dòng hóa biểu hiện và tinh chế protein huỳnh quang rhau30 cfp ứng dụng trong xác định cấu trúc g quadruplex song song

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.5 MB, 53 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ hồchíminh

---x0x---

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

1

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ hồchí MINH

---x0x---

TRẦN

HỒNG

BẢO

TRÂN

PROTEIN HUỲNH QUANG RHAU30-CFP

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tơi tên là : Trần Hồng Bảo Trân

Ngày sinh: 07/12/1999 Nơi sinh: Bình Định

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã học viên : 1753010272 Tôi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư

viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: TS. Đặng Thanh Dũng

Học viên thực hiện: Trần Hoàng Bảo Trân Lớp: DH17YD01 Ngày sinh: 07/12/1999 Nơi sinh: Bình Định

Tên đề tài: Dịng hóa, biểu hiện và tinh chế protein huỳnh quang RHAU30-CFP ứng dụng trong xác định cấu trúc G-quadruplex song song

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng: Cho phép sinh viên Trần Hồng Bảo Trân được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng.

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 01 năm 2022

Người nhận xét

Đặng Thanh Dũng

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Lời đầu tiên em xin trân trọng cảm ơn thầy TS. Đặng Thanh Dũng người đã truyền đạt, chỉ dạy cho em những kiến thức về đề tài khóa luận tốt nghiệp của em trong suốt cả quá trình nghiên cứu làm khóa luận vừa qua. Xin gửi lời tri ân chân thành đến thầy đã tạo điều kiện cho em tham gia các cuộc thi, nghiên cứu khoa học, em được trải nghiệm thực hành thí nghiệm ở mơi trường mới, thầy cịn là người ln đồng hành, theo sát và tạo điều kiện, hướng dẫn em những kiến thức khoa học khi em làm báo cáo để

em hồn thành bài báo cáo Khóa luận tốt nghiệp: “Dịng hóa, biểu hiện và tinh chế protein huỳnh quang RHAU30-CFP ứng dụng trong xác định cấu trúc G-quadruplex song song” một cách tốt nhất.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong phòng sinh học phân tử của Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đã hỗ trợ hết mình cho quá trình thực tập của em. Xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Thu Thảo và anh Ngô Tiến Lý Đức đã giúp đỡ em thật nhiều trong bài khóa luận này.

Mình cũng gửi lời cảm ơn đến bạn Phan Đặng Hoàng Nam vừa là một người bạn vừa là người thân thiết trong 4 năm học qua đã hỗ trợ và giải đáp rất nhiều các thắc mắc khi mình thực hiện đề tài cũng như giúp mình vui vẻ trong suốt quá trình làm khóa luận. Suốt 4 năm học tập em học hỏi thêm được rất nhiều kiến thức vô cùng bổ ích và em cũng đã được trau dồi thêm kinh nghiệm trong lĩnh vực mà em theo học. Tất cả những đều đáng quý đó mà em có được là nhờ vào sự giúp đỡ và chỉ dạy nhiệt tình của thầy, cơ, anh, chị và bạn bè.

Và lời cuối con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã ln bên con, động viên con, ủng hộ tinh thần con và tạo điều kiện tốt nhất cho cả quá trình học tập của con ở ngơi trường đại học.

Bình Dương, tháng 6 năm 2021

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

1.1.2. Cấu trúc của G-tetrad ... 4

1.1.3. Phân loại G-quadruplex ... 5

1.1.4. Vị trí hình thành G-quadruplex... 6

1.1.5. Chức năng của cấu trúc G-quadruplex với sự duy trì telomere ... 6

1.2. Protein RHAU ... 8

1.3. Sự tương tác giữa G-quadruplex và protein ... 8

1.4. Protein huỳnh quang CