TAO DOØNG VAØ BIEÅU HIEÄN GEN MAÕ HOÙA KHAÙNG NGUYEÂN P42 TÖØMYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRONG ESCHERICHIA COLI (BL21)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.81 MB, 104 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

HỘI THÚ Y VIỆT NAM

VIETNAM VETERINARY ASSOCIATION

Tập XXVIII Số 9 - 2021

JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE AND TECHNOLOGY

KHOA HỌC KỸ THUẬT

ISSN 1859 - 4751

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

VIETNAM VETERINARY ASSOCIATION

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

KHOA HỌC KỸ THUẬTTHÚ Y

JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE AND TECHNOLOGY

TẬP XXVIII. SỐ 9 - 2021 VOL. XXVIII. N

o

9 - 2021

HỘI THÚ Y VIỆT NAM

VIETNAM VETERINARY ASSOCIATION

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ YTẠP CHÍ RA 8 KỲ/NĂMCỦA HỘI THÚ Y VIỆT NAM

Tổng biên tập: GS.TS. Đậu Ngọc Hào

Phĩ TBT: PGS.TS. Trần Đình Từ, TS. Nguyễn Văn Cảm

Thư ký tịa soạn: TS. Nguyễn Văn Cảm

Hội đồng biên tập:

Địa chỉ giao dịch: TẠP CHÍ KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y

86 Trường Chinh - Đống Đa - Hà Nội

Giấy phép xuất bản số 301/GP - BVHTT ngày 23/7/2001 của Bộ Văn hĩa và Thơng tin In tại Cơng ty Cổ phần Khoa học và Cơng nghệ Hồng Quốc Việt

In xong và nộp lưu chiểu tháng 8/2021

PGS.TS. Đặng Xuân Bình, TS. Nguyễn Cơng Dân, TS. Nguyễn Tiến Dũng, TS. Trần Xuân Hạnh, PGS.TS. Phạm Khắc Hiếu, TS. Nguyễn Văn Hưng, PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, GS.TS. Nguyễn Thị Lan, TS. Võ Thị Hải Lê, TS. Nguyễn Văn Long, PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam, PGS.TS. Lê Văn Năm, PGS. TS. Phạm Hồng Ngân, PGS.TS. Võ Văn Nha, TS. Phan Thị Hồng Phúc, PGS.TS. Lê Quang Thơng, TS. Nguyễn Tùng, GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên, TS. Ngơ Chung Thủy

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

MỤC LỤC

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

• NGUYỄN THANH THỦY, ĐINH THỊ BÍCH LÂN, LÊ VIẾT QUÂN, PHÙNG THĂNG LONG

Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên P42 từ Mycoplasma hyopneumoniae trong

Escherichia coli (BL21) Avs 29

• NGUYỄN MINH THƯƠNG, NGUYỄN KHÁNH THUẬN, TRẦN QUỐC PHI, LÝ THỊ LIÊN KHAI

Khảo sát ảnh hưởng của một số chế phẩm sinh học lên sự tăng trưởng và điều trị bệnh do vi

khuẩn Salmonella typhimurium trên gà nịi lai Avs 20

• LÊ HỒNG NGHỊ, NGUYỄN KHÁNH THUẬN, TRẦN THỊ LỆ TRIỆU, LÝ THỊ LIÊN KHAI, TRẦN NGỌC BÍCH

Sự lưu hành và đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Enterohaemorrhagic Escherichia coli

(EHEC) O45, O121, O157 trên bò tại huyện Ba Tri, tỉnh Bến Tre Avs12

• VÕ THÀNH THÌN, ĐẶNG VĂN TUẤN, LÊ ĐÌNH HẢI

Một số đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh thực nghiệm của vi khuẩn Riemerella

anatipestifer phân lập từ vịt mắc bệnh nhiễm trùng huyết ở Việt Nam Avs 28

• NGUYỄN KHÁNH THUẬN, LÂM NGỌC ĐIỆP, TIÊU HỒNG PHÚC, LÝ THỊ LIÊN KHAI

Sự lưu hành các chủng phổ biến và gen độc lực STX2, EAE của vi khuẩn Escherichia coli

phân lập trên gà tại huện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long Avs ?

• NGUYỄN ĐỨC TÂN, NGUYỄN THỊ THẮM, LÊ LẬP

Nghiên cứu sản xuất vacxin giải độc tố (CLOSTOXOI I.VAC) phòng bệnh viêm ruột hoại tử

do vi khuẩn Clostridium perfringens gây ra trên trâu, bị, dê, cừu Avs 156

• CAQAEWFDWEGEHTH (chưa có tên tác giả)

Sự lưu hành và một số đặc điểm dịch tễ của bệnh viêm đường hô hấp mãn tính (CRD) trên gà ni tập trung tại Thừa Thiên Huế Asv 07

• NGƠ THỊ NGỌC TRÂM, NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN, 1NGUYỄN QUANG HỢP, NGUYỄN MINH NAM, ĐỖ TIẾN DUY,

Đặc điểm di truyền của virus dịch tả heo châu Phi từ các ổ dịch tại một số tỉnh phía Nam từ 2019 đến 2020 Avs 77

• HUỲNH NGỌC TRANG, VÕ BÃO DUY, PHẠM HUỲNH KHIẾT TÂM, HỒ THỊ VIỆT THU

Khảo sát miễn dịch sau tiêm phịng vacxin dại trên đàn chó ở huyện Phú Tân, tỉnh An Giang • ĐẶNG THỊ MAI LAN, ĐỖ ĐỨC THÀNH, ĐOÀN THỊ THANH HƯƠNG

Giải mã kháng nguyên H, phân tích đặc điểm phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của canine distember virus gây bệnh Care ở chó tại Hà Nội

• NGUYỄN VĂN PHƯƠNG, BÙI KHÁNH LINH, NGUYỄN THỊ HOÀNG YẾN, NGUYỄN THỊ HỒNG CHIÊN, NGUYỄN THỊ NHIÊN, DƯƠNG ĐỨC HIẾU, NGUYỄN HUYỀN THƯƠNG Tình hình mắc bệnh ghẻ tai do Otodectes cynotis gây ra ở mèo và thử nghiệm phác đồ điều trị

TRAO ĐỔI KHKT - HOẠT ĐỘNG NGÀNH

• NGUYỄN XN HỊA, NGUYỄN VĂN CHÀO, PHẠM HỒNG SƠN

Hoạt động nghiên cứu khoa học Bộ môn Thú y, Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm Huế giai đoạn 2015-2020

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

SCIENTIFIC RESEARCH

• NGUYEN NGOC HAI, NGUYEN THI NGOC, NGUYEN THI KIM YEN, NGUYEN THI PHUONG BINH, TRAN HOANG ANH THU, NGUYEN TRUNG QUAN

African swine fever virus on abortus and false negative result of realtime PCR

• LE THI XIEM, CAO VAN HUNG, LAI VAN DAM, NGO THI THU THAO, PHAM HONG TRANG, LAI THI LAN HUONG, BUI TRAN ANH DAO, TO LONG THANH

Evaluation of inactivation efficacy using Binary Ethylenimine (BEI) for Foot-and-mouth disease commercial vaccine production

• CAN XUAN MINH, PHAM THI HUE, BUI NGOC ANH, PHAM THI NGA, NGUYEN THANH HOA, NGO THI MINH QUYEN, HOANG THI THUY, NGUYEN HOANG GIANG, HOANG VIET HUNG, DAO DUY TUNG, BUI NGHIA VUONG

Phân tích phả hệ di truyền và đặc điểm bộ gene của các chủng virus cúm gia cầm H5N6 phân lập tại Việt Nam trong năm 2014-2015

• VU THI THU TRA, PHAM HONG NGAN, LAI THI LAN HUONG, BUI THI HUONG, HOANG ANH HAO, PHAM THANH LAN, NGUYEN PHUONG THUY, NGUYEN THI TRAM

Assessment of microbiological contaminationsin feeds at chicken farms in Dong Anh, Hanoi • VO PHONG VU ANH TUAN

Isolation and antimicrobial susceptibility of pasteurella multocida from infected or suspected chickens of pasteurellosis

• PHUNG THANG LONG, LE VIET QUAN, DONG HUU RIN, LE QUOC VIET, DANG THI HUONG, NGUYEN THI THU HIEN, DINH THI BICH LAN

Cloning and expression of gene encoding p102 antigen of mycoplasma hyopneumoniae in E. coli bl21(de3)

• NGUYEN THI THANH HA, NGUYEN THI THAO, NGUYEN VAN THANH, NGUYEN THANH HAI

A study to investigate the use of pharmaceutical products derived from extracts of Rhodomyrtus tomentosa and Lactuca indica L. in the prevention and treatment of chicken diarrhea

• PHAM MINH HANG, PHAM THI THU THUY, NGUYEN VIET KHONG

Isolation and characterization of lactobacilli strains from kimchi for development of probiotics • NGUYEN THI KIM LAN,, NGUYEN THI NGAN, PHAN THI HONG PHUC, PHAM DIEU

THUY, DUONG THI HONG DUYEN, TRAN NHAT THANG, DO THI LAN PHUONG, NGUYEN HOANG ANH, NGUYEN THI NGOC HA

Study on prevalence of swine cysticercosis in Bac Ninh province

FOLLOWING - UP FORMATION

• ĐANG THI XUAN THIEP, VO THI TRA AN

Các phương pháp đánh giá mức độ mẫn cảm

SCIENTIFIC AND TECHNICAL EXCHANGE - PROFESSIONAL ACTIVITIES

• NGUYEN NGOC SON

Giết mổ tập trung, giải pháp hiệu quả đảm bảo an toàn thực phẩm tại hà nội

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

TẠO DỊNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HĨA KHÁNG NGUYÊN P42 TỪ

Nguyễn Thanh Thủy1, Đinh Thị Bích Lân1*, Lê Viết Quân2, Phùng Thăng Long1

*Email:

TĨM TẮT

Trong nghiên cứu này chúng tơi đã tạo dịng và biểu hiện thành cơng gene mã hĩa kháng nguyên

P42 của Mycoplasma hyopneumoniae phân lập từ mẫu phổi của lợn thu thập tại tỉnh Thừa Thiên Huế,

Việt Nam. Gene mã hĩa cho kháng nguyên P42 được tạo dịng và biểu hiện bởi vector

pET200/D-TOPO trong tế bào Escherichia coli BL21 (DE3). Gene mã hĩa kháng nguyên P42 đã được tạo dịng

cĩ chiều dài 1119 bp, mã hĩa một chuỡi polypeptide dài 372 axit amin, và tương đồng 100% so với

trình tự chuỡi polypeptide của Mycoplasma hyopneumoniae 7448 (từ vị trí amino acid thứ 229 đến

600) đã được cơng bố trên GenBank (mã số AAZ53444.1). Kết quả điện di trên SDS-PAGE cho thấy protein tái tổ hợp 6xHis-P42 cĩ khối lượng phân tử khoảng 44 kDa. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của protein tái tổ hợp cho thấy protein tái tổ hợp 6xHis-P42 cĩ kết hợp đặc hiệu với kháng thể cĩ

trong huyết thanh của lợn nhiễm Mycoplasma hyopneumoniae.

Từ khóa: Mycoplasma hyopneumoniae, P42, tạo dịng, biểu hiện, kháng nguyên tái tổ hợp

Cloning and expression of gene encoding p42 antigen from Mycoplasma

hyopneumoniae in Escherichia coli (bl21)

Nguyen Thanh Thuy, Dinh Thi Bich Lan,Le Viet Quan, Phung Thang Long

In this study, we successfully cloned and expressed of gene encoding P42 antigen of

Mycoplasma hyopneumoniae isolated from lung samples from pigs raised in Thua Thien Hue

province, Vietnam. The gene encoding P42 antigen was cloned and expressed with vector

pET200/D-TOPO in Escherichia coli BL21 (DE3) cells. The cloned fragment of gene encoding

P42 antigen has a length of 1119 bp, encoding a polypeptide chain with 372 amino acid

residues, and 100% similarity to the polypeptide chain of Mycoplasma hyopneumoniae 7448 in

GenBank (accession number: AAZ53444.1). Results of SDS-PAGE electrophoresis showed that molecular weight of 6xHis-P42 recombinant protein is about 44 kDa. Results of testing the specificity of the recombinant protein showed that the recombinant protein 6xHis-P42 had a

specific linkage with antibodies in the serum of pigs infected with Mycoplasma hyopneumoniae.Keywords: Mycoplasma hyopneumoniae, P42, cloning, expression, recombinant protein

1. Trường Đại học Nơng lâm, Đại học Huế

2. Học viên Thạc sĩ Đại học Okayama, Nhật Bản

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) là vi khuẩn gây bệnh suyễn

(hay còn gọi là bệnh viêm phổi địa phương) trên lợn. Đây là một bệnh hơ hấp mãn tính ảnh hưởng đến lợn trên toàn thế giới [3], [11]. Đặc trưng của bệnh là tỉ lệ mắc bệnh rất cao, nhưng tỉ lệ chết thấp. Tuy nhiên, thiệt hại bệnh gây ra rất lớn là do: lợn bị bệnh thường còi cọc, chậm lớn, lớn không đồng đều, tiêu tốn thức ăn cao, thời gian vỗ béo kéo dài dẫn đến giảm năng suất thịt

và lợi nhuận [1]. Mặt khác, M. hyopneumoniae tấn công vào đường hô hấp trên của lợn, làm tổn

thương hệ thống lông rung của đường hô hấp, thúc đẩy quá trình xâm nhập và tạo điều kiện

cho sự kết hợp của M. hyopneumoniae với các

loại vi khuẩn khác [2]. Bệnh có thể chẩn đốn sơ bộ căn cứ vào một số triệu chứng và bệnh tích đặc trưng, tuy nhiên chẩn đốn trong phịng

thí nghiệm để xác định M. hyopneumoniae mới

thực sự có ý nghĩa trong giám sát dịch bệnh. Hiện nay, tiêm chủng được xem là chiến lược tiết kiệm chi phí nhất để kiểm sốt và phịng ngừa căn bệnh này [7]. Các loại vaccine bất hoạt hiện có làm giảm các tổn thương phổi và các dấu hiệu lâm sàng cho lợn con được tiêm chủng, cải thiện tăng trọng hàng ngày và hệ số chuyển hóa thức ăn, nhưng các vaccine này chỉ cung cấp được sự bảo hộ một phần và không ngăn chặn

được sự xâm nhập của M. hyopneumoniae vào

trong phổi; cũng như chi phí sản xuất vaccine

này rất cao do quá trình nuôi cấy in vitro M.

hyopneumoniae rất phức tạp [3], [10]. Do đó,

việc nghiên cứu các vaccine mới hiệu quả và an toàn đang được tích cực tiến hành, đặc biệt là vaccine tiểu đơn vị và vaccine DNA tái tổ hợp [9], [11].

Trong một nghiên cứu trước đây, khi so sánh trình tự nucleotide cho thấy gen mã hóa P42 có thể là một phần của gen mã hóa P65. Phân tích sâu hơn đã chứng minh rằng P42 thực sự là một protein shock nhiệt biểu hiện với số lượng lớn, được phơi bày trên bề mặt mầm bệnh và liên quan

đến cơ chế sinh bệnh của M. hyopneumoniae

[5]. Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng P42 có

khả năng sinh đáp ứng miễn dịch cao, có thể

ngăn chặn sự phát triển của M. hyopneumoniae

và là ứng viên cho nghiên cứu sản xuất vaccine tái tổ hợp [4], [5], [6], [11]. Nghiên cứu của Galli và cộng sự (2012) đã kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch ở chuột đối với các kháng nguyên tái tổ hợp P37, P42, P46 và P95

từ M. hyopneumoniae. Kết quả ELISA cho thấy

huyết thanh từ chuột được tiêm kháng nguyên tái tổ hợp P42 có khả năng liên kết đặc hiệu với

protein nguyên thể từ M. hyopneumoniae cao

nhất. Ngoài ra, kháng nguyên tái tổ hợp P42 cũng kích thích sản sinh IgG2a và INF khi được tiêm vào cơ thể chuột. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu sản xuất kháng nguyên P42 tái tổ hợp, nhằm tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu phát triển vaccine hoặc

kháng thể dùng trong phòng và trị bệnh do M.

hyopneumoniae gây ra ở lợn tại Việt Nam.

II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

- Các mẫu dịch phổi của lợn nghi bị nhiễm

M. hyopneumoniae.

- Vector pET200/D-TOPO (Invitrogen),

chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen).

- QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Miniprep Kit (Biobasic), Isolate II Plasmid Mini Kit, Bio 52056 (Bioline), ProBond™ Purification System Kit (Thermo Fisher Scientific).

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Phân lập gene mã hóa kháng nguyên P42

từ các mẫu dịch phổi của lợn nghi bị nhiễm M.

- Tạo dịng gene mã hóa kháng ngun P42 - Biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên P42 - Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp P42

2.3. Phương pháp nghiên cứu

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

* Phương pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên P42

Các mẫu dịch phổi của lợn nghi bị nhiễm M.

hyopneumoniae được thu thập từ các đàn lợn

nuôi trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế. DNA tổng số được tách chiết và tinh sạch từ dịch ni tăng sinh vi khuẩn có trong mẫu phổi bằng Kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), và được sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng khuếch đại đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 với cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế trong nghiên cứu DNA tổng số (30 ng), 1 μL mồi xuôi P42F (10 pmol/μL), 1 μL mồi ngược P42R (10 pmol/μL), 5 μL đệm PCR 10X, 1 μL dNTP (10 pmol/μL), 1 μL Enzyme VELOCITY DNA Polymerase (5 U/μL), nước cất vô trùng vừa đủ 50 μL. PCR được thực hiện với chu trình ln nhiệt như sau: biến tính genome 95°C/5 phút, tiếp đến là 30 chu kỳ: 95°C/30 giây, 50°C/30 giây và 72°C/60 giây, cuối cùng là 72°C/10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di agarose gel 1% với thuốc nhuộm ethidium bromide (0,5 µg/l).

* Phương pháp tạo dịng gene mã hóa kháng nguyên P42

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Miniprep Kit (Biobasic) được gắn vào vector pET200/D-TOPO với thành phần phản ứng gắn bao gồm 2 μL sản phẩm PCR sau tinh sạch (20 ng), 1 μL vector pET200/D-TOPO (20 ng/μL), 1 μL dung dịch muối, nước cất vơ trùng để đạt thể tích gắn là 6 μL. Trộn nhẹ và ủ ở 25°C trong 60 phút; sản phẩm phản ứng gắn được biến nạp vào tế

bào khả biến E. coli BL21 (DE3) bằng phương

pháp sốc nhiệt. Các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp được chọn lọc bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu P42 và cặp mồi T7 (T7F:

5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3´ và T7R: 5´-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3´) được thiết kế sẵn trên vector pET200/D-TOPO.

Vector tái tổ hợp pET200/P42 được tách bằng Isolate II Plasmid Mini Kit, Bio 52056 (Bioline) và gửi đi giải trình tự nucleotide tại Cơng ty 1st BASE (Malaysia). Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm BioEdit và so sánh mức độ tương đồng với trình tự đã được cơng bố trên GenBank.

* Phương pháp biểu hiện gene mã hóa

kháng nguyên P42 trong E. coli BL21 (DE3)

Các tế bào E. coli BL21 (DE3) có chứa

vector biểu hiện mang gene mã hóa kháng nguyên P42 được nuôi trong 50 mL mơi trường YJ có bổ sung 100 μg/mL kanamycin ở 37oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Khi mật độ tế bào đạt OD600 = 0,8 thì bổ sung 40 μL chất cảm ứng IPTG 1M (Bio-Rad) để đạt nồng độ 0,8 mM và tiếp tục ni ở 30oC với tốc độ lắc 150 vịng/ phút trong 8 giờ. Sau đó, sinh khối được thu bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/ phút trong 10 phút và tách chiết protein tổng số bằng cách tái huyền phù tế bào trong đệm TNE (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA), 1% Triton X-100, 0,001 mg/mL lysozyme, ủ trong đá 60 phút có lắc, sau đó xử lý với sóng siêu âm trong 5 phút. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút để thu lấy protein thể dịch. Tiếp tục hòa tan phần kết tủa với dung dịch urea 8 M, ủ ở 30ºC trong 1 giờ, sau đó ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút để thu lấy protein trong thể vùi. Protein dung hợp 6xHis-P42 được tinh sạch từ protein tổng số bằng ProBond™ Purification System Kit (Thermo Fisher Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Sự biểu hiện protein của đoạn gene mã hóa

kháng nguyên P42 trong E. coli BL21 (DE3)

được đánh giá bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.

* Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp P42

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp P42 được xác định bằng phản ứng ELISA gián tiếp giữa huyết thanh lợn với kháng nguyên phủ đĩa là kháng nguyên tái tổ hợp P42 (đã được tinh sạch theo phương pháp được nêu ở trên). Có tất cả sáu mẫu huyết thanh của hai nhóm lợn được thu thập: 3 mẫu huyết thanh của lợn không bị

nhiễm M. hyopneumoniae; 3 mẫu huyết thanh

của lợn bị nhiễm M. hyopneumoniae. Hai nhóm

lợn này được xác định dựa vào các triệu chứng

lâm sàng và bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc

hiệu 16S rRNA của M. hyopneumoniae [8].

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập đoạn gene mã hóa

kháng nguyên P42 của M. hyopneumoniae

Sau khi tách DNA tổng số của các mẫu mô

phổi, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp

mồi đặc hiệu để nhân đoạn gene mã hóa kháng

nguyên P42. Kết quả điện di sản phẩm (hình

1) cho thấy các băng DNA được khuếch đại có kích thước khoảng 1110 bp. Sản phẩm PCR cho một băng duy nhất, nồng độ cao, sáng và rõ nét.

Hình 1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mời đặc hiệu cho đoạn gene

mã hóa kháng nguyên P42

M: Maker HyperLadder™ 1kb (Bioline), 1 và 2: Sản phẩm PCR gen mã hóa kháng nguyên P42 phân lập từ các mẫu DNA khác nhau

3.2. Kết quả tạo dịng gene mã hóa kháng

nguyên P42 của M. hyopneumoniae

Sản phẩm PCR được tinh sạch từ gel agarose 1% và được gắn vào vector pET200/D-TOPO. Tiến hành biến nạp sản phẩm gắn chứa plasmid

pET200/P42 vào tế bào E. coli BL21, chọn lọc

trên mơi trường LB agar có bổ sung ampicillin. Sự hiện diện của đoạn gen mã hóa kháng nguyên

P42 trong tế bào E. coli BL21 được kiểm tra

bằng phản ứng PCR trực tiếp với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen mã hóa kháng nguyên P42 và cặp mồi T7 của vector pET200/D-TOPO.

Kết quả điện di sản phẩm PCR ở hình 2 cho thấy xuất hiện băng DNA tương tự với kích thước phân lập ban đầu (khoảng 1110 bp) đối với cặp mồi đặc hiệu và băng DNA có kích thước xấp xỉ khoảng 1300 bp đối với cặp mồi T7 (bao gồm kích thước của gen và một đoạn khoảng 200 bp nằm trên vector pET200/D-TOPO do cặp primer T7 khuếch đại). Điều này chứng tỏ đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 đã được tạo dịng thành cơng vào vector

pET200/D-TOPO trong tế bào E. coli BL21.

Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của plasmid tái tổ hợp

pET200/P42 trong tế bào E. coli BL21

M: Maker HyperLadder™ 1kb (Bioline). 1, 3: Sản phẩm PCR với cặp mồi T7. 2, 4: Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen mã hóa kháng nguyên P42

Kết quả giải trình tự cho thấy đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 phân lập được có độ dài 1119 bp, có độ tương đồng cao (99%) với trình tự

gen mhp0067 của Mycoplasma hyopneumoniae

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

Hình 3. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen mã hóa kháng ngun P42 với trình tự gen mhp0067 của M. hyopneumoniae 7448 (AE017244.1)

Hình 4. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ đoạn gen mã hóa kháng ngun P42 với trình tự amino acid của M. hyopneumoniae 7448 (AAZ53444.1)

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

7448, mã số AE017244.1 (từ vị trí nucleotide thứ 88523 đến 89641), chỉ sai khác ở 3 vị trí (nucleotide thứ 339, 393 và 936) (hình 3). Tuy nhiên, sự sai khác của nucleotide thứ 339, 393 và 936 không làm ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện protein vì trình tự axit amin suy diễn của kháng nguyên P42 thu được có độ tương đồng

100% với protein tương ứng của Mycoplasma

hyopneumoniae 7448, mã số AAZ53444.1 (từ

vị trí amino acid thứ 229 đến 600) (hình 4).

3.3. Kết quả biểu hiện đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42

Sự biểu hiện protein P42 tái tổ hợp ở E. coli

BL21 (DE3) trong môi trường YJ được thể hiện trên gel polyacrylamide 15% có chứa SDS (Hình 5).

Hình 5. Điện di SDS-PAGE đánh giá khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp P42

trong E. coli BL21 (DE3)

M: Marker 10-200 kDa (Bio basic). 1: Mẫu protein hòa tan thu được từ tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET200/P42 không cảm ứng IPTG. 2: Mẫu protein thể vùi thu được từ tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET200/P42 không cảm ứng IPTG. 3: Mẫu protein hòa tan thu được từ tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET200/P42 được cảm ứng bằng IPTG. 4: Mẫu protein thể vùi thu được từ tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET200/P42 được cảm ứng bằng IPTG

Theo tính tốn, protein P42 tái tổ hợp được biểu hiện sẽ có khối lượng khoảng 43,8 kDa, gồm protein P42 có khối lượng phân tử khoảng 40,6 kDa và đuôi dung hợp của vector pET200/ D-TOPO có khối lượng phân tử khoảng 3,2 kDa. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy protein P42 tái tổ hợp khơng có mặt trong protein dịch thể, mà nằm trong protein thể vùi có khối lượng khoảng 45 kDa, phù hợp với kích thước đã được ước tính. Như vậy, protein P42 tái tổ hợp đã được biểu hiện thành công trong

tế bào E. coli BL21 (DE3), và dung dịch urea

8M có hiệu quả trong hòa tan protein trong thể vùi. Sau khi tinh sạch protein thể vùi bằng ProBond™ Purification System Kit (Thermo Fisher Scientific), thu được một băng protein duy nhất có khối lượng khoảng 45 kDa (Hình 6). Kết quả này hồn toàn tương tự với kết quả

trong nghiên cứu của Simionatto và cộng sự

(2010) [12].

Hình 6. Kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp 6xHis-P42 từ thể vùi

M: Marker 10-200 kDa (Bio basic). 1: Dịch thu được sau khi cho dịch protein tái tổ hợp chảy qua gel. 2: Dịch thu được sau khi rửa gel với Denaturing Binding Buffer. 3,4: Dịch thu được sau khi rửa gel với Denaturing Wash Buffer. 5,6,7: Dịch thu được sau khi rửa gel với Denaturing Elution Buffer.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

3.4. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của

protein tái tổ hợp P42 tổ hợp P42 bằng phương pháp ELISA gián tiếp Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của protein tái được trình bày ở hình 7 và bảng 1.

Bảng 1. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp P42

NhómMẫu huyết thanhGiá trị OD450Trung bình

Hình 7. Kết quả ELISA kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp P42

Kết quả ở bảng 1 cho thấy trung bình giá trị OD450 ở các giếng được phủ kháng nguyên tái tổ hợp P42 của nhóm bị nhiễm

M. hyopneumoniae là 1,432; ở các giếng

được phủ kháng nguyên tái tổ hợp P42 của

nhóm không bị nhiễm M. hyopneumoniae

là 0,185; ở giếng đổi chứng là 0,064. Điều này này chứng tỏ kháng nguyên tái tổ hợp P42 có liên kết với kháng thể

có trong huyết thanh lợn đã nhiễm M.

IV. KẾT LUẬN

Đoạn gene mã hóa kháng nguyên P42 của

M. hyopneumoniae đã được tạo dòng và biểu

hiện thành công trong tế bào E. coli BL21

(DE3). Đoạn gene này có kích thước 1119 bp và mã hóa tạo ch̃i polypeptide dài 372 axit amin, có độ tương đồng 100% so với trình tự cơng bố trên GenBank (mã số AAZ53444.1). Thí nghiệm tinh sạch và điện di SDS-PAGE cho thấy protein tái tổ hợp 6xHis-P42 có khối lượng phân tử khoảng 44 kDa. Protein

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

tái tổ hợp 6xHis-P42 có kết hợp đặc hiệu với kháng thể có trong huyết thanh của lợn

nhiễm M. hyopneumoniae.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Bá Hiên (2011). Giáo trình Bệnh

truyền nhiễm thú y. Hà Nội: NXB Nông

nghiệp, tr.252.

2. Phạm Sĩ Lăng và Trương Văn Dung (2002).

Một số bệnh mới do vi khuẩn và Mycoplasma ở gia súc - gia cầm nhập nội và biện pháp phịng trị. Hà Nội: NXB Nơng nghiệp.

3. Assao V.S., Scatamburlo T.M., Araujo E.N., Santos M.R., Pereira C.E.R., Guedes R.M.C., Bressan G.C., Fietto J.L.R., Chang Y.-F. & Moreira M.A.S. (2019). Genetic

variation of Mycoplasma hyopneumoniae from Brazilian field samples. BMC

microbiology, 19(1), 234.

4. Chen Y.L., Wang S.N., Yang W.J., Chen Y.J., Lin H.H. & Shiuan D. (2003). Expression

and immunogenicity of Mycoplasma

hyopneumoniae heat shock protein antigen

P42 by DNA vaccination. Infection and

immunity, 71(3), 1155-1160.

5. Chou S.Y., Chung T.L., Chen R.J., Ro L.H., Tsui P.I. & Shiuan D. (1997). Molecular cloning and analysis of a HSP (heat shock protein) Like 42 kDa antigen gene of

Mycoplasma hyopneumoniae. IUBMB Life,

41(4), 821-831.

6. Galli V., Simionatto S., Marchioro S., Fisch A., Gomes C., Conceiỗóo F. & Dellagostin O. (2012). Immunisation of

mice with Mycoplasma hyopneumoniae

antigens P37, P42, P46 and P95 delivered as recombinant subunit or DNA vaccines.

Vaccine, 31(1), 135-140.

7. Maes D., Segales J., Meyns T., Sibila M., Pieters M. & Haesebrouck F. (2008).

Control of Mycoplasma hyopneumoniae infections in pigs. Veterinary microbiology,

126(4), 297-309.

8. Mattsson J.G., Bergström K., Wallgren P. & Johansson K.E. (1995). Detection

of Mycoplasma hyopneumoniae in nose swabs from pigs by in vitro amplification of the 16S rRNA gene. Journal of Clinical

Microbiology, 33(4), 893-897.

9. Meens J., Selke M. & Gerlach G.F. (2006). Identification and immunological

characterization of conserved Mycoplasma

hyopneumoniae lipoproteins Mhp378 and

Mhp651. Veterinary microbiology,

116(1-3), 85-95.

10. Sibila M., Pieters M., Molitor T., Maes D., Haesebrouck F. & Segalés J. (2009). Current perspectives on the diagnosis and epidemiology of Mycoplasma hyopneumoniae infection. The Veterinary Journal, 181(3), 221-231.

11. Simionatto S., Marchioro S.B., Galli V., Brum C.B., Klein C.S., Rebelatto R., Silva E.F., Borsuk S., Conceiỗóo F.R. & Dellagostin O.A. (2012). Immunological characterization of Mycoplasma hyopneumoniae recombinant proteins. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases, 35(2), 209-216.

12. Simionatto S., Marchioro S.B., Galli V., Hartwig D.D., Carlessi R.M., Munari F.M., Laurino J.P., Conceiỗóo F.R. & Dellagostin O.A. (2010). Cloning and purification

of recombinant proteins of Mycoplasma

hyopneumoniae expressed in Escherichia coli. Protein expression and purification,

69(2), 132-136. Ngày nhận 1-6-2021

Ngày phản biện 15-6-2021 Ngày đăng 15-8-2021

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH DO VI KHUẨN SALMONELLA

Nguyễn Minh Thương, Nguyễn Khánh Thuận,Trần Quốc Phi, Lý Thị Liên Khai*Email:

Bộ mơn Thú y, Khoa Nơng nghiệp, trường Đại học Cần Thơ

TĨM TẮT

Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng tăng trưởng và điều trị bệnh do vi khuẩn Salmonella Typhimurium trên gà Nịi lai bằng chế phẩm sinh học được thực hiện từ tháng 6/2020 đến 11/2020. Thí nghiệm tác động tăng trưởng được tiến hành trên 120 con gà (7 ngày tuổi) và được chia ngẫu nhiên 4 nghiệm thức (NT). Kết quả cho thấy, bổ sung 0,05% dịch chiết nấm men Saccharomyces cerevisiae (NT1), hỡn hợp 0,8%

than hoạt tính với 0,2% giấm than (NT2) khơng ảnh hưởng đến tăng trọng, tiêu tốn thức ăn và chỉ số FCR

của gà nhưng làm giảm mật độ E. coli trong đường tiêu hố. Thử nghiệm hiệu quả điều trị đối với bệnh do Salmonella Typhimurium gây ra được tiến hành trên tổng cộng 40 con gà (35 ngày tuổi) với hai lần lập lại. Tiến hành điều trị trong 7 ngày với tỷ lệ bổ sung các chế phẩm sinh học gấp đơi giai đoạn phịng

bệnh ở các nghiệm thức. Kết quả ghi nhận tỷ lệ khỏi bệnh ở NT1, NT2 là 100%; số ngày khỏi bệnh trung

bình (SNKBTB) ngắn nhất là NT1 (3 ngày), NT2 (2,9 ngày). Kết quả cho thấy dịch chiết nấm men Sac-charomyces cerevisiae mang lại hiệu quả cao nhất trong điều trị bệnh do S. Typhimurium trên gà Nịi lai.Từ khóa: Gà Nịi lai, giấm than, than hoạt tính, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella Typhimurium.

Study on effects of some bioproducts on the growth and disease treatment

caused by Salmonella typhimurium in the hybrid noi chickens

Nguyen Minh Thuong, Nguyen Khanh Thuan, Tran Quoc Phi, Ly Thi Lien Khai

The study on the growth effects and disease treatment caused by Salmonella Typhimurium in

hybrid Noi chickens via using bioproducts were conducted from June 2020 to November 2020. The experiments of growth effects were conducted on 120 chickens (7 days old) and randomly divided

into 4 treatments (NT). The results showed that adding 0.05% extract of Saccharomyces cerevisiae

(NT1), a mixture of 0.8% of activated charcoal with 0.2% of charcoal vinegar (NT2) did not affect the weight gain and feed consumption, and FCR index of chickens; however, it could reduce the

density of E. coli in the gastrointestinal tract. Treatment efficacy trials for Salmonella Typhimurium

disease were carried out on a total of 40 chickens (35 days old) with two replicates. The treatment were observed for 7 days with the double dose of bioproducts used in the preventive experiments. The results indicated that the recover rate of NT1 and NT2 was 100%; the average number of days of recovery (SNKBTB) was the least in NT1 (3 days), and NT2 (2.9 days). The results showed that

the extract of Saccharomyces cerevisiae was the most effective in treating diseases caused by S.

Typhimurium in hybrid Noi chickens.

Keywords: Activated charcoal, charcoal vinegar, hybrid Noi chicken, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella typhimurium.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

I. GIỚI THIỆU

Hiện nay, đàn gia cầm nước ta ngày càng gia tăng về số lượng từ 361,7 triệu con năm 2016 và đã tăng lên 481,0 triệu con vào năm 2019 (Tổng Cục Thống kê Việt Nam, 2020). Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các trang trại chăn ni gà cơng nghiệp thì tại các nông hộ việc chăn nuôi các giống gà địa phương như gà Nòi lai cũng rất phát triển. Giống gà Nịi lai có khả năng thích nghi cao với điều kiện tự nhiên bản địa và có giá trị kinh tế cao trong chăn ni tại các nông hộ. Tuy vậy, một trong những khó khăn lớn nhất đối với ngành chăn ni đó chính là sự gia tăng dịch bệnh; trong

đó Salmonella được xem là một trong những tác

nhân gây bệnh phổ biến nhất trên đàn gia cầm.

Trong các chủng Salmonella, Salmonella enterica

serovar Typhimurium được ghi nhận là chủng gây bệnh xuất hiện phổ biến trên gà và con người ở

khu vực Đông Nam Á (Antony và cs., 2009; Neto và cs., 2010). Mặt khác, việc lạm dụng kháng sinh

trong điều trị đã làm gia tăng sự đa kháng thuốc ở

vi khuẩn Salmonella (Ed-dra và cs., 2017), dẫn đến sự xuất hiện và lan truyền các chủng Salmonella

đề kháng kháng sinh từ động vật sang người (Sallam và cs., 2014). Một trong những giải pháp hiện nay là chăn ni an tồn sinh học bằng việc bổ sung các chế phẩm sinh học trong khẩu phần để nâng cao sức đề kháng và phịng trị bệnh. Trong

đó, dịch chiết nấm men Saccharomyces cerevisiae

được đánh giá là có hiệu quả cao trong việc tăng sức đề kháng cho gà trong quá trình điều trị bệnh

do vi khuẩn Salmonella gây ra (Haldar và cs., 2011; Shao và cs., 2013). Đồng thời, một số chế

phẩm khác như than hoạt tính và giấm than cũng được ghi nhận có khả năng hấp thụ độc tố, bảo

vệ đường tiêu hoá chống lại vi khuẩn Salmonella (Watarai và Tana, 2005). Tuy nhiên, ở Việt Nam

vẫn còn hạn chế nghiên cứu về giá trị sử dụng của các chế phẩm phẩm sinh học này trong chăn ni gà Nịi lai.

Xuất phát từ những vấn đề trên, nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định khả năng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và hiệu quả điều trị bệnh do

vi khuẩn Salmonella Typhimurium gây ra trên gà

Nòi lai bằng chế phẩm sinh học. Từ đó, cung cấp những lợi ích trong việc sử dụng các chế phẩm sinh học trong chăn nuôi, ngăn ngừa sự đề kháng

thuốc của vi khuẩn, góp phần bảo vệ sức khoẻ vật nuôi và con người.

II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

- Xác định hiệu qủa của việc sử dụng các chế

phẩm sinh học (dịch chiết nấm men Saccharomyces cerevisiae, than hoạt tính, giấm than) lên sự phát

triển ở gà Nòi lai.

- Xác định hiệu quả điều trị bệnh do vi khuẩn

S. Typhimurium gây ra trên gà Nòi lai bằng

các chế phẩm sinh học (dịch chiết nấm men

Saccharomyces cerevisiae, than hoạt tính, giấm

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Giống gà: gà Nòi lai (1 ngày tuổi) được cung

cấp từ Trung tâm giống Bến Tre. - Chế phẩm dùng trong thí nghiệm

+ Chế phẩm sinh học: Immuno-tonic N24 (thành phần chính là dịch chiết nấm men

Saccharomyces cerevisiae) (AsenTech Pharma

JSC, Việt Nam), than hoạt tính gáo dừa bột mịn, giấm than (Tấn Phát, TP Hồ Chí Minh).

+ Kháng sinh colistin (AsenTech Pharma JSC, Việt Nam).

- Chuồng trại

+ Thí nghiệm tăng trưởng: chuồng nền có diện tích 2m²/ơ, được trang bị một máng ăn máng uống riêng biệt.

+ Thí nghiệm điều trị: chuồng lồng có diện tích 64 cm² (8x8) được chia ra làm 2 lô với mỗi lô là một ô chuồng (5 con gà), được trang bị một máng ăn và máng uống riêng biệt.

- Thức ăn: thức ăn hỡn hợp Con cị S823

(Proconco, Việt Nam).

- Vi khuẩn: Vi khuẩn Salmonella typhimurium

được cung cấp từ phịng thí nghiệm Thú y chun ngành 2, Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ. Vi khuẩn được phân lập từ gà nhiễm Salmonellosis trong nghiên cứu trước đây tại Đồng bằng sông Cửu Long.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của gà Nòi lai khi sử dụng chế phẩm sinh học

* Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hồn tồn ngẫu nhiên trên 120 con gà 7 ngày tuổi (sau khi úm 1 tuần) vào 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại khẩu phần được bổ sung:

Đối chứng (ĐC): Khẩu phần ăn cơ sở (KPCS):

Mỗi nghiệm thức có 3 lần lập lại với mỡi lần lập lại là 1 đơn vị thí nghiệm (1 ô chuồng gồm 10 con gà với tỷ lệ trống mái như nhau). Thí nghiệm được theo dõi trong 4 tuần liên tục.

* Chỉ tiêu đánh giá khả năng tăng trưởng và phòng bệnh

- Tăng trọng (TT) của gà được tính dựa vào khối lượng trung bình cuối thí nghiệm (KLTBcuối) trừ khối lượng trung bình đầu thí nghiệm (KLTBđầu) theo cơng thức:

- Mức tiêu tốn thức ăn (lượng ăn vào) được đánh giá qua lượng thức ăn ăn vào hàng ngày của gà. Mỗi ngày ghi nhận lượng thức ăn cho ăn và lượng thức ăn dư để theo dõi chỉ tiêu tiêu tốn thức ăn (TTTĂ) được tính theo công thức:

TTTĂ (g/con/ngày)= [Lượng TĂ cho ăn (g/ ngày)- Lượng TĂ thừa (g/ngày)]/ Tổng số gà trong ơ

- Hệ số chuyển hố thức ăn (FCR) hàng tuần được tính theo cơng thức:

FCR= Tổng khối lượng thức ăn tiêu tốn tuần/ Tăng trọng tuyệt đối trong tuần

- Xác định sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella và mật độ vi khuẩn E. coli trong đường tiêu hoá:

tiến hành lấy mẫu phân ngẫu nhiên ở mỡi ơ thí nghiệm (3 mẫu/lơ/nghiệm thức). Mẫu phân được lấy trực tiếp từ trực tràng.

+ Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn

E.coli được tiến hành dựa theo TCVN 5155-90.

Cân chính xác 1g phân từ mẫu lấy được cho vào 9ml nước muối sinh lý, sau đó vortex và pha lỗng đến nồng độ cần thiết từ 10-1 đến 10-9. Sau khi pha lỗng, chọn 2 nồng độ thích hợp dự kiến có chứa từ 25-300 khuẩn lạc trong 0,1ml mẫu để chan lên môi trường MacConkey (MC, Merck, Đức). Dùng phương pháp chan đĩa làm khô dịch mẫu trên bề mặt mơi trường, sau đó ủ ở 37oC. Sau 24 giờ ủ

mẫu, khuẩn lạc E. coli được đếm và ghi nhận trên

từng nồng độ kiểm tra.

- Sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella trong

phân gà được xác định theo TCVN 4829:2005.

2.3.2 Thí nghiệm 2: Thử nghiệm hiệu quả điều trị bệnh của chế phẩm sinh học đối với vi khuẩn Salmonella Typhimurium trên gà Nịi lai

* Bố trí thí nghiệm

Thử nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên trên 40 con gà Nòi lai (35 ngày tuổi) được chia vào 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại khẩu phần với tỷ lệ bổ sung các chế phẩm gấp 2 lần giai đoạn ni phịng:

Đối chứng (ĐC): Khẩu phần ăn cơ sở (KPCS).

Mỡi thí nghiệm có 2 lần lặp lại với mỗi lần lặp lại là 1 ô chuồng gồm 5 con gà với tỷ lệ trống mái như nhau. Tất cả gà thí nghiệm được kiểm tra

sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella trong phân; những con gà không bị nhiễm Salmonella được

chọn để tiến hành thí nghiệm. Sau 3 ngày ni với khẩu phần điều trị, tiến hành gây nhiễm tất cả gà

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

Bảng 1: Sự tăng trọng, tiêu tốn thức ăn và hệ số chuyển hoá thức ăn (FCR) của gà trong thí nghiệm ảnh hưởng tăng trưởng

Chỉ tiêuTuần tuổiNghiệm thức thí nghiệmP

ĐC: đối chứng; NT1: bổ sung 0,05% sản phẩm Immuno-tonic N24; NT2: bổ sung 0,8% than hoạt tính và 0,2% giấm than; NT3: bổ sung 0,01% kháng sinh colistin; TB: trung bình.

thí nghiệm với vi khuẩn Salmonella Typhimurium.Liều gây nhiễm S. Typhimurium: 10⁵ CFU/ ml, dựa trên khảo sát LD50 trước đây của chủng

S. Typhimurium được sử dụng trong nghiên cứu

này. Sau khi gây nhiễm 24 giờ, phân của gà bị gây nhiễm sẽ được thu thập để kiểm tra sự hiện diện

của vi khuẩn S. Typhimurium.

Điều trị được theo dõi trong 7 ngày liên tục. Đối với gà chết trong thời gian thí nghiệm sẽ được mổ khám theo TCVN 8420:2010 nhằm kiểm tra các biểu hiện bệnh tích trên tất cả các cơ quan nội tạng, tập trung vào những cơ quan đích gây bệnh

bởi S. Typhimurium.

*Chỉ tiêu theo dõi trong thử nghiệm điều trịTỷ lệ gà chết sau khi gây nhiễm Salmonella

Typhimurium được tính theo cơng thức:

Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Excel 2013 và phân tích thống kê bằng phép thử Chi-square, Anova (General Liner Model), Anova (One-way) của phần mềm Minitab 16, ở mức ý nghĩa 95%.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả đánh giá khả năng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của chế phẩm sinh học trên gà Nòi lai

3.1.1 Kết quả khảo sát các chỉ tiêu sinh trưởng

Qua 4 tuần theo dõi, tăng trọng của gà thí nghiệm được ghi nhận ở Bảng 1.

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Vào tuần 1, tăng trọng trung bình của gà ở các nghiệm thức khơng có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). Sau 4 tuần thí nghiệm, mặc dù có sự gia tăng trọng lượng cao hơn trên nhóm gà sử dụng các chế phẩm sinh học; tuy nhiên, kết quả sự tăng trọng trung bình này khơng có sự khác biệt giữa các nghiệm thức (P>0,05). Kết quả này cho thấy việc bổ sung dịch chiết nấm men, hỡn hợp than hoạt tính với giấm than (AC+WV) vào khẩu phần tại các nồng độ thí nghiệm này không gây ảnh hưởng đến sự tăng trọng của gà thí nghiệm. Trong nghiên cứu của Chae và cs. (2006), cho thấy việc bổ sung 0,05% dịch chiết nấm men

Saccharomyces cerevisiae trong khẩu phần của gà

thịt không làm ảnh hưởng đến sinh trưởng bình thường của gà. Yamauchi và cs. (2010) cũng cho thấy rằng việc bổ sung hỗn hợp AC+WV từ 0,5%-1,5% vào khẩu phần cũng không làm ảnh hưởng đến tăng trọng và sự phát triển bình thường của gà. Do đó, cần có các nghiên cứu tiếp theo để xác định hiệu quả tăng trọng khi sử dụng các chế phẩm sinh học này ở các nồng độ khác.

Lượng tiêu tốn thức ăn trung bình của gà giữa các nghiệm thức (Bảng 1) cũng khơng có khác biệt về mặt thống kê. Điều này cho thấy việc bổ sung các chế phẩm sinh học, kháng sinh colistin vào khẩu phần tại các nồng độ thí nghiệm khơng ảnh hưởng đến mức ăn vào của gà. Có thể lý giải do

các chế phẩm bổ sung vào khẩu phần khơng có chứa các thành phần kích thích mức tiêu thụ lượng thức ăn ăn vào của gà vì vậy mà những con gà ở NT1, NT2, NT3 có mức ăn giống với những con gà ở ĐC. Nghiên cứu của Thanissery và cs. (2010) cũng cho thấy việc bổ sung men sinh học từ tinh

chất nấm men Saccharomyce cerevisiae không

gây ảnh hưởng tới lượng tiêu tốn thức ăn trên gà. Ngoài ra, hệ số chuyển hóa thức ăn trung bình của gà ghi nhận sau 4 tuần ở các nghiệm thức khơng có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức (P>0,05) (Bảng 1). Do các chế phẩm sinh học khi bổ sung vào khẩu phần của gà không làm ảnh thưởng đến mức ăn vào và tăng trọng của gà, vì vậy mà hệ số chuyển hóa thức ăn cũng không bị ảnh hưởng. Các chỉ tiêu sinh trưởng được ghi nhận phù hợp với sự sinh trưởng bình thường của giống gà Nịi lai trong nghiên cứu của Hồ Tân Hiệp (2014). Điều này chứng tỏ việc bổ sung chế phẩm sinh học và kháng sinh colistin vào khẩu phần không làm xáo trộn sự phát triển bình thường của gà thí nghiệm.

3.1.2 Kết quả định lượng mật độ vi khuẩn E. coli và sự hiện diện của Salmonella trong đường tiêu hố của gà Nịi lai

Trong nghiên cứu này, khơng tìm thấy sự hiện

diện của vi khuẩn Salmonella trong phân gà ở đầu

và cuối thí nghiệm ở tất cả các lơ thí nghiệm.

Bảng 2: Mật độ vi khuẩn E. coli trong phân trong nghiên cứu hiệu quả phòng bệnh

TuầnMật độ vi khuẩn (logCFU/g)PĐC NT1NT2NT3

Đầu thí nghiệm6,546,536,526,540,84Cuối thí nghiệm6,80a6,56d6,62c6,71b0,00

ĐC: đối chứng; NT1: bổ sung 0,05% sản phẩm Immuno-tonic N24; NT2: bổ sung 0,8% than hoạt tính và 0,2% giấm than; NT3: bổ sung 0,01% kháng sinh colistin

Mật độ vi khuẩn E. coli trong mẫu phân gà ở

đầu thí nghiệm khơng có sự khác biệt thống kê giữa các nghiệm thức (Bảng 2), do tất cả gà trong thí nghiệm đều được lựa theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên từ những con gà có chế độ ni dưỡng như nhau.

Cuối thí nghiệm, tổng số vi khuẩn giữa các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt (P<0,05). Tổng số vi khuẩn đường ruột ghi nhận cao nhất ở ĐC (6,80 logCFU/g), tiếp sau là NT3 (6,71 logCFU/g), NT2 (6,62 logCFU/g) và thấp nhất là NT1 (6,56 logCFU/g). Qua đó nhận thấy, việc bổ sung dịch

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Bảng 3: Tỷ lệ gà chết, tỷ lệ gà khỏi bệnh và số ngày khỏi bệnh trung bình trong thí

nghiệm điều trị bệnh do S. typhimurium

ĐC: đối chứng; NT1: bổ sung 0,1% sản phẩm Immuno-tonic N24; NT2: bổ sung 1,6% than hoạt tính và 0,4% giấm than; NT3: bổ sung 0,02% kháng sinh colistin; SNKBTB: số ngày khỏi bệnh trung bình; Các số trong cùng một cột có mang chữ mũ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ( P<0,05).

chiết nấm men vào khẩu phần của gà mang lại hiệu quả cao nhất trong việc phòng ngừa sự phát triển

của vi khuẩn E. coli có trong đường ruột. Dịch chiết nấm men Saccharomyces cerevisiae giúp

tăng cường nồng độ các lồi vi khuẩn hội sinh có lợi và ức chế các vi khuẩn gây bệnh có hại trong đường ruột (Stanley, 2004; Huff và cs., 2010) nên có mật độ vi khuẩn có trong đường ruột thấp hơn rất nhiều so với nghiệm thức ĐC. Vì vậy, sau hai tuần bổ sung dịch chiết nấm men vào khẩu phần của gà trong NT1 đã góp phần làm giảm đáng kể lượng vi khuẩn gây hại trong đường tiêu hoá của gà khi so với ĐC.

Việc sử dụng hỗn hợp than hoạt tính và giấm than trong khẩu phần của gà ở NT2 cũng có tác động tích cực đến hệ vi sinh đường ruột. Than hoạt tính với khả năng hấp thụ vi khuẩn và các chất độc của vi khuẩn có trong đường tiêu hố

(Gardiner và cs., 1993) đã góp phần hạn chế sự

phát triển của vi khuẩn gây hại từ đó làm giảm mật độ vi khuẩn có trong đường tiêu hố khi so với đối chứng (P<0,05). Kháng sinh colistin tác động mạnh nhất trên các trực khuẩn gram âm, tác

động trên Salmonella, E. coli, các Pseudomonas, Shigella, Haemophillus, Aerobacter (Huỳnh Kim

Diệu, 2010). Vì vậy, mật độ vi khuẩn trong phân gà ở NT3 trong thử nghiệm cũng thấp hơn so với ĐC. Điều này cho thấy kháng sinh colistin dùng trong thử nghiệm vẫn cịn có hiệu quả trong việc

tiêu diệt vi khuẩn. Tuy nhiên, kết quả cho thấy việc

sử dụng kháng sinh không mang lại hiệu cao bằng việc sử dụng các chế phẩm sinh học do kháng sinh colistin là một loại kháng sinh được dùng khá phổ biến trong chăn nuôi, nên về lâu dài một số loại vi khuẩn đã trở nên đề kháng với thuốc (Abed và Hossein, 2015).

3.2 Kết quả thử nghiệm hiệu quả điều trị bệnh của chế phẩm sinh học đối với vi khuẩn

Salmonella Typhimurium trên gà Nòi lai

Kết quả kiểm tra ở đầu thí nghiệm đã xác định 100% gà thí nghiệm khơng có sự hiện diện của vi

khuẩn Salmonella trong phân. Sau khi gây nhiễm với vi khuẩn S. Typhimurium, toàn bộ gà ở các

nghiệm thức đều có biểu hiện bệnh với tỷ lệ là 100% (Bảng 3).

Phân của tất cả gà có biểu hiện nhiễm bệnh

được thu thập để xác định sự hiện diện của S.

Typhimurium. Kết quả kiểm tra cho thấy 100% mẫu phân gà được kiểm tra đều có sự hiện diện của

vi khuẩn S. Typhimurium. Điều này chứng tỏ, với

liều gây bệnh 1x10⁵ CFU/ml S. Typhimurium dùng

trong thử nghiệm đã đủ độc lực gây bệnh trên gà Nòi lai.

Tuy nhiên, sau 7 ngày điều trị, khơng có gà nào chết ở các nghiệm thức NT1, NT2 và NT3 cho thấy việc sử dụng các chế phẩm sinh học và kháng sinh trong điều trị đã có khả năng đối kháng

lại với vi khuẩn S. Typhimurium. Việc sử dụng các

chế phẩm sinh học cũng mang lại kết quả tương đương như việc sử dụng kháng sinh trong điều trị

bệnh do Salmonella gây ra trên gia cầm. Do đó,

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

sử dụng các chế phẩm sinh học hồn tồn có khả năng thay thế kháng sinh, hạn chế sự đa kháng

kháng sinh của vi khuẩn Salmonella (Ed-dra và cs., 2017). Ngoài ra, kết quả trong thử nghiệm

cũng cho thấy nếu có sự hỡ trợ từ các chế phẩm sinh học và kháng sinh trong điều trị sẽ giúp gia tăng khả năng sống sót của gà cao hơn.

Tỷ lệ khỏi bệnh của gà sau 7 ngày điều trị ghi nhận ở ĐC là 90%, các nghiệm thức NT1, NT2, NT3 là 100% (Bảng 3). β-glucans là một thành

phần có trong dịch chiết nấm men Saccharomyce cerevisiae có khả năng kích thích và gia tăng số

lượng các tế bào đài (goblet cells) trên niêm mạc ruột. Các tế bào này có khả năng tiết ra các chất nhày giữ vai trò quan trọng trong việc bảo vệ niêm mạc ruột trước các tác nhân gây bệnh thông qua khả năng ngăn cản sự bám dính của vi khuẩn trên bề mặt của ống tiêu hố, góp phần hạn chế sự tấn

công từ các loại vi khuẩn như Salmonella (Shao

và cs., 2013). Chính vì vậy mà việc điều trị bằng

dịch chiết nấm men Saccharomyce cerevisiae đã

góp phần mang lại hiệu quả trong việc nâng cao tỷ lệ khỏi bệnh của gà ở NT1 là 100%. Đối với gà ở NT2, khi trộn hỗn hợp than hoạt tính và giấm than trong khẩu phần cũng có khả năng làm giảm số lượng vi khuẩn và ngăn chặn sự phát triển của vi

khuẩn Salmonella (Watarai và Tana, 2005). Điều

này cho thấy việc sử dụng chế phẩm sinh học dịch

chiết nấm men Saccharomyce cerevisiae và hỗn

hợp than hoạt tính với giấm than trong điều trị

bệnh do S. Typhimurium là có hiệu quả.

Thời gian khỏi bệnh ở gà trong NT1 và NT2 có thời gian khỏi bệnh nhanh hơn (Bảng 3). Số ngày khỏi bệnh trung bình ngắn nhất ở NT1 (3 ngày) và NT2 (2,9 ngày), dài nhất ở hai nghiệm thức ĐC (4,3 ngày) và NT3 (3,9 ngày), khác biệt giữa NT1 và NT2 là khơng có ý nghĩa nhưng lại chênh lệch có ý nghĩa đối với ĐC (1,3 ngày) và NT3 (0,9 ngày) (P<0,05). Vì vậy, việc bổ sung các chế phẩm sinh học vào trong khẩu phần có khả năng rút ngắn thời gian điều trị nhanh nhất khi so với việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh do

vi khuẩn S. Typhimurium gây ra. Than hoạt tính

đã được chứng minh có khả năng hấp thu vi khuẩn và các chất độc trong đường tiêu hoá (Gardiner và cs., 1993), khi kết hợp cùng với các acid hữu cơ trong giấm than đã ức chế các vi khuẩn gây bệnh

trong đường tiêu hoá (Partanen và Morz, 1999). Tương tự, trong thành phần của dịch chiết nấm

men Saccharomyce cerevisiae có chứa hợp chất

mannan-oligosaccharide có khả năng hấp thụ và

thải trừ độc tố của vi khuẩn Salmonella (Spring và cs., 2000). Vì vậy mà khi bổ sung hai chế

phẩm này vào khẩu phần điều trị ở NT1 và NT2 đều mang lại hiệu quả tốt như nhau. Nghiên cứu của Hooge và cs. (2003) và Stanley và cs. (2004) cũng ghi nhận các chế phẩm làm từ tinh chất nấm

men Saccharomyces cerevisiae hồn tồn có thể

thay thế cho việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn ở gà. Do đó, việc bổ sung dịch chiết nấm men

Saccharomyces cerevisiae trong phòng và điều trị

bệnh được đánh giá cao hơn việc sử dụng kháng sinh trong tất cả các thí nghiệm này.

IV. KẾT LUẬN

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc bổ sung các chế phẩm sinh học như sản phẩm

Immuno-tonic N24 (dịch chiết nấm men Saccharomyces cerevisiae 0,05%) và hỡn hợp than hoạt tính (0,8%)

với giấm than (0,4%) trong khẩu phần không làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng bình thường của gà Nịi lai. Đồng thời, sử dụng 0,1% dịch chiết nấm

men Saccharomyces cerevisiae (Immuno-tonic

N24) hay 1,6% than hoạt tính với 0,4% giấm than có khả năng làm tăng tỷ lệ khỏi bệnh, rút ngắn

thời gian điều trị bệnh do vi khuẩn Salmonella

Typhimurium gây ra trên gà Nòi lai. Những kết quả nghiên cứu này có thể ứng dụng trong thực tế chăn nuôi nhằm nâng cao hiệu quả trong phòng trị bệnh cho gia cầm bằng chế phẩm sinh học.

Lời cảm ơn: Đề tài này được tài trợ bởi Dự án

nâng cấp Trường Đại học Cần Thơ VN14-P6 bằng nguồn vốn vay ODA từ chính phủ Nhật Bản.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Abed Z.B., and Hossein S.K., 2015. Colistin,

mechanisms and prevalence of resistance. Curr. Med. Res. Opin., 31(4): 707-721.

2. Antony B., Dias M., Shetty A.K., and Rekha B.,

2009. Food poisoning due to Salmonella enterica serotype Weltevreden in Mangalore. Indian J. Med. Microbiol., 27(3): 257-258.

3. Chae B.J., Lohakare J.D., Moon W.K., Lee S.L., Park Y.H., and Hahn T.W., 2006. Effects of

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

supplementation of beta-glucan on the growth

performance and immunity in broilers. Res. Vet. Sci., 80: 291–298.

4. Ed-dra, A., Filali, F. R., Karraouan, B., El Allaoui, A., Aboulkacem, A., and Bouchrif, B., 2017. Prevalence, molecular and antimicrobial

resistance of Salmonella isolated from sausages in Meknes, Moroco. Microb. Pathogen., 105:

5. Gardiner K.R., Anderson N.H., McCaigue M.D., Erwin P.J., Halliday M.I., and Rowlands B.J., 1993. Adsorbents as antiendotoxin agents in

experimental colitis. Gut, 34: 51-55.

6. Haldar S., Ghosh T.K., Toshiwati, and Bedford

M.R. (2011). Effects of yeast (Saccharomyces cerevisiae) and yeast protein concentrate on

production performance of broiler chickens exposed to heat stress and challenged with

Salmonella Enteritidis. Anim. Feed Sci. Technol.,

168: 61–71.

7. Hooge D.M., Sims M.D., Sefton A.E., Connolly A., and Spring P., 2003. Effect of dietary mannan oligosaccharide, with or without bacitracin or virginiamycin, on live performance of broiler chickens at relatively high stocking density on

new litter. J Appl. Poult. Res., 12: 461–467.

8. Hồ Tân Hiệp, 2014. Ảnh hưởng của các tỷ lệ sử dụng bánh dầu dừa lên năng suất sinh trưởng, tỷ lệ tiêu hố dưỡng chất và Nitơ tích lũy của gà Nòi. Luận văn cao học, Trường Đại học Cần Thơ. 9. Huff G.R., Huff W.E., Farnell M.B., Rath N.C.,

Santos F.S.de.L., and Donoghue A.M., 2010. Bacterial clearance heterophil function, and hematological parameters of transport-stressed turkey poults supplemented with dietary yeast

extract. Poult. Sci., 89: 447–456.

10. Huỳnh Kim Diệu, 2010. Thú y-Cơ sở dược lý trong điều trị. Nxb Nông nghiệp, 320 trang. 11. Neto O.C.F., Filho P.R.A.C., Barrow P., and

Junior A.B., 2010. Sources of human

non-typhoid salmonellosis: a review. Braz. J. Poult. Sci., 12(1): 1-11.

12. Partanen K.H., and Mroz Z., 1999. Organic acids

for performance enhancement in pig diets. Nutr. Res. Rev., 12: 117-145.

13. Sallam K.I., Modhammed M.A., Hassan M.A.,

and Tamura T., 2014. Prevalence, molecular identification and antimicrobial resistance profile

of Salmonella serovar isolated from retail beef products in Mansoura, Egypt. Food Control,

38(1): 209-214.

14. Shao Y., Guo Y., and Wang Z., 2013. Beta-1,3/1,6-Glucan alleviated intestinal mucosal barrier impairment of broiler chickens challenged with

Salmonella enterica serovar Typhimurium. Poult. Sci., 92: 1764–1773.

15. Spring P., Wenk C., Dawson K.A., and Newman K.E., 2000. The effects of dietary mannanoligosaccharides on cecal parameters and the concentrations of enteric bacteria in the ceca

of Salmonella-challenged broiler chicks. Poult. Sci., 79: 205–211.

16. Stanley V.G., Gray C., Daley M., Krueger W.F., and Sefton A.E., 2004. An alternative to antibiotic-based drugs in feed for enhancing

performance of broilers grown on Eimeria spp.-infected litter. Poult. Sci., 83: 39–44.

17. Thanissery R., McReynolds J.L., Conner D.E., Macklin K.S., Curtis P.A., and Fasina Y.O., 2010. Evaluation of the efficacy of yeast extract

in reducing intestinal Clostridium perfringens levels in broiler chickens. Poult. Sci., 89: 2380– s%E1%BA%A3n. Truy cập ngày 3/12/2020. 19. Watarai S., and Tana, 2005. Eliminating the

carriage of Salmonella enterica serovar Enteritidis

in domestic fowls by feeding activated charcoal from bark containing wood vinegar liquid

(Nekka-Rich). Poult. Sci., 84(4): 515-21.

20. Yamauchi K., Ruttanavut J., and Takenoyama S., 2010. Effects of diatery bamboo charcoal powder including vinegar liquid on chicken performance

and histological alterations of intestine. J. Anim. Feed Sci., 19: 257-268.

