ứng dụng nano au polymer định lượng cholesterol trên mẫu thực phẩm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.1 MB, 115 trang )
<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">
BỘ CÔNGTHƯƠNG
<b>TRƯỜNGĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHĨ HỊ CHÍMINH</b>
<b>NGUYỄN NGỌC VY</b>
<b>ỨNG DỤNG NANO Au/POLYMER ĐỊNH LƯỢNG CHOLESTEROL TRÊN </b>
<b>MẢU THỰC PHẨM</b>
Ngành: HĨA PHÂN TÍCH Mangành:8440118
<b>LUẬN VĂN THẠC sĩ</b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">Cơng trình được hồn thànhtại Trường Đại học Cơng nghiệp TP. Hồ Chí Minh.Người hướng dẫn khoahọc: PGS.TS. Đoàn Văn Đạt
TS. Đỗ Thị Long
Luận văn thạc sĩ được bảovệ tại Hội đồngchấm bảo vệ Luận văn thạc sĩTrường Đại
học Cơng nghiệp thành phố HồChí Minhngày 06 tháng 04 năm 2024Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. PGS.TS. Nguyễn Văn Cường...- Chủ tịch Hội đồng
2. TS. Nguyễn Văn Anh...- Phản biện 1
3. TS. Hoàng Thị Quỳnh Diệu...- Phản biện 2
4. TS. Trần Thị ThanhThúy...- ủy viên5. PGS.TS. NguyễnQuốc Thắng...- Thư ký
<b>CHỦTỊCH HỘI ĐỒNGTRƯỞNG KHOA CƠNG NGHỆ HĨAHỌC</b>
<b>PGS.TS. NguyễnVăn Cường</b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3"><small>BỘ CƠNG THƯƠNG </small> <b>CỘNG HỊA XÃHỘICHỦ NGHĨAVIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆPĐộc lập -Tựdo - Hạnh phúc</b>
<b>NHIỆM VỤVÀ NỘI DUNG:</b>
Khảo sát các điều kiện tổng hợpnano vàng từ dịch chiếtcủ Sùng Thảo
Đặctrưng hạt nano vàng được xác định bằng phương pháp phân tích hóalý hiệnđại: XRD, TEM, SEM, EDX, DLS, TG-DTA, FT-IR, UV-Vis
Xác định đượccác thông số tối ưu đểđịnh lượng Cholesterol trong mẫu thực phẩm
<b>II. NGÀY GIAO NHIỆMVỤ: </b>Theo QĐ số 928/QĐ-ĐHCN ngày20/04/2022
<b>III.NGÀY HOÀN THÀNHNHIỆM VỤ: </b>theo đơn bảo vệ
<b>IV. NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: </b>PGS.TS. Đồn Văn Đạt
TS. ĐỗThị Long
<i>Tp. HoChí Minh,ngày ...tháng 02 năm 2024</i>
<b>NGƯỜI HƯỚNG DẪN 1 CHỦNHIỆM BỌ MƠN ĐÀO TẠO</b>
PGS.TS. Đồn Văn Đạt
<b>NGƯỜI HƯỚNG DẪN2</b>
TS. Nguyễn Quốc Thắng
<b>TRƯỞNG KHOACƠNGNGHỆ HĨAHỌC</b>
TS. Đỗ Thị Long <sub>PGS.TS. Nguyễn</sub><sub> Văn Cường</sub>
</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4"><b>LỜI CÁM ƠN</b>
Lời đầutiên, tôi xin được gửi tới thầy PGS.TS. Đồn Văn Đạtvà cơ TS. Đỗ Thị Long,
khoa Cơng nghệHóa học, trường Đại học Cơng NghiệpThành phố Hồ Chí Minh lời
biết ơn chân thành và sâu sắc nhất. Thầy/Cô lnquan tâm, hướng dẫn tận tình, động
viên và giúp đỡ tơi rấtnhiều trong q trình họctập, nghiên cứu và tạo mọi điều kiệnthuận lợi để hồn thành luận văn.
Tơi chân thành cám ơn thầy trưởng khoa PGS.TS. Nguyễn Văn Cường, các thầy cơkhoa Cơng Nghệ HóaHọcnói chung và các thầy cơ bộ mơn Phân Tích nói riêng, các
thầy cơ đã ln tậntụy, quan tâm để tơi kiên trì, phấn đấu trong quá trình học tập tại
trườngvàthực hiện luận văn. Đồng thời, tôibiết ơn sâu sắcviệcKhoađã đào tạo thạc sĩ chun ngành Hóa phân tích và trong q trình học tập thầy/cô luôn ghi nhận ý
kiếncủa học viên và thị hiếu của xã hội nhằm mục đích nâng cao chất lượng tốt nhất.
Tôi cũng chân thành cámơn đến các anh, chị công ty Eurofins sắc Ký Hải Đăng cùng
các bạn đồng nghiệp vàanh/chị/em, bạn bè đãtạo điều kiện thuận lợi, ln giúp đỡ tơi trong q trình học tập, nghiên cứu và đã luôn bên cạnh ủng hộ tôi về mặt tinh
thần và tạo động lực trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin cám ơn gia đình đã ln động viên, cổ vũ, tạo mọi điều kiện thuận
lợi nhất và là chỗ dựa vữngchắc để tơinỗ lực vượt qua mọi khókhăn và kiên trì trong
q trình học tập cũng như hồn thành luận văn.
Tuy luận văn hồn thành nhưng vẫn cịn những hạn chế nhất định, tôi rất mong nhận được những góp ý để luận văn được hồn thiện hơn.
Trân trọng.
</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5"><b>TÓM TẤT LUẬN VĂN THẠC sĩ</b>
Trong nghiên cứu này, một quy trình đơn giản, thân thiện với môi trường đã được
nghiên cứu để tổng hợp nano vàng trên nền gelatin (Au/gelatin) sử dụng dịch chiết
củ Sùng Thảo, ứng dụng định lượng Cholesterol trong mẫu thực phẩm. Nano Au/geltatin đã được đặc trưng bởi XRD, FTIR, TEM, SEM, EDX và DLS. Hạt nano
sau khi được tổng hợp được theo dõi bằng máy phân tích quang phổ uv - VIS đểxác nhận sự hình thành và tính ổn định. Đã tối ưu quy trình tổng hợp Au/gelatin từ dịch chiết củ Sùng Thảo, thu được hạtnano có dạng hìnhcầu, kích thước trung bình30 - 50 nm. Nano Au/gelatin sau tổng hợp được đánh giá là cảm biến sinh học so màu để phát hiện Cholesterol với sự có mặt của cholesterol oxidase (ChOx). Hiệu suất thu hồi của phương pháp đạt 91 - 110 %. Phương phápthể hiện tính chọn lọc và
độ nhạy cao, khoảngtuyến tính Cholesterol nằm trong khoảng 10 - 700 pM vàLOD,
LOQlần lượt là6,5 pM và 19,5 pM. Độ đúngcủa phương pháp được đánh giá bằng cách đối chiếu với kết quả phân tích bằng phương pháp sắc ký khí chothấy độ đúng
đạt trên 90%.
<i><small>Từ khóa: cholesterol oxydaza (ChOx), nano</small></i><small> vàng, định lượng Cholesterol, thực phẩm.</small>
</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">In this study, a simple, environmentally friendly process was investigated to
synthesize nanocomposite based on gold nanoparticles and gelatin (Au/gelatin) from
an aqueous extract<i>of Stachys affinis,</i> applied for the quantification ofCholesterol in food samples. Au/gelatin nanoparticles were characterized by XRD, FTIR, TEM,
SEM, EDX, and DLS. The formation and stability of the nanoparticles weremonitored by UV-Vis spectroscopy. The process of synthesizing Au/gelatin from
Sung Thao extract was optimized, yielding spherical nanoparticles with an average
size of 30-50 nm. Thesensing ability of the synthesized Au/gelatinnanoparticles wasevaluated as a colorimetric biosensor for Cholesterol detection in the presence
(ChOx). The recoveryefficiency ofthe method ranged from 91 - 100%. The methoddemonstrated selectivityand highsensitivity, linear range for Cholesterol between 10
-700 pM and LOD and LOQ values of6,5 and 19,5 pM, respectively. Themethod's accuracy was assessed by comparing the results with the analysis by gaschromatography, with an accuracygreater than 90%.
Keywords: cholesterol oxidase (ChOx), gold nanoparticles, Cholesterolquantification, food.
