nghiên cứu phân lập cấu trúc và chuyển hóa zerumbone có trong củ gừng gió zinggiber zerumbet thu hái tại huyện bảo lạc cao bằng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.19 MB, 60 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Phitsakhone SYLAPHET

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, CẤU TRÚC VÀ CHUYỂN HÓA

ZERUMBONE CÓ TRONG CỦ GỪNG GIÓ (ZINGGIBER ZERUMBET) THU HÁI TẠI HUYỆN BẢO LẠC- CAO BẰNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2022

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Phitsakhone SYLAPHET

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, CẤU TRÚC VÀ CHUYỂN HÓA

ZERUMBONE CÓ TRONG CỦ GỪNG GIÓ (ZINGGIBER ZERUMBET) THU HÁI TẠI HUYỆN BẢO LẠC - CAO BẰNG

Ngành: HOÁ HỮU CƠ Mã số: 8.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Đinh Thúy Vân

THÁI NGUYÊN - 2022

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi dưới sự hướng dẫn của TS. Đinh Thúy Vân, sự giúp đỡ của các cán bộ giáo viên trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên. Các số liệu nêu trong luận văn là trung thực, có xuất xứ rõ ràng. Một phần kết quả đã được cơng bố trên Tạp chí phân tích Lý, Hóa và Sinh học, phần cịn lại chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này.

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2022

Tác giả luận văn

Phitsakhone SYLAPHET

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

LỜI CẢM ƠN

Trong q trình hồn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ hết sức quý báu của các tập thể và cá nhân.

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc tới cô giáo: TS. Đinh Thúy Vân, người đã tận tình hướng dẫn, hết lịng giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này.

Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể thầy, cô giáo trong khoa Hóa học, tổ bộ mơn Hữu cơ, khoa Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ cho tơi nghiên cứu, học tập và hồn thành luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, các học viên đã ln động viên, khuyến khích giúp đỡ tơi trong q trình học tập và hoàn thành luận văn.

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2022

Học viên

Phitsakhone SYLAPHET

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

2. Mục tiêu của đề tài ... 2

3. Nội dung nghiên cứu ... 2

4. Phương pháp nghiên cứu ... 2

Chương 1: TỔNG QUAN ... 3

1.1. Đặc điểm thực vật cây gừng gió... 3

1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) ... 3

1.2.1. Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió ... 4

1.2.2. Thành phần hóa học của tinh dầu thân và lá Gừng gió. ... 5

1.2.3. Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió . ... 6

1.3. Các đặc trưng của zerumbone ... 9

1.3.1. Phân lập và chuyển hóa zerumbone ... 9

1.3.2. Hoạt tính sinh học của gừng gió và zerumbone ... 10

1.4. Những nghiên cứu chuyển hóa zerumbone ... 11

1.4.1. Các nghiên cứu về hợp chất chứa vòng triazol ... 12

1.4.2. Các phương pháp tổng hợp azide ... 15

Chương 2: THỰC NGHIỆM ... 19

2.1. Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị ... 19

2.1.1. Phương pháp nghiên cứu ... 19

2.1.2. Hóa chất và dung mơi ... 19

2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng ... 19

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

2.1.4. Chứng minh cấu trúc ... 19

2.2. Chuẩn bị nguyên liệu ... 20

2.3. Ly trích tinh dầu gừng gió ... 20

2.4. Xác định thành phần hóa học của tinh dầu ... 20

2.5. Phân lập zerumbone từ cao chiết ethanol củ gừng gió khơ ... 21

2.6. Thử hoạt tính sinh học của zerumbon TL01 ... 22

2.6.1. Thử hoạt tính kháng khuẩn trên đĩa thạch ... 22

2.6.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của TL01 ... 22

2.6.3. Thử hoạt tính kháng oxi hóa của TL01 ... 24

2.7.1. Chuyển hóa zerumbone TL01 thành dẫn xuất 7-bromo-2,9,9-trimethyl-6- methylenecycloundeca-2,10- dienone G2-Br ... 25

2.7.2. Chuyển hóa 7-bromo-2,9,9-trimethyl-6-methylenecycloundeca-2,10- dienone thành Zerumbon azid G2-Az ... 25

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ... 27

3.1. Thành phần hóa học tinh dầu gừng gió Cao Bằng ... 27

3.2. Phân tích cấu trúc zerumbone bằng các phương pháp phổ ... 28

3.2.1. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ IR ... 28

3.2.3. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ NMR ... 28

3.2.4. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ HSQC và HMBC ... 32

3.2.5. Phân tích phổ khối lượng của TL01 ... 36

3.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của zerumbone TL01 ... 36

3.3.1. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn ... 36

3.3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng ung thư của zerumbone TL01 ... 37

3.3.3. Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa của zerumbone TL01 ... 38

3.4. Chuyển hóa Zerumbone thành hợp chất azid ... 38

KẾT LUẬN ... 42

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ... 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 44

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MS Phương pháp phổ khối lượng

EI Phương pháp bắn phá bằng dịng electron CI Phương pháp ion hóa hóa học

FAB Phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh

HSQC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều biểu hiện tương tác trực tiếp giữa H với C mà nó liên kết trực tiếp. 1H-NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hiđro

13C-NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân của cacbon

COSY Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều thể hiện tương tác của các proton gần nhau trong không gian

DEPT Phương pháp ghi phổ

HMBC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều thể hiện tương tác xa của nguyên tử 1H với 13C

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số chỉ số hóa học của tinh dầu củ Gừng gió ... 4

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió ... 4

Bảng 1.3. Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió ... 5

Bảng 1.4. Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió Huế ... 7

Bảng 1.5. Thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ Gừng gió Bình Định ... 8

Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất tổng hợp được ... 14

Bảng 3.1. Thành phần hóa học tinh dầu gừng gió trồng tại Cao Bằng ... 27

Bảng 3.2. Bảng dữ liệu phổ quy gán của zerumbone TL01 ... 34

Bảng 3.3. Đường kính vịng kháng khuẩn (ĐKVKK) của zerumbone TL01... 37

Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính kháng ung thư của zerumbone ... 37

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình:

Hình 1.1. Cây và củ Gừng gió (Zinggiber Zerumbet) ... 3

Hình 1.2. Cấu trúc của một số hợp chất lai có hoạt tính tốt [14] ... 15

Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất zerumbone ... 29

Hình 3.2. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone ... 30

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone ... 30

Hình 3.11. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone azid ... 40

Hình 3.12. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone azid ... 40

Hình 3.13. Phổ 13C-NMR của hợp chất G2-Az ... 41

Hình 3.14. Phổ HR-MS của hợp chất G2-Az ... 41

Sơ đồ: Sơ đồ 1.1. Phản ứng “click” dùng xúc tác Cu(I) [23, 30] ... 12

Sơ đồ 1.2. Phản ứng “click” dùng xúc tác phức [Cp*(RuCl(PPh3)2] ... 12

Sơ đồ 1.3. Tổng hợp các hợp chất lai của dẫn xuất quinazolin 119a-d với các azid qua cầu nối triazol... 13

Sơ đồ 3.1. Chuyển hóa Zerumbone thành hợp chất azid ... 38

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài

Ngày nay, ô nhiễm môi trường sống cùng thực phẩm bẩn là những nguyên nhân hàng đầu làm gia tăng số ca mắc các bệnh ung thư trên toàn cầu. Việt Nam là nước mà WHO xếp nằm trong 50 nước thuộc top 2 của bản đồ ung thư (50 nước cao nhất thuộc top 1). Điều trị ung thư thường được biết đến với phương pháp hóa trị, xạ trị thuốc điều trị tây y... Tuy nhiên, các liệu pháp này bộc lộ một số hạn chế như khả năng kéo dài thời gian sống của bệnh nhân thường ngắn, thông thường dưới 1 năm đi kèm với chất lượng sống bị ảnh hưởng nặng nề. Người bệnh phải gánh chịu nhiều tác dụng phụ của thuốc, đặc biệt là các tác dụng phụ trên tủy xương, gây ra tình trạng thiếu máu, chảy máu và giảm sức đề kháng của cơ thể dẫn đến các khả năng nhiễm khuẩn huyết làm cho bệnh nhân sớm tử vong. Vì vậy, để giảm bớt các tác dụng phụ của thuốc tây y thì nhiều nghiên cứu gần đây trên thế giới đã hướng đến các chất có hoạt tính kháng ung thư có trong thực vật và được chuyển hóa từ hợp chất thiên nhiên.

Từ lâu đời Gừng gió (Zingiber zerumbet) được sử dụng là cây thuốc quen thuộc

của các dân tộc thiểu số ở miền núi phía Bắc và miền Trung Tây Nguyên Việt Nam, là loài thực vật phát triển mạnh mẽ và phân bố ở hầu hết các nước nhiệt đới Châu Á. Trong cây Gừng gió thì hàm lượng tinh dầu trong củ là cao nhất. Hoạt chất chính trong tinh dầu của củ Gừng gió là zerumbone và hàm lượng của nó là tiêu chuẩn để đánh giá tinh dầu Gừng gió. Ở các vùng lãnh thổ khác nhau làm cho hàm lượng và thành phần hóa

học của gừng gió cũng khác nhau. Tuy nhiên đến nay chưa có cơng trình nào cơng bố về

thành phần hóa học của tinh dầu gừng gió trồng tại Cao Bằng. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu phân tích thành phần hóa học của tinh dầu gừng gió, chiết tách và thử hoạt tính sinh học, kháng ung thư của zerumbone và chuyển hóa zerumbone để bước đầu có những đánh giá về tiềm năng, cung cấp dữ liệu về sự ảnh hưởng địa chất đến thành phần tinh dầu gừng gió được trồng và thu hái tại Cao Bằng.

Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước mới đây cho thấy Zerumbon là một tác nhân phòng ngừa và chống ung thư mạnh trên 10 loại ung thư khác nhau, đặc biệt là ung thư gan và ung thư vú, phòng ngừa ung thư, chống viêm, kháng các vi sinh vật và chống virut HIV. Do đó, chuyển hóa zerumbone cịn nhằm tạo ra các dẫn xuất mới chứa nhóm

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

chức sinh học của zerumbone với hoạt tính sinh học tốt hơn nó đang là những hướng nghiên

cứu rất được quan tâm. Với các lý do trên thì đề tài “Nghiên cứu phân lập, cấu trúc và

chuyển hóa zerumbone có trong củ gừng gió (Zinggiber Zerumbet) thu hái tại

huyện Bảo Lạc- Cao Bằng” có ý nghĩa khoa học và tính thời sự cao. 2. Mục tiêu của đề tài

- Xác định thành phần hóa học trong tinh dầu và cao chiết cồn củ gừng gió thu hái tại Bảo Lạc- Cao Bằng.

- Phân lập và xác định cấu trúc zerumbone từ cao chiết cồn củ gừng gió. - Chuyển hóa zerumbone thành một dẫn xuất.

- Xác định hoạt tính sinh học của các chất phân lập được.

3. Nội dung nghiên cứu

Từ mục tiêu đặt ra, đề tài có các nội dung chính sau:

1. Thu mẫu củ Gừng gió (Zingiber zerumbet). Tạo tiêu bản, xác định tên

khoa học.

2. Tạo mẫu nguyên liệu thu được.

3. Khảo sát thành phần phần hóa học trong tinh dầu và cao chiết cồn củ gừng gió.

4. Phân lập và xác định cấu trúc zerumbone từ cao chiết cồn củ gừng gió. 5. Chuyển hóa zerumbone thành một dẫn xuất.

6. Xác định hoạt tính sinh học chất phân lập được.

4. Phương pháp nghiên cứu

- Xử lý mẫu, ngâm chiết với các dung mơi phù hợp. - Trích ly tinh dầu bằng hơi nước.

- Phương pháp GC-MS xác định thành phần tinh dầu.

- Phương pháp sắc ký như sắc ký cột thường, sắc ký cột với chất nhồi cột silicagel. - Phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), tử ngoại (UV-VIS), phổ khối (EI-, ESI-, HR-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D-, 2D-NMR) để xác định cấu trúc của các chất phân lập được.

- Phương pháp thử hoạt tính sinh học.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm thực vật cây gừng gió

Hình 1.1. Cây và củ Gừng gió (Zinggiber Zerumbet)

Gừng gió là cây thảo mộc, cao 1 - 1,3 m. Thân rễ dạng củ, phân nhánh, lúc non màu vàng và thơm, lúc già màu trắng và đắng, có mùi thơm. Thân khí sinh khỏe, mọc đứng, nhẵn. Lá không cuống mọc thành 2 dãy, hình mác thn dài, gốc hẹp dần, đầu nhọn, dài khoảng 20 cm, rộng 5cm mặt trên nhẵn, mặt dưới có lơng rải rác. Bẹ lá to nhẵn, lưỡi bẹ tròn dễ gãy. Cụm hoa dạng trứng, đơi khi hình trụ, kích thước 6 - 14 x 4 - 5 cm, chóp tù, mọc từ thân rễ trên một cán mập dài 20 - 30 cm phủ bởi những lá bắc xếp lớp; mép màu lục nhạt. Đài hoa nhỏ, tràng hoa có ống loe thành thùy hẹp màu trắng; một nhị; bao phấn dài hơn trung đới, cánh môi rộng màu vàng nhạt. Các thùy hình mác dài, màu vàng chanh; có 3 thùy, thùy phía lưng lớn hơn, kích thước 2,5 x 2 cm; các thùy bên nhỏ kích thước 1,6 x 0,7 cm; mơi dài 5 cm. Mép có răng tròn, màu trắng hoặc vàng, bao phấn màu vàng nhạt; bầu 3 ơ, quả nang hình bầu dục, chứa ít hạt màu đen. Mùa hoa nở từ tháng 7 đến tháng 9 [6, 7, 8, 12].

1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.)

Trong Gừng gió có nhiều tinh dầu, dầu béo và nhựa dầu. Trong tinh dầu có 13% các monoterpen và nhiều sesquiterpen, trong đó humulen 27%, monocyclic, sesquiterpen, xeton, zerumbone 37,5%. Các monoterpen gồm α - pinen, camphen, limonen, cineol, và camphor. Zerumbone là thành phần chính của tinh dầu [7].

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

1.2.1. Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió

Tinh dầu cây Gừng gió chủ yếu tập trung ở bộ phận củ, tinh dầu củ Gừng gió có mùi thơm nồng [6]. Tinh dầu củ Gừng gió mọc ở Trị Thiên và Đắc Lắc - Việt Nam có

các chỉ số hóa học được dẫn ra trong bảng 1.1 [6].

Bảng 1.1. Một số chỉ số hóa học của tinh dầu củ Gừng gió

Vùng Chỉ số xà phịng hóa Chỉ số acid Chỉ số este

Thành phần hóa học chính của củ Gừng gió vùng Bình Trị Thiên - Việt Nam cũng được chỉ ra trong bảng sau [6, 19].

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió

6 Caryophylen oxit 1,5 22 Terpinen-4-ol 0,1

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

1.2.2. Thành phần hóa học của tinh dầu thân và lá Gừng gió.

Tinh dầu thân, lá và hoa Gừng gió đều có màu vàng xanh nhạt, phảng phất mùi thơm của tinh dầu hoa bưởi [6]. Có khoảng 40 hợp chất tìm thấy trong tinh dầu thân, lá Gừng gió (chiếm hơn 84% và 82% tinh dầu). Năm 1995, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu thân, lá Gừng gió vùng Bình Trị Thiên, kết quả được chỉ ra trong bảng 1.3.

Bảng 1.3. Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

TT Tên chất Thân Gừng gió

Các chất chưa nhận biết được 15,5 17,7

1.2.3. Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió [6, 19]

Hơn 44 hợp chất được tìm thấy trong tinh dầu hoa Gừng gió sinh trưởng khu vực Huế (chiếm khoảng 85% tinh dầu) và được chỉ ra trong bảng 1.4.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Bảng 1.4. Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió Huế

11 (E)-β-ocimen 1,3 33 Caryophylen oxit 2,2

13 2-metyl-6-metylen-1,7-octadien

Năm 2018 Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Lê Tuấn và cộng sự đã nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ Gừng gió thu hái tại Bình Định. Kết quả được trình bày trong bảng sau:

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

Bảng 1.5. Thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ Gừng gió Bình Định

Dựa trên kết quả GC/MS của tinh dầu thân rễ Gừng gió thu hái tại Bình Định cho thấy có 14 chất đã được định danh chiếm 98,74% tổng lượng tinh dầu. Trong đó, cấu tử chính có trong tinh dầu là zerumbone 79,60%, α-Humulene 9,06%, Humulene epoxide I 2,77%, Camphene 1,97% và Humulene epoxide II 1,64%. Hầu hết các chất trong tinh dầu nghiên cứu đã được định danh, các chất chưa biết chỉ chiếm dưới 2%.

Kết quả phân tích định lượng và nhận dạng các thành phần hóa học của tinh dầu củ,

thân, rễ, lá và hoa của cây Gừng gió (Zingiber Zerumbet Sm.) cho thấy thành phần chủ yếu

của các loại tinh dầu này là các sesquitecpen và dẫn xuất chứa oxi của chúng được xây dựng trên hai khung cacbon cơ sở là humulan và caryophylan. Trong tinh dầu củ chúng chiếm đến 83,6%, tinh dầu của thân và lá có thêm dẫn xuất oxi của khung farnezan chiếm một lượng khá lớn: trong thân là 16,8%, trong lá là 22,3%.

Mối liên hệ giữa 4 loại tinh dầu này dựa trên 3 thành phần: zerumbone, humulen và caryophylen với tinh dầu của củ thì zerumbone là chủ yếu (72,3%), humulen và humulen

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

oxit là 11,3%, caryophylen chiếm 1,5%. Trong khi đó, tinh dầu của hoa thì zerumbone là 3,2%, humulen là 1,9% nhưng caryophylen lên đến 13,2%.

Ở các vùng lãnh thổ khác nhau thì các thành phần này cũng khác nhau, ví dụ như tinh dầu củ Gừng gió Việt Nam vùng Bình Trị Thiên zerumbone chiếm 72,3%, humulen chiếm 4,2%. Trong khi đó, tinh dầu củ Gừng gió Philippin thì zerumbone chiếm 35,5% và humulen là 17,3%. Trong cây Gừng gió thì hàm lượng tinh dầu trong củ là cao nhất. Vì trong tinh dầu của củ Gừng gió zerumbone là thành phần có hàm lượng lớn nhất nên nói đến tinh dầu Gừng gió là nói đến zerumbone và hàm lượng của nó là tiêu chuẩn để đánh giá tinh dầu Gừng gió.

1.3. Các đặc trƣng của zerumbone

1.3.1. Phân lập và chuyển hóa zerumbone

Zerumbone là thành phần chính được phân lập từ củ Gừng gió lần đầu tiên vào năm 1960 [17], được Damodaran.N.P và các cộng sự xác định cấu trúc phân tử vào năm 1965. Hiện nay zerumbone đang được ứng dụng trong lâm sàng làm thuốc điều trị ung thư ở giai đoạn III. Do đó việc phân tích cấu trúc và xây dựng phương pháp hóa lý hiện đại để định lượng zerumon là rất có ý nghĩa khoa học.

Zerumbone cịn có tên là 8-oxohumulen, tên khoa học là (E,E,E)-2,6,9,9-tetrametylcycloundeca-2,6,10-trien-1-on, được phân lập chủ yếu từ tinh dầu. Zermbon là tinh thể hình kim, nóng chảy ở 67-68oC và có nhiệt độ sôi (10 mmHg) là 165-167oC. Ngoài ra, zerumbone đã được phân lập từ các cây: Syringa

pinnafolta; Zingiber zerumbet và một số cây thuộc chi gừng.