Ngày nhận 20-6-2021 Ngày phản biện 5-7-2021 Ngày đăng 15-8-2021

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN

TRÊN BÒ TẠI HUYỆN BA TRI, TỈNH BẾN TRE

Lê Hồng Nghị, Nguyễn Khánh Thuận*,Trần Thị Lệ Triệu, Lý Thị Liên Khai1, Trần Ngọc Bích

Bộ mơn Thú y, Khoa Nơng nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ

*Email:

TĨM TẮT

Trong thời gian từ tháng 8/2020 đến 12/2020, tổng cộng 121 mẫu phân bị khỏe được thu thập trên tất cả các giống bị, lứa tuổi, giới tính tại các hộ chăn nuơi bị thuộc huyện Ba Tri, Bến Tre. Bằng phương pháp PCR, tỷ lệ hiện diện của vi khuẩn EHEC O45, O121 lần lượt là 4,13% và 7,44% trong

mẫu phân bị; khơng cĩ sự khác biệt giữa giới tính, độ tuổi. Tuy nhiên, sự hiện diện của chủng E. coli

O45 trên bị sữa (10,81%) cĩ tỷ lệ cao hơn bị thịt (1,19%). Khơng tìm thấy sự hiện diện của vi khuẩn

E. coli O157 trên đàn bị được khảo sát trong nghiên cứu này. Kiểm tra sự đề kháng kháng sinh của

các chủng vi khuẩn E. coli O45, O121 phân lập được bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch đối với 10 loại kháng sinh. Các chủng vi khuẩn E. coli O45, O121 trên bị nhạy cảm cao với amikacin và

doxycycline (100%), kế đến là ofloxacin (85,71%) và ceftazindime (71,43%); tuy nhiên, đã đề kháng với streptomycin (50,00%), colistin (57,14%) và ampicillin (64,29%).

Từ khóa: Bị, Bến Tre, đề kháng kháng sinh, EHEC, serotype

Prevalence and antimicrobial resistance of Enterohaemorrhagic Escherichia

coli (EHEC) O45, O121, O157 in cattle in Ba Tri, Ben Tre province

Le Hong Nghi, Nguyen Khanh Thuan, Tran Thi Le Trieu, Ly Thi Lien Khai, Tran Ngoc Bich

From August 2020 to December 2020, a total of 121 fecal samples were collected from healthy cattle on all of the breeders, ages, gender at the household farms in Ba Tri, Ben Tre province. Applying PCR assay, the prevalence of positive EHEC O45, O121 was 4.13% and 7.44% respectively; there was no significant difference in gender, ages. However, the

prevalence of E. coli O45 in dairy cattle (10.81%) was higher than that in beaf cattle (1.19%). E. coli O157 was not found in cattle in this study. The antimicrobial resistance of the E. coli O45, O121 isolates was carried out following the disk infusion method with 10 antibiotics. E. coli O45, O121 strains were extremely sensitive to amikacin, doxycycline (100%), followed by

ofloxacin (85.71%), and ceftazindime (71.43%); however, those strains were resistant against streptomycin (50,00%), colistin (57.14%) and ampicillin (64.29%).

Keywords: Antimicrobial resistance; Ben Tre province; cattle; ETEC; serotype

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC)

là vi khuẩn sản sinh độc tố shiga (Stx), gây ngộ

độc thực phẩm nghiêm trọng trên người. EHEC tồn tại trong đường ruột của nhiều lồi gia súc, chủ yếu là lồi nhai lại và con bị là nguồn mang trùng chủ yếu (Amstrong và cs., 1996). Các chủng vi

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

khuẩn EHEC không gây bệnh cho vật mang trùng, nhưng là nguồn dự trữ tự nhiên làm phát tán mầm bệnh thông qua phân, và làm vấy nhiễm vào nước, sữa, thịt tươi sống, rau củ, mơi trường. EHEC có thể tồn tại trong thịt tươi sống và thịt nấu chín; với số lượng rất thấp cũng có thể gây ra tử vong

cho người già và trẻ nhỏ (Griffin và Tauxe, 1991).

Khảo sát tại các trại chăn ni bị ở Hoa Kỳ cho

thấy các chủng vi khuẩn E. coli O45, O121 hiện

diện với tỉ lệ lần lượt là 14,6%, 2,0% (Dewsbury và cs., 2015). Ngoài ra, nhiều ca bệnh nguy hiểm trên trẻ em do EHEC gây ra đã được ghi nhận ở nhiều quốc gia, trong đó có Nhật Bản từ 2010-2013 (Kanayama và cs., 2005). Từ đó, cho thấy được sự nguy hiểm đối với sức khỏe cộng đồng của chủng vi khuẩn EHEC và vai trò trung gian quan trọng của con bò trong việc phát tán mầm bệnh. Bên cạnh đó, việc điều trị bệnh do vi khuẩn

E. coli trên người và động vật ngày càng trở nên

phức tạp hơn do sự kháng thuốc của vi khuẩn E.

coli. Medina và cs. (2011) khi phân tích các chủng E. coli EHEC phân lập trên gia súc tại châu Âu

và châu Mỹ đã cho thấy các chủng này có sự đề kháng cao với các kháng sinh như tetracycline, trimethoprim/sulfamethoxazole. Heydari và cs. (2020) cũng đã xác định có sự đề kháng kháng

sinh của các chủng E. coli EHEC phân lập trên

người bệnh tiêu chảy tại Iran; vi khuẩn đề kháng với ampicillin, ciprofloxacin (54.5%). Ngoài ra, EHEC đề kháng kháng sinh có thể lây nhiễm sang người nếu bị phát tán ra môi trường từ nguồn phân của gia súc (Nguyen và Sperandio, 2012). Điều này cho thấy mức độ nguy hiểm của EHEC đề kháng thuốc đối với sức khoẻ của con người; do đó đặc điểm đề kháng kháng sinh của EHEC phân lập trên bò cũng cần được nghiên cứu.

Tại Bến Tre, chăn ni bị ngày càng phát triển và được chọn làm phương thức chăn nuôi giúp người nơng dân thốt nghèo và phát triển kinh tế. Tuy nhiên, điều kiện vệ sinh, chăn ni cịn hạn chế, rất dễ làm lây lan và phát tán mầm bệnh trên đàn gia súc và giữa động vật - con người. Do đó nghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích cung cấp thông tin về đặc điểm hiện diện và khả năng đề kháng kháng sinh của vi

khuẩn E. coli O45, O121, O157 phân lập trên

đàn bò tại đây.

II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu

- Phân lập vi khuẩn Escherichia coli từ mẫu

phân bò ở tất cả các độ tuổi, giống, giới tính tại huyện Ba Tri, tỉnh Bến Tre.

- Định danh vi khuẩn Enterohaemorrhagic

Escherichia coli (EHEC) O45, O121, O157 bằng

phương pháp PCR với các đoạn mồi đặc hiệu. - Xác định sự đề kháng kháng sinh của các chủng EHEC được định danh bằng phương

pháp kháng sinh đồ.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp thu thập mẫu

Điều tra cắt ngang được thực hiện với tổng số mẫu dự kiến được tính theo công thức của

Thrusfield (2018) và tỷ lệ lưu hành của E. coli

O157 trên phân bị tại Đồng bằng sơng Cửu Long trong nghiên cứu trước đây là 2,1% (Ly và cs., 2009). Tổng số mẫu phân bò dự kiến thu thập là 32 mẫu. Tuy nhiên, trong quá trình khảo sát đã thu thập 121 mẫu phân bò khoẻ được lấy ở các hộ chăn ni bị tại huyện Ba Tri, tỉnh Bến Tre. Bò được lấy mẫu bao gồm bò thịt và bò sữa HF ở tất cả các lứa tuổi tại địa bàn khảo sát.

Đĩa kháng sinh chuẩn được sử dụng của công ty Nam Khoa (Việt Nam): amikacin (Ak) 30 μg, ampicillin (Am) 10 μg, amoxicillin/clavulanic acid (Ac) 20/10 μg, bactrim (Bt) 1,25/23,75 μg, ceftazidime (Cz) 30 μg, colistin (Co) 10 μg, doxycycline (Dx) 30 μg, ofloxacin (Of) 5 μg, streptomycin (Sm) 10 μg, tetracycline (Te) 30 μg.

- Phân lập vi khuẩn E. coli từ phân bò

Phân bò khoẻ được lấy trực tiếp từ trực tràng bằng găng tay vơ trùng. Sau đó, mẫu phân được chuyển vào bọc nilon vô trùng, ghi ký hiệu, bảo quản trong điều kiện lạnh 2-8oC, và đưa về phịng thí nghiệm phân tích trong 24 giờ.

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Mẫu phân sau khi thu thập tiến hành phân

lập vi khuẩn E. coli theo TCVN:5155-90 và dựa

theo miêu tả của Barrow và Feltham (2003). Mỗi mẫu phân được lấy 25g và cho vào môi trường tăng sinh Buffer peptone water (BPW, Merck, Đức), ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó, mẫu tăng sinh được cấy trên môi trường chuyên biệt Macconkey (MC, Merck, Đức), ủ ở 37oC trong 24 giờ. Chọn những tất cả các khuẩn lạc điển

hình của vi khuẩn E. coli trên môi trường MC

và cấy thuần lại trên môi trường MC, ủ ở 37oC

trong 24 giờ. Khuẩn lạc E. coli nghi ngờ được

kiểm tra đặc điểm sinh hóa trên: môi trường KIA (Kligler Iron Agar), Indole, VP (Voges – Proskauer), MR (Methyl Red) và Simmons Citrate (Merck, Đức).

- Phương pháp định danh vi khuẩn EHEC O45, O121, O157 bằng phương pháp PCR

Ly trích DNA

Tất cả các chủng E. coli được khẳng định sau

khi kiểm tra sinh hóa, được tăng sinh trên môi trường Tryptycase soy agar (TSA, Merck, Đức) và ly trích DNA bằng phương pháp shock nhiệt

của Soumet và cs. (1994). DNA khuôn mẫu sau

khi ly trích được trữ ở -20°C.

Thực hiện phản ứng PCR

Phản ứng PCR sử dụng bộ kit Mastermix 2X (Promega, Mỹ) với tổng thể tích 25µl: Mastermix 2X (12,5µl), mồi xi (F: 0.5µl), mồi ngược (R: 0,5µl), nước tinh khiết (9,5µl), và DNA (2 µl). Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR: 95oC - 5 phút; 30 chu kỳ: 94oC - 30 giây, 57oC - 90 giây, 72oC - 90 giây; 72oC - 5 phút. Trình tự nucleotide các cặp primer được sử dụng trong nghiên cứu này được thể hiện qua Bảng 1.

Bảng 1. Trình tự nucleotide của các cặp mồi primer định danh EHEC O45, O121, O121

ChủngTrình tự primer (5’-3’)Kích thước (bp)tham khảoTài liệu

Sản phẩm PCR được điện di ở hiệu điện thế 50V, trong 60 phút và đọc kết quả dưới tia UV để xác định sự hiện diện của gene mã hoá. Mẫu

đối chứng dương: DNA của vi khuẩn E. coli

O45, O121, O157; mẫu đối chứng âm: nước tinh khiết không chứa enzyme DNA và RNA.

- Phương pháp khảo sát sự nhạy cảm của vi khuẩn EHEC O45, O121 đối với kháng sinh

Kiểm tra sự đề kháng của vi khuẩn E. coli đối

với kháng sinh dựa theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer (CLSI, 2019). Vi khuẩn được khuyếch tán trên đĩa thạch Muller-Hilton agar (MHA, Merck, Đức) ở nồng độ tương

đương ống Mac Farland 0.5 (106-108 CFU/ml); sau đó, đĩa kháng sinh được đặt lên và ủ ở 37oC trong 24 giờ. Kết quả đường kính vịng vơ khuẩn được so sánh theo tiêu chuẩn của CLSI, 2019.

- Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mền Excel 2010. Phân tích tỷ lệ bằng phép thử Chi-square Test của phần mềm Minitab 16 (ở mức ý nghĩa 5%).

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.

Sự hiện diện của các chủng vi khuẩn

EHEC O45, O121, O157 trên bò tại huyện Ba Tri, Bến Tre

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Kết quả khảo sát sự hiện diện các chủng

EHEC O45, O121, O157 phân lập trên phân bò tại huyện Ba Tri tỉnh Bến Tre qua Bảng 2.

Bảng 2. Tỷ lệ hiện diện của các chủng vi khuẩn E.coli O45, O121, O157 trên bị (n=121)

Chủng EHECSố mẫu dương tínhTỷ lệ (%)

Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định chủng vi khuẩn (a) E.coli O45 (255bp) và (b) E. coli O121 (628bp)

M: 100 bp DNA marker; P: đối chứng dương; N: đối chứng âm(a): Giếng 1, 2, 4: (+); Giếng 3:(-); (b): Giếng 1, 2, 4: (+); Giếng 3:(-)

Kết quả cho thấy tỷ lệ lưu hành của các chủng EHEC tương đối thấp (11,57%) và khơng có sự khác biệt về mặt thống kê giữa tỷ lệ hiện

diện của hai chủng E. coli O45 (4,13%) và O121

(7,44%) (P>0,05); khơng tìm thấy sự hiện diện

của vi khuẩn E. coli O157 trong nghiên cứu này.

Các chủng vi khuẩn EHEC đều có khả năng tồn tại trong đường ruột của các loài nhai lại như một phần của hệ vi sinh vật tự nhiên. Trong khi

đó, sự vắng mặt của vi khuẩn E. coli O157 có

thể bị ảnh hưởng bởi độ tuổi của vật chủ, do hầu hết bò tại thời điểm được khảo sát đều đã trưởng

thành. Gannon và cs. (2002) đã ghi nhận E. coli

O157 hiện diện trên bê sẽ cao hơn hơn trên bò trưởng thành. Đồng thời, do sự thiếu mất các thụ

thể Gb3 cần thiết cho sự bám dính của E. coli O157 lên các tế bào ruột, từ đó làm suy giảm số lượng vi khuẩn tồn tại, phát triển trong đường ruột, cũng như số lượng vi khuẩn được đào thải theo phân ra ngoài (Brown và cs., 1997). Nghiên cứu của Paddock và cs. (2012) trên 216 mẫu phân gia súc tại Mỹ đã cho thấy tỷ lệ hiện

diện của vi khuẩn E. coli O45 là 50% và E. coli

O121 là 47,69%. Mainga và cs. (2018) khi khảo sát sự hiện diện của các chủng vi khuẩn EHEC

trên bò tại Nam Phi với tỷ lệ E. coli O45 (2.9%).

Qua kết quả nghiên cứu này cho thấy con bò là

một nguồn mang vi khuẩn E. coli O45, O121

nguy hiểm tại địa bàn khảo sát.

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

3.2.

Sự hiện diện của các chủng vi

khuẩn E. coli O45, O121 trên bò theo

mục đích sử dụng

Tại huyện Ba Tri, bị được ni với mục đích để lấy thịt và lấy sữa. Tuy nhiên, tại Việt Nam nói

chung, cũng như tại Đồng bằng sơng Cửu Long hầu như khơng có nghiên cứu về đặc điểm lưu hành của EHEC trên hai đối tượng bị này. Do đó, trong nghiên cứu này, tỷ lệ hiện diện của vi khuẩn

E. coli O45 và O121 trên hai nhóm bị này được

phân tích và thể hiện kết quả qua Bảng 3.

Bảng 4. Tỷ lệ hiện diện các chủng vi khuẩn E. coli O45, O121 trên bị theo giới tính

Giới tính khảo sátSố mẫu Chủng E. coli O45Chủng E. coli O121

Bảng 3. Tỷ lệ hiện diện các chủng vi khuẩn E. coli O45, O121 trên bị theo mục đích sử dụng

Giống bò khảo sátSố mẫu Chủng E. coli O45Chủng E. coli O121

Kết quả khảo sát cho thấy khơng có sự khác biệt về mặt thống kê giữa tỷ lệ hiện diện

của chủng vi khuẩn E. coli O121 trên bò sữa

(13,51%) và bò thịt (4,76%) (P> 0,05). Tuy

nhiên, sự hiện diện của vi khuẩn E. coli O45 trên

bò sữa (10,81%) cao hơn trên bò thịt (1,19%) và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P=0,05). Trong khảo sát này, nguyên nhân của sự sai khác này có thể do số lượng mẫu thu thập cịn chênh lệch giữa hai nhóm bị tại địa bàn nghiên cứu (do thực tế chăn ni bị thịt nhiều hơn tại đây). Vì vậy, cần có các nghiên cứu với quy mô lớn hơn để xác định đặc điểm hiện diện của các chủng EHEC này trên hai nhóm bị này tại tỉnh Bến Tre. Kết quả nghiên cứu này thấp hơn kết quả nghiên cứu của Mellor và cs. (2016) khi kiểm

tra các mẫu phân thu thập trên bò thịt, bò sữa tại

Úc, tỷ lệ hiên diện của vi khuẩn E. coli O45 trên

bò thịt (22,7%), bò sữa (19,6%), và chủng O121 trên bò thịt (21,0%), bò sữa (20,3%). Tuy vậy, kết quả trong nghiên cứu này đã chỉ ra trên bò sữa và bò thịt đều là nguồn mang các chủng vi

khuẩn E. coli O45 và O121.

