Phân lập và biểu hiện gen fljB mã hoá kháng nguyên roi H: 1,2 của Salmonella typhimurium trong Escherichia coli BL21

LỜI NóI ĐẦU
Salmonella là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm độc thức ăn trên toàn thế
giới. Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 1998, hàng năm
trên thế giới có khoảng hơn 10 triệu trẻ em dưới 5 tuổi và người già chết do
nhiễm độc thức ăn, trong đó 90% trẻ em sống ở các nước đang phát triển (bao
gồm cả Việt Nam). Ngoài việc gây nhiễm độc thức ăn, Salmonella còn gây ra
các chứng bệnh nguy hiểm khác như sốt thương hàn, nhiễm trùng máu cấp
tính, sẩy thai, viêm khớp và các bệnh về đường hô hấp. Hai chủng chính gây
nhiễm độc thức ăn cho người đó là S. typhimurium và S. enteritidis. Một vấn
đề rất đáng lo ngại hiện nay là hầu hết các chủng Salmonella đặc biệt là S.
typhimurium đã kháng được nhiều loại kháng sinh khác nhau. Chính vì vậy,
việc điều trị các bệnh do Salmonella ngày càng gặp nhiều khó khăn, chi phí
tốn kém và đòi hỏi phải tạo ra nhiều loại kháng sinh mới. Vấn đề khác không
kém phần quan trọng đó là gia cầm khi bị nhiễm Salmonella không biểu hiện
bất kỳ một triệu chứng bất thường nào, điều này đã gây khó khăn trong việc
ngăn chặn vùng bị dịch.
Xuất phát từ thực tế trên, một phương pháp được xem là hiệu quả nhất
để ngăn chặn Salmonella nhiễm ở gà là tạo ra một loại vacxin cho gia cầm
chống lại sự xâm nhiễm của Salmonella. Đây không chỉ là tính cấp thiết của
ngành chăn nuôi mà còn là biện pháp chủ động trong công tác an toàn thực
phẩm và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.
Hiện nay trên thị trường có nhiều loại vacxin cho gà chống lại
Salmonella như vacxin chết, vacxin sống giảm độc lực, nhưng mỗi loại vacxin
lại có nhược điểm riêng. Vacxin sống giảm độc lực có hiệu quả cao nhưng lại
không an toàn. Do đó, gần đây các nhà khoa học trên thế giới đang tập trung
nghiên cứu tạo ra vacxin thành phần bằng kỹ thuật ADN tái tổ hợp và được
gọi là vacxin tái tổ hợp. Vacxin tái tổ hợp ra đời khắc phục được những
1
nhược điểm trên do việc sử dụng nguồn kháng nguyên thành phần có nhiều
ưu điểm vượt trội hơn về độ an toàn khi sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch
một cách đặc hiệu. Đây còn là lựa chọn kinh tế so với các phương pháp cũ khi

đưa vào ứng dụng, sản xuất vacxin thành phẩm. Từ yêu cầu cấp thiết về tăng
cường sức khoẻ cộng đồng, an toàn thực phẩm, chúng tôi đã tiến hành đề tài
nghiên cứu: “Phân lập và biểu hiện gen fljB mã hoá kháng nguyên roi H:
1,2 của Salmonella typhimurium trong Escherichia coli BL21” nhằm thu
được lượng lớn kháng nguyên tinh sạch, dùng cho việc nghiên cứu và sản
xuất vacxin thế hệ mới là vacxin tái tổp hợp chống lại Salmonella.
Công việc được tiến hành tại Phòng kỹ thuật Di truyền, Viện công nghệ
sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát chung về Salmonella
1.1.1. Tình hình dịch bệnh
Vi khuẩn Salmonella đã được nghiên cứu từ hàng trăm năm nay, tuy
nhiên trong mấy chục năm trở lại đây, chúng được các nhà nghiên cứu quan
tâm bởi sự gia tăng các bệnh ngộ độc thực phẩm ở người do Salmonella gây
ra. Vào năm 1980, khi tìm hiểu nguyên nhân của dịch tả, Daniel E. Salmon đã
phát hiện trong ruột của lợn có một loại vi sinh vật gây sốt, tiêu chảy [61].
Sau đó, ông phát hiện chủng vi khuẩn này còn sinh sống trong ống tiêu hoá
của các động vật có vú, bò sát, chim và cả côn trùng. Vi khuẩn này là vi
khuẩn gram âm, hình que, di động được, thuộc họ Enterobacteriaceae và có
quan hệ gần gũi với vi khuẩn E. coli. Năm 1984, ông đã phân lập nuôi cấy và
đặt tên chủng là Salmonella.
Salmonella đã gây tác hại không nhỏ đối với người và động vật, gây ảnh
hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế. Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới
[63], chỉ tính riêng ở Mỹ, năm 2004 có 1,4 triệu người nhiễm Salmonella. Trong
số những trường hợp nhiễm có 183000 trường hợp phải điều trị tại bệnh viện,
580 trường hợp bị tử vong, tổng thiệt hại kinh tế lên tới 3 tỉ USD. Cũng tương tự,
ở Đan Mạch, theo thống kê năm 2001, tổng chi phí để khắc phục hậu quả do
Salmonella lên tới 25 triệu USD.
Tại Việt Nam, mặc dù chưa có thống kê nào về thiệt hại do Salmonella

gây ra, nhưng báo cáo mới nhất của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
cho thấy, độ nhiễm khuẩn trong các sản phẩm chăn nuôi như thịt lợn, thịt bò,
thịt gà ở Hà Nội là 100%, trong đó 40% là nhiễm Salmonella [63]. Hơn nữa,
cả trong những sản phẩm được coi là đảm bảo để xuất khẩu cũng chứa
Salmonella. Chỉ trong 3 tháng cuối năm 2001, Cơ quan Lương thực và Dược
liệu Hoa Kỳ (FDA) đã tịch thu và tiêu huỷ hàng trăm lô thực phẩm được nhập
3
khẩu từ Việt Nam, đặc biệt là mặt hàng hải sản bị nhiễm Salmonella. Thiệt hại
kinh tế do vấn đề tiêu huỷ lên đến hàng trăm ngàn USD. Báo chí đã đưa tin,
tại kho dự trữ lạnh của khu công nghiệp Sóng Thần Thành phố Hồ Chí Minh
đã từng tồn tại 19 tấn gà nhiễm Salmonella [58]. Con số đó không những ảnh
hưởng đến nền kinh tế mà còn thực sự là mối lo ngại cho an toàn sức khoẻ
cộng đồng.
1.1.2.Một số đặc điểm vi sinh về Salmonella
Salmonella là loại vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae, dạng
hình que với chiều dài 2-5 ỡm, chiều rộng 0,5 -1,5 ỡm. Samonella có khả năng
sinh trưởng cả trong môi trường hiếu khí và kỵ khí, không sinh bào tử [16].
Salmonella có thể nuôi cấy dễ dàng ở nhiệt độ 37
o
C trong môi trường
nuôi cấy thông thường. Khi sinh trưởng trên môi trường đặc, Salmonella phát
triển thành các khuẩn lạc nhỏ, đường kính 2- 4 mm, mịn và đồng nhất. Cũng
giống như hầu hết các vi khuẩn khác, điều kiện pH tối ưu cho vi khuẩn này
hoạt động là pH trung tính 6-8. Tuy nhiên, trong cả môi trường kiềm và axít
vi khuẩn này vẫn có khả năng tồn tại. Ngoài tính chất chung của họ vi khuẩn
đường ruột Enterobacteriaceae, vi khuẩn Salmonella còn có một số tính chất:
không lên men đường Lactoza, Sacaroza, Ureaza(-), Indol(-), H
2
S(+).
Salmonella có sức sống và sức đề kháng tốt, trong canh trùng, trong