</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7"><b>LỜICAM ĐOAN</b>
Tôi tên Nguyễn Ngọc Vy học viên cao học chuyên ngành Kỹ thuật Hóa phân tích,
lớp CHHOPT10Acủa trường Đại học Cơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.Cam đoan răng:
Những kết quả nghiên cứu đượctrình bày trong luận văn là cơng trình của riêng tácgiảdưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Đồn Văn Đạt và TS. ĐỗThị Long khoa Cơng
nghệ Hóahọc, trường Đại học CơngNghiệp Thành phố Hồ Chí Minh
Những kết quảnghiên cứu củacác tác giả khác và các số liệu được sử dụng trong
luận văn đều cótríchdẫn đầy đủ.
Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
<i>TP. Hồ ChíMình, tháng 02 năm 2024</i>
<b>Nguyễn Ngọc Vy</b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...<small>XV</small>MỞ ĐẨU...1
1. Đặtvấn đề...1
2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu...2
3. Đối tượngvà phạm vi nghiên cứu...3
3.1 Đối tượng nghiên cứu...3
</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">1.3.2 Các phương pháp xác định cholesterol...10
1.4 Cơ sởlý thuyết định lượng cholesterol sử dụng hạtnano vàng...11
1.4.1 Nguyên tắc xác định cholesterol...11
1.4.2 Vai tròcủa enzyme trong định lượng cholesterol...11
1.4.3 Cơ chế nano vàngxúctác để định lượng cholesterol...12
1.5 Tình hình nghiên cứu trong vàngồi nước sử dụng hạtnano trong phân tích... 12
1.5.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước...12
1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước...13
1.6 Các phương pháp đặctrưngxác định hạtnano vàng...14
1.6.1 Kính hiển vi điệntử quét (SEM)...14
1.6.2 Kính hiển vi điện truyền qua (TEM)...14
1.6.3 Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD)...14
1.6.4 Quang phổ hồngngoại biến đổi Fourier (FTIR)...15
1.6.5 Phân tích nhiệt trọng lượng...15
</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">2.3 Phương pháptổng hợpnano và yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp...20
2.3.1 Khảo sát tỷ lệdịch chiếtcủ Sùng Thảo và dung dịchAu3+...21
2.3.2 Khảo sát nồng độ dung dịch Au3+trong quá trình tổng hợp nano Au...22
2.3.3 Khảo sát thời gian cần thiết để tổng hợpnano Au...23
2.3.4 Khảo sát nhiệt độ tối ưu đểtổng hợpnano Au...24
2.3.5 Phương pháp tổng hợp nanoAu/gelatin...25
2.3.6 Nghiên cứu tỷ lệ tối ưu của dịch chiết: Au3+ : gelatin...26
2.4 Nghiên cứu về khảnăng xúctác của nano Au/gelatin...26
2.4.1 Đánh giá tính đặchiệu của nano Au/gelatin...27
2.4.2 Khảo sát lượng vật liệu nano Au/gelatin đến phảnứng oxy hoáTMB...28
2.4.3 Khảo sát nhiệt độ đến qtrình oxy hốTMB...29
2.4.4 Khảo sát thời gian đến q trình oxy hóa TMB...30
2.4.5 Khảo sát pH đến phản ứng oxy hoáTMB...31
2.4.6 . Khảo sát nồng độ TMB đến phản ứng oxy hóa TMB...32
2.5 Thẩm định phương pháp...33
2.5.1 Xác định khoảng tuyến tính...33
2.5.2 Xác định LOD, LOQ...37
2.5.3 Độ đúng của phương pháp...38
2.5.4 Độ lặplại và tái lặpcủa phương pháp...38
2.5.5 Khảo sát độ đặchiệu của phản ứng với Cholesterol...40
2.6 Xác định hàm lượng Cholesterol trong mẫu thực phẩm...41
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀTHẢO LUẬN...43
3.1 Phương pháptổng hợp nano Au...43
3.1.1 Khảo sát tỷ lệ dịch chiếtcủ Sùng Thảo vớiAu3+...43
</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">3.1.2 Khảo sát nồng độ Au3+ trong quá trình tổng hợp nanoAu...45
3.1.3 Khảo sát thời gian để tổng hợp nano Au...47
3.1.4 Nghiên cứu nhiệt độ tối ưu tổng hợpnano Au...49
3.1.5 Nghiên cứu tỷ lệ Au3+: dịch chiết: gelatin...51
3.2 Nghiên cứu các đặctrưng vậtlý của vật liệu nano Au/polymer...52
3.3.2 Đánh giálượng vật liệu nano Au/gelatin đến phản ứngoxy hóaTMB...61
3.3.3 Khảo sát tác độngcủa nhiệt độ đến q trìnhoxy hóa TMB... 63
3.3.4 Thời gian phản ứng oxyhóa TMB...64
3.3.5 Đánh giáyếu to pH đến phản ứngoxy hóa TMB...65
3.3.6 Đánh giánồng độ TMB đến phản ứng oxy hóa TMB...66
</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">3.4.5 Độ lặp lại của phương pháp...78
3.4.6 Kết quả phân tích mẫu...80
KẾTLUẬN VÀ KIẾNNGHỊ...85
DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐẪ CƠNG BỐ CỦA HỌC VIÊN...86
TÀI LIỆU THAM KHẢO...87
PHỤ LỤC...98
LÝLỊCH TRÍCH NGANG...101
</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13"><b>DANH MỤC HÌNHẢNH</b>
Hình 1.1 Củ Sùng Thảo...4
Hình 1.2 Hình dạng nano khác nhau ảnh hưởng đến bước sóng hấp thu [21]...6
Hình 1.3 Cơ chế cholesterol bị oxy hóa bởi enzyme cholesterol oxidase [57]...11
Hình 1.4 Cơ chế nano vàngxúctác để định lượng cholesterol...12
Hình 2.1 Sơ đồchuẩn bị dịch chiếtcủ Sùng Thảo...19
Hình 2.2 Sơ đồ tổng hợpnano Au...20
Hình 2.3 Sơđồ quy trình tổng hợp vật liệu nano Au/gelatin...25
Hình 2.4 Ảnh hưởngnano Au/gelatin đến phản ứng định lượng cholesterol...27
Hình 2.5 Sơ đồ xử lý mẫu phân tích... 41
Hình 3.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ dịch chiết củ Sùng Thảo vàAu3+ được thu bằngphương pháp phổ uv - Vis...43
Hình 3.2 Mau thí nghiệm nghiên cứu tỷ lệ tối ưu dịch chiếtcủ Sùng Thảo: Au3+ ...43
Hình3.3 Kết quả thể hiệncác tỷ lệ khác nhau giữa dịchchiết và Au3+ở các bước sóngX max và độ hấp thu cực đại...44
Hình 3.4 Phổ ƯV - Vis được sử dụng để xác định nồng độ Au3+ cần thiết cho quátrình tổng hợpnanoAu...45
Hình 3.5 Mau thí nghiệm nghiên cứu nồng độ Au3+ đểtổng hợpnano Au...45
Hình 3.6 Kết quả các giátrị nồng độAu3+khảo sát sovới bước sóng X max và độ hấpthu cực đại...46
Hình 3.7 Kết quả khảo sát thời gian để tổng hợp nanoAu bằng phổƯV - Vis...47
Hình 3.8 Mau thí nghiệm nghiên cứu thời gian cần đểtạo thành nano Au...47
</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">Hình 3.9 Kết quả thể hiện các thời gian khảo sát khác nhau để tơng hợp nano Au so
với bước sóng Xmaxvà độ hấp thu cực đại...48
Hình 3.10 Kết quả phân tích nhiệt độ đểtổng hợpnanoAu bằng phổ uv - Vis ....49
Hình 3.11 Mau thí nghiệm nghiên cứu nhiệt độ tối ưu đểtổng hợpnano Au...49
Hình 3.12 Kết quả thể hiện nhiệt độ khác nhau đểtổnghợp nano Au so với bước sóngX maxvà độ hấp thu cực đại...50