Zerumbone là một xeton sesquitecpen đơn vòng, trong phân tử có nhóm

cacbonyl α,β khơng no, có ba liên kết đơi do đó khả năng chuyển hóa zerumbone rất

lớn: chuyển hóa ở các liên kết đơi (1, 2 hay cả 3 liên kết đôi) bằng các phản ứng khác nhau như cộng hợp, oxi hóa, đồng phân hóa... Chuyển hóa nhóm cacbonyl bằng cách

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

khử hóa theo các mức độ khác nhau, như khử thành ancol, khử thành metylen bằng các phương pháp khử khác nhau, bảo tồn và khơng bảo tồn liên kết đơi. Chuyển hố mở vịng thành các dẫn xuất oxi hay dẫn xuất khác.

Zerumbone là một tác nhân chống ung thư [40], phòng ngừa ung thư [32], chống viêm, kháng các vi sinh vật [27] và chống virut HIV [18]. Do đó, chuyển hóa zerumbone cịn nhằm tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học tốt hơn zerumbone và tìm ra nhóm chức sinh học của phân tử zerumbone cũng là một hướng chuyển hóa rất được quan tâm: Khử hóa nhóm cacbonyl thành ancol để nghiên cứu phản ứng tổng hợp bất đối xứng của zerumbol và xác định cấu hình tuyệt đối của nó [26]. Cộng hợp vào

liên kết đơi liên hợp α,β của nhóm cacbonyl: các nghiên cứu cho thấy khi ở nhiệt độ phòng hay ở nhiệt độ thấp hơn các amin bậc 1 và bậc 2 cộng hợp vào liên kết đơi α,β

với nhóm cacbonyl tạo ra các dẫn xuất amin của zerumbone [27].

1.3.2. Hoạt tính sinh học của gừng gió và zerumbone

Như phần trên đã trình bày hàm lượng zerumbone trong củ Gừng gió rất cao, đặc biệt trong tinh dầu (73,2%) [19]. Nó là thành phần chính quyết định giá trị của tinh dầu Gừng gió cũng như cặn chiết của Gừng gió. Do đó, nghiên cứu hoạt chất sinh học trong Gừng gió trước hết là nghiên cứu hoạt tính sinh học của zerumbone.

Hoạt tính chống ung thư là hoạt tính nổi bật của zerumbone. Điều này được Takahashi.S đề cập đến năm 1988 [28] và về sau có nhiều nghiên cứu khẳng định điều này. Đặc biệt năm 2005, Huang.G.C và cộng sự nghiên cứu tác dụng ức chế khối u của

zerumbone trên tế bào P-388Dl invitro, invo ở chuột và khẳng định ở nồng độ 5 mg/kg

(thể trọng chuột) thì kéo dài sự sống của chuột một cách rõ rệt [24]. Zerumbone cũng ức chế sự phát triển tế bào ung thư máu trắng dòng HL 60 ở người, ở các nồng độ 22,29; 9,12 và 2,27 µg/ml trong 6, 12 và 18 giờ, tùy theo phương thức điều trị [25].

Ngoài nghiên cứu hoạt tính chống ung thư, người ta cũng rất quan tâm nghiên cứu hoạt tính phịng ngừa ung thư và nhóm chức sinh học của phân tử zerumbone. Đây là một hướng nghiên cứu mới phát triển đầu thế kỉ này. Để khảo sát hoạt tính phịng ngừa ung thư Murakami.A và cộng sự đã khảo sát hoạt tính ức chế của zerumbone đối với tác nhân gây ung thư TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) do hoạt động của virut Epstein-Barr tạo ra. Kết quả cho thấy zerumbone là một tác nhân ức chế mạnh tác nhân gây ung thư TPA (IC50 = 0,14 µM) [32].

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Các nghiên cứu sâu hơn vai trò của nhóm cacbonyl α, β khơng no trong phân tử zerumbone của Nakamura và cộng sự cho thấy zerumbone là một tác nhân hóa học phịng ngừa (chemopreventive agent) chống lại các bệnh ung thư ruột già và ung thư da nhờ nhóm cacbonyl α, β khơng no của nó đã kích thích các enzym giải độc phase II của tế bào biểu mô nuôi cấy trên chuột. Cịn humulen và zerumbol khơng có các nhóm này nên không thể hiện một tác dụng nào. Các tác giả cịn cho rằng đặc tính ái điện tử của nhóm cacbonyl α, β khơng no làm cho khả năng phản ứng ái nhân của các protein sunfuryl tốt hơn ở vị trí nhóm cacbonyl này, nhất là các tiol có phân tử lượng thấp. Đó

là thực chất vai trị quan trọng của nhóm cacbonyl α,β khơng no trong kích thích enzym

giải độc phase II [34].

1.4. Những nghiên cứu chuyển hóa zerumbone

Vào năm 2010 Uraiwan Songsiang và cộng sự đã chỉ ra rằng dẫn xuất 3- amino, 3- amino thế có hoạt tính chống sự phát triển của 5 dòng ung thư túi mật khác nhau ở nồng độ IC50  75 M trong khi đó ở nồng độ này zerumbone khơng có tác dụng- đây là một kết quả thú vị [42]. Theo hướng này người ta tổng hợp rất nhiều dẫn xuất của zerumbone nhằm nâng cao hiệu quả của zerumbone. Cấu tạo phân tử của Zerumbone cho thấy có nhiều khả năng tổng hợp các dẫn xuất của Zerumbone như: dẫn xuất của nhóm cacbonyl, dẫn xuất của liên kết đơi liên hợp với nhóm C=O, dẫn xuất của liên kết đôi độc lập (C6=C7) và các dẫn xuất của oix hố mở vịng. Đứng đầu trong chuyển hoá Zerumbone là các nhà khoa học Nhật Bản [31].