đất có thể sống được vài tháng, trong nước 2-3 tuần, trong nước đá sống từ 2-
3 tháng, trong phân sống khoảng vài tuần.
Phần lớn Salmonella đều có khả năng di chuyển nhờ roi trừ S.
gallinarum và S. pullorum. Khả năng này sẽ mất đi khi xử lý chúng với tác
nhân vật lý gây sốc nhiệt cho tế bào như: nhiệt độ lạnh hoặc nhiệt độ cao [16]
ở 50
o
C khoảng 1giờ, ở 60
o
C khoảng 10-20 phút, 100
o
C khoảng 5 phút và các
chất khử trùng như Chloramin 3%, vv… Thông thường, khi mất khả năng di
chuyển, Salmonella cũng mất khả năng sinh trưởng.
1.1.3. Phân loại Salmonella
4
Theo hệ thống phân loại Kaufman-White, Salmonella khoảng hơn
2501 các typ huyết thanh (serotyp) khác nhau [16. 63] và số lượng này ngày
một tăng lên. Trong đó, Salmonella được chia làm 2 loài chính là S. enterica và
S. bongori, S. enterica lại được chia ra làm 6 dưới loài khác nhau là S. enterica,
S. salamae, S. arizonae, S. diarizonae, S. indica và S. houtenae. Theo hệ thống
phân loại này, S. typhimurium nằm trong dưới loài S. enterica [16, 21].
Sự phân loại các typ huyết thanh khác nhau của Salmonella được dựa
vào kháng nguyên bề mặt tế bào vi khuẩn: kháng nguyên thân hay kháng
nguyên O (somatic antigen), kháng nguyên roi hay kháng nguyên H (flagellar
antigen) và kháng nguyên vi (vi antigen). Kháng nguyên O là chuỗi phức hợp
lipopolisaccarit-protein nằm trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Kháng nguyên H
được tạo thành bởi các tiểu phần protein là flagellin. Sự đa dạng về vùng giữa
của flagellin là cơ sở cho sự đa dạng về kháng nguyên H. Một số typ huyết
thanh như là S. typhimurium, S. dublin còn có thêm kháng nguyên vi. Đây là

loại kháng nguyên định vị bên ngoài vỏ polisacarit của vi sinh vật, có liên
quan đến tính độc riêng với tế bào chủ [16].
1.1.4. Bệnh học của sự lây nhiễm Salmonella
Salmonella là loại vi khuẩn có khả năng gây bệnh, lây nhiễm chủ yếu
qua con đường ăn, uống. Chúng có khả năng sống trên nhiều động vật, trong
trứng của gia cầm [2, 16, 19].
Vi khuẩn này liên quan đến một loại bệnh thường gặp ở người: như bệnh
thương hàndo(S. typhi gây nên. Bệnh thương hàn là một trong những căn bệnh
nguy hiểm và biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất gây tổn thương nhiều phủ
tạng, đặc biệt là hệ tiêu hoá.
Tuy nhiên mỗi cơ thể chủ khác nhau có sự thích ứng khác nhau với
mỗi loại Salmonella: S.typhimurium và S. enteritidis là hai loài thường gây
bệnh cho người và gia súc, gia cầm, và S. dublin gây bệnh tiêu chảy ở lợn
[63]. Tuy có nhiều loại Salmonella, nhưng chỉ một số Salmonella gây bệnh
cho người và động vật.
5
Hầu hết sự lây nhiễm Salmonella vào cơ thể người thường là do ăn phải
thức ăn có nguồn gốc động vật và gia cầm bị nhiễm Samonella. Để có thể gây
bệnh, Samonella phải có một loạt các nhân tố gây độc. Các nhân tố này bao
gồm: khả năng xâm nhập vào tế bào, phức hệ vỏ lipopolysaccarit, khả năng
phát triển trong nội bào và khả năng tạo độc tố. Sau khi xâm nhập vào bụng,
Salmonella nhân lên trong ruột hồi và ruột kết xâm nhiễm vào biểu mô ruột,
và tăng sinh nhanh trong biểu mô và nang lympho. Từ đây, Salmonella lan ra
khắp cơ thể và cuối cùng bị chặn lại bởi các tế bào lưới nội mô. Dưới sự kiểm
soát của hệ thống lưới nội mô, sự phát triển của Salmonella bị ức chế. Tuy
nhiên với mỗi typ huyết thanh Salmonella khác nhau lại có khả năng gây độc
khác nhau. Một số typ Salmonella có khả năng nhiễm vào gan, lá lách, xương,
màng não và một số cơ quan khác trong cơ thể gây ra tác hại nghiêm trọng
với cơ thể. Sau khi nhiễm Salmonella vào người, và triệu chứng sẽ xuất hiện
sau 12 đến 72 giờ như đau bụng tiêu chảy, đau đầu, nôn mửa, sốt cao. Bệnh

này có thể tự khỏi sau một vài ngày đến một tuần nhưng cũng gây tổn thương
cơ thể người bệnh, đặc biệt những người già, các em nhỏ và những người có
thể trạng yếu thì sự lây nhiễm có thể dẫn tới làm tăng khả năng mắc các
chứng bệnh khác. Khi xâm nhập vào ruột, Salmonella kích thích sự đáp ứng
viêm ác tính, gây loét ruột. Nội độc tố do Salmonella tiết ra có khả năng ức
chế quá trình tổng hợp protein. Cho đến nay, độc tố gây viêm ác tính, sự lở
loét vẫn chưa được biết rõ. Sự xâm nhiễm của Salmonella lên màng nhày gây
kích thích các tế bào biểu mô giải phóng ra hàng loạt các cytokin như: IL-1,
IL-6, IL-8, TNF-2, IFN-U, MCP-1 và GM-CSF [12]. Các nhân tố gây độc
làm viêm đường ruột [59], một số khác đi vào hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng
máu cấp tính có thể dẫn đến tử vong [31].
Có 30000 ca của người nhiễm vi khuẩn Salmonella đã gián tiếp được
công bố ở Anh. Sự nhiễm bệnh này do lây lan từ gia cầm. Bởi vậy hạn chế sự
lây nhiễm Salmonella trong những đàn gà sẽ đem lại kết quả quan trọng cho
6
sức khoẻ cộng đồng. Ngoài khả năng lây nhiễm trên người, Salmonella cũng
nhiễm vào các động vật khác. S. typhimurium có thể nhiễm vào gà qua thức ăn
hoặc nhiễm từ gà mẹ sang gà con [25]. Hậu quả của sự lây nhiễm này là gà
con có thể bị chết [12].
1.1.5. Sự đề kháng của Salmonella với các kháng sinh
Cho đến nay, có nhiều báo cáo ghi nhận khả năng kháng lại kháng sinh
của Salmonella [63]. Tính đề kháng này do sự truyền gen giữa các chủng vi
khuẩn. Nguy hiểm hơn, thông qua sự chuyển đoạn ADN cộng gộp,
Salmonella có khả năng kháng đồng loạt các chất kháng sinh khác nhau. Một
minh chứng gần đây về tính kháng nhiều chất kháng sinh là chủng S.
typhimurium DT104. Chủng vi khuẩn này có thể kháng lại một số chất kháng
sinh thông thường nên khi động vật và người bị nhiễm việc điều trị bằng các
loại kháng sinh thường không hiểu quả [62]. Mặt khác, S. typhimurium kháng
chloramphenicol xảy ra ngày một nhiều ở các nước đang phát triển từ đầu
năm 70 đến giữa năm 80. Cuối những năm 80 đến đầu những năm 90, người

ta phát hiện thấy S. typhimurium có plasmit đề kháng với chloramphenicol,
ampixillin, cotrimoxazol ở Châu á và Đông Bắc Phi. Vì vậy, việc tìm ra một
loại vacxin để chống Salmonella là hết sức cần thiết.
1.2. Kháng nguyên của Salmonella
1.2.1. Đặc điểm chung về kháng nguyên của Salmonella
7
Salmonella có 3 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên thân (O);
kháng nguyên roi (H); kháng nguyên vi có ở một số typ huyết thanh khác như:
S. typhi, S. dublin và S. hirschfeldii. Kháng nguyên nằm trong lớp vỏ
lypopolysaccharit gọi là nội độc tố tạo thành phần phía ngoài của thành vi khuẩn.
Nội độc tố gồm 3 lớp: lớp ngoài (O), lớp giữa (R) và lớp nền (lớp lipit A).
1.2.1.1. Kháng nguyên thân O (lypopolysaccharit)
Salmonella có tới hơn 60 kháng nguyên O khác nhau. Kháng nguyên
thân có cấu trúc dạng sợi lypopolysaccharit-protein được bộc lộ trên bề mặt tế
bào do đó khả năng gây đáp ứng miễn dịch rất mạnh. Kháng nguyên (O) gồm
hai phần: phần nhân cơ bản và phần các chuỗi ngang. Phần nhân cơ bản giống
nhau trong tất cả Salmonella. Phần các chuỗi ngang gồm có những tiểu đơn vị
oligosidic có tính tái diễn, chính các chuỗi ngang quyết định tính đặc hiệu của
mỗi nhóm Salmonella. Mặt khác kháng nguyên thân (O) rất khó biểu hiện
trong những hệ biểu hiện thông thường.
1.2.1.2. Kháng nguyên tua riềm (vi)
Kháng nguyên tua riềm là những sợi protein nhỏ nằm trên bề mặt của vi
khuẩn, nó có thể do một hay một số tiểu phần protein cấu thành. Dạng điển
hình cho tua riềm là cấu trúc hình xoắn ốc [37]. Tuỳ thuộc vào sự thích nghi
Kháng nguyên H
(Roi)
Màng trong
Lớp peptidoglycan
Kháng nguyên Vi
Kháng nguyên O

(Chuỗi polisaccarit)
Màng ngoài
Tua riềm
Nội bào
Hình 1. 1: Khái quát cấu trúc kháng nguyên của Salmonella
8
về khả năng sống, khả năng gây bệnh, mỗi loài vi khuẩn có dạng tua riềm
khác nhau. Chức năng chính của tua riềm là khả năng kết dính, tương tác với
vi khuẩn và với các nhân tố khác. Đối với Salmonella, cấu trúc tua riềm
thường có dạng dày và cứng nên giúp chúng gắn thụ động lên bề mặt tế bào
biểu mô cơ thể chủ, nhờ sự nhận biết của thụ thể, các tín hiệu có bản chất ion
Ca
2+
từ tế bào vi khuẩn được giải phóng tạo ra đáp ứng các nội bào của tế bào
chủ, kích thích sự giải phóng ra các cytokin điều khiển đáp ứng miễn dịch có
cho vi khuẩn [51].
1.2.1.3. Kháng nguyên roi H
Kháng nguyên roi H với bản chất là protein cấu trúc có mặt ở hầu hết các
typ huyết thanh của Salmonella [34]. Do có thành phần đơn nhất là protein
tham gia chức năng cấu trúc nên chúng ít hoặc không mang tính độc và dễ
dàng được phân lập cũng như biểu hiện bằng công nghệ ADN tái tổ hợp.
Ngoài ra protein này thường được tiết ngoại bào và có khả năng cho đáp ứng
miễn dịch cao. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy kháng nguyên của các vi
khuẩn thuộc nhóm gram âm ái lực mạnh với các chuỗi polypeptit bề mặt gây
ra sự tổng hợp TNF-ỏ và Interleukin-1õ (IL- 1õ) từ tế bào monocyte ở người.
Nhân tố này đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự xâm nhiễm của
Salmonella và tạo khả năng đáp ứng miễn dịch ghi nhớ [18, 27]. Như vậy
kháng nguyên H không chỉ đơn thuần là protein cấu trúc mà còn thể hiện rõ
tính gây miễn dịch bảo hộ. Chính dựa vào đặc tính này mà kháng nguyên H
được chọn làm đối tượng để nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp phục vụ