Hình 3.13 Phổ uv - Visđượcdùng đểxác định tỷ lệ Au3+ : dịchchiết: gelatin ....51
Hình 3.14 Kết quả nghiên cứu nanoAu bằng giản đồ XRD...52
Hình 3.15 Kết quả nghiên cứu nano Au/gelatin, dịch chiết và gelatin bằng giản đồXRD...52
Hình 3.16 Giản đồ XRD chuẩn của Au... 53
Hình 3.17 Phổ hồng ngoại FT-IR đã được sử dụng để nghiên cứu đặc trưng của Au/gelatin...54
Hình 3.18 Ket quả quan sát bề mặtcủavậtliệu nano Au bằng SEM...55
Hình 3.19 Kết quả quan sát bề mặtcủavậtliệu nano Au/gelatin bằng SEM...55
Hình 3.20 Kết quả TEM của (A) nanoAuNPs, (B) Au/gelatin...56
Hình 3.21 Biểu đồ thể hiện phân bố kích thước của hạt nano vàng(A) và nanoAu/gelatin (B)...56
Hình 3.22 Kết quả the zeta của nano Au/gelatin...57
Hình 3.23 Kết quả EDX vật liệu nano Au/gelatin...58
Hình 3.24 Kết quả EDX phân bốcácngun tố có trong vật liệuAu/gelatin...58
Hình 3.25 Kết quả phổ TGA vật liệu nano Au/gelatin...59
</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">Hình 3.26 Đánh giá tính đặc hiệu của nano Au/gelatin bằng phổ uv - VIS...60
Hình 3.27 Mau thí nghiệm đánh giá độ đặc hiệu vật liệu nano Au/gelatin...61
Hình 3.28 Đánhgiálượngvậtliệu nanoAu/gelatin đến phản ứng oxy hóa TMBbằng phổUV-VIS...61
Hình 3.29Mau thí nghiệmđánh giá lượng vậtliệu liệu nanoAu/gelatin đến phản ứngoxy hóaTMB...62
Hình 3.30 Khảo sáttác độngcủa nhiệt độ đến q trình oxy hóaTMB...63
Hình 3.31 Mau thí nghiệm đánh giáảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng oxy hóaTMB...63
Hình 3.32 Khảo sát tác độngcủa thời gian đến q trình oxy hóa TMB bằng phổ hấpthu uv - Vis...64
Hình 3.33 Mau đượckhảo sát thời gian phản ứng oxy hóaTMB...64
Hình 3.34 Đánh giáyếu tốpH đến phản ứng oxy hóaTMB bằng phổ uv - VÌS....65
Hình 3.35 Mau đánh giá pH ảnh hưởng đến phản ứng oxy hóaTMB...65
Hình 3.36 Đánh giánồngđộ TMB đến phản ứngoxy hóaTMB bằng uv - Vis ....66
Hình 3.37 Mau thí nghiệm đánh giánồng độ TMB đến phản ứng oxy hóaTMB ...66
Hình 3.38 Khoảng tuyến tính và đườngchuẩn của H2O2...68
Hình 3.39 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn củacholesterol...70
Hình 3.40 Kết quả phổ hấp thu khảo sát độ đặc hiệu phản ứng...75
Hình 3.41 Biểu đồ thể hiện độ đặc hiệu của phưong pháp...75
Hình 3.42 Thí nghiệm khảo sát độ đặc hiệu...76
Hình 3.43 Đường chuẩn phân tích cholesterol bằng GC - FID...82
</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16"><b>DANH MỤC BẢNG BIỂU</b>
Bảng 2.1 Giá trị tối ưu tỷ lệ dịch chiết: dung dịch Au3+...21
Bảng 2.2 Nồng độ tối ưuAu3+ được nghiên cứu trongtổng hợp nano Au...22
Bảng 2.3 Nghiên cứu thời gian cần thiết đểtổng hợpnanoAu...23
Bảng 2.4 Nghiên cứu nhiệt độthích hợp đểtổng hợpnano vàng...24
Bảng 2.5 Nghiên cứu tỷ lệ tối ưucủa dịch chiết: Au3+ : gelatin...26
Bảng2.6 Xác định ảnh hưởng của lượng vật liệu nano Au/gelatin đến phản ứngoxy hoá TMB...28
Bảng 2.7 Khảo sát tác động của nhiệt độ đến q trình oxyhốTMB...29
Bảng 2.8 Khảo sát tác động của thời gian đến q trình oxyhốTMB...30
Bảng 2.9 Đánh giáyếu to pH đến phản ứng oxy hoáTMB...31
Bảng 2.10. Đánh giánồng độ TMB đến phản ứng oxy hoá...32
Bảng 2.11 Dung dịchH2O2 được chuẩn bị đểxác định khoảng tuyến tính H2O2 ....34
Bảng 2.12 Dung dịch cholesterol được chuẩn bị đểxác định khoảng tuyến tính...36
Bảng 3.1 Tối ưu hóa quy trình và điều kiện tối ưu tổng hợp nano Au... 51
Bảng3.2 Thành phần nguyên tố của mẫu nano Au/gelatin được xác định...59
Bảng 3.3 Tối ưu hóa các thơng số trong phản ứng oxy hóa TMB...67
Bảng3.4 Kết quả khảo sát về khoảng tuyến tính H2O2...68
Bảng 3.5 Độchệch của các điểm chuẩn...69
Bảng3.6 Khoảng tuyến tínhcholesterol...70
Bảng 3.7 Độ chệch của các điểm chuẩn...71
</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">Bảng3.8 Ket quả khảo sát LOD, LOQdung dịch H2O2...72
Bảng3.9 Kết quả khảo sát LOD, LOQ dung dịch cholesterol...73
Bảng 3.10 So sánh giói hạn phát hiện giữaphươngpháp nghiên cứuvà một số phương pháp khác để phân tích cholesterol...74
Bảng 3.11 Ket quả đánhgiá độ đúng...77
Bảng3.12 Kết quả đánh giá độ lặp lại...78
Bảng3.13 Kết quả đánh giá độ tái lặp...79
Bảng3.14 Kết quả phân tích mẫu thực phẩm...80
Bảng3.15 GC - FID được sử dụng để xây dựng đường chuẩn Cholesterol...82
Bảng3.16 Kết quả phân tích mẫu được phân tích bằng thiết bị GC - FID...83
Bảng 3.17 Kết quả so sánh của hai phương pháp tiến hành phân tích mẫu thực theo hàm t-test...84
</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18"><b>DANH MỤCTừ VIẾT TẤT</b>
<b>Viêt tăt Tên Tiêng AnhAuNPs</b> Gold Nanoparticles
<b>DLS</b> Dynamic Light Scattering
<b>FTIR</b> Fouier Tranfomation lifraRedspectrum
<b>SEM</b> Scanning Electronn Microscope
<b>TEM </b> Transmission Electron Microscope
<b>uv - VIS Ultraviolet-visible</b> spectroscopy
Ảnh hiển vi điệntừ quét
Ảnh hiển vi điệntử truyền qua
Quang phổ hấpthu phân tử
Nhiễu xạ tia X
</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19"><b>MỞ ĐẦU</b>
<b>1.Đặt vấn đề</b>
Cùng với sự pháttriển của ngành công nghiệp hiện đại, nhu cầu của con người cũng
ngày càng tăng cao, đặcbiệt làyêu cầu vềchất lượng và an toàn củathực phẩm. Vì
vậy, càng ngày càng có nhiều phịng phân tích thực phẩm nghiên cứu để đảm bảochất lượngthành phần trongthực phẩm đáp ứng tiêu chuẩn.
Cholesterol đóng vai trị trung tâm của q trình sinh hóa cótrong cơ thể người qua
hai con đường: do cơthể tự sản xuất và và từ thức ăn. Cholesterol là nguồn sản xuất
hormone steroid đểduytrì các hoạt động bình thường của cơthể, đồng thờicịn đóng
vai trị tổng hợp nên Cortisol tham gia vào quá trình điều tiết hàm lượng hàm lượng đường trong máu [1]. Tuynhiên việc sử dụng quá nhiều thực phẩm chứahàm lượng cholesterol cao sẽ dẫn đến tình trạng cholesterol trong máu cao, là mộttrong nhữngyếu tố dẫn đến xơ vữa động mạch và nhiều biến chứng tim mạch nguy hiểm [2]. Vì
vậy, việc kiểm sốt hàm lượngcholesterol trongthựcphẩm mang ý nghĩaquan trọng.Hiện nay, cónhiều phương pháp đểxác định cholesterol trong thựcphẩm như sắc ký
lỏng (HPLC), sắc ký khí (GC). Các phương phápnày sử dụng nhiều dung mơi, năng
lượng ảnhhưởng đến mơi trường, bên cạnh đó chi phí đo mẫu khácao.
