dung môi trên.

- Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi dưới áp lực giảm, dùng ether rửa dịch chiết đậm đặc cịn lại. Trong mơi trường acid, ether thường hoà tan một số tạp chất chứ khơng hồ tan các alcaloid, các chất màu và các chất không mong muốn khác được loại bỏ bằng cách lắc với cloroform hoặc các dung môi hữu cơ khác. - Sau khi tách lớp ether, kiềm hoá dung dịch nước rồi lấy alcaloid base được giải phóng ra bằng một dung mơi hữu cơ thích hợp (dung mơi này phải không trộn lẫn với dung dịch nước) thường dùng cloroform, ether, benzen... Cất thu hồi dung môi hữu cơ rồi bốc hơi tới khô sẽ thu được cắn alcaloid thơ.

<b>Hình 2.9. Quy trình chiết alkaloid bằng nước acid</b>

<b>2.2.3.Chiết bằng cồn (Chiết alkaloid dạng muối)</b>

Có một số alkaloid trong dược liệu tồn tại dưới dạng muối tan tốt trong cồn ở mơi trường trung tính do đó sau khi tán nhỏ dược liệu ở kích thước thích hợp đem thấm ẩm và chiết bằng cồn etylic cho tới kiệt alcaloid. Quá trình tiếp theo được thực hiện

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

tương tự như ở trên. Trong quá trình chiết xuất người ta dùng thuốc thử tạo tủa để kiểm tra xem các alcaloid đã lấy kiệt chưa.

Các phương pháp chung đã nêu ở trên có kết quả tốt đối với phần lớn các alcaloid trong dược liệu, nhưng có một số alcaloid ở dạng base lại tan nhiều trong nước (ephedrin, colchicin...) hoặc ở dạng muối ít tan trong nước (berberin nitrat...), tan trong dung môi hữu cơ (reserpin hydroclorid tan trong cloroform) thì người ta phải có cách chiết riêng cho thích hợp.

<b>Hình 2.10. Quy trình chiết alkaloid bằng cồn</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>2.3. ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP2.3.1. Chiết bằng cất kéo hơi nước</b>

Ưu điểm: alkaloid thu được khá tinh khiết Nhược điểm: Không áp dụng phổ biến

<b>2.3.2. Chiết bằng dung môi hữu cơ</b>

-Ưu điểm: Hiệu suất chiết các hoạt chất từ dược liệu cao do dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế loại các tạp đi kèm theo. Các dung môi hữu cơ không phân cực thường là các dung mơi có khả năng chiết chọn lọc đối với alkaloid ở dạng base.

-Nhược điểm: Dung môi hữu cơ thường là các dung môi đắt tiền. Khi sửa dụng các dung mơi này để chiết địi hỏi các thiết bị phức tạp đầu tư cho thiết bị lớn. Không dùng được với dược liệu tươi. Hiệu suất chiết dựa vào q trình kiềm hóa.

<b>2.3.3. Chiết bằng dung dịch nước acid cồn</b>

-Ưu điểm: Dung môi rẻ tiền

. Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít.

-Nhược điểm: Dịch chiết rút ra lẫn nhiều tạp chất, khó tinh chế do đó mất mát nhiều trong khâu tinh chế làm cho hiệu suất chiết thấp. Đối với các dược liệu chứa nhiều chất nhầy, việc sử dụng nước làm dung môi chiết gặp khó khăn trong khâu rút dịch chiết.

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

<b>CHƯƠNG 3. TINH CHẾ - PHÂN LẬP ALKALOID</b>

Sau khi chiết xuất ít khi thu được một alkaloid tinh khiết mà thường là một hỗn hợp các alkaloid còn lẫn tạp chất.

Nếu chỉ có một alkaloid thơ thì có thể tinh chế bằng cách chuyển nó nhiều lần từ dung môi hữu cơ sang dung môi nước và ngược lại, cuối cùng bốc hơi dung môi ta được một alcaloid tinh khiết.

Nếu là hỗn hợp nhiều alkaloid, để tinh chế và phân lập riêng từng alkaloid trước đây thường dùng phương pháp kết tinh phân đoạn bằng các dung môi, ngày nay đối với các alkaloid khó tách có thể sử dụng phương pháp sắc ký hấp phụ hoặc phương pháp trao đổi ion, sắc ký cột (giảm hoạt, tẩm đệm phosphat), sắc ký lớp điều chế, sử dụng các kỹ thuật phân tách mới nhất, chẳng hạn, sắc ký lỏng hiệu năng (HPLC), sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC).