cho việc tạo vacxin tái tổ hợp sau này.
Trong nghiên cứu của chúng tôi gen fljB mã hoá cho kháng nguyên roi
H: 1,2 của vi khuẩn Salmonella đã được sử dụng làm cơ sở nghiên cứu sản
xuất vacxin tái tổ hợp.
1.2.1.3.1. Cấu trúc protein flagellin của Salmonella
Roi của vi khuẩn Salmonella tồn tại ở dạng siêu xoắn và được cấu tạo
từ một protein đơn nhất gọi là flagellin. Cấu trúc siêu xoắn này bao gồm 11 vi
9
sợi (protofilament), khi sử dụng phương pháp tia Rơngen (X-ray) để quan sát
cấu trúc tinh thể của một đoạn flagellin thì người ta thấy rằng ẩn đi 100 gốc
cấu trúc về vi sợi. Vì vậy, với phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử nhiệt
độ thấp (eletron cryomicroscopy) người ta có thể quan sát một cách toàn diện
hơn về cấu trúc xoắn.
Đi sâu về mặt cấu trúc ta thấy rằng phân tử flagellin gồm bốn vùng
(ký hiệu là D0, D1, D2, D3, D4) được nối với nhau bằng các cặp đoạn nối
song song (gọi là vùng đệm). Mô hình khung cacbon ở vị trí ỏ (Cỏ) cho thấy
sự tạo thành các nếp gấp và phần đầu của chuỗi xoắn ỏ được cuộn vào trong
vùng D0. Đầu N của chuỗi (ND0) được bắt đầu từ axit amin Gln ở vị trí thứ 2
kéo dài tới Serin ở vị trí 32, trong khi đó ở đầu C của chuỗi xoắn (CD0) lại
bắt đầu từ Alanin 459 và kéo dài tới Serin 491. Trong đó vùng đệm bao gồm
hai chuỗi là NS và CS, một chuỗi bắt đầu từ ser 32 đến Ala 44 còn chuỗi khác
bắt đầu từ Glu 454 tới Ala 459. Đầu N của vùng D1 (ND1a) bắt đầu Ala 44 và
kéo dài tới Ala 99, đây chính là đoạn tiếp theo của đoạn ND1b. Sau đó, chuỗi
tiếp tục kéo dài xuống phía dưới và quay ngược lại ở vị trí của hai chuỗi kẹp
tóc õ và kết thúc ở trong domain D2. Đầu C của chuỗi xoắn ỏ trong vùng D1
(CD1) bắt đầu từ Asn 406 và kéo dài tới Glu 454. So với F41, quá trình kéo
dài ND1a và CD1 lên phía trên của vùng D1 xuống phía dưới. Hai vùng D0,
D1 có kích thước theo chiều dọc tương ứng khoảng 50 Å, 80 Å và vùng đệm
có chiều dài khoảng 20 Å.
10

Hình1.2. Cấu trúc siêu hiển vi protein flagellin
của vi khuẩn S. typimurium
1.2.1.3.2. Quá trình hình thành flagella của Salmonella
Roi của Salmonella được cấu tạo từ một protein đơn nhất được gọi là
flagellin, kích thước cua flagellin ở các chủng Salmonella là khác nhau
khoảng 20-60 kDa, được mã hoá bởi hơn 50 gen thuộc 17 operon khác nhau
[26]. Một đơn vị điều hoà sinh tổng hợp roi gồm 3 lớp gen (sớm, trung gian,
và muộn) [20] . Hình 1.3.
11
Các gen muốn phiên mã được cần có vùng trình tự ái lực với ARN
polymeraza, vùng này được gọi là promoter. Tương ứng với ba lớp gen (sớm,
trung gian, và muộn) là lớp promoter (lớp 1, lớp 2, lớp 3) đóng vai trò khởi
động quá trình phiên mã [3]. Promoter lớp 1 ở dạng promoter đơn, với tín
hiệu khởi đầu là cAMP-CAP thực hiện phiên mã hai gen flhD và flhC mã hóa
cho phức hệ hoạt hoá, quá trình dịch mã tạo protein cần thiết cho lắp ghép
được tiến hành để hình thành nên cấu trúc phần gốc roi. Phần trục roi được
tạo thành bởi quá trình dịch mã của hai gen fliC và fljB nằm trong lớp gen
muộn [22]. Hoạt động tuần tự của các lớp gen sớm, trung gian có vai trò điều
khiển sự biểu hiện của lớp gen muộn. Quá trình sẽ kết thúc tại thời điểm
protein flagellin được tạo ra và vận chuyển ra ngoài màng tế bào, tham gia lắp
ghép để tạo nên phức hệ roi của vi khuẩn [46] hình 1.4
12
Gen sớm
Gen trung gian Gen muộn
_
cAMP-CAP
flh C D
flg A
flg B C D E F G H I J
flh B A

fliA
fliB
fli E
fli F G H i J K
fli L M N O P Q R
fig K L
fli D
fli C
mot A B che A W
tar che R B Y Z
fljB A
FlgR
FliA
Hình 1.3: Mô hình các lớp gen điều hòa sinh tổng hợp protein flagellin
ở vi khuẩn S. typhimurium
ở mỗi typ huyết thanh khác nhau, protein flagellin được biểu hiện các
pha là khác nhau có thể một pha, hai pha thậm chí có thể nhiều hơn ba pha (ở
S. rubislaw) [47].
Quá trình biểu hiện protein cấu trúc flagellin của Salmonella gồm hai pha
do gen fliC và fljB quy định, được điều khiển biểu hiện không đồng thời.
1.2.1.3. 3. Cơ chế điều hoà biểu hiện protein roi H của Salmonella
FliC, fljB quy định hai pha khác nhau của kháng nguyên H và được điều
khiển biểu hiện không đồng thời. Gen fliC mã hoá cho kháng nguyên H: i
(495 axit amin), gen fljB mã hóa cho kháng nguyên H: 1.2 (506 axit amin).
Dựa vào trình tự axit amin của protein flagellin, người ta chia protein ra làm
tám vùng khác nhau, trong đó vùng I, II, VIII là vùng bảo thủ, vùng IV, V, VI
là những vùng siêu biến, xác định tính đặc hiệu cho kháng nguyên H. Vùng
13
Hình 1.4. Cấu trúc phức hệ roi của vi khuẩn S.
typhimurium

siêu biến của gen fliC (86 axit amin) mang epitop đặc trưng cho kháng
nguyên H: i, vùng siêu biến của fljB (102 axit amin) mang epitop đặc trưng
cho kháng nguyên H: 1,2 [17]. Ngoài ra, tận cùng đầu N của protein còn có
trình tự có vai trò quan trọng trong quá trình tiết và polyme hoá để cấu tạo
nên trục roi [50]. Bằng việc so sánh khả năng kết cặp đặc hiệu giữa kháng thể
đơn dòng kháng fliC và kháng thể đơn dòng kháng fljB, Vries và cộng sự cho
thấy, ngoài khả năng bắt cặp đặc hiệu với fliC, kháng thể kháng fliC còn bắt cặp
với kháng nguyên của các chủng Salmonella khác như: S. bonariensis, S.
kentucky, S. jukestown, S. takoradi, S. bandia [17]. Cách tổ chức của gen fljB và
fliC trên hệ gen và cơ chế hoạt động luân phiên giữa chúng đó là: trên nhiễm
sắc thể, operon fljB-fljA nằm phía trước operon fliC và có hai promoter riêng
biệt nhau. Operon fljB-fljA do một promoter điều khiển có khả năng hoạt động
như một invertasome với hai trình tự lặp lại đảo ngược nằm ở hai đầu. Mỗi
trình tự có chiều dài 13 cặp. Khi promoter của operon fljB-fljA nằm xuôi
chiều, hai gen fljB và fljA sẽ được phiên mã. Protein FljB sẽ tham gia vào cấu
trúc roi. Protein FljA có vai trò là một chất ức chế gen fliC. Trong trường hợp
này roi của vi khuẩn S. typhimurium sẽ có pha H: 1,2, hay flagellin sẽ biểu
hiện ở H: 1,2. Ngược lại, khi promoter của operon fljB-fljA đảo chiều theo cơ
chế thắt thòng lọng (looping), gen fljB và fljA sẽ ngừng hoạt động, do đó, gen
fliC không còn bị ức chế bởi protein FljA. Nó sẽ được phiên mã và cho ra
flagellin H: i hay còn gọi là pha H: i. Người ta theo dõi thấy xác suất xảy ra
sự thay thế giữa hai gen đó trong một thế hệ tế bào là 10
-5
đến 10
-3
[18].
14
Hình 1.5: Cơ chế hoạt động luân phiên của hai gen fljB và
fliC trong vi khuẩn S. typhimurium
hixL hin P hinR