Với sự pháttriển mạnh mẽ của cơng nghệ và vật liệu nano, đặc biệtlàcác nano kim
loại quý như vàng có đặc tính quang học độc đáo và hiệu ứng plasmon bề mặt, gần
đây đãcónhiều nghiên cứu ứng dụngcác tính chất đặc biệt này để chế tạo cảm biếnsinh học, hoá học để phát hiện nhiều loại hợpchất [3]. Nhiềunhóm tác giả đãnghiên
cứu ứng dụng nano kim loại trong việc phát hiện và phân tích như: thuốc trừ sâu [4],
Ascorbic acid [5] trong mẫu thực phẩm. Tuy nhiên,hiện nay quá trình tổng hợp nano thường sử dụng muối kim loại vàchất khử hoá học để chuyển kim loại hốtrị thành
nano [6]. Các chất khử thường có tính độc hại ảnh hưởng sức khoẻ con người. Để
tránh sử dụng các chất khử có tính độc hại, các nghiên cứu hiện nay có xu hướng sử
</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">dụng dịch chiếttừ các loại thực vật chứa hợp chất hữu cơ có khả năng khử ion kim loại thành nano kim loại [7].
Ngoài ra, các vật liệu nano kém bền, dễ bị keo tụ ảnh hưởng đến tính chất vật liệu dẫn đến việctănggiá thành tổng hợp và khóáp dụng trong thực tế. Vì vậy,việcnghiên
cứu sử dụng polymer như một chất nền để tạo môi trường bền vững và tăng tính ổnđịnh của các hạtnano là điều cần thiết. Sự kết hợp giữapolymer vàhạt nano khôngchỉ tạo ra một hệ thống mới với tính chất đặc biệt, mà cịn cung cấp khảnăng kiểm sốt kích thước, hìnhdạngvà phân bốcủa hạtnano trong môi trường polymer [8].
Với những lợi ích vượt trội về tính chất và độ ổn định, sự kết hợp giữa polymer và
hạt nanovàngmởra những triển vọngtrong lĩnh vực nghiên cứuvà ứng dụng. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc sử dụng dịch chiết cây sùng thảo làm chất khử và polymer làm chất ổn định đểtổng hợp vật liệu nano từ vàng và từ đó ứng dụng định
lượng Cholesterol trong mẫu thực phẩm. Đó cũng chínhlà mục tiêu của đềtài “ứng dụng nano Au/polymer định lượngCholesterol trong mẫu thựcphẩm” được trìnhbày
trong nghiên cứu này.
<b>2.Mụctiêuvà nhiệm vụ nghiên cứu</b>
Mục tiêu chính của đề tài là phát triển phương pháp đơn giản để tổng hợp nano
Au/polymer từ dịch chiết củ Sùng thảo trên nền polymer ứng dụng định lượng Chloesterol. Khả năng định lượng của hệ vật liệu được đánh giá bằng cách so sánhkết quả định lượng bằng phương pháp GC-FID tại Công ty Eurofins sắc Ký Hải Đăng.
Để đạt được mục đích trên cần giải quyết các nhiệm vụ nghiên cứu sau:
Tối ưu quá trìnhtổng hợpnanoAu/polymer: ảnh hưởng thời gian, nhiệtđộ, tỷ lệ Au/ polymer
Xác định các đặctrưngcủanano Au/polymer bằng các phương pháp phân tíchhóalý hiện đại như: TEM, SEM,XRD, EDX, FT IR, DLS, đo thếZeta.
Tối ưu các điều kiện đểđịnhlượngCholesterolbằng vậtliệunano Au/polymer.
Phân tích mẫu thực phẩm bằng phương pháp đã được tối ưu.
</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21"><b>3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu3.1 Đối tượngnghiên cứu</b>
Tổng hợp vật liệu nano Au/polymer bằng cách sử dụng dịch chiết cây Sùng
Đánh giá khả năng ứng dụng vật liệu nano Au/polymer để định lượng
<b>3.2 Phạm vi nghiên cứu</b>
Đề tài: “ứng dụngnano Au/polymer sử dụng dịch chiếtcây sùngthảo để định lượng
Cholesterol trên mẫu thực phẩm” đề tài được thực hiện từ tháng 04 Năm 2022 đến tháng 01 năm 2024 tại khoa Cơng Nghệ Hóa Học - ĐH Cơng Nghiệp TP. Hồ Chí
Minhtại địa chỉ: 12 Nguyễn Văn Bảo - phường4 - quậnGịvấp -TP. Hồ Chí Minh.
<b>3.3Cách tiếp cận và phươngpháp nghiên cứu</b>
Cách tiếp cận: tổng quancác công bố chấtlượngtrong lĩnh vực nghiên cứu để chọn lựa phương pháp tổng hợp thực nghiệm phù hợp. Dựa trên kết quả thu được, đánh giá hiệu suất và điều chỉnh phương pháp đểthu được vật liệu có khảnăng định
lượng tốt nhất.
Phươngphápnghiên cứu: thựcnghiệm, phân tích, xửlý số liệu và đánh giákết
quả thu được.
</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22"><b>CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN</b>
<b>1.1Tổng quan về củ Sùng Thảo</b>
Củ Sùng Thảo <i>(Stachys affinis)</i> thường gọi là Atiso Trung Quốc có nguồn gốc từTrung Quốc, Nhật Bảnđượcsửdụng như mộtloại cây ăn củvà có thểhỗ trợ điều trị
cácchứng bệnh [9], Là cây sống lâu năm, cây mọc thẳng.
Củ Sùng Thảo dài khoảng 3-5cm, cócác đốt ởphần thânnhưconấu trùng [9], là thực
phẩm giàu protein, carbohydrate và vitamin [10], giàu sắt, kali nên là ngn thực phẩm có lợi phù hợp người mắc chứng bệnh thiếu máu và lượng đường trong máu
cao. Ngoài ra, củ Sùng Thảo đã được tìm thấy chứa nhiều Stachyose [1,3],
oligosaccharide (tetrasacarit bao gồm glucose, fructose và galactose) chứa nhiều trong củ Sùng Thảo khi lên men [11],
DocủSùngThảolà thực phẩm giàu carbohydratvà chứanhiềuStachyose... Nên việc
tận dụng dịch chiết của củ Sùng Thảo để tổng hợp nano kim loại là phương án xanh, không dùng các hóa chất mang tính độc hại.
Hình 1.1 Củ Sùng Thảo
</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23"><b>1.2 Tổng quan về nano vàng</b>
Các vật liệu có kích thước nano (NMs) được nghiên cứu và phát triển nhanh chóng vì đặc tính cấu trúc,hình dạngvà khảnăng ứngdụng của chúng. Các vật liệu cókíchthước nano được chia thành 4 loại: vật liệu nano carbon, vật liệu nano kim loại và oxit kim loại, vật liệu nanohữu cơ và vật liệu nanocomposite [12], Trongđó, hai loại
hạtnano kim loại được nghiên cứu và ứng dụng nhiều là nano vàng và bạc, các hạtnano vàng được quantâm nhiều khơng chỉ vì các tính chất đặc biệt về bề mặt và kíchthước mà cịn vì được ứng dụng rộng rãi trong xúctác [13], cảm biến sinh hóa [14], kháng khuẩn [15], điệnhóa [16], tăng cường bề mặt phổ Raman [17], điều trị ungthưvà truyền thuốc [14].
Hạt nano vànglàhạtvàngcó kích thướctừ 1 - 100nm, là hạtnanoổn định nhấttrongvậtliệu nano kim loại, có các đặc tính mà vật liệu khối khơng có [18]. Thơngthường
được sử dụng ở dạng keo và kích thước cũng như hình dạng của các hạt nano đượctạo thànhphụ thuộc vào phương pháp tổng hợp.
<i>ĩ.2.1 Tínhchấtcủahạt nano vàng1.2.1. ỉTỉnh chấtquanghọc</i>
Khivật liệu có kích thướcởthang đo nanomet, tính chấttừ, điệntừ và quang học củachúng bị thay đổi. Cáctính chất quang học của nano bị ảnh hưởng bởi cộng hưởng
plasmon bề mặt(SPR),do liên quanđến daođộng của các electrontrong vật liệu nano
dưới tác động của sóng điện từ [19], Theo hình 1.2 cho thấy, ở các dạng nano hình
cầu, dạng thanh, dạng lăngtrụ, dạng bơng hoa vàdạng ngơi sao cho thấy ở các dạngnano khác nhau màbước sóng hấp thu khácnhau, nên kích thước của hạtnano khác
nhau. Có sự khác nhau giữa hìnhdạng và kích thước của hạtnano làdo sử dụng cácchất khử có tính chất khác nhau [20].
</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24"><small>flowers </small>
<small>rods </small>
<small>prism stars</small>
<b><small>400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400</small></b>
<b><small>Wawelength [nm]</small></b>
Hình 1.2 Hình dạng nano khác nhau ảnh hưởng đến bước sóng hấpthu[21]
<i>1.2.1.2 Tinhdẫn điện và dẫn nhiệt</i>
Tính dẫn điện và dẫn nhiệt của dung dịchnanotăng lên khi đượcchiếu sáng hoặcgianhiệt và quay về giá trị ban đầu khi loại bỏ ánh sáng hoặc nhiệt. Sự thayđổi độ dẫn
điện là do các ion bị phân ly dưới tác động của nhiệt độ trên bề mặtcủa hạt nano [21 ]. Dung dịch nano có đặc tính nhiệt vượttrội do vói các chất lỏng thơng thường: dầukhống, dầu truyền nhiệt,... tính năng này làm cho vậtliệunanotrởnênhấp dẫn khi
dùnglàm chất lỏng truyền nhiệt cho nhiều ứng dụng và trong quá trình sảnxuất [12].
<i>1.2.1.3 Tinh chấttừ</i>
Ở trạng thái khối các kim loại quý như: vàng, bạc,., có tính nghịch từ do sự bù trừ của
cặp điện tử. Ở trạng thái nano vật liệu ở kích cỡ nhỏ thì sự bù trừ khơng có nữa dẫnđến vật liệu mang tính chất từ tưong đối mạnh [22].
<i><b>1.2.2 Các phtiưng phấp tẳng hợp nano vàng</b></i>
Vậtliệu nano có kích thước nhỏ, trong khoảng từ 1 đến 100 nm và được tổng hợp
bằng nhiều phu ong pháp khác nhau. Các phưong pháp này được chia thànhhai loạichính: phưong pháp từ trên xuống (top-down) và phưong pháp từ dưới lên (bottom- up) [23].
</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">Phươngpháptừ trên xuống bao gồm các kỹ thuật đểcắtgiảm kích thước của vật liệu khối để tổng hợp thành vật liệu nano. Cách này thường dùng để tổng hợp các nano có hình dạng đơn giản, ví dụ như các hạtcầu hoặc các hạt trục. Tuy nhiên, phương
pháp nàycóhạn chế là cần năng lượng lớn để kích thước các hạtnano được tạo thành có kích cỡ đồng đều. Do vậy, ngàynay phương pháp từ dưới lên được sử dụng nhiều
Các phương pháp từ dưới lên bao gồm phương pháp khử hóahọc, phương pháp khử
vật lý vàphương pháp khử sinh học.
Phương pháp khử hóa học là phương pháp tạo ra các nano vật liệu bằng cách
khử ion kim loại thành kim loại hoặc hợp chất kim loại bằng các chất khửnhư citric
acid, ascorbic acid, sodium borohydride, ethanol và các tác nhân khác [26].
Phươngpháp khử vậtlý sử dụng các tác nhân vậtlý đểtạora các nano vật liệu,
bao gồm các phương pháp như điện tử [27], tia gamma [28] và tia tửngoại [29].
Phương pháp khử sinh học đã được sử dụng để tạo ra các hạtnano vàng, nhờ
sử dụng vi khuẩn làm tácnhân khử giúp cho quá trình nhân giống vi khuẩn diễn ra
nhanh chóng và dễ dàng thực hiện [30]. Điều này giúp tăng tốcđộ q trình sản xuất
hạtnano vàng màkhơng cần sử dụng các chấthố học độc hại [31].Ngồi ra, phương
pháp này cịn được kiểm sốtqua nhiệt độ và thời gian ủ để đảm bảo chấtlượng củasản phẩm cuối cùng. Điểm mạnh của phương pháp khử sinh học là sự đơn giản và
thân thiện với môi trường [26].
Phươngpháptổnghợpnano sử dụng tác nhân khử hóahọc, vật lý hay sinhhọc
đều có một điểm chung là các hạtnanotổng hợp có kích thước đồng đều. Tuy nhiên, các phương pháp này đều có những hạn chế, bao gồm chất khử được sử dụng làcácchất hố học độchại, chi phí cao, khơng thân thiện với môi trườnghoặc phải sử dụng
</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">các trang thiết bị phức tạp [26]. Vì vậy, việc tìm raphương pháp tổng hợpnano vàng không ảnh hưởng đến môi trường, chi phí rẻ và dễ dàng thực hiện đã được các nhà
khoahọctập trung nghiên cứunhiều trong những năm gần đây [32]. Một trong những cách tiếp cận nàylà nghiên cứucác dịch chiết từ các loại cây trồng, chẳng hạn nhưlá
và hạt nho <i>(Vitis Vinifera) </i>để tạo ra các hạt nano với kích thước trung bình 18-25nm [33]. Dịch chiết từ các thực vật thường có chứa Flavonoid, amin acid, protein,polysacarit, enzyme, polyphenol, steroid và đường khử tạo điều kiện cho quá trình
tạo thành nano [34]. Vì vậy, sử dụng dịch chiết củ Sùng Thảo có chứa steroid,
flavonoid [35] có thể thay cho các hố chất để tổng hợp nano. Ngồi ra, trong q
trình tổng hợp các hạt nano vàng, hiện tượng keo tụ thường xảy ra sau một thời gian ngắn. Vì vậy, việc sử dụngcác chấtnền có diện tíchbề mặt lớn đãđượcnghiên cứuđể các hạt nano vàng phân bố đều trên bề mặt chất nền, làm cho các hạt nano vàng
trởnên ổn định hơn [26]. Những nghiên cứu này đã góp phần quan trọng trong việc
cải thiện hiệu suất các hạtnano vàng và mangý nghĩa quan trọng choviệc ứng dụng các hạtnano.
<i>ĩ. 2.3 ứng dụng của nanovàng</i>
Do nano vàng mang tính chấthóalý đặc biệt tùy thuộc vào kích cỡ và hình dạng củahạtnano vàng,các tính chất quantrọng nàylà tiền đề để ứng dụng vàođa ngành nghề khác nhau, gồm:
Ngành công nghệ ô tô: dùng nguồn năng lượng lớn để nằng cấp hệ thống khi dùng nano vàng được coi là dung dịch làm mátgiúp phântán nhiệt, giúpgiảm trọnglượng của hệthống quản lý nhiệt, giảm nguy cơ cháy nổ [12].
Ysinh: nanovàng có những đặc tính đặc biệt cókhảnăngphân phốithuốc vào trong cơ thểcon người, chụp ảnh y sinh, chẩn đoán bệnh [36]. Dưới tác độngcủa tialaser, hạt nano có đặc tính phátranhiệt.Nhiều nghiên cứu được tậptrung điều trị ung thư bằng cách tạo ra viên thuốc con nhộng có kích thước vài nanomet. Các lớp
polymer được sử dụng đểtạo thành lớp vỏ ngoài của viên thuốc. Khi đã đi vào tế bào,
dưới tác động đặc trưng của hạtnano vàng làm viên thuốc vỡ ra và sẽ phávỡkết cấutếbào ác tính [37].
</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">Trongxúc tác: nano vàngcó diện tích bề mặt lớn được dùng làm chấtxúc tác được nghiên cứu đầu tiên vào năm 1980, nano vàng được dùng làm chấtxúc tác chophản ứng oxi hóa khí cacbon monoxit (CO) ỏ nhiệt độ thường và cảở -70°C [37],nhưngkhi dùng chấtxúctác là Platin chỉ cóthểphản ứng ở trên 100°C. Phản ứng này
giúp làm sạch khơng khí và khí thải từ các nhà máy cơng nghiệp [38]. Sau đó, cónhiều nghiên cứu vềkhảnăng ứng dụng của nano vàng trongxúc tác dị thể, quá trình
oxy hóa cyclohexane (CH) và rượu benzyl (BA) thành acidAdipic (AA) [39]. Nano
vàng được dùng làm hoạt tính xúc tác để chuyển 4 - nitrophenol thành 4
-aminophenol [3],
<b>1.3 Tỗng quan về cholesterol</b>
Cholesterol là một phân tử steroid tồn tại trong các màng tế bào động vật và lippprotein. Nó là phân tử sinh học có vai trị chính trong cơ thể con người.Cholesterol trong cơ thể người đến từ 2 nguồn: trong cơ thể cholesterol chủ yếu ở
gan, ruột [40]. Khoảng 20 - 25% cholesterol cịn lại có trongthực phẩm từ động vật
được sử dụng hằng ngày như: thịt gia cầm, các sản phẩm từ sữa,....[41] Cholesterol
gồm có hai loại:
Cholesterol lipoprotein mật độ thấp (LDL): là cholesterol “xấu”, giátrị LDL
cao trongmáu làmtích tụ ởthành mạch máu, gây nêncác mảng sơ vữa gây tắc mạch máu. Giá trị LDL tăng do chế độăn uống, ít vận động, giới hạn cho phép trong cơthể
người là 100mg/dL [42].
Cholesterol lipoprotein mật độ cao (HDL): là cholesterol tốt”, có khả năng
vận chuyển cholesterol LDL trở lại gan, có thể phân hủy và giải phóng cholesterol “xấu”, HDL chỉ loại bỏ khoảng từ 1/3 đến 1/4, giá trị HDL giảm do hútthuốc, thừa
cân, béo phì,... Giátrị thấp nhất cần có trong cơthể là60mg/dL [43].
<i>1.3.1Ỷ nghĩa của cholesterol trong thựcphẩm</i>
Thực phẩm được tạoratừnguồn thực phẩm giàuchất béo bãohịa và chất béo chuyểnhóa sẽ khiến gan sinh ranhiều cholesterol hơn bình thường, ảnh hưởng đến sứckhỏe.
Cholesterol giúp lưu thông máu, khi lượng Cholesterol trong máu tăng lên dễ mắc các bệnh tim mạch, đột quỵ [36,44]. Vào năm 2003, tổ chức y tế thế giới (WHO) và
</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">bộ lươngthực và nông nghiệp đãđưara khuyến cáo mức tối đalượngcholesterol 300
mg/ngày với người trưởngthành [44].
<i>1.3.2Các phương phápxác địnhcholesterol</i>
Việc phân tích cholesterol đóng vai trồthiết yếu trong q trình chẩn đốn các bệnh lý và phòng ngừa các dấu hiệu ảnh hưởng đến sức khỏe [45]. Ngày nay, việc phân tích cholesterol chủ yếu dựa trêncác kỹ thuật tiêntiến baogồm: sắc ký khối phổ, phổhuỳnh quang và phương pháp so màu, giúp đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong
việc xác định cholesterol.
<i>1.3.2.1Phương pháp sắc ký khổi phổ</i>
Phương pháp hiện đại này cho phép xác định cholesterol tự do, ester hóa và tổng cholesterol dựa vào qtrìnhxử lý mẫu [46] làphương phápcó độ nhạyvà chính xác
nhất để phát hiện cholesterol. Tuy nhiên, yêu cầu thiết bị đắt tiền vàthời gian xử lý
mẫu kéo dài thời gian [47]. Đối với HPLC, cholesterol được chiết bằng
metanol/chloroform [48] trong khi GC, cholesterol trong mẫu sẽ được chiếtrasau khi xà phịng hóa và sau đó tạo dẫn xuất để định lượngbằng kỹ thuật GC [49].
<i>1.3.2.2Phương pháp quangphổ huỳnhquang</i>
Phương pháp dùng xác định cholesterol có độ chọn lọccao, không bị ảnhhưởng bởi các hợp chất sinh học, về nguyên tắc tương tự như phương pháp so màu sử dụngenzyme nhưng nhạy hơn so với phương pháp so màu [50],
<i>ỉ. 3.2.3 Phương phápsomàu</i>
Phương pháp dùng enzyme cholesterol oxidase để oxy hóa cholesterol trong mẫu,sinh ra hydro peroxide. Sau đó, hydroxy peroxide sinh ra tiếp tục bị enzymeperoxidase thông dụng nhất là horseradish peroxidase - HRP sẽ phân huỷ và sinh ra oxy. Oxy giải phóng sẽ oxy hoá chấtchỉ thị, thườngdùng là 4 - aminophenzon hoặc3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine (TMB) để tạo ra một sản phẩm màu xanh đặc trưng.Lượngcholesterol trong mẫu tỷlệ thuận với cường độ màu, sử dụng đường chuẩn để
xác định nồng độcholesterol [51], Tuy enzymehorseradish peroxidase là một xúc tác
sinh học có độ chọn lọc caonhưng có giá thànhcao, khó điều chế, độ ổn định thấp
</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">và dễbị biếntính do điều kiệnmơi trường [48]. Do đó, nhiều nghiên cứu đã tìm cách
thaythe horseradish peroxidase bằng cáchsử dụng vật liệu nano có đặc tínhvật lý và
hóahọc độc đáo được dùng làm cảmbiến sinh học thay the choHRP [49].
<b>1.4 Cơ sở lý thuyết định lưọng cholesterol sử dụng hạt nano vàng</b>
<i>1.4 .ĩ Nguyên tắc xúc định cholesterol</i>
Xác định cholesterol bằng phươngpháp somàu sử dụng enzyme cholesterol oxidase (ChOx) là loại enzyme đặc hiệu cho phântích cholesterol. Cholesterol oxidase sẽ oxy
hóacholesterol cótrong mẫu để tạo ra 4-cholesten- 3 - one và hydroperoxit (H2O2)
[52]. Lượng H2O2 sinh ra tỷ lệ thuận với lượng cholesterol trong mẫu nên có thể gián tiếp định lượng cholesterol. Từ mỗi liên hệ giữanồng độ cholesterolvà tín hiệu hấp thu tại bước sóng khoảng 652 - 654 nm, thu được phương trình A=f(C) theo nồng
độcholesterol [53].
<i>1.4.2 Vai trờ của enzyme trong định lượng cholesterol</i>
Cholesterol Oxidase là loại enzyme flavooxidaxe do vi khuẩn tiết ra [54], được sử
dụng như loại enzyme có tính đặc hiệu để phân tích cholesterol [55]. Enzyme oxy
hóacholesterol qua hai phản ứng: ban đầu nhóm hydroxy của cholesterol bị oxỵ hóa
thành nhóm ceton. Tiếp theo, enzymexúc tác quá trìnhoxỵhóa thành sản phẩm cuối
cùng là cholest-4-en-3-one và hydroxy peroxit (H2O2) [56].
Hình 1.3 Cơ chế cholesterol bị oxy hóa bởi enzyme cholesterol oxidase [57]
</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30"><i>1.4.3 Cơ chế nano vàng xúc tác để định lượng cholesterol</i>
Nano vàng xúc tác q trình oxy hóa chất chỉthị3,3’,5,5’-tetrametylbenzidin (TMB)
bằng H2O2 [58]. Cơ sở cho quá trình xúc tác đuợc giải thích nhu sau: hydrogen
peroxide đuợc tạo ra từ phản ứng giữa cholesterol và enzyme cholesterol oxidase sẽbị phân hủy trên bề mặt của hạt nano để tạo ra gốc hydroxyl ( OH), sau đó gốc
hydroxylcó thể oxyhóa 3,3',5,5,-tetramethylbenzidine (TMB) để tạoradạngoxy hóa
củaTMB (TMBox) cómàu xanh, hấp thuởbướcsóng 652 - 654 nm. Độ hấp thu nàyúng với lượngcholesterol trong mẫu [49].
Hình 1.4 Cơ chế nano vàng xúc tác để định lượng cholesterol.
<b>1.5 Tình hình nghiên cún trong và ngồi nướcsử dụnghạt nanotrong phân tích</b>
<i>1.5.1 Tìnhhình nghiền cứu ngồi nước</i>
Việc sử dụng các loại vật liệu nano để xác định cholesterol đã được các nhà khoa học
nghiên cứu qua các phương pháp như:
Năm 2016, tác giả Xiaoyun Linvàcác cộng sựđã nghiên cứu tổng họp M0S2- AuNPs là điện cực xác định cholesterol trong mẫu trúng gà và gan heo. Phép đo
vơn kế tuần hồn (CV) thể hiện sự giảm dòng điện cùng với việc tăng nồng độ
cholesterol, giớihạn phát hiện của phương pháp là 0,26 ±0,15 pM, tuyến tính trong
khoảng 0,5-48 pM [60].
</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">Năm 2017, tác giả Yanzi Wu và các cộng sự đã tổng hợp vật liệu Fe3Ơ4@ MIL - 100(Fe) được xem như làperoxidase cókhảnăng phát hiện Cholesterol trong mẫu huyếtthanh, sử dụng phưong pháp đo quang với sự cómặtcủa TMB, LOD củaphương pháp 0,8 pM [61].
Năm 2021, tác giả Seong và các cộng sự đã tổng hợp hạt nano Rhodium - Platinum được dùng để phát hiện cholesterol trong mẫu huyết thanh bằng phương
pháp somàu, khả năng phát hiện cholesterol trong khoảng từ 0,08 -í- 5 mM, LOD là 25,7. Hiệu suất thu hồi của phương pháp trong mẫu huyết thanh người đạt 96,8% [62].
