luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại việt nam

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ </b>

<b>PHẠM VĂN SƠN </b>

<b>NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VƠ HOẠT PHỊNG HỘI CHỨNG </b>

<b>RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM </b>

<b>LUẬN ÁN TIẾN SĨ </b>

<b>NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM </b>

<b>PHẠM VĂN SƠN </b>

<b>NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHỊNG HỘI CHỨNG </b>

<b>RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HƠ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM </b>

<b>Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi </b>

<b>Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên 2. TS. Nguyễn Văn Cảm </b>

<b>HÀ NỘI, 2018</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>LỜI CAM ĐOAN </b>

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn và các thơng tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

<i>Hà Nội, ngày tháng năm 2018 </i>

<b>Tác giả luận án </b>

<b>Phạm Văn Sơn</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>LỜI CẢM ƠN </b>

Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả:

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên và TS. Nguyễn Văn Cảm, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy mà luận án của tơi đã được hồn thành.

Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Phịng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức q báu và giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu này.

Trân trọng cảm ơn nhóm các nhà Khoa học nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin vô hoạt phịng Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn”. Thuộc chương trình KC-04 do PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên chủ nhiệm đã tạo điều kiện cho chúng tôi tham gia nhiều công đoạn nghiên cứu và cho phép tôi sử dụng một số kết quả nghiên cứu trong luận án này.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và cơ quan mà tôi đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tơi trong q trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

<i>Hà Nội, ngày tháng năm 2018 </i>

<b>Nghiên cứu sinh </b>

<b>Phạm Văn Sơn </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

Trích yếu luận án ... xiv

Thesis abstract ... xvi

<b>Phần 1. Mở đầu ... 1</b>

1.1. Tính cấp thiết của đề tài ... 1

1.2. Mục tiêu của đề tài ... 2

1.4. Những đóng góp mới của đề tài ... 3

1.5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ... 3

1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ... 3

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ... 4

<b>Phần 2. Tổng quan tài liệu ... 5</b>

2.2.2. Phân loại virus PRRS ... 17

2.2.3. Khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus PRRS... 18

2.3. Truyền nhiễm học ... 19

2.3.1. Loài vật mắc bệnh ... 19

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

2.3.2. Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây ... 19

2.3.3. Cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây và đáp ứng miễn dịch ... 20

2.6.4. Các phương pháp bảo quản giống gốc PRRSV trong phịng thí nghiệm ... 28

2.7. Nghiên cứu sản xuất vacxin phòng PRRS ... 30

2.7.1. Sản xuất vacxin bằng phương pháp vô hoạt virus ... 30

2.7.2. Sản xuất vacxin bằng phương pháp nhược độc virus trên môi trườngtế bào ... 31

2.7.3. Phương pháp sản xuất vacxin thế hệ mới ... 32

<b>Phần 3. Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu ... 36</b>

3.1. Địa điểm nghiên cứu ... 36

3.2. Thời gian nghiên cứu ... 36

3.3. Vật liệu nghiên cứu ... 36

3.4. Nội dung nghiên cứu ... 36

3.4.1. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn ở những ổ dịch PRRS và thu thập mẫu ... 36

3.4.2. Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRSV ... 36

3.4.3. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vơ hoạt nhũ dầu phịng PRRS ... 37

3.5. Phương pháp nghiên cứu ... 37

3.5.1. Phương pháp mổ khám ... 37

3.5.2. Phương pháp RT - PCR ... 37

3.5.3. Phương pháp làm tiêu bản vi thể ... 40

3.5.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào ... 41

3.5.5. Phương pháp nhân virus PRRS ... 43

3.5.6. Phương pháp xác định hiệu giá virus ... 43

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

3.5.7. Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus ... 43

3.5.8. Phương pháp giải trình tự gen ... 44

3.5.9. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein ... 45

3.5.10. Phương pháp gây tối miễn dịch trên chuột ... 45

3.5.11. Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh pha loãng) ... 46

3.5.12.Phương pháp IPMA ... 47

3.5.13.Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống PRRS (master seed và working seed)... 48

3.5.14. Phương pháp kiểm tra thuần khiết của giống (master seed và workingseed) bằng kỹ thuật PCR/RT-PCR ... 50

3.5.15.Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 trên hệ thống Bioreactor ... 50

3.5.16.Phương pháp cô đặc virus PRRS bằng lọc tiếp tuyến ... 50

3.5.17. Phương pháp vô hoạt virus ... 51

3.5.18. Phương pháp kiểm tra sau vơ hoạt ... 51

3.5.19. Phương pháp nhũ hóa vacxin ... 52

3.5.20. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của vacxin ... 52

3.5.21.Kiểm tra chỉ tiêu an toàn ... 53

3.5.22.Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin ... 53

3.5.23.Phương pháp Realtime RT-PCR ... 54

3.5.24. Phương pháp ELISA ... 55

3.5.25. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu ... 56

<b>Phần 4. Kết quả và thảo luận ... 57</b>

4.1. Nghiên cứu một số biểu hiện bệnh lý của lợn mắc PRRS ... 57

4.1.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm ... 57

4.1.2. Chẩn đoán PRRS bằng phương pháp RT-PCR ... 58

4.1.3. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể ... 60

4.1.4. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể ... 62

4.2. Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRS ... 65

4.2.1. Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 ... 65

4.2.2. Nghiên cứu sự ổn định một số đặc tính sinh học của các chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam ... 71