fljB fljA
fliC
Hin
P
Flagellin H:
1,2
Chất
ức chế
mRNA
fljB fljA
P
Flagellin H: i
mRNA
Đảo đoạn
1.2.2. Vai trò của kháng nguyên H trong đáp ứng miễn dịch bảo hộ
phòng chống Salmonella
Như ở phần trước đã đề cập S. typhimurium là nguyên nhân chính gây
ngộ độc thức ăn, vừa làm thiệt hại kinh tế vừa làm ảnh hưởng đến sức khoẻ
cộng đồng. Mặt khác, với khả năng kháng lại các chất kháng sinh, S.
typhimurium đang là mối đe doạ cho con người. Vì vậy, để khắc phục và
phòng tránh những hậu quả do chủng vi khuẩn này gây ra, chúng ta cần phải
sản xuất được loại vacxin an toàn và hiệu quả cao. Qua thời gian nghiên cứu,
với những thành công trong lĩnh vực sinh học phân tử ở nước ta, việc nghiên
cứu chế tạo ra một loại vacxin tái tổ hợp với độ an toàn và hiệu quả là điều có
thể thực hiện. Tuy nhiên, muốn tạo ra được một loại vacxin hiệu quả nhất, thì
việc quan trọng nhất là xác định chính xác nguồn kháng nguyên sử dụng để
15
chế tạo vacxin tái tổ hợp. Sau khi S. typhimurium xâm nhập và bám dính lên
tế bào biểu mô ruột, trong cơ thể chủ đáp ứng lại sự nhiễm đầu tiên là cơ chế
tự bảo vệ không đặc hiệu bằng quá trình thực bào bởi bạch cầu đơn nhân,

bạch cầu đa nhân trung tính, và đại thực bào. Khi tế bào vi khuẩn bị dung giải
sẽ tiết ra nội độc tố, gây hoạt hoá bổ thể theo con đường nhánh tạo ra hiện
tượng opsonin hoá vi khuẩn. Ngoài ra, khi nội độc tố được giải phóng, nó
kích thích đại thực bào và các tế bào viêm khác để sản xuất ra các cytokin như
TNF, IL-1,IL-6 và các chất gây viêm khác, làm tăng phản ứng viêm cấp [28].
Các quá trình ấy cũng dẫn tới sự hoạt hoá tế bào miễn dịch đặc hiệu để loại
trừ S. typhimurium. Các kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức (LPS) kích
thích lympho B tạo kháng thể đặc hiệu (chủ yếu là IgM) [3]. Những phần
kháng nguyên khác của S. typhimurium được đại thực bào xử lý và trình diện
cùng với phân tử MHC II cho tế bào T CD4
+
, khi đó các tế bào này được hoạt
hoá tiết ra IL-4, IL-5, IL-6 kích thích dòng tế bào B sản xuất ra kháng thể Ig
G đặc hiệu [54].
Trong quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể chủ với sự lây nhiễm của
S. typhimurium, kháng nguyên O là kháng nguyên tạo ra sự đáp ứng miễn
dịch ban đầu mạnh, nhưng sau yếu dần và không gây đáp ứng miễn dịch nhớ.
Kháng nguyên O vừa tương tác với tế bào lympho B tạo kháng thể vừa hoạt
hoá hệ thống bổ thể. Tuy nhiên, nếu như lượng độc tố giải phóng quá lớn,
các phản ứng viêm cấp xảy ra quá mạnh gây tổn thương tổ chức mô của cơ
thể chủ [3, 33]. Vì vậy, kháng nguyên O thường không sử dụng để lựa chọn
làm nguồn kháng nguyên tái tổ hợp.
Một kháng nguyên có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cao của S.
typhimurium là kháng nguyên roi. Với cấu trúc đơn giản chỉ bao gồm protein,
kháng nguyên này được coi là lý tưởng trong việc nghiên cứu tạo vacxin tái tổ
hợp. Gần đây, Stephen J. cùng cộng sự đã xác định khả năng sinh đáp ứng
miễn dịch của kháng nguyên thông qua việc xác định hàm lượng IFN-γ sinh ra
16
trong suốt quá trình lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh. IFN-γ là một loại cytokin do
tế bào CD4

+
tiết ra để hoạt hóa các đại thực bào và tăng cường khả năng bảo vệ
cơ thể trước sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng kháng nguyên H có khả năng gây
đáp ứng miễn dịch mạnh, đặc biệt có khả năng tạo miễn dịch nhớ, miễn dịch
bảo hộ giúp gia cầm chống lại Salmonella. Chúng ta đã biết ở S. typhimurium
kháng nguyên H được biểu hiện ở hai pha đó là fliC và fljB cơ chế hoạt động
của hai pha này đã được nói đến ở phần 1.2.1.1.3. Bình thường kháng nguyên
roi ở pha fliC hoạt động tương đối mạnh trong các cơ thể gia cầm và gây ra
nhiều bệnh cho gia cầm, nhiều nhất là bệnh về đường ruột, từ đó lây lan sang
người qua đường ăn uống và hô hấp.
Tuy nhiên khi cơ thể có kháng thể chống lại flic thì vi khuẩn chuyển sang
biểu hiện gen fljB để tạo roi giúp vi khuẩn di động, bám dính vào niêm mạc
ruột, xâm nhiễm vào cơ thể. Đây là một trong những cơ chế trốn hệ miễn dịch
của cơ thể chủ.
Vì vậy, để ngăn chặn vi khuẩn nhiễm gia cầm, điều quan trọng là phải gây
miễn dịch chủ động cho gia cầm, để tạo kháng thể chống cả fliC, fljB. Vì thế khi
vi khuẩn đi vào ruột chúng lập tức bị kháng thể nhận ra và bắt giữ roi, do đó
chúng mất khả năng di động bám dính vào ruột để gây bệnh.
1.3. Vacxin
1.3.1. Khái quát về vacxin
Hơn một ngàn năm trước, con người đã biết đến cách phòng bệnh đơn
giản mà không kém phần hiệu quả, đó là sử dụng vẩy da từ vết thương của
người bệnh để gây nhiễm cho người lành, nhờ đó mà ngăn chặn được dịch
bệnh. Tuy nhiên ở thời điểm đó chưa biết đến “vacxin” hay “sự tiêm chủng”,
nhưng họ đã áp dụng nguyên tắc phòng bệnh của việc tiêm chủng một cách
ngẫu nhiên thông qua một số hiện tượng mà họ gặp phải.
17
Đến năm 1796, một sự kiện quan trọng đã được ghi nhận như một dấu
mốc đánh dấu sự ra đời của ngành vacxin học. James Phipps, một cậu bé tám