<b>3.1. KẾT TINH PHÂN ĐOẠN:</b>

Kết tinh trực tiếp từ dung môi: Đây là phương pháp phân lập đơn giản trong đó các alkaloid kết tinh trực tiếp bằng q trình phân đoạn và có thể khơng hữu ích trong trường hợp hỗn hợp phức tạp.

<b>3.2. KỸ THUẬT GRADIENT pH:</b>

Có sự khác biệt về mức độ base của các alkaloid khác nhau trong cùng một loại cây Dựa trên đặc tính này, hỗn hợp alkaloid thơ được hòa tan trong dung dịch acid tartaric 2% và được chiết bằng benzen sao cho phần thứ nhất chứa các alkaloid trung tính và/hoặc có tính base rất yếu.

Giá trị pH của dung dịch nước được tăng dần 0,5 lần đến pH 9 và quá trình chiết được thực hiện ở mỗi pH khác nhau bằng dung môi hữu cơ.

Bằng cách này, các alkaloid có tính bazơ khác nhau được chiết và các alkaloid có tính base mạnh được chiết ở cuối.

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

<b>3.3. KỸ THUẬT SẮC KÝ: </b>

Sắc ký là phương pháp lý tưởng để tách một số lượng lớn các alkaloid.Việc tách các alkaloid được thực hiện bằng cách sử dụng pha tĩnh và pha động của các dung môi hữu cơ khác nhau.

Các kỹ thuật sắc ký khác nhau được sử dụng để tách các ancaloit riêng lẻ khỏi hỗn hợp

<b>3.3.1.Sắc ký giấy (Paper chromatography) </b>

Kỹ thuật này đơn giản nhất và được sử dụng rộng rãi nhất trong số các kỹ thuật sắc ký khác vì khả năng ứng dụng của nó để phân lập, nhận dạng và đôi khi xác định định lượng tất cả các loại sản phẩm tự nhiên. Đây là kỹ thuật phân vùng cũng như kỹ thuật hấp thụ, trong đó pha động là riêng lẻ hoặc hỗn hợp các dung môi hữu cơ và pha tĩnh là bề mặt ưa nước của giấy.

Việc lựa chọn dung môi dùng để chạy sắc ký phụ thuộc vào bản chất của alkaloid.

<b>3.3.2. Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography-TLC): </b>

TLC là một công cụ quan trọng được sử dụng rộng rãi để nhận dạng, tách và xác định độ tinh khiết của alkaloid phân lập.

Mặc dù phương pháp TLC được sử dụng trong phân tích định tính nhưng nó cũng có tầm quan trọng lớn trong phân tích định lượng.

Việc tách TLC của các alkaloid có thể được thực hiện trên silica gel, alumina, bột xenlulo hoặc kieselguhr. Silica gel là pha tĩnh hoạt động mạnh nhất và đạt được khả năng phân tách tốt ngay cả khi sử dụng một vài miligam chất.

Phương pháp này cũng được sử dụng để tách chuẩn bị các alkaloid.

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

<b>Hình 3.1. Phân tách Alkaloid bằng Sắc ký lớp mỏng</b>

<b>3.3.3. Phương pháp sắc ký trao đổi ion:</b>

Phương pháp trao đổi ion dựa vào sự trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch muối alkaloid và các ion đã bị hấp phụ trên chất mang (nhựa trao đổi ion). Các nhựa trao đổi ion (ionit) được dùng là các cationit (những cao phân tử rắn mang nhóm acid có khả năng hấp phụ các cation) và các anionit ( những cao phân tử rắn mang nhóm base có khả năng hấp phụ các anion). Các nhựa trao đổi ion này không tan trong nước và các dung môi hữu cơ,

Muối alkaloid hòa tan trong nước tạo ra các cation lớn:

-Nhựa cationit hấp phụ alcaloid tạo ra dạng muối alcaloid, alcaloid này sẽ được đẩy ra khi có dung dịch kiềm hoặc amoniac, theo phương trình sau:

Cat<small>-</small>.[BH]<small>+</small> + [NH<small>4</small>]<small>+</small>OH<small>-</small> ↔ Cat<small>-</small>.[NH<small>4</small>]<small>+</small> + B + H<small>2</small>O

</div>