Năm 2016 S. C. Santosh Kumar và cộng sự đã nghiên cứu chuyển hóa Zerumbone thành Zerumbal và zerumbenone, hoạt tính kháng khuẩn tốt trên hai chủng

khuẩn: Samonella; E. coli.

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

1.4.1. Các nghiên cứu về hợp chất chứa vòng triazol

Triazol là hợp chất dị vòng thơm năm cạnh với 3 nguyên tử nitơ có moment lưỡng cực cao, dễ dàng tham gia quá trình hình thành liên kết hydro và các tương tác lưỡng cực với DNA, protein hoặc các tế bào. Hợp chất dị vịng này khơng bị thủy phân trong môi trường acid và bazơ cũng như không bị phá huỷ trong q trình khử và oxy hóa. Triazol dễ dàng được tổng hợp bằng phản ứng cộng đóng vịng kiểu 1,3 lưỡng cực với xúc tác Cu(I) hay còn gọi là phản ứng “click” [23, 30].

Sơ đồ 1.2. Phản ứng “click” dùng xúc tác phức [Cp*(RuCl(PPh3)2]

Các triazol là nhóm hợp chất dị vịng có nhiều hoạt tính sinh học quý như kháng khuẩn, kháng nấm và chống ung thư [16, 20, 29, 35, 38]. Đây là những hoạt tính tương tự như một số hợp chất nhóm imidazol, trong đó nhiều hợp chất imidazol đã được sử dụng trong dược phẩm như kháng khuẩn (ví dụ như 5-nitroimidazol) [15],

chống nấm (muconazol) [45], thuốc an thần (midazolam) [30]. Đã có rất nhiều cơng

trình cơng bố tổng hợp thành cơng các hợp chất lai bằng phản ứng click tạo cầu nối là nhóm 1,2,3-triazol [22, 36, 37, 39, 41]. 1,2,3-triazol là hợp chất dị vòng thơm năm cạnh với 3 nguyên tử nitơ có moment lưỡng cực cao, dễ dàng tham gia quá trình hình thành liên kết hydro và các tương tác lưỡng cực với ADN, protein hoặc các tế bào. Hợp chất dị vịng này khơng bị thủy phân trong môi trường acid và bazơ cũng như

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

khơng bị phá hủy trong q trình oxi hóa và khử. Triazol dễ dàng được tổng hợp bằng phản ứng cộng đóng vịng kiểu 1,3 lưỡng cực với xúc tác Cu(I) hay còn gọi là phản ứng “click”. Bên cạnh đó, hợp chất 1,2,3-triazol cho hoạt tính chống ung thư, kháng khuẩn và kháng nấm mạnh. Với những tính năng ưu việt về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học, 1,2,3-triazol vừa là tác nhân vừa là cầu nối lý tưởng để lai hóa các hợp chất có dược tính khác như 4-anilinoqinazoline. Việc đưa nhóm thế triazoyl có chứa vịng thơm chứa các nhóm chức NO2 và CF3 ở các vị trí khác nhau vào mạch nhánh có thể sẽ làm tăng tương tác tyrosin kinase và cải thiện tính chất hóa lý của hợp chất quinazolin ban đầu. Tuy nhiên cho đến nay thì chưa có cơng trình nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất 4-anilinoquinazolin chứa nhóm 1,2,3 triazol ở mạch nhánh. Do vậy đây là nhóm cầu nối lí tưởng để lai hóa các lớp chất có hoạt tính khác nhau, hứa hẹn tổng hợp được nhiều hợp chất cấu trúc lai có hoạt tính sinh học quý.

Năm 2019 Đinh Thúy Vân và cộng sự đã tổng hợp được nhiều hợp chất lai chứa vòng triazol có hoạt tính sinh học cao đối với 3 dịng ung thư ở người: KB (ung thư biểu mô, Hep-G2 (ung thư gan) và Lu (ung thư phổi không phải tế bào nhỏ) [14].

Sơ đồ 1.3. Tổng hợp các hợp chất lai của dẫn xuất quinazolin 119a-d với các azid qua cầu nối triazol.

Thuốc thử và điều kiện: 1 equiv 4-anilinoquinazolin 119a-d, 1,1 azid equiv, 12

equiv DIPEA, 0,2 equiv CuI, THF, khuấy, 1-2 ngày, 70-90%.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất tổng hợp đƣợc

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

Azide là hợp chất trung gian để tạo ra các hợp chất có hoạt tính sinh học cao chứa cầu nối triazol, như vậy có thể thấy azide là cầu nối quan trọng để tổng hợp ra các hợp chất hoạt tính sinh học ứng dụng vào lĩnh vực Dược học và Y học. Trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về quy trình tổng hợp các hợp chất azide với nhiều con đường khác nhau.