tuổi sống tại làng quê nước Anh đã được bác sĩ Edward Jenner tiêm chủng để
chống lại được dịch bệnh đậu mùa đang lây lan rộng khắp [65]. Sự kiện này đã
mở ra cho ngành Y học trong việc tìm ra các phương pháp phòng bệnh hiệu quả.
Tuy nhiên, phải đến gần một thế kỷ sau, Luis Pasteur (1879- 1881)
mới chế tạo thành công 3 loại vacxin giảm độc lực (attenuated vaccine) chống
bệnh lỵ ở gà, bệnh than và bệnh dại, ông đã áp dụng thành công khi thử
nghiệm phương pháp điều trị bệnh dại trên cơ thể người: bé Josehp Meister đã
được cứu sống. Với những thành công ấy, Pasteur đã đặt nền móng đánh dấu
một mốc quan trọng cho sự phát triển môn khoa học: miễn dịch học [3].
Ngày nay, với sự tiến bộ khoa học và kỹ thuật, nhiều cơ chế và nguyên
lý của miễn dịch đã được sáng tỏ. Vì vậy, những hiểu biết về vacxin cũng
ngày càng hoàn thiện. Việc gây miễn dịch chủ động (tiêm chủng phòng bệnh)
đã được hiểu biết một cách đầy đủ hơn và luôn là lựa chọn hàng đầu, trong
cuộc sống chống lại các bệnh dịch do các vi sinh vật gây nên. Nhiều thế hệ
vacxin đã ra đời và ngày càng hoàn thiện hơn, nhưng mục đích và hiệu quả sử
dụng vẫn còn là vấn đề phải nói tới. Việc sử dụng vi sinh vật để làm nguồn
kháng nguyên toàn bộ để gây đáp ứng miễn dịch đã không đáp ứng được yêu
cầu về hiệu quả cũng như độ an toàn với cơ thể sử dụng. Người ta quan tâm
đến việc tạo ra một vacxin mới, đơn giản hơn mà lại cho các đặc điểm vượt
trội hơn cả về mặt gây đáp ứng miễn dịch và độ an toàn khi sử dụng. Vì vậy
mà một thế hệ vacxin mới đã ra đời, đó là vacxin tái tổ hợp được sản xuất dựa
trên cơ sở kháng nguyên thành phần. Có nhiều định nghĩa khác nhau về
vacxin, nhưng tựu chung lại có thể hiểu vacxin là một phần hay toàn phần của
tác nhân gây bệnh. Dưới tác động của con người các thành phần của tác nhân
18
gây bệnh được làm mất khả năng gây bệnh, khi đưa vào cơ thể, các tác nhân
ấy có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch giúp bảo vệ cơ thể.
Điều kiện của một vacxin phải đảm bảo 4 đặc tính sau:
• Tính sinh miễn dịch hay tính mẫn cảm
• Tính kháng nguyên hay tính sinh kháng thể

• Tính không độc
• Tính hiệu lực
1.3.2. Phân loại vacxin
Người ta đã dựa vào thành phần kháng nguyên và phương pháp chế
tạo vacxin để chia ra các thế hệ vacxin khác nhau. Loại vacxin kinh điển nhất
là vacxin chết hay vacxin bất hoạt (inactivated vacxin) được tạo ra trên cơ sở
giết chết vi sinh vật gây bệnh, bằng tác nhân vật lý, hoá học, nhưng vẫn giữ
được khả năng đáp ứng miễn dịch. Loại vacxin này đã được sử dụng rộng rãi
vào cuối thế kỷ XIX, nhưng nó đã bộc lộ những nhược điểm không thể khắc
phục về độ an toàn và hiệu quả phòng bệnh.
Tiếp đến là vacxin sống nhược độc hay vacxin sống giảm độc lực
(attenuated vaccine) loại vacxin này được điều chế bằng cách làm yếu hay bất
hoạt các vi sinh vật gây bệnh, nhưng vẫn còn khả năng gây đáp ứng miễn dịch
ghi nhớ. Tuy loại vacxin này có hiệu quả phòng bệnh cao hơn loại vacxin
chết, nhưng lại có nhiều mặt hạn chế như khả năng phục hồi độc tính, khả
năng đột biến trở thành dạng khác nguy hiểm hơn, vì vậy, vacxin sống nhược
độc cũng không đáp ứng được tính an toàn trong việc sử dụng trên quy mô
lớn. Mặc dù từ trước đến nay vacxin giảm độc lực là dạng vacxin được ứng
dụng và sử dụng nhiều nhất. Một số loại vacxin giảm độc lực điển hình là:
vacxin chủng lao BCG, vacxin chủng sởi, vacxin chủng bại liệt Sabin [27].
Trước tình hình đó, bên cạnh vacxin cổ điển, nhiều vacxin thế hệ mới đã
được ra đời, trên cơ sở sử dụng một số các protein đơn lẻ có khả năng đáp
19
ứng miễn dịch đặc hiệu làm nguồn kháng nguyên thành phần. Bằng việc sử
dụng một số kỹ thuật trong sinh học phân tử, người ta đã tìm ra vùng mã hóa
cho kháng nguyên đặc hiệu. Từ đó, các gen này được đưa vào các chủng biểu
hiện để tiến hành sản xuất hàng loạt kháng nguyên tái tổ hợp trên cơ sở sử
dụng công nghệ ADN tái tổ hợp. Công nghệ ADN tái tổ hợp không những tiết
kiểm thời gian nghiên cứu mà còn giúp giảm thiểu về mặt kinh tế khi ứng
dụng sản xuất vacxin thành phẩm trên quy mô công nghiệp. Mặt khác công