3.3. Sự hiện diện của các chủng vi khuẩn

E. coli O45, O121 trên bị theo giới tính

Một số nghiên cứu trên thế giới đã ghi nhận đặc điểm về sự hiện diện của EHEC giữa hai giới tính (đực, cái) trên bị. Do đó, trong nghiên cứu này tỷ lệ hiện diện của các chủng vi khuẩn

E. coli O45 và O121 dựa trên giới tính được

phân tích và thể hiện qua Bảng 4.

Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự lưu hành

của các chủng vi khuẩn E. coli O45 và O121 trên bò đực và bị cái; đồng thời, khơng có sự khác biệt về mặt thống kê giữa tỷ lệ hiện diện

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

của cả hai chủng này trên hai giới tính (P>0,05). Lồi nhai lại là nguồn mang trùng; đồng thời, do tình trạng ni nhốt giữa gia súc đực và gia súc cái trong cùng chuồng làm gia tăng khả năng vấy nhiễm mầm bệnh. Jeffrey và cs. (2001) ghi nhận các chủng vi khuẩn EHEC có thể tồn tại khoảng 245 ngày trong máng ăn và máng ăn của gia súc có thể là ổ chứa lâu dài cho vi khuẩn EHEC trong các trang trại. Hutchison và cs. (2005) cho biết tỷ lệ nhiễm các chủng vi khuẩn EHEC không bị ảnh hưởng bởi giới tính.

3.4. Sự hiện diện các chủng vi khuẩn E. coli

O45, O121 trên bò theo lứa tuổi

Các chủng EHEC được ghi nhận có khả năng hiện diện trên bê cao hơn trên bò trưởng thành (Hussein và Sakuma, 2005). Do đó, độ tuổi của bò được thu thập mẫu trong nghiên cứu này được phân tích nhằm xác định đặc điểm lưu hành của EHEC giữa các nhóm tuổi. Tuy nhiên, trong thực tế khảo sát, do bò tại huyện Ba Tri chủ yếu được mua về để tiếp tục nuôi thịt hoặc lấy sữa, nên bò tại đây đều ở độ tuổi lớn. Vì

vậy, sự hiện diện của các chủng vi khuẩn E. coli

O45, O121 trên đàn bò tại đây được chia làm hai nhóm là bị ≤12 tháng tuổi và bò >12 tháng tuổi, kết quả được thể hiện qua Bảng 5.

Bảng 5. Tỷ lệ hiện diện các chủng vi khuẩn E. coli O45, O121 trên bò tại hai huyện theo lứa tuổi

Lứa tuổi khảo sátSố mẫu Chủng E. coli O45Chủng E. coli O121

Các chủng vi khuẩn E. coli O45 chỉ tìm thấy trên bị >12 tháng tuổi với tỷ lệ 4,46%. Trong khi đó, tỷ lệ hiện diện của chủng E. coli O121 thì khơng có sự khác biệt về thống kê giữa hai nhóm tuổi (P>0,05). Nguyên nhân có thể do số lượng bò ≤12 tháng tuổi khi khảo sát cịn ít dẫn đến sự chênh lệch này. Ngoài ra, nghiên cứu của Vilte và cs. (2008) cho rằng sữa non của bị mẹ có kháng thể IgG và lactoferrin có khả năng đề kháng và làm giảm khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn EHEC. Donkersgoed và cs. (1999) khi nghiên cứu trên đàn gia súc ở Canada cho biết tỷ lệ hiện diện vi khuẩn EHEC không phụ thuộc vào yếu tố độ tuổi của đàn gia súc. Các nghiên cứu khác cần tiếp tục được thực hiện tại huyện Ba Tri và tỉnh Bến Tre để xác định chính xác tỷ lệ hiện diện của các chủng EHEC trên bò ở các độ tuổi khác nhau.

3.5. Kết quả khảo sát tính đề kháng kháng

sinh của các chủng vi khuẩn E.coli O45, O121

phân lập được đối với kháng sinh

Vi khuẩn EHEC không gây bệnh cho bò, nhưng là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên người khi bị vấy nhiễm từ phân bò. Đồng thời, sự đề kháng kháng sinh của EHEC lưu hành trên bị có ảnh hưởng lớn đến khả năng điều trị bệnh do các chủng này gây ra trên người khi bị vấy nhiễm (Nguyen and Sperandio, 2012). Do đó,

các chủng vi khuẩn E. coli O45, O121 phân lập

trên bò tại huyện Ba Tri được kiểm tra kháng sinh đồ nhằm cung cấp thông tin tham khảo trong việc lựa chọn kháng sinh điều trị bệnh do EHEC gây ra. Kết quả khảo sát được thể hiện qua Bảng 6.

Các chủng vi khuẩn E. coli O45, O121

còn nhạy cảm cao với kháng sinh amikacin và doxycycline (100%), ofloxacin (85,71%), ceftazidime (71,43%) và bactrim, tetracycline

(69,29%) (Bảng 6). Các chủng vi khuẩn này

cịn nhạy cảm cao với kháng sinh vì trong chăn nuôi gia súc nhai lại, kháng sinh được hạn chế sử dụng do ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Bảng 6. Kết quả kiểm tra tính đề kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli O45, O121

phân lập trên bò tại huyện Ba Tri, tỉnh Bến Tre (n= 14)

Loại kháng sinhNhạyKháng

dạ cỏ. Tuy nhiên, các chủng này đã biểu hiện sự đề kháng đối với streptomycin (50,00%), colistin (57,14%) và ampicillin (64,29%). Vi khuẩn EHEC đề kháng kháng sinh có thể do khả năng tự đề kháng tự nhiên của vi khuẩn, hoặc do tiếp xúc với các tác nhân gây đề kháng kháng sinh xung quanh môi trường (Heydari và cs., 2020). Ngoài ra, việc trao đổi mua bán con giống tự do trên địa bàn tỉnh Bến Tre tạo điều kiện cho các chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh phát tán trên phạm vi lớn. Um và cs. (2018) phân tích sự đề kháng kháng sinh của

E. coli EHEC (O26, O103, O111, O145, O157)

tại Pháp cũng đã ghi nhận sự đa kháng thuốc đối với ampicillin, streptomycin, nalidixic acid, tetracycline. Rubab và Oh (2020) khi phân tích các chủng EHEC (O26, O45, O103, O104, O113, O121, O145, O157) phân lập trên người và gia súc đã cho thấy có sự tương đồng về khả năng đề kháng kháng sinh giữa các chủng trên người và gia súc; các chủng này cùng đề kháng cao với ampicillin, streptomycin, gentamycin, tetracycline. Do đó, việc kiểm sốt các chủng EHEC đề kháng kháng sinh là cần thiết nhằm bảo vệ sức khoẻ vật nuôi và con người.

IV. KẾT LUẬN

Trên đàn bò tại huyện Ba Tri, tỉnh Bến Tre, có sự lưu hành của vi khuẩn EHEC O45 và O121, nhưng khơng tìm thấy sự hiện diện của chủng EHEC O157. Sự lưu hành của các chủng

E. coli O45, O121 không phụ thuộc vào giới

tính, độ tuổi; tuy nhiên, sự hiện diện của E. coli

O45 trên bò sữa cao hơn bò thịt trong nghiên

cứu này. Đồng thời, vi khuẩn E.coli O45, O121

đã có sự đề kháng cao đối với một số kháng sinh như colistin và ampicillin. Cần có các nghiên cứu tiếp theo để đánh giá độc lực và khả năng gây bệnh của các chủng EHEC này.

Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được thực hiện

với sự hỗ trợ của Chi cục Chăn nuôi và Thú y, cùng các đơn vị liên quan của tỉnh Bến Tre. Nguồn kinh phí thực hiện nghiên cứu từ đề tài cấp tỉnh của Sở KHCN Bến Tre.

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Armstrong G.L., Hollingsworth J., and Morris J.G.Jr., 1996.

Emerging foodborne pathogens: Escherichia coli O157:H7 as

a model of entry of a new pathogen into the food supply of the

developed world. Epidemiol. Rev.,18(1): 29-51.

2. Barrow G.I., and Feltham R.K.A., 2003. Cowan and Steel’s manual for identification of medical bacteria. Cambridge press, 3rd (ed): 140-142.

3. Bertrand R. and Roig B., 2007. Evaluation of

enrichment-free PCR-based detection on the rfbE gene of Escherichia

coli O157-application to municipal wastewater. Water Res.,

41(6): 1280-1286.

4. Brown C.A., Barry G.H., Tong Z., and Micheal P.D., 1997.

Experimental Escherichia coli O157:H7 carriage in calves.

Appl. Environ. Microbiol., 63(1): 27-32.

5. CLSI, 2019. Performance Standard for Antimicrobial-Susceptibility Testing 28th edition. Clinical and Laboratory Standard Institute. M100S, Wayne, PA, USA.

6. Debroy C., Robert E., and Fratamico P.M., 2011. Detection

of O antigens in Escherichia coli. Anim. Health Res. Rev.,

12(2): 169-185.

7. Dewsbury D.M.A., Renter D.G., Shridhar P.B., Noll L.W., Shi X., Nagaraja T.G., and Cernicchiaro N., 2015. Summer and

winter prevalence of Shiga toxin–producing Escherichia coli

(STEC) O26, O45, O103, O111, O121, O145, and O157 in feces

of feedlot cattle. Foodborne Pathog. Dis., 12(8): 726-732.

8. Donkersgoed V.J., Berg J., Potter A., Hancock D., Besser T., Rice D., LeJeune J., and Klashinsky S., 2001. Environmental

sources and transmission of Escherichia coli O157 in feedlot cattle. Can. Vet. J., 42(9), pp. 714-20.

9. Gannon V.P.J., Graham T.A., King R., Michel P., Read S.,

Ziebell K., and Johnson R.P., 2002. Escherichia coli O157:H7

infection in cows and calves in a beef cattle herd in Alberta,

Canada. Epidemiol. Infect., 129: 163–172.

10. Griffin P.M. and Tauxe R.V., 1991. The epidemiology of

infections caused by Escherichia coli O157: H7, other enterohemorrhagic E. coli and the associated hemolytic uremic syndrome. Epidemiol. Rev., 13: 60-98.

11. Heydari F.E., Mojtaba B., Moshtaghi H., and Sami M., 2020. Prevalence and antibiotic resistance profile of Shiga

toxin-producing Escherichia coli isolated from diarrheal samples.

Iran. J. Microbiol., 12(4): 289-295.

12. Hussein H.S., and Sakuma T., 2005. Prevalence of shiga

toxin-producing Escherichia coli in dairy cattle and their products. J. Dairy Sci., 88(2): 450-465.

13. Hutchison M.L., Walters L.D., Avery S.M., Munro F., and Moore A., 2005. Analyses of livestock production, waste storage, and pathogen levels and prevalences in farm

manures. Appl. Environ. Microbiol., 71(3): 1231-1236.

14. Jeffrey T.L., Besser T.E., and Hancock D.D., 2001. Cattle

water troughs as reservoirs of Escherichia coli O157. Appl.

Environ. Microbiol., 67(7): 3053-3057.

15. Kanayama A., Yahata Y., Arima Y., Takahashi T., Saitoh T., Kanou K., Kawabata K., Sunagawa T., Matsui T., and Oishi

K., 2015. Enterohemorrhagic Escherichia coli outbreaks related to childcare facilities in Japan, 2010-2013. BMC

Infect. Dis., 15: 539.

16. Ly T.L.K., Tran T.P., Nguyen T.T., Iwata T., Kobayashi H., Okatani A.T., Taniguchi T., Ha T.T., and Hayashidani H.,

2009. Prevalence of Escherichia coli O157 from cattle and foods in the Mekong Delta, Vietnam. J. Vet. Epidemiol.,

13(2): 107-113.

17. Mainga A.O., Cenci Goga B.T., Malahlela M.N., Tshuma T., Kalake A., and Karama M., 2018. Occurrence and characterization

of seven major Shiga toxin producing Escherichia coli

serotypes from healthy cattle on cow–calf operations in South

Africa. Zoonoses and Public health, 65(7): 777-789.

18. Medina A., Horcajo P., Jurado S., Fuente R.D.L., Ruiz-Santa-Quiteria J.S., Dominguez-Bernal G., and Orden J.A., 2011. Phenotypic and genotypic characterization of antimicrobial

resistance in enterohemorrhagic Escherichia coli and atypical enteropathogenic E. coli strains from ruminants. J. Vet.

Diagn. Invest., 23: 91–95.

19. Mellor G.E., Fegan N., Duffy L.L., McMillan K.E., Jordan D., and Barlow R.S., 2016. National survey of shiga toxin–

producing Escherichia coli serotypes O26, O45, O103, O111, O121, O145, and O157 in Australian beef cattle feces. J.

Food Prot., 79 (11): 1868–1874.

20. Nguyen Y., and Sperandio V., 2012. Enterohemorrhagic E.

coli (EHEC) pathogenesis. Front. Cell Infect. Microbiol.,

2(90): 1-7.

21. Paddock Z., Shi X., Bai J., and Nagaraja T.G., 2012. Applicability of a multiplex PCR to detect O26, O45, O103,

O111, O121, O145, and O157 serogroups of Escherichia coli in cattle feces. Vet. Microbiol., 156: 381-388.

22. Rubab M., and Oh D.H., 2020. Virulence characteristics and

antibiotic resistance profiles of shiga toxin-producing Escherichia

coli isolates from diverse sources. Antibiotics, 9(9): 587-602.

23. Soumet C., Ermel G., Fach P., and Colin P., 1994. Evaluation of different DNA extraction procedures for the detection

of Salmonella from chicken products by polymerase chain reaction. Lett. Appl. Microbiol., 19(5): 294-298.

24. Thrusfield M., 2018. Veterinary epidemiology 4th Edition. John Wiley and Sons Ltd., UK., 276-277.

25. Um M.M., Hubert B., Monique K., Eric O., and Delphine B., 2018. Antimicrobial resistance profiles of Enterohemorrhagic

and Enteropathogenic Escherichia coli of serotypes O157:H7,

O26:H11, O103:H2, O111:H8, O145:H28 compared to

Escherichia coli isolated from the same adult cattle. Microb. Drug Resist., 24(6): 852-859.

26. Vilte D.A., Larzábal M., Cataldi Á.A., and Mercado E.C., 2008. Bovine colostrum contains immunoglobulin G antibodies against intimin, EspA, and EspB and inhibits hemolytic activity mediated by the type three secretion

system of attaching and effacing Escherichia coli. Clin.

Vaccine Immunol., 15(8): 1208-1213.

Ngày nhận 1-6-2021 Ngày phản biện Ngày đăng 15-8-2021

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM CỦA VI KHUẨN RIEMERELLA ANATIPESTIFER PHÂN LẬP TỪ VỊT MẮC

BỆNH NHIỄM TRÙNG HUYẾT Ở VIỆT NAM

Võ Thành Thìn*, Đặng Văn Tuấn, Lê Đình Hải

Phân viện Thú y Miền Trung

*Email:

TĨM TẮT

Trong nghiên cứu này, một số đặc tính nuơi cấy và sinh hĩa của các chủng vi khuẩn Riemerella

anatipestifer (RA) phân lập được từ mẫu bệnh phẩm vịt mắc bệnh nhiễm trùng huyết tại Việt Nam

được kiểm tra. Đồng thời, khả năng gây bệnh thực nghiệm trên vịt 2 tuần tuổi của các chủng vi khuẩn này cũng được đánh giá. Kết quả cho thấy, vi khuẩn phát triển tốt trên mơi trường BHI, trên thạch máu và Chocolate hình thành khuẩn lạc cĩ đường kính khoảng 1 - 2 mm, trịn lồi, rìa gọn, nhầy hơi ướt trong điều kiện 37oC sau 24 – 48 giờ, đặc biệt vi khuẩn khơng mọc trên mơi trường MacConkey. Vi khuẩn khơng lên men tất cả các loại đường trong mơi trường sinh hĩa, phản ứng Catalase và Oxidase dương tính. Vi khuẩn RA cĩ độc lực cao trên vịt thí nghiệm, liều LD50 từ 1,5 x 108 – 6,4 x 108 CFU/con. Đường gây nhiễm tốt nhất ở vịt là tiêm bắp thịt hoặc dưới da.