4.2.3. Đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus PRRS ... 79

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

4.2.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus

PRRS nghiên cứu ... 98

4.2.5. Sản xuất giống gốc ... 102

4.3. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS ... 107

4.3.1. Nhân giống sản xuất (Working seed) vacxin ... 107

4.3.2. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS ... 109

4.3.3. Nghiên cứu kiểm nghiệm vacxin vô hoạt PRRS ... 115

<b>Phần 5. Kết luận và kiến nghị ... 123</b>

5.1. Kết luận ... 123

5.2. Kiến nghị ... 123

Danh mục cơng trình đã cơng bố có liên quan đến luận án ... 124

Tài liệu tham khảo ... 125

Phụ lục ... 137

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT </b>

<b>Từ viết tắt Viết đầy đủ </b>

PEARS Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>Từ viết tắt Viết đầy đủ </b>

PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SIRD Swine Infertility and Respiratory Disease

TCID<small>50</small> 50% Tissue Culture Infective Dose

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>DANH MỤC BẢNG </b>

2.1. Lịch sử phát hiện bệnh ... 6

2.2. Một số tên thường gặp trong các tài liệu ... 6

2.3. Protein cấu trúc của PRRSV ... 7

2.4. Tổng hợp các ổ dịch PRRS xảy ra ở Việt Nam từ 2007-2016 ... 10

2.5. Cấu trúc và chức năng protein phi cấu trúc ... 16

2.6. Các vacxin đã thử nghiệm sản xuất ... 33

3.1. Thành phần phản ứng RT – PCR ... 38

3.2. Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR: ... 38

3.3. Chu kỳ nhiệt trong máy PCR ... 39

3.4. Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml ... 44

3.5. Chương trình chạy PCR giải trình tự ... 44

4.1. Số lượng mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được ... 57

4.2. Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đốn PRRS... 59

4.3. Bệnh tích đại thể ở phổi lợn mắc PRRS ... 60

4.4. Bệnh tích đại thể ở một số khí quan khác của lợn mắc PRRS ... 60

4.5. Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch phổi và hạch amidan của lợn mắc PRRS ... 62

4.6. Bệnh tích vi thể ở gan, lách và thận của lợn mắc PRRS ... 63

4.7. Bệnh tích vi thể ở tim, hạch ruột và ruột của lợn mắc PRRS ... 63

4.8. Kết quả phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 ... 65

4.9. Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được ... 66

4.10. Kết quả lựa chọn các chủng virus PRRS xác định hiệu giá ... 67

4.11. Kết quả xác định hiệu giá của các chủng PRRSV phân lập được ... 68

4.12. Các chủng virus PRRS được lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên ... 69

4.13. Kết quả lựa chọn sơ bộ các chủng virus PRRS cho nghiên cứu ... 72

4.14. Khả năng gây bệnh tích tế bào theo thời gian của các chủng virus qua 5 đời cấy chuyển ... 73

4.15. Hiệu giá của các chủng virus PRRS nghiên cứu qua 5 đờicấy chuyển ... 75

4.16. Kết quả lựa chọn chủng virus PRRS để nghiên cứu các đặc tính sinh học phân tử ... 79

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

4.17. Tương đồng nucleotide gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu

và các chủng tham chiếu ... 81

4.18. Tương đồng axit amin gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu ... 83

4.19. Tương đồng nucleotide gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng tham chiếu ... 86

4.20. Tương đồng axit amin gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng tham chiếu ... 88

4.21. Kết quả tinh chế kháng nguyên các chủng virus PRRS nghiên cứu... 98

4.22. Kết quả của phản ứng IPMA kiểm tra kháng thể kháng PRRSV ở thời điểm 14 ngày sau khi tiêm kháng nguyên PRRS cho chuột ... 99

4.23. Kết quả phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV ... 100

4.24. Phản ứng trung hòa xác định tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu ... 101

4.25. Kết quả kiểm tra vô trùng của giống gốc PRRS ... 103

4.26. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của giống gốc PRRS ... 104

4.27. Kết quả nhân giống sản xuất vacxin PRRS ... 108

4.28. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của các lô giống sản xuất ... 108

4.29. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của các lô giống sản xuất ... 109

4.30. Hiệu giá virus sau khi cô đặc bằng phương pháp lọc tiếptuyến ... 110

4.31. Kết quả xác định nồng độ formalin sử dụng vô hoạt virus vacxinPRRS ... 110

4.32. Kết quả q trình vơ hoạt virus vacxin PRRS bằng Formalin ... 111

4.33. Lịch tiêm các loại vacxin vô hoạt cho các lô lợn thí nghiệm ... 112

4.34. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV của lợn sau khi tiêm vacxin sử dụng chất bổ trợ khácnhau ... 113