nghệ này còn cho phép tạo ra các vacxin đa chức năng, nhờ vào việc kết hợp
các tiểu đơn vị chứa epitop kháng nguyên đặc hiệu của nhiều loài do vậy mở
rộng phạm vi tác dụng. Loại vacxin này cho ưu điểm vượt trội cả về hiệu quả
cũng như độ an toàn khi sử dụng bởi tính đặc hiệu và tính không gây độc với
cơ thể. Nhờ tính ưu việt đó mà hiện nay vacxin tái tổ hợp đang là vấn đề được
quan tâm nghiên cứu hàng đầu và sẽ được sử dụng rộng rãi trong một tương
lai không xa. Có thể kể đến một số loại vacxin thế hệ mới như:
• Vacxin dưới đơn vị (subunit): chứa kháng nguyên đã tinh chế nên an
toàn hơn. Tuy nhiên, kháng nguyên của vacxin này có thể mất cấu trúc tự nhiên
nên sự đáp ứng miễn dịch tạo ra không có khả năng bảo vệ cơ thể trước nhân tố
gây bệnh [3].
• Vacxin peptit (peptid vacxin): là dạng các chuỗi peptit được phân lập
từ MHC của tế bào chủ. Dạng vacxin peptit thường để kích ứng sự miễn dịch
chứ không trực tiếp tạo ra sự đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Vacxin dạng này
thường sử dụng để chống ký sinh trùng [31,60].
• Vacxin cộng hợp (Conjugate vaccine): là dạng vacxin dựa trên sự kết
hợp của một protein mang với kháng nguyên (thường là polysaccarit). Dựa
vào cơ chế của hiện tượng opsoni hoá, khả năng đáp ứng miễn dịch của kháng
nguyên được tăng cường [60]. Ví dụ như polysaccarit của Heamophilus
influenzae B được kết hợp với giải độc tố bạch hầu để tăng khả năng miễn
dịch ở trẻ nhỏ.
20
• Vacxin ADN (DNA vaccine): Đây cũng là một dạng vacxin mới đã
được ghi nhận về tính hiệu quả và độ an toàn cao. Cũng tương tự như vacxin
tái tổ hợp, gen lựa chọn để tạo vacxin cũng cần phải chọn lọc và tiến hành
tách dòng. Tuy nhiên, vacxin loại này không sự dụng protein mà lại sử dụng
DNA làm liệu pháp vacxin. Với loại vacxin này, cả đáp ứng miễn dịch tế bào
cũng được kích ứng [31, 32, 43, 60]. Vacxin tái tổ hợp (recombinant vaccine):
là dạng vacxin tạo ra bằng cách được sử dụng trực tiếp như là vacxin hoặc có
thể tinh sạch như là vacxin dưới đơn vị. Kháng nguyên tái tổ hợp được tạo ra

bằng việc biểu hiện trong tế bào động vật, nấm men, virut hay vi khuẩn.
Một hướng tạo vacxin tái tổ hợp đã và đang được quan tâm nghiên cứu
nhiều hiện nay là vacxin virut lai.
Trong các loại vacxin trên mặc dù có một số khó khăn trong quá trình
lựa chọn kháng nguyên, tách dòng và biểu hiện nhưng dạng vacxin sử dụng
kháng nguyên tái tổ hợp vẫn là dạng vacxin có độ an toàn cao, dễ sử dụng, dễ
bảo quản và cho giá thành rẻ [43, 60].
Ngoài ra, dựa vào chủng sinh vật gây bệnh, có thể chia vacxin thành các
dạng như sau:
+ Vacxin virut
Virut là dạng ký sinh nội bào, về cấu trúc chúng chỉ gồm có vỏ bọc và
nhân (ARN hoặc ADN). Muốn tồn tại và phát triển virut phải kí sinh trong tế
bào vật chủ. Chúng sử dụng chính nguyên liệu của tế bào chủ để tổng hợp nên
các phân tử sinh học cho bản thân. Vì vậy, nhiệm vụ của liệu pháp vacxin là
ngăn cản sự nhân lên của virut và tiêu huỷ chúng.
Bình thường, hệ miễn dịch bẩm sinh của cơ thể cũng có khả năng tự bảo
vệ khi nhiễm virut bằng cách tiết IFN-ỏ hoặc dung giải các tế bào nhiễm virut
nhờ các tế bào aturebill. Tuy nhiên, trước sự phát triển nhanh của virut, hệ
miễn dịch bẩm sinh thường không lại kịp thời sự lây nhiễm của virut. Vì vậy,
để bảo vệ chống lại sự lây nhiễm, sự phát triển bệnh do virut gây ra, người ta
21
sử dụng vacxin. Điểm cơ bản của liệu pháp vacxin là việc kích thích miễn
dịch thích ứng của cơ thể chủ, từ đó giúp cơ thể chủ tạo khả năng bảo vệ
trước các tác nhân gây nhiễm. Kết quả do vacxin tạo ra là các dòng tế bào
lympho B, T có khả năng nhận biết đặc hiệu các protein của virut, từ đó ngăn
chặn sự lây nhiễm của virut từ tế bào nhiễm sang tế bào bình thường trong cơ
thể chủ.
Miễn dịch thích ứng bảo vệ cơ thể chống lại virut có thể tạo ra nhờ việc
tiêm chủng vào cơ thể chủ chủng virut gây bệnh nhưng đã được bất hoạt khả
năng gây bệnh hoặc bộc lộ protein virut đã được xác định với cơ thể chủ. Tuỳ

thuộc vào phương thức tác động khác nhau mà có các loại vacxin khác nhau.
Nhưng về bản chất đều là phương thức tạo “trí nhớ” miễn dịch hoặc đáp ứng
miễn dịch “nhắc lại” khi cơ thể chủ gặp lại virut gây bệnh. Đáp ứng miễn dịch
chống virut nhờ tiêm chủng vacxin được coi là “chủ động”. Đáp ứng miễn
dịch “thụ động” chống virut là do việc cung cấp trực tiếp kháng thể IgG
kháng virut. Sự đáp ứng miễn dịch “thụ động” này thường cần thiết đối với trẻ
nhỏ để cung cấp globulin miễn dịch khi trẻ nhiễm virut gây bệnh. Ví dụ như
tiêm kháng huyết thanh (chứa kháng thể) chống bệnh dại, bệnh thuỷ đậu. Vì
đáp ứng miễn dịch chủ động bằng vacxin là sự bắt chước tạo trí nhớ miễn dịch
nên đáp ứng miễn dịch chủ động thường bền hơn đáp ứng miễn dịch thụ động
[16].
Có thể sử dụng nhiều cách thức khác nhau để tạo vacxin virut. Mỗi cách
thức ấy phụ thuộc vào nguồn bệnh, mục đích của con người. Vacxin sống
nhược độc chống virut như vacxin chống bệnh sốt vàng, bệnh đậu mùa…đã
trở thành liệu pháp miễn dịch không thể thiếu. Cơ sở cho việc chế tạo vacxin
sống nhược độc là làm mất tính độc của chủng virut, nhưng vẫn giữ được khả
năng kích thích đáp ứng miễn dịch thích ứng. Tính độc trong vacxin có thể
làm mất đi dựa trên cơ chế cách ly vật chủ, sự thay đổi điều kiện trong quá
trình nuôi cấy virut, hay sự đột biến gen gây tính độc. Tuy nhiên, khi sử dụng
22
loại vacxin này, khả năng nguy hiểm không mong muốn cho cơ thể chủ có thể
xẩy ra. Đại đa số khi tiêm vacxin loại này thường tạo ra triệu chứng sốt nhẹ ở
cơ thể chủ. Thậm chí, trong một số trường hợp, khi tính độc của chủng virut
hồi phục, vật chủ có thể bị tử vong [16].
Các loại vacxin virut không gây nhiễm như: vacxin cúm, vacxin bại liệt,
vacxin virut viêm gan A, B, vacxin virut viêm não Nhật Bản. Các vacxin này
đều thuộc vacxin chết, vacxin dưới đơn vị, vacxin tái tổ hợp. Mặc dù khả
năng tái gây bênh được loại bỏ nhưng khả năng kích thích miễn dịch thích
ứng của của loại vacxin này lại giảm. Chính vì vậy, để tăng cường khả năng
kích thích này, các vacxin virut không gây nhiễm thường phải bổ sung tá chất.