Từ khóa: Bệnh nhiễm trùng huyết ở vịt, vi khuẩn Riemerella anatipestifer, vịt

Some biological characteristics and experimental pathogenicity of

riemerella anatipestifer isolated from duck septicaemia in vietnam

Vo Thanh Thin, Dang Van Tuan, Le Dinh Hai

In this study, some culture and biochemical properties of Riemerella anatipestifer (RA)

strains isolated from samples that taken in ducks with septicaemia in Vietnam were examined. Meanwhile, the ability of these strains to cause experimental disease in 2-week-old ducks was also evaluated. The results showed that, the bacteria grew well on BHI broth medium, on blood agar and chocolate agar, forming colonies with a diameter of about 1-2 mm, round convex, compact edges, slightly wet mucus in the condition of 37oC after 24 - 48 hours, especially bacteria do not grow on MacConkey. Bacteria did not ferment all sugars in biochemical medium, but Catalase and Oxidase reactions were positive. The RA is highly virulent in experimental ducks, LD50 from 1.5 x 108 - 6.4 x 108 CFU/duck. The best routes to infect ducks is intramuscular or subcutaneous.

Keywords: Duck, duck septicaemia, Riemerella anatipestifer

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngành chăn nuơi gia cầm đang được đầu tư và phát triển mạnh mẽ. Theo Cục Chăn nuơi, tính đến cuối năm 2020, cả nước cĩ khoảng 500 triệu gia cầm. Trong đĩ, cĩ khoảng 82 triệu con vịt được chăn nuơi rải đều trên cả nước (Cục Chăn nuơi, 2020). Tuy nhiên, vấn đề đặt ra cho ngành chăn

nuơi vịt hiện nay là tình hình dịch bệnh gây ảnh hưởng lớn đến hiệu quả kinh tế. Một trong những bệnh xuất hiện khá phổ biến tại Việt Nam hiện nay được quan tâm nhiều đĩ là bệnh nhiễm trùng huyết

do vi khuẩn Riemerella anatipestifer (RA) gây ra.

Nhiễm trùng huyết do vi khuẩn RA là bệnh truyền nhiễm trên vịt nuơi, ngỡng, gà tây và một

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

số loài gia cầm khác. Bệnh được phát hiện lần đầu tiên trên vịt vào năm 1932 tại New York (Mỹ) (Ruiz và Sandhu, 2013). Bệnh thường xảy ra ở thể cấp tính hoặc nhiễm trùng huyết mạn tính (chronic septicemia) với triệu chứng đặc trưng như rối loạn thị giác, rối loạn vận động, sưng phù đầu – cổ, ngoẹo cổ, rung đầu – cổ, viêm khớp. Vịt mắc bệnh bị suy gan, suy thận và các nội tạng khác của cơ thể làm cho vịt chết rất nhanh với tỷ lệ chết cao,

lên đến 90% (Li và cs., 2011). Ở nước ta, bệnh nhiễm trùng huyết do RA gây ra trên vịt vẫn thường xuyên xảy ra ở các trang trại và hộ chăn nuôi vịt, gây thiệt hại đáng kể cho người chăn nuôi. Theo

Bùi Hữu Dũng và cs. (2016), khi xác định sự hiện

diện của vi khuẩn RA từ mẫu bệnh phẩm vịt mắc bệnh nhiễm trùng huyết tại một số tỉnh phía nam bằng phương pháp PCR cho thấy có 53,94% mẫu dương tính với vi khuẩn RA. Nghiên cứu của Lý Thị Liên Khai và Nguyễn Hiền Hậu (2018) cũng cho thấy có 50,6% mẫu bệnh phẩm vịt nghi mắc bệnh nhiễm trùng huyết tại tỉnh Bến Tre dương tính với vi khuẩn RA. Năm 2020, Võ Thành Thìn

và cs. đã tiến hành phân lập và định danh được vi

khuẩn RA từ mẫu bệnh phẩm vịt bệnh nhiễm trùng huyết tại nhiều địa phương trong cả nước. Trong nghiên cứu này, một số đặc tính ni cấy, sinh hóa và khả năng gây bệnh thực nghiệm trên vịt của các chủng RA được đánh giá để có cơ sở tiếp tục nghiên cứu lựa chọn chủng giống đủ tiêu chuẩn dùng cho sản xuất vắc-xin phòng bệnh.

II. NGUYỆN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

- Chủng vi khuẩn RA: được Võ Thành Thìn

và cs. (2020) phân lập từ mẫu bệnh phẩm vịt

mắc bệnh nhiễm trùng huyết tại Việt Nam. - Môi trường dùng trong nuôi cấy vi khuẩn RA: BHI, thạch máu, thạch Chocolate và MacConkey.

- Mơi trường, hóa chất dùng để xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn RA: bộ Kit API 20 NE (BioMerieux), NaCl 0,85%, James (BioMerieux, 70.542), NIT 1 + NIT chất sinh hóa của vi khuẩn RA;

- Đánh giá khả năng gây bệnh thực nghiệm trên vịt của một số chủng vi khuẩn RA:

+ Độc lực vi khuẩn trên vịt;

+ Liều gây chết 50% (LD50)và đường gây nhiễm tối ưu trên vịt.

+ Đánh giá một số bệnh tích đại thể và vi thể trên vịt gây nhiễm.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

Đặc tính ni cấy của vi khuẩn RA được kiểm tra bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch máu, thạch Chocolate, MacConkey và BHI trong điều kiện hiếu khí ở 37oC sau 24 – 48 giờ. Sau đó, quan sát hình thái khuẩn lạc và khả năng phát triển của vi khuẩn trên mơi trường.

Đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn RA được xác định bằng bộ kit API 20NE. Quy trình thực hiện và dánh giá kết quả theo hướng dẫn của nhà cung cấp kit (BioMerieux, Pháp). Kiểm tra tính chất Catalase và Oxidase theo

Markey và cs. (2013).

Độc lực của vi khuẩn RA trên vịt được đánh

giá dựa theo Seo và cs. (2013). Vi khuẩn RA

nuôi cấy trên môi trường BHI/ 37oC/ 24 giờ. Pha loãng canh khuẩn, đếm số lượng vi khuẩn và tiến hành gây nhiễm cho vịt 2 tuần tuổi theo đường tiêm bắp, mỗi chủng vi khuẩn gây nhiễm cho 5 con. Theo dõi vịt thí nghiệm hằng ngày để đánh giá thời gian nung bệnh, phát bệnh và các triệu chứng lâm sàng đến 7 ngày. Vịt chết được mổ khám để đánh giá bệnh tích và phân lập lại vi khuẩn RA.

Liều gây chết 50% vịt thí nghiệm (LD50)

được đánh giá dựa theo Cammayo và cs.

(2020). Vi khuẩn RA nuôi cấy trên môi trường

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

BHI/ 37oC/ 24 giờ, xác định số lượng vi khuẩn, sau đó pha lỗng canh khuẩn ở các nồng độ khác nhau. Tiến hành gây nhiễm cho vịt 2 tuần tuổi theo đường tiêm dưới da, tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch, nhỏ mũi hoặc cho uống với liều 0,2 ml/con. Theo dõi vịt thí nghiệm hằng ngày để đánh giá thời gian nung bệnh, khởi phát và phát bệnh, số lượng vịt sống/ chết đến 10 ngày để tính LD50. Giá trị LD50 củavi khuẩn trên vịt được xác định theo Reed và Muench (1938). Căn cứ vào giá trị LD50 để đánh giá độc lực vi khuẩn và lựa chọn đường gây nhiễm tối ưu nhất trên vịt.

Tất cả vịt chết trong quá trình thí nghiệm đều được mổ khám đánh giá bệnh tích đại thể và vi thể (tim, gan, lách, não, phổi), phân lập lại vi khuẩn RA. Mẫu xét nghiệm vi thể được bảo quản trong formalin 10%. Mẫu sau khi cố định được vùi parafin, đúc khối parafin, cắt, dán mảnh cắt và nhuộm Hematoxylin – Eosin. Quá trình phân tích và đánh giá bệnh tích vi thể thực hiện tại Bộ môn Bệnh lý – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đặc tính ni cấy và đặc tính sinh hóa vi khuẩn RA

Các chủng vi khuẩn RA phân lập từ mẫu bệnh phẩm vịt mắc bệnh nhiễm trùng huyết đều phát triển tốt trên môi trường như thạch máu, thạch Chocolate trong điều kiện hiếu khí ở 37oC sau 24 – 48 giờ, không phát triển trên môi trường MacConkey. Trên mơi trường thạch máu, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc có đường kính khoảng 1 - 2 mm, trịn lồi, trắng trong, rìa gọn, nhầy hơi ướt và khơng gây dung huyết (hình 3.1a). Trên thạch Chocolate, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc rìa gọn, màu trắng xám, nhầy hơi ướt, có kích thước từ 1 – 2 mm (hình 3.1b). Như vậy, khả năng phát triển trên môi trường thạch máu và Chocolate của các chủng vi khuẩn RA phân lập được giống như các nghiên cứu khác đã mô tả (Krieg và

cs., 2011; Majhi và cs., 2020). Trên môi trường BHI,

vi khuẩn phát triển tốt, không lắng cặn và gây đục nhẹ ống nghiệm. Đặc biệt, vi khuẩn kết thành sợi đặc trưng khi lắc ống nghiệm (hình 3.2) – đây là phát hiện mới về khả năng phát triển của vi khuẩn này trên môi trường BHI mà chưa có tài liệu nào cơng bố.

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn RA trên thạch máu (a) và Chocolate (b)

Hình 3.2. Vi khuẩn RA phát triển trên môi trường BHI

a) trước khi lắc; b) sau khi lắc

b b

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

Một số đặc tính sinh hóa các chủng vi khuẩn

RA phân lập được tiến hành kiểm tra bằng bộ kit API 20NE. Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 và minh họa ở hình 3.3.

Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn RA

TTChỉ tiêu kiểm traSố chủng kiểm tradương tínhSố chủng

(chuyển nitrate ⁵ nitrites; chuyển nitrate ⁵ nitrogen) 69 0 7Tryptophane/ sinh Indol694

Hình 3.3. Kiểm tra đặc tính sinh hóa vi khuẩn RA trên bộ API 20NE

a) Vi khuẩn RA, trước khi bổ sung NIT 1 và NIT 2 vào ống NO3; b) Vi khuẩn RA, sau khi bổ sung NIT 1 và NIT 2 vào ống NO3; c) Đối chứng: vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Kết quả bảng 3.1 cho thấy, tất cả các chủng vi khuẩn RA phân lập từ vịt khơng có khả năng lên men các loại đường như Glucose, Mannitol, Arabinose, Mannose, Maltose; không có khả năng chuyển nitrate thành nitrites hay nitrate thành nitrogen; khơng sinh Argine dihydrolase, Urease, H2S; âm tính với β-galactosidase; không sử dụng N-acetyl-glucosamine, Potassium gluconate, Capric acid, Adipic acid, Malic acid (malate), Trisodium citrate, Phenylacetic acid;

Theo Hinz và cs. (1998a), vi khuẩn RA không

lên men đường trong mơi trường ni cấy, có thể hóa lỏng Gelatin, không sinh Indol và H2S. Một số chủng RA có phản ứng Indol dương tính

(Hinz và cs., 1998b). Chỉ có một vài chủng RA

sinh Urease và Arginine dihydrolase; hầu hết các chủng âm tính với α- và β-galactosidases, β-glucuronidase, β-glucosidase, α-mannosidase, β-glucosaminidase, Lipase C14, Fucosidase, Ornithine và Lysine decarboxylases. Vi khuẩn RA không chuyển Nitrate thành Nitrite, không thủy phân tinh bột; vi khuẩn sinh Oxidase,

Catalase (Krieg và cs., 2011).

Nghiên cứu của Cha và cs. (2015), Surya và cs. (2016) cho thấy vi khuẩn RA phân lập

từ chim (tại Hàn Quốc) và vịt (tại Ấn Độ) cũng mang một số đặc tính sinh hóa tương tự. Tất cả các chủng RA phân lập được đều cho phản ứng Catalase và Oxydase dương tính, hóa lỏng Gelatin; vi khuẩn không chuyển Nitrate thành Nitrite, khơng sinh Indol; khơng có khả năng lên men 12 loại đường, trong đó có Glucose, Mannitol, Arabinose, Mannose, Maltose.

Nghiên cứu gần đây của Shancy và cs. (2018)

cũng cho thấy các đặc tính sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn RA là không đi động, Catalase và Oxydase dương tính, khơng sinh Indol và H2S, khơng chuyển hóa Nitrate, hóa lỏng Gelatin, không lên men nhiều loại đường như Dextrose, Galactose, Lactose, Fructose, Sucrose, Xylose,

Mannose, Maltose, Mannitol, Sorbitol, Dulcitol, Adonitol, Inositol, Salicin, Inulin, Arabinose, Trehalose, Melibiose, Cellobiose, Rhamnose, Raffinose. Như vậy, đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn RA phân lập được trong nghiên cứu này phù hợp với kết quả của nhiều nghiên cứu trước đây đã mô tả.

3.2. Đánh giá khả năng gây bệnh thực nghiệm trên vịt của một số chủng vi khuẩn RA

Khả năng gây bệnh trên vịt của một số chủng vi khuẩn RA phân lập được thể hiện ở bảng 3.2. Kết quả cho thấy, tất cả các chủng RA đều có khả năng gây bệnh trên vịt. Trong đó, 19/24 chủng gây chết 100%, 3/24 chủng gây chết 80% và 2/24 chủng gây chết 60% vịt thí nghiệm. Kết quả phân lập lại vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm vịt chết cho thấy chỉ có vi khuẩn RA. Điều này chứng tỏ vịt thí nghiệm chết là do vi khuẩn RA.

Theo dõi vịt thí nghiệm nhận thấy vịt xuất hiện triệu chứng đầu tiên sau 24 giờ gây nhiễm và chết trong vòng 24 – 48 giờ tiếp theo. Các triệu chứng điển hình xuất hiện trên tất cả vịt sau gây nhiễm là vịt lờ đờ, bỏ ăn, tiêu chảy phân xanh, chảy nước mũi, sưng phù đầu – cổ (hình 3.4a); rung đầu – cổ, ngoẹo cổ, thường nằm ngữa, 2 chân duỗi – đạp (hình 3.4b); đi lại khó khăn, vịt nằm 2 chân d̃i ra như bơi (hình 3.4c).

Mổ khám vịt mắc bệnh và chết cho thấy một số bệnh tích đại thể điển hình quan sát được là xác vịt còi cọc, gầy; gan sưng to, bở, màng bao gan bị viêm có màu trắng đục (hình 3.5a); viêm màng ngồi bao tim có sợi huyết (hình 3.5b); lách sưng to và có những vết chấm lốm đốm; phổi không thể hiện bệnh tích đặc trưng, một số con có phổi xung huyết, viêm có mũ lẫn sợi huyết; khớp sưng, phù nề.

Một số bệnh tích vi thể chủ yếu quan sát được trên mẫu bệnh phẩm phổi và gan vịt gây nhiễm là phổi xuất huyết, hồng cầu tràn ngập trong lịng các phế nang (hình 3.6a), phổi xuất huyết, rải rác có nhiều đám hemoshiderin màu nâu đậm trên nền hồng cầu màu đỏ (hình 3.6b), viêm phổi, thâm nhiễm tế bào viêm trong lòng

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

-Hình 3.5. Một số triệu chứng thường gặp trên vịt gây nhiễm

a) Vịt sưng phù đầu; b) Vịt nằm ngữa, 2 chân duỗi – đạp, ngoẹo cổ; c) Vịt nằm, 2 chân duỗi ra như bơi

các phế nang, phế quản (hình 3.6c); tế bào gan

thối hóa khơng bào (hình 3.6d), gan sung huyết, hồng cầu tràn ngập trong các mạch quản và vi quản xuyên tâm (hình 3.6e), thâm nhiễm

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

tế bào viêm ở gan (hình 3.6f), tế bào gan thối hóa mỡ (hình 3.6g). Các biến đổi bệnh lý vi thể ở tim, não và lách là không rõ ràng. Đây là công

bố đầu tiên ở Việt Nam về triệu chứng, bệnh tích đại thể và vi thể bệnh nhiễm trùng huyết do vi khuẩn RA gây ra trên vịt.

Hình 3.6. Một số bệnh tích đại thể trên vịt gây nhiễm

a) Gan sưng to, bở, màng bao gan bị viêm có màu trắng đục; b) Viêm màng bao tim có sợi huyết.