Các cơng trình nghiên cứu nanoAu đểxác định cholesterol
Năm 2018, tác giả Narsingh R. Nirala và các cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp
nanoAu được chức năng hóavới cholesterol oxidase, khi cholesterol tácdụngvới hệnano tạo ra H2O2. Nồng độ cholesterol được phát hiện bằng phương pháp huỳnh
quang do tính chất của H2O2 [67].
Năm 2018, tác giả Yong Huang và các cộng sự đãtổnghợpcảm biến xác định cholesterol dựa trên AuNP và GO, điện cực được phủ cholesterol oxidase (CHOD),
cholesterol esterase (CHER) và GO trên be mặt, khi đó sự có mặt của cholesterol trong mẫu thử tạo ra hydro peroxide (H2O2), ion Au bị khử thành nano Au trên bề mặt. Cholesterol được xác định bằng phương pháp đo vôn kế. Giới hạn phát hiện củaphương pháp là0,001 pg/mL [68].
Năm 2014, tác giả Monika Srivastava vàcác cộng sự đã nghiên cứu tổng hợpnano Polyaniline - Vàng (PAni - Au) để xác định cholesterol. Điện cực từ vật liệu
nano dùng xác định Cholesterol bằng kỹthuật sử dụng vôn kế, giới hạn phát hiện củaphương pháp đạt 37,89 mg/L [69].
<i>1.5.2Tỉnh hình nghiên cứu trong nước</i>
Các phươngphápđịnh lượngcholesterol đã được nghiên cứuvà công bố kết quả phân tíchhiệu quả cao. Tuy nhiên, các phương pháp này cóthể bị ảnh hưởngbởi điều kiện
mơi trườngvà các yếu tố khác, vì vậycần phải khảo sát các yếu tố này trước khi tiếnhành định lượng. Việctổng hợp nano Au sử dụng các hốchất vàdung mơi độc hại
</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">tốn kém vàảnh hưởng đến sứckhoẻ [70]. Do đó, sử dụng dịch chiếtcủ Sùng Thảo để
tổng hợp nano Au mang tính xanh giúp khắc phục các nhược điểm này. Ngoài ra, việc sử dụng gelatin, một polymer tự nhiên có diện tích bề mặt lớn, giúp ngăn cản
hiện tượng quá trình quá trỉnh keo tụ giúp hệ vật liệu bền theo thời gian.
<b>1.6 Các phưorig pháp đặctrungxác địnhhạt nano vàng</b>
<i>1.6 . ỉ Kínhhiến viđiện tửquét (SEM)</i>
Để xácđịnh kích thước và hìnhdạng của mẫu nano vàng bằng cách quét trên bềmặt của mẫu [71]. Phưong pháp này đã được thực hiệntrên máy Hitachi S4800 tạiTrung tâm công nghệ cao quận 9, TP.HCM, vói hiệu thế gia tốc lOkV và độ phân giải từ 200 nm đến 1 pm, và khoảngcách nguồn tới mẫu là 7,7 mm (WD = 7,7 mm).
<i>1.6.2Kính hiển viđiệntruyềnqua (TEM)</i>
Để phân tích hìnhthái và cấu trúc của mẫu nano vàng, phưong pháp TEM đã đượcsử dụng trong nghiên cứu [72]. Phưong pháp này đã được thực hiện trên máy JEM2100 của hãng JEOL, Nhật Bản, với các thông số như sau: thế phát 200 kv, sợi đốt
LaB6, độ phân giải giữa hai điểm là 0,23 nm, hai đường 0,14 nm, và khả năng nhiễu xạ bao gồm nhiễu xạ lựa chọn vùng (SAED) và nhiễu xạ chùm hội tụ (CBED) với góc nhiễu xạ rộng. Mau được đo tại tại Viện Khoa Học Vật Liệu - Viện Hàn Lằm
Khoa Học VàCông Nghệ Việt Nam, địa chỉ tại số 18 Hoàng Quốc Việt, cầu Giấy,
Hà Nội.
<i>1.6.3Phươngphápnhiêuxạtia X (XRD)</i>
Để xác địnhthành phần và cấu trúc tinh thể của nano vàng [73] sử dụng phương pháp
phân tích nhiễu xạtia X (XRD) được sử dụng cùng với việc thực hiện đo trên máy
Shimadzu 600. Các thí nghiệm được thực hiện tại Khoa Cơng nghệ Hóahọc của Đại
học Công nghiệp TP.HCM, địa chỉ tại số 12 Nguyễn Văn Bảo, phường 4, quận GòVấp, TP.HCM.
</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33"><i>1.6.4 Quangphể hồngngoại biếnđểì Fourier (FTIR)</i>
Được dùng đểxác định các nhóm chức có trong thành phần hữu cơ baophủ bên ngoài mẫu nano vàng rắn [74] phương pháp phân tích FTIR được sử dụng trên máy 55 EQUINOXBruker (Đức). Các mẫu thí nghiệm được đo tại khoa Cơng nghệ Hóahọc
của Đại học Cơng nghiệp TP.HCM, địa chỉ tại số 12 Nguyễn Văn Bảo, phường 4, quận GịVấp, TP.HCM.
<i>ỉ.6.5Phân tích nhiệt trọnglượng</i>
Được dùng để xác định tính ổn định của vật liệu nano vàng theo nhiệt độ [74], các
Mettler Toledo - Thụy Sĩ, được thực hiện trong khoảng nhiệt độtừ phịng đến 800°C,
áp suất khí quyển và gia tăngnhiệt độ lên 10°C/phút cho các mẫu,tại trường Đại họcSư phạm TP.HCM.
<i>1.6.6 Phươngpháp tán xạ ánh sáng động (DLS)</i>
Phương pháp DLS được sử dụng để xác định khả năng phân bố kích thước của hạt
nano dưới dạng dung dịch [75]. Mau nano Au/gelatin được đo trên máy Horiba 100 của Nhật Bản vớicác thông số: tên hạt Polystyrene latex, chỉ số khúc xạ hạt 1,90,
SZ-phaphân tán lànước, chỉ số khúc xạ phântán 1,30. Cácmẫu thí nghiệm được đo tại
khoaCơngnghệHóa học của Đại học Cơng nghiệpTP.HCM, địa chỉ tại số 12 Nguyễn Văn Bảo, phường4, quận Gồvấp, TP.HCM.
<i>1.6.7Phươngpháp đo điệnthe Zeta</i>
Phương pháp đo điện thế zeta được sử dụng để đánh giá diện tích bề mặt và độ ổn
định của hạt nano [75]. Điều kiện ổn định của hạt nano được xác định khi điện thế
zetadao động từ -30 mV đến +30 mV [76]. Mau nano Au/gelatin được đo trên máyHORIBA với các thông số: độ dẫn điện 2,810 mS/cm, điện áp điện cực 2,8V, nhiệt
độ 24,8°c. Các mẫu thí nghiệm được đo tại khoa Cơng nghệ Hóa học của Đại học Cơng nghiệp TP.HCM, có địa chỉ tại số 12 Nguyễn Văn Bảo, phường 4, quận GòVấp, TP.HCM.
</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">Dung dịch Cholesterol oxidase 5 U/mL được lấy tại Viện Cơng nghệ Hóahọc
tại Đường TL 29, p. Thạnh Lộc,Q. 12, Tp. Hồ Chí Minh
Mau bánh Snack Tomym,bánh mì bo ruốc, cá sốtcà đóng hộp Vissan, trứng gà tưoi BaHuân, sữatưoi tiệt trùng TH True Milk được mua tại Bách Hóa Xanh, Tơ
NgọcVân, Thủ Đức.
<i>2.ỉ. 2 Thiết bị</i>
Cân phằn tích SatoriusMáylắc Muliti ReaxBe điều nhiệtMEMMERT
Máy khuấytừ gianhiệtAsone HS-360Máyly tâm HERMLE
Máy đo pH METTLE
Máy rung siêu âm YAMATO BRANSON
Máy đo XRD, TEM, SEM, TGA,...
Máy quang phổ uv- Vis Shimadzu uv- 1800Máy sắc ký GC -FID - AgilentS
Dụng cụ
Beacher 100, 250, 500, 1000 mL
Micropipet 200 pL, 500 pL, 1 mL, 5 mLBình duran 100 mL, 250 mL, 500 mLGiấy lọc không tro, đũa thủy tinh
Cuvet thạch anh, cá từ
</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35"><i>2.1.3Hóa chất</i>
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine; TMB; 54827-17-7; Sigma-Aldrich
Hydrogen peroxide 30%; H2O2; 7722-84-1; Sigma-AldrichCholesterol; C27H46O; 57-88-5; Chemservice
Cholesterol Oxidase; 9028-76-6; Sigma-Aldrich
Acetic acid sodium salt; CHỉCOONa; 127-09-3; Pudak Scientific
Acetic acid; CH3COOH; 64-19-7; Thermo
Sodium Hydroxide; NaOH; 1310-73-2; Sigma-Aldrich
Sodium Chloride; NaCl; 7647-14-5; Sigma-AldrichZincChloride; ZnCh; 7646-85-7; Xylong
Niacin; C5H4NCOOH; 59-67-6; Sigma-Aldrich
Uric acid; C5H4N4O3; 69-93-2; Sigma-AldrichAscorbic acid;
C
ổH
sO
ố;
50-81-7; HPCMagnesiumchloridehexahydrate; MgC12.6H2Ơ; 7791-18-6; Xylong
Glycine; C2H5NO2; 56-40-6; Sigma-AldrichTrytophan; C11H12N2O2; 54-12-6; Sigma-Aldrich
Riboflovin; C17H20N4O6; 83-88-5; Chemservice
Glucose; C6H12Ơ6; 50-99-7; Sigma-Aldrich
Nước cat hai lan
<b>2.2 Chuẩn bịhóa chất vàdịchchiết</b>
<i>2.2.1 Chuẩn bịhóachất</i>
Pha 1000 mL dung dịch HAuCÌ4 mM; Đầu tiên, cân mẫu vàng vào berchervàphá mẫu bằng hỗn hợpnước cường thủy. Sau đó, đun sơi hỗn hợp cho đến khi tanhồn tồn và để nguội. Tiếp theo, chuyển dung dịch vào bình định mức 100 mL và
hòa tan trong nước cất 2 lần đến khoảng 50 - 60 mL. Chỉnh pH bang HNO3 trong
khoảng 4-5. Sau đó, định mứcbằng nước cất đến vạch và lưu trong bìnhtối màu.Pha 10 mL dung dịch3,3',5,5’ Tetramethylbenzidine(TMB) 5 mM: Cân 0,012 g TMB vào beacher, thêm 5 mL Methanol vào và khuấy cho tan hoàn tồn. Sau đó,chuyển dung dịch vào bình định mức 10 mL và định mức đến vạch bằng nước cất
</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">Pha 10 mL H2O2 1 M: Hút 0,25 mL vào bình định mức 10 mL và định mức
bằngnướccất hai lần đến vạch. Cũng như TMB, đểbảo quản H2O2, cần sử dụng chai tối màu và sử dụng trong ngày.
Dung dịch chuẩn Cholesterol 1 M: Cân 4 mg cholesterol vào bình định mức 10 mL và định mức đến vạch bang Methanol. Sau đó, lắc trộn trên máy lắc cho đến
khi tan và bảo quản ở 4 ± 4°c.
Pha 10 mL các dung dịch xác định độ đặc hiệu gồm: ZnCỈ2,Niacin,Ascorbic
acid, MgCỈ2, Glycine, Trytophan, Riboflovin: cân lần lượt theo thứ tự 1,5 mg, 1,24
mg, 1,7 mg, 1,77 mg, 1 mg, 0,8 mg, 2,06 mg, 3,8 mg, 1,82mg vào các bình định mức 10 mL và định mức đến vạchbằngnướccất hai lần. Dung dịch sử dụng trong hai tuầnvàbảo quản ở 4 ± 4°c.
Pha 100 mL dung dịch đệm acetat pH 5: cân l,37g CHsCOONa vào bercherkhuấytan bằngnước cất hai lần và định mức đến vạch vào bình định mức 50 mL (1),
hút 600 pL CH3COOH vào bình định mức định mức 50 mL (2). Trộn dungdịch (1)
và dung dịch (2) thu được dung dịch đệm pH 5. Sau đó xác định lại bằng máy đo pH,thu được giátrị pH 5 ± 0,05
</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37"><i>2.2.2Chuẩnbịdịch chiết củ Sàng Thẩo</i>
Củ Sùng Thảo được bào mỏng vỏ ngồi, sau đó rửa sạch bằng nước hai lần để loại
bỏ các chất bẩnbên ngoài. Tiến hành cắt nhỏ, đem sấy ở 70°C đến khi khơ hồn tồn.
Sau đó, xay mịn. Sử dụng dung mơi chiết lànước, tỷ lệ giữa dung môi chiết và khối
lượng củ Sùng Thảo đượckhảosát trước khi thực hiện thí nghiệm tiếp theo. Củ Sùng
Thảo đượcchiết trongbể siêu âm để thu được dịch chiết, thịi gian chiết trong 3 giờ,nhiệt độ chiết ln duy trì ổn định ở 80°C. Dịch chiếtsau đó được lọc quagiấylọc để
loại bỏ phần xác. Để bảo quản dịch chiết cần bảo quản ở nhiệt độ 3 - 5°c và sử dụngtrong vòng 3-5 ngày. Các bước chuẩn bị dịch chiết được trình bày cụ thể theo hình 2.1.
Hình2.1 So đơ chn bị dịch chiêt củ Sùng Thảo
</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38"><b>2.3 Phương pháp tổng hợp nano vàyếu tố ảnhhưởng đến quá trìnhtổng hựp</b>
Để tổng hợp nano Au, tiến hành cho dịch chiếtcủ Sùng Thảo phản ứng trực tiếp với HAuCU. Các điều kiện ảnh hưởng đến quy trình tổng hợpnano như: tỷ lệ dịch chiết
với Au3+, nồng độAu3+, thời gian và nhiệt độ phản ứng được nghiêncứu nhằm tối ưu điều kiện tổng hợp nano Au bằng dịch chiếtcủ Sùng Thảo. Dung dịch keo nano sau
được chuẩn bị phần lỏng tiến hành đo ƯV-Vis, sau đórửa để loại bỏ chất khử vàsấy
ở 50oC để tiến hành đo các phương pháp phân tích vật lý: SEM, TEM, XRD, IR,... Quy trình được thực hiệncụ theo hình 2.2.
FT-Hình 2.2 Sơ đồ tổng hợp nano Au
</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">2<i>3.1 Khảo sát tỷ lệ dịch chiết củ SùngThẩo vàdung dịch Au3+</i>
Thực hiện quy trình phản ứng xác định tỷ lệ dịch chiết: dung dịch Au3+, tiến hành
thực hiện phản ứng trựctiếp giữa dung dịch Au3+ và dịch chiết đểtồng hợp nano Au với cáctỷ lệ theo thể tích phản ứng khác nhau theo thứ tự là 1:10, 1:5, 2:1, 1:2, 1:1.Phản ứng đượcthực hiện trong 30 phútỏ70°C với nồngđộAu3+ là0,5 mM. Sau khi
kếtthúc phản ứng, mẫu được đo uv - Vis để xác nhận sự hình thành của nano Au,
thông qua việcxuất hiện đỉnh hấpthu trong khoảng 538 - 570 nm, tín hiệu đỉnh hấp
thu cao nhất thể hiện tỷ lệtối ưu củatỷ lệ dung dịch Au3+và dịch chiết. Giátrị khảo sát và quy trình thực hiện được tiến hành cụ thể theobảng 2.1.
Bảng 2.1 Giá trị tối ưu tỷ lệ dịch chiết: dung dịch Au3+
<b>STT<sup>Tỷ </sup><sup>lệ</sup><sup> dịch</sup><sup> chiết</sup><sup>: AuJ+ </sup>(v/v)</b>
<b>Nồngđộ A<small>u</small>3+ (mM)</b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">2<i>3.2 Khảo sát nồng độ dung dịch Au3+trong quá trình tonghợpnano Au</i>
Đe xác địnhnồng độ tối ưu của dung dịchAu3+, chúng tôi đã thực hiện phản ứng dựa
trên tỷ lệ dịch chiết : Au3+ với các nồng độ Au3+ khác nhau: 0.25 mM, 0.5 mM, 1
mM, 1.5 mM và 2 mM trong 30 phút ở nhiệt độ 70°C. Sau khi phản ứng hoàn tất, mẫu được quét phổ ƯV-Vis để xác nhận sự hình thành của nano Au, dựa trên đỉnh
hấpthu trong khoảng 538 - 570 nm. Giátrị khảo sát và quy trìnhthực hiện được tiến
<b>Nhiệt độ(°C)</b>
</div>