+ Vacxin vi khuẩn
Liệu pháp vacxin vi khuẩn cũng dựa trên nguyên tắc sự kích thích tạo
đáp ứng miễn dịch chống lại bệnh do vi khuẩn mà không gây bệnh cho vật
chủ. Các vacxin loại này thường sử dụng vi khuẩn đã bị thay đổi (bất hoạt hay
làm giảm độc lực), hoặc sử dụng một phần của vi khuẩn để kích thích miễn
dịch. Kết quả của việc sử dụng vacxin này là ngăn chặn sự lây nhiễm hoặc
hạn chế những hậu quả do nhiễm vi khuẩn gây ra.
Trong cơ thể chủ có hai dạng vi khuẩn tồn tại: vi khuẩn nội bào và vi
khuẩn ngoại bào [3]. Vì vậy, liệu pháp vacxin được nghiên cứu dựa trên khả
năng gây bệnh và khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể chủ đối với mỗi loại
vi khuẩn. Đối vi khuẩn ngoại bào, kháng thể giữ một vai trò quan trọng trong
việc ngăn chặn khả năng lan rộng của kháng nguyên, trung hoà độc tố vi
khuẩn. Nhờ cơ chế trình diện kháng nguyên của đại thực bào cùng với phân
tử MHC II (hệ thống gen kiểm soát đáp ứng miễn dịch nằm trong hệ phù hợp
tổ chức chính) giúp tạo ra dòng tế bào lympho B có khả năng tiết IgG đặc
hiệu với kháng nguyên vi khuẩn. Bằng nhiều nghiên cứu, người ta thấy rằng,
kháng nguyên roi, kháng nguyên thân, và độc tố của vi khuẩn là những kháng
nguyên tạo đáp ứng miễn dịch mạnh nhất. Dựa trên cơ sở ấy, nhiều loại
23
vacxin chống vi khuẩn đã ra đời. BCG (Bacille Calmette và Guerin) là một
loại vacxin giảm độc lực dùng để phòng lao cho trẻ em 10-14 tuổi. Chủng vi
khuẩn Mycobacter tạo ra vacxin được phát triển ở bò và được sử dụng như
vacxin phòng lao. Với bệnh thương hàn người ta, đã tìm ra chủng S.
typhimurium Ty21 có thể được dùng làm vacxin giảm độc lực qua đường
uống. Bệnh bạch hầu, uốn ván lại dựa trên sự trung hoà độc tố của vi khuẩn
gây bệnh bởi các vacxin dưới đơn vị. Các vacxin ấy nhờ có mức độ thuần
nhất và tinh khiết hơn toàn bộ vi khuẩn nên tính mẫn cảm, tính sinh kháng
nguyên và tính hiệu lực đều cao hơn [55].
Hiện nay, bằng sự tiến bộ của công nghệ sinh học, người ta phân lập
được các gen mã hoá cho kháng nguyên vi khuẩn. Các gen này được tiến

hành dựa vào các hệ biểu hiện mạnh để biểu hiện ra các kháng nguyên tái tổ
hợp. So với việc tinh chế kháng nguyên dưới đơn vị, các kháng nguyên tái tổ
hợp cho lượng nhiều hơn mà vẫn giữ được tính an toàn và hiệu quả sử dụng.
Tuy nhiên, vacxin này chưa được phát triển rộng rãi.
+ Vacxin ký sinh trùng
Tương tự như các vacxin vi khuẩn, vacxin chống ký sinh trùng cũng có
những đặc điểm như khả năng tạo miễn dịch lâu dài bảo vệ cơ thể chủ, khả
năng an toàn… Tuy nhiên, đối với việc sản xuất vacxin ký sinh trùng, có rất
nhiều khó khăn nảy sinh. Khác với vacxin chống vi khuẩn và virut, vacxin ký
sinh trùng rất phức tạp bởi hệ thống kháng nguyên luôn thay đổi trong chu kỳ
sống, những cơ chế tự bảo vệ tinh vi của chúng trước sự đáp ứng miễn dịch
của cơ thể. Tổ chức Y tế thế giới đã nhận định, bệnh do ký sinh trùng gây ra
là một trong 7 bệnh lây nhiễm nguy hiểm và cần phải nghiên cứu vacxin để
phòng chống bệnh. Mặc dù vậy, cho đến nay, vẫn chưa có vacxin nào thực sự
có giá trị để chống ký sinh trùng ở người [27].
Một trong những vacxin ký sinh trùng nghiên cứu sớm nhất phải kể đến
là dạng vacxin có nguồn gốc từ sinh vật gây bệnh. Vacxin chết đã được
24
nghiên cứu nhưng không cho kết quả khả quan. Mặc dù khả năng gây độc
được loại trừ nhưng khi bất hoạt ký sinh trùng, hệ kháng nguyên cũng bị mất
đi đặc tính tự nhiên vốn có. Do đó, đáp ứng của hệ miễn dịch không đủ cơ sở
để bảo vệ cơ thể. Để khắc phục thiếu sót đó, vacxin giảm độc lực cũng đã
được nghiên cứu. Bằng việc xử lý ký sinh trùng bằng các tác nhân vật lý hay
hóa học, vacxin này được tạo ra. Tuy nhiên, những thử nghiệm về loại vacxin
này cho thấy khả năng tạo đáp ứng miễn dịch không đủ lâu dài để bảo vệ cơ
thể chủ.
Mỗi phương thức tạo vacxin đều có những hạn chế nhất định. Bằng việc
tinh chế, các kháng nguyên của ký sinh trùng khi đã tinh sạch được sử dụng
để kích ứng hệ miễn dịch tạo kháng thể đạt kết quả cao, nhưng khả năng bảo
vệ cơ thể lại kém. Hơn nữa, vacxin trong quá trình tinh chế có thể gây ra

những hậu quả không mong muốn với cơ thể chủ. Vacxin tái tổ hợp có thể
khắc phục được những khiếm khuyết do quá trình tinh chế có thể gây ra
nhưng sự biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp lại gặp khó khăn trong quá trình
lựa chọn kháng nguyên để biểu hiện và sự hình thành đúng cấu trúc kháng
nguyên sau khi biểu hiện. Mặc dù vacxin nào cũng có ưu nhược điểm, nhưng
riêng vacxin tái tổ hợp có nhiều ưu điểm hơn và ngày càng làm sáng tỏ hơn
những vấn đề nảy sinh trong quá trình đáp ứng miễn dịch .
1.4. Phân lập và biểu hiện gen
25