Hình 3.6. Một số bệnh tích vi thể trên vịt gây nhiễm

a) phổi xuất huyết, hồng cầu tràn ngập trong lòng các phế nang, HE x 100; b) phổi xuất huyết, rải rác có nhiều đám hemoshiderin màu nâu đậm trên nền hồng cầu màu đỏ, HE x 200; c) viêm phổi, thâm nhiễm tế bào viêm trong lòng các phế nang, phế quản, HE x 200; d) tế bào gan thoái hóa không bào, HE x 200; e) gan sung huyết, hồng cầu tràn ngập trong các mạch quản và vi quản xuyên tâm, HE x 400; f) thâm nhiễm tế bào viêm ở gan, HE x 400; g) tế bào gan thoái hóa mỡ, HE x 400; h) phổi vịt đối chứng: lòng phế nang rỗng, trong sáng, HE x 400; i) gan vịt đối chứng: tế bào gan sắp xếp trật tự, bắt màu hồng đều, HE x 400.

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Như vậy, các chủng vi khuẩn RA phân lập được đều có khả năng gây bệnh trên vịt. Theo Ruiz và Sandhu (2013), vịt 1 – 8 tuần tuổi được xem là mẫn cảm nhất đối với vi khuẩn RA và thường chết trong vòng 1 – 2 ngày sau khi xuất

hiện triệu chứng. Nghiên cứu của Seo và cs.

(2016) cũng cho thấy với liều gây nhiễm 1 x 109 CFU/con bằng đường tiêm bắp, vi khuẩn RA

có thể gây chết 80 – 100% vịt thí nghiệm trong vịng 7 ngày sau gây nhiễm.

Để đánh giá chính xác liều gây nhiễm và đường gây nhiễm tối ưu của vi khuẩn RA trên vịt, chúng tôi đã tiến hành xác định giá trị LD50 của10 chủng vi khuẩn RA đại diện. Kết quả

Kết quả bảng 3.3 cho thấy, giá trị LD50 của 10 chủng RA khi gây nhiễm cho vịt qua đường dưới da giao động từ 2,3 x 108 – 6,0 x 108 CFU/0,2ml/con, đường tiêm bắp thịt là từ 2,1 x 108 – 6,4 x 108 CFU/0,2ml/con, đường tĩnh mạch là từ 1,5 x 108 – 6,2 x 108 CFU/0,2ml/con. Đối với đường gây nhiễm qua nhỏ mũi và cho uống, giá trị LD50 > 1010 CFU/0,2ml/con. Giá trị LD50 của từng chủng vi khuẩn trên vịt khi gây nhiễm qua đường dưới da, bắp thịt và tĩnh mạch có khác nhau, nhưng sự sai khác này khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), ngoại trừ thời gian chết khi gây nhiễm qua đường tĩnh mạch. Vịt được gây nhiễm vi khuẩn RA bằng đường tĩnh mạch thường chết rất nhanh (trong khoảng 24 giờ sau gây nhiễm) nên rất khó để đánh giá triệu chứng và bệnh tích. Vì vậy, đường gây nhiễm vi khuẩn RA cho vịt thích hợp nhất là tiêm dưới da hoặc tiêm bắp thịt.

Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá độc lực cũng như giá trị LD50 của vi khuẩn RA trên vịt. Các kết quả đều không đồng nhất, tùy thuộc vào độc lực, nguồn gốc vi khuẩn và thời điểm nghiên cứu. Một số nghiên cứu tại Trung Quốc cho thấy, giá trị LD50 của chủng RA độc lực cao vi khuẩn RA đột biến làm giảm độc lực thường có giá trị LD50 trên vịt rất cao (> 1010 CFU) như

chủng RA∆604 (Yu và cs., 2016), Yb2∆pncA (Wang và cs., 2016), CH1∆gldK (Yuan và cs., 2019). Theo Gong và cs. (2020), những chủng

vi khuẩn RA có độc lực cao trên vịt thường có giá trị LD50 vào khoảng 108 CFU, một số chủng có LD50 thấp hơn. Đối với những chủng độc lực

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

yếu hoặc khơng có độc lực, giá trị LD50 ≥ 1010 CFU. Như vậy, kết quả thu được của chúng tôi về độc lực cũng như giá trị LD50 khẳng định các chủng vi khuẩn RA phân lập trong nghiên cứu này có độc lực cao trên vịt và có khả năng gây bệnh thực nghiệm trên vịt với các triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh nhiễm trùng huyết.

IV. KẾT LUẬN

Các chủng vi khuẩn RA phân lập tư mẫu bệnh phẩm vịt mắc bệnh nhiễm trùng huyết phát triển tốt trên môi trường thạch máu, thạch Chocolate trong điều kiện 37oC sau 24 – 48 giờ, không mọc trên môi trường MacConkey. Vi khuẩn tạo thành sợi đặc trưng khi nuôi cấy trên môi trường BHI. Vi khuẩn không lên men tất cả các loại đường trong môi trường sinh hóa, có phản ứng Catalase và Oxidase dương tính.

Vi khuẩn RA có độc lực cao trên vịt. Vịt xuất hiện triệu chứng đầu tiên sau 24 giờ gây nhiễm và chết trong vòng 24 – 48 giờ tiếp theo. Các triệu chứng điển hình xuất hiện trên vịt gây nhiễm bao gồm lờ đờ, bỏ ăn, tiêu chảy phân xanh, chảy nước mũi, sưng phù đầu – cổ, ngoẹo cổ, rung đầu – cổ, đi lại khó khăn, thường nằm ngữa, 2 chân duỗi ra như bơi. Liều gây chết LD50 trên vịt từ 1,5 x 108 – 6,4 x 108 CFU/con. Đường gây nhiễm tốt nhất ở vịt là tiêm bắp thịt hoặc dưới da.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Cục Chăn nuôi, 2020. (http://cucchannuoi. gov.vn/nganh-chan-nuoi-lam-duoc-dieu-ma-the-gioi-chua-lam-duoc/).

2. Bùi Hữu Dũng, Đỗ Tiến Duy, Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Thị Thu Năm, Lê Thanh Hiền, Nguyễn Thị Phước Ninh, 2016. Xác định sự

hiện diện Duck circovirus và Riemerella

anatipestifer từ các ca bệnh bại huyết trên

vịt bằng kỹ thuật PCR. Khoa học kỹ thuật thú

y, 23(6), 14-21.

3. Lý Thị Liên Khai và Nguyễn Hiền Hậu,

2018. Bệnh bại huyết trên vịt do Riemerella

anatipestifer gây ra tại tỉnh Bến Tre. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 54 (số

chuyên đề: Nông nghiệp), 90-97.

4. Võ Thành Thìn, Đặng Văn Tuấn, Lê Đình

Hải, 2020. Phân lập vi khuẩn Riemerella

anatipestifer từ mẫu bệnh phẩm vịt có triệu

chứng nghi mắc bệnh nhiễm trùng huyết.

Khoa học kỹ thuật thú y, 27(3), 26-31.

5. BioMerieux, API 20NE (Ref. 20 050). Identification system for non-fastidious, non-enteric gram-negative rods.

6. Cammayo, P.L.T., Fernandez-Colorado, C.P., Flores, R.A., Roy, A., Kim, S., Lillehoj, H.S., Kim, W.H., Min, W., 2020. IL-17A treatment influences murine susceptibility to experimental Riemerella anatipestifer infection. Developmental and Comparative Immunology, 106, 103633.

7. Cha, S.Y., Seo, H.S., Wei, B., Kang, M., Roh, J.H., Yoon, R.H., Kim, J.H., Jang, H.K., 2015. Surveillance and characterization of Riemerella anatipestifer from wild birds in South Korea. Journal of Wildlife Diseases, 51(2), 341-347.

8. Gong, Y., Yang, Y., Chen, Y., Sun, B., Xue, Y., Xu, X., Wang, X., Islam, N., Du, X., Hu, Q., 2020. Characterization of the hemolytic

activity of Riemerella anatipestifer.

Microbiology, 166(5), 436-439.

9. Hinz, K.H., Ryll, M. and Köhler, B., 1998a. Detection of acid production from

carbohydrates by Riemerella anatipestifer

and related organisms using the buffered

single substrate test. Veterinary Microbiology,

60, 277-278.

10. Hinz, K.H., Ryll, M., Köhler, B. and Glünder, G., 1998b. Phenotypic characteristics

of Riemerella anatipestifer and similar micro-organisms from various hosts. Avian

Pathology, 27, 33-42.

11. Hu, Q., Han, X., Zhou, X., Ding, C., Zhu, Y., Yu, S., 2011. OmpA is a virulence factor

of Riemerella anatipestifer. Veterinary

Microbiology, 150, 278-283.

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

12. Krieg, N.R., Staley, J.T., Brown, D.R., Hedlund, B.P., Paster, B.J., Wad, N.L., Ludwig, W., Whitman, B., 2011. Genus

XLIV, Riemerella. In: Bergey’s Manual

of Systematic Bacteriology, 2nd edition, Vol. 4. Edited by Krieg, N.R., Ludwig, W., Whitman, W., Hedlund, B.P., Paster, B.J.,

Staley, J.T., Ward, N., Brown, D. Springer,

13. Li, J.X., Tang, Y., Gao, J.Y., Huang, C.H., and

Ding, M.J., 2011. Riemerella anatipestifer infection in chickens. Pakistan Veterinary

Journal, 31(1), 65-69.

14. Majhi, C., Jena, G.R., Dash, L., Kumar, D., Mishra, S.K., Mishra, A., Elmorsy, M.A, and Das, M.R., 2020. Isolation and identification

of Riemerella anatipestifer from Duck in

Odisha, and its susceptibility to antibiotics

and therapeutic management. Journal of

Entomology and Zoology Studies, 8(2),

15. Markey, B., Leonard, F., Archambault, M., Cullinane, A., Maguire, D., 2013. Chapter 2: Bacterial pathogens: Microscopy, culture and identification. In: Clinical veterinary microbiology, 2nd edition. Edited by Markey, B., Leonard, F., Archambault, M., Cullinane,

A., Maguire, D. Elsevier, 29.

16. Ni, X, Jiang, P., Xing, L., Ou, C., Yu, H., Qi, J., Sun, B., Cui, J., Wang, G., Hu, Q., 2016. Genome-wide mining of potential

virulence-associated genes in Riemerella anatipestifer

using random transposon mutagenesis.

Veterinary Microbiology,189, 52-58.

17. Reed, L.J., and Muench, H., 1938. A simple method of estimating fitty percent endpoins.

The American Journal of Hydrogene, 27(3),

18. Ruiz, J.A. and Sandhu, T.S., 2013.

Riemerella anatipestifer infection. In:

Diseases of poultry, 13th edition. Edited by

Swayne, D.E., Glisson, J.R., McDougald, L.R., Nolan, L.K., Suarez, D.,L., and Nair,

V., Wiley Blackwell, 824-828.

19. Seo, H.S., Cha, S.Y., Kang, M., Jang, H.K., 2013. Chicken embryo lethality assay for

determining the virulence of Riemerella

anatipestifer isolates. Avian Pathology,

42(4), 387-392.

20. Shancy, C., Priya, P.M., Sabnam, V.S., Syam, R. and Mini, M., 2018. Rapid detection

of Riemerella anatipestifer isolates using

16S rRNA based PCR and species- specific

assay. International Journal of Science,

Environment and Technology, 7(5),

21. Surya, P.S., Priya, P.M. and Mini, M., 2016. Biotyping and antibiogram of

Riemerella anatipestifer from ducks in

Kerala. Bioscience Biotechnology Rerearch

Communications, 9(3), 457-462.

22. Yuan, H., Huang, L., Wang, M., Jia, R., Chen, S., Liu, M., Zhao, X., Yang, Q., Wu, Y., Zhang, S., Liu, Y., Zhang, L., Yu, Y., You, Y., Chen, X., Zhu, D., Cheng, A., 2019. Role of the gldK gene in the virulence of Riemerella anatipestifer.

Poultry Science, 98(6), 2414-2421.

23. Yu, G., Wang, X., Dou, Y., Wang, S., Tian, M., Qi, J., Li, T., Ding, C., Wu, Y., Yu, S.,

2016. Riemerella anatipestifer M949_1360

gene functions on the Lipopolysaccharide

biosynthesis and bacterial virulence. PLoS

One., doi: 10.1371/journal.pone.0160708.

24. Wang, X., Liu, B., Dou, Y., Fan, H., Li,

T., Ding, C., Yu, S., ,2016. The Riemerella

anatipestifer AS87_01735 gene encodes

Nicotinamidase PncA, an important

virulence factor. Applied Environmental

Microbiology, 82(19), 5815-5823.

Ngày nhận 1-6-2021 Ngày phản biện 15-6-2021 Ngày đăng 15-8-2021

</div>

TAO DOØNG VAØ BIEÅU HIEÄN GEN MAÕ HOÙA KHAÙNG NGUYEÂN P42 TÖØMYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRONG ESCHERICHIA COLI (BL21)

<b>HỘI THÚ Y VIỆT NAM</b>

<b>VIETNAM VETERINARY ASSOCIATION</b>

<b>Tập XXVIII Số 9 - 2021</b>

<b>JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE AND TECHNOLOGY</b>

KHOA HỌC KỸ THUẬT

ISSN 1859 - 4751

<b>VIETNAM VETERINARY ASSOCIATION</b>

<b>KHOA HỌC KỸ THUẬTTHÚ Y</b>

<b>JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE AND TECHNOLOGY</b>

<b>TẬP XXVIII. SỐ 9 - 2021 VOL. XXVIII. N</b>

<b>9 - 2021</b>

<b>HỘI THÚ Y VIỆT NAM</b>

<b>VIETNAM VETERINARY ASSOCIATION</b>

<b>KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ YTẠP CHÍ RA 8 KỲ/NĂMCỦA HỘI THÚ Y VIỆT NAM</b>

<b>MỤC LỤC </b>

<b>TẠO DỊNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HĨA KHÁNG NGUYÊN P42 TỪ </b>

<b>TĨM TẮT</b>

<i><b>Cloning and expression of gene encoding p42 antigen from Mycoplasma </b></i>

<i><b>hyopneumoniae in Escherichia coli (bl21)</b></i>

<b>I. ĐẶT VẤN ĐỀ</b>

<b>II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU </b>

<b>III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN</b>

<b>IV. KẾT LUẬN</b>

<b>TÀI LIỆU THAM KHẢO</b>

<b>KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH DO VI KHUẨN SALMONELLA </b>

<b>TĨM TẮT</b>

<b>Study on effects of some bioproducts on the growth and disease treatment </b>

<i><b>caused by Salmonella typhimurium in the hybrid noi chickens </b></i>

<b>I. GIỚI THIỆU</b>

<b>II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU</b>

<b>III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN</b>

<b>IV. KẾT LUẬN</b>

<b>TÀI LIỆU THAM KHẢO</b>

<b>SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN </b>

<b>TRÊN BÒ TẠI HUYỆN BA TRI, TỈNH BẾN TRE</b>

<b>TĨM TẮT</b>

<i><b>Prevalence and antimicrobial resistance of Enterohaemorrhagic Escherichia </b></i>

<i><b>coli (EHEC) O45, O121, O157 in cattle in Ba Tri, Ben Tre province</b></i>

<b>I. ĐẶT VẤN ĐỀ</b>

<b>II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU</b>

<b>III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN</b>

<b> Sự hiện diện của các chủng vi khuẩn</b>

<b>Sự hiện diện của các chủng vi </b>

<i><b>khuẩn E. coli O45, O121 trên bò theo </b></i>

<b>mục đích sử dụng</b>

<b>IV. KẾT LUẬN </b>

<b>TÀI LIỆU THAM KHẢO</b>

<b>MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM CỦA VI KHUẨN RIEMERELLA ANATIPESTIFER PHÂN LẬP TỪ VỊT MẮC </b>

<b>BỆNH NHIỄM TRÙNG HUYẾT Ở VIỆT NAM</b>

<b>TĨM TẮT</b>

<b>Some biological characteristics and experimental pathogenicity of </b>

<i><b>riemerella anatipestifer isolated from duck septicaemia in vietnam</b></i>

<b>I. ĐẶT VẤN ĐỀ</b>

<b>II. NGUYỆN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU </b>

<b>III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN</b>

<b>IV. KẾT LUẬN</b>

<b>TÀI LIỆU THAM KHẢO</b>

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về