4.35. Kết quả sản xuất vacxin vô hoạtnhũ dầu PRRS ... 115

4.36. Kết quả kiểm tra cảm quan các lơ nhũ hố ... 115

4.37. Kết quả kiểm tra vô trùng vacxin vô hoạt PRRS ... 116

4.38. Kết quả kiểm tra thuần khiết vacxin vô hoạt PRRS ... 116

4.39. Kết quả theo dõi chỉ tiêu an toàn của vacxin PRRS ở lợn thí nghiệm ... 117

4.40. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp ELISA ... 118

4.41. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp IPMA ... 118

4.42. Kết quả đánh giá công cường độc ... 120

4.43. Phản ứng Realtime - PCR xác định virus trong máu của lợn sau công cường độc .... 121

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<b>DANH MỤC HÌNH </b>

2.1. Bản đồ dịch tễ phân bố của PRRS tại Việt Nam từ 2007-2010 ... 9

2.2. Bản đồ dịch tễ phân bố của PRRS tại Việt Nam từ 2011-2013 ... 10

2.3. Cấu trúc virus PRRS ... 15

2.4. Cấu trúc genome virus PRRS ... 16

2.5. Cây phả hệ của virus PRRS ... 17

2.6. Gen từ các chủng virus khác nhau ... 34

4.1. Tai sung huyết ... 58

4.10. Viêm phổi (HE×10) ... 64

4.11. Dịch tiết trong lịng phế nang (H40) ... 64

4.12. Gan sung huyết (HE×10) ... 64

4.13. Gan thâm nhiễm tế bào viêm (HE×40) ... 64

4.14. Đường biểu diễn quy luật nhân lên trên môi trường nuôi cấy của các chủng virus PRRS phân lập được ... 70

4.15. Bệnh tích tế bào (CPE) do PRRS gây ra trên tế bào MARC-145ở các thời điểm khác nhau ... 74

4.16. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 010TB ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau ... 76

4.17. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 012NA ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau ... 77

4.18. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 049HY ở P0 và P5 tạicác thời điểm khác nhau ... 77

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

4.19. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 052TH ở P0 và P5 tại các

thời điểm khác nhau ... 77

4.20. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 008HN ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau ... 78

4.21. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide của đoạn gen ORF5

4.24. So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng tham chiếu ... 85

4.25. So sánh trình tự axit amin gen ORF7 của các chủng virus PRRS

nghiên cứu ... 87

4.26. Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF5 ... 90

4.27. Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF7 ... 91

4.28. Kết quả điện di sản phẩm đoạn gen ORF5 và ORF7 sau 5 đời cấy chuyển của chủng KTY-PRRS-01 ... 92

4.29. So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển ... 93

4.30. So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển ... 94

4.31. So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-02 qua 5 đời cấy chuyển ... 94

4.32. So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của virus KTY-PRRS-02 qua 5 đời cấy chuyển ... 95

4.33. So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-03 qua 5 đời cấy chuyển ... 96

4.34. So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của virus KTY-PRRS-03 qua 5 đời cấy chuyển ... 97

4.35. Hình ảnh điện di kiểm tra tạp nhiễm của giống với virus CSF, PCV2, PPV ... 105

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

4.36. Hình ảnh điện di kiểm tra tạp nhiễm của giống với virus giả dại và

<i>Mycoplasma ... 105</i>

4.37. Hình ảnh điện di kiểm tra tạp nhiễm của giống với virus PED, TGE ... 106

4.38. Tế bào MARC-145 âm tính với KT PRRSV ... 119

4.39. Tế bào MARC-145 dương tính với KT PRRSV bằng kỹ thuật IPMA... 119

4.40. Kết quả Realtime-PCRxác định virusPRRSV ... 121

1. Môi trường dinh dưỡng trước khi kiểm tra vô trùng ... 137

2. Môi trường dinh dưỡng sau khi kiểm tra vô trùng ... 137

3. Môi trường dinh dưỡng sau khi kiểm tra vô trùng ... 137

4. Giống sản xuất được lấy để kiểm tra vô trùng ... 138

5. Kiểm tra vô trùng giống sản xuất trên thạch Macconkey ... 138

6. Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên thạch Sabouraud ... 138

7. Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên thạch Macconkey... 138

8. Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên Canh thang PPLO ... 138

9. Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên Thioglycollat ... 138

10. Phổi lợn được tiêm vacxin vô hoạt PRRS sau công cường độc ... 139

11. Phổi lợn được tiêm vacxin vô hoạt sau công cường độc (10X) ... 139

12. Phổi lợn không tiêm vacxin sau công cường độc, viêm, xuất huyết ... 139

13. Phổi lợn không tiêm vacxin sau công cường độc, viêm kẽ phổi (10X) ... 139

14. Triệu chứng lâm sàng của lợn không tiêm vacxin sau cơng cường độc (tím tai) ... 139

15. Bệnh tích đại thể của lợn không tiêm vacxin sau công cường độc (thận xuất huyết điểm) ... 139

</div>