Năm 2000 C. Yu và cộng sự đá tiến hành tổng hợp Phosphorylpyridinium azide từ Bis (2,4-diclorophenyl) photphat theo sơ đồ sau:

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Theo đó Bis (2,4-diclorophenyl) photphat làm trung gian để tiến hành phản ứng one- pot điều chế hiệu quả các ankyl azide từ các ankan với sự có mặt của 4 - (đimetylamino) pyridin làm bazơ. Phosphorylpyridinium azide được cho là tác nhân kích hoạt trong những điều kiện này.

Đến năm 2006 một nghiên cứu của Y. Ju và các cộng sự cho thấy con đường tổng hợp các azide bằng lị vi sóng nhanh chóng và hiệu quả, con đường này thúc đẩy sự thay thế nucleophin của alkyl halogenua hoặc tosylat bằng azid kiềm, thiocyanat hoặc sulfinat trong môi trường nước dung nạp các nhóm chức phản ứng khác nhau.

Tuy nhiên theo phương pháp trên thì điều kiện phức tap, khống chế phản ứng khó, khắc phục những điều kiện phản ứng khác nghiệt theo các nghiên cứu trên thì năm 2012 M. Kitamura và cộng sự đã nghiên cứu chuyển azid của 2-azido-1,3-đimetylimidazolinium hexafluorophosphat (ADMP) thành rượu tiến hành tạo ra các azid tương ứng trong điều kiện phản ứng nhẹ. Các azid hữu cơ được phân lập dễ dàng vì các sản phẩm phụ hịa tan nhiều trong nước.

Trong một nghiên cứu khác của G. Dagousset, và các cộng sự vào năm 2014 cho thấy sự chuyển hóa azidotrifluoromethyl được xúc tác quang học của styren được thay thế cũng như các anken hoạt hóa và khơng hoạt hóa khác nhau bằng cách sử dụng [Ru (bpy) 3 (PF 6 ) 2] làm chất xúc tác quang và thuốc thử của Umemoto như nguồn CF 3 cung cấp một loạt các azid hoặc amin β-trifluoromethyl hóa rộng rãi với sản lượng tốt.

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Năm 2015 nghiên cứu của M. Dryzhakov và các cộng sự đã nghiên cứu về hiệu ứng của xúc tác trong chuyển hóa của ancol như sau:

Hiệu ứng đồng xúc tác của các hợp chất nitro cho phép acid hóa xúc tác B (C 6 F 5 ) 3· H 2 O của rượu béo bậc ba với nhiều loại cơ chất. Bằng chứng động học, điện tử và quang phổ cho thấy rằng các tập hợp liên kết hydro bậc cao của các hợp chất nitro và acid là chất xúc tác acid Brønsted có hiệu quả về mặt động học.

Với AgNO 3 làm chất xúc tác và K 2 S 2 O 8 làm chất oxy hóa, một phương pháp hiệu quả và tổng quát để khử cacboxyl hóa acid cacboxylic béo với tosyl azid hoặc pyridin-3-sulfonyl azid trong dung dịch nước MeCN tạo ra các ankyl azid tương ứng dưới điều kiện nhẹ. Đã quan sát thấy phạm vi chất nền rộng và khả năng tương thích nhóm chức năng rộng. Một cơ chế cấp tiến được đề xuất.

C. Liu, X. Wang, Z. Li, L. Cui, C. Li, J. Am. Chèm. Soc. , 2015 , 137 , 9820-9823.

Trong quá trình nitro hóa khử cacboxyl hóa có xúc tác, một loạt các organoazid bậc ba, bậc hai và chính được điều chế từ các acid cacboxylic béo có sẵn dễ dàng bằng cách sử dụng K 2 S 2 O 8 làm chất oxy hóa và PhSO 2 N 3 làm nguồn nitơ thơng qua q trình gốc ankyl.

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Y. Zhu, X. Liu, X. Wang, X. Huang, T. Shen, Y. Zhang, X. Sun, M. Zou, S.

Song, N. Jiao, Org. Lett. , 2015 , 17 , 4702-4705.

Phương pháp hydroazid hóa trực tiếp chống Markovnikov liên phân tử đối với olefin khơng hoạt tính được thúc đẩy bởi một lượng xúc tác benziodoxol ổn định ở nhiệt độ môi trường xung quanh. Phương pháp này tạo điều kiện thuận lợi cho việc bổ sung trực tiếp acid hydrazoic trước đây qua nhiều loại olefin khơng hoạt

tính. H. Li, S.-J. Shen, C.-L. Zhu, H. Xu, J. Am. Chèm. Soc. , 2019 , 141 , 9415-9421.

Theo NPR Onuska và các cộng sự vào năm 2020, muối acridinium hữu cơ xúc tác q trình hydroazid hóa chống Markovnikov của các olefin hoạt hóa dưới sự chiếu xạ từ đèn LED xanh lam. Phương pháp này có thể áp dụng cho nhiều loại styren được thay thế và một số ete vinyl, tạo ra các sản phẩm hydroazid hóa tổng hợp đa năng với năng suất tuyệt vời, trong khi styren cuối cung cấp các sản phẩm hydroazid hóa với sản lượng vừa phải.

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1. Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị

2.1.1. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp ngâm chiết, phân lập chất, thử hoạt tính sinh học, phương pháp nghiên cứu cấu trúc hợp chất hữu cơ: phổ IR, MS, NMR, 2D-NMR…phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, sắc kí bản mỏng, sắc kí cột…

2.1.2. Hóa chất và dung môi

- Ethanol, n-hexane, methanol, nước cất, - Sắc ký bản được sử dụng bản mỏng từ silica gel 60 F254 tráng trên lá nhôm của hãng Merck (Đức).

- Silica gel cỡ hạt 0,04-0,06 mm.

- Thuốc thử hiện vết rên bản mỏng: CeSO4 pha trong Mo(SO4)2.

2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính các chất và hỗn hợp sản phẩm. Thơng thường các chất có giá trị Rf khác nhau, màu sắc và sự phát quang khác nhau. Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất của các chất và phụ thuộc vào dung mơi làm pha động. Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm được dung mơi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung mơi

Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo tại phịng thí nghiệm Hóa hữu cơ, khoa Hóa học, trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên.

b) Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ IR của các chất nghiên cứu được xác định trên máy FT-IR Spectrum Two Perkinelmer L160 tại phịng Hóa dược - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các mẫu nghiên cứu được đo ở dạng ép viên với KBr rắn.

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

c) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với dung mơi thích hợp và TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.

d) Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Hewlett phổ LC-LTQ Orbitrap XL của hãng Thermo Scientific tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.2. Chuẩn bị nguyên liệu

Củ gừng gió tươi được thu thập tại huyện Bảo Lạc, tỉnh Cao Bằng vào tháng 10. Nguyên liệu được thu hái từ 7-8 giờ sáng, yêu cầu củ không bị dập, héo úa, nấm mốc và sâu bệnh. Sau đó rửa bằng nước sạch, đập dập trước khi cho vào thiết bị chưng cất.

2.3. Ly trích tinh dầu gừng gió

Tinh dầu củ gừng gió được ly trích bằng phương pháp chưng cất lơi cuốn hơi nước trực tiếp.

+ Cân 100g củ tươi, bổ sung nước cất đến tỉ lệ nguyên liệu: nước là 1:6; sử dụng bộ cất tinh dầu nhẹ để tiến hành chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp trong thời gian thích hợp. Thời gian chiết tách được tính từ khi bắt đầu có giọt dầu ngưng tụ đầu tiên. Chưng cất trong khoảng 4 giờ cho tới khi thể tích tinh dầu không tăng nữa. Ngừng cất, sau 10 phút đọc thế tích tinh dầu trong ống cất để xác định hàm lượng tinh dầu (ml/l00g).

Tinh dầu thô được xử lý lọc và làm khan bằng Na2SO4 khan.

Tinh dầu được bảo quản trong lọ thủy tinh tối màu ở nhiệt độ 6°C (trong ngăn mát tủ lạnh) đế tiến hành các thử nghiệm.

2.4. Xác định thành phần hóa học của tinh dầu

Thành phần hóa học của tinh dầu gừng gió được xác định bằng phương pháp sắc ký khí ghép phổ khối GC-MS tại phòng phân tích Hóa học- viện Hợp Chất Thiên Nhiên- Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Tinh dầu gừng gió được phân tích bằng thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS của Agilent, GC 7890A - MS 5975C. Cột HP5 (30m; 0,25mm; 0,25pm). Sử dụng khí mang là He. Nhiệt độ buồng bơm mẫu là 250°C, nhiệt độ đầu dò 280°C. Tỉ lệ chia dịng 1:20, mẫu được pha lỗng trong hexane, thể tích tiêm 1µl. Chương trình nhiệt: nhiệt độ đầu 90°C, tăng 8°C/phút đến 280°C, giữ 5 phút, sử dụng thư viện phổ NIST 2011 của máy để định danh các cấu tử trong mẫu tinh dầu.

2.5. Phân lập zerumbone từ cao chiết ethanol củ gừng gió khơ

Cho 2,1 kg mẫu củ Gừng gió khơ đã được nghiền nhỏ vào bình thủy tinh 10 lít tối màu. Cho tiếp 5,0 lít cồn tuyệt đối (C2H5OH 96%)vào đến khi ngập nguyên liệu. Tiến hành ngâm chiết nguyên liệu trong 7 ngày. Sau đó chiết dịch lọc cồn qua phễu lọc hút chân không. Dịch chiết cồn được quay cất dưới áp suất thấp để thu hồi dung mơi. Q trình ngâm chiết được thực hiện lặp lại đến khi nào dịch chiết cồn có phản ứng âm tính với thuốc thử Bayers. Gộp các dịch chiết này lại quay đuổi dung môi thu được cao chiết cồn. Cao chiết thu được có mầu nâu đỏ, mùi thơm dễ chịu có khối lượng 459 gam. Nhồi cột silica gel kích thước (đường kính: 4cm và chiều cao: 56cm). Ổn định cột bằng dung môi hexane. Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi hexane: ethyl acetate

(95:5). Thu được 1,0 gam zerumbone tinh khiết TL01 là tinh thể hình kim màu trắng,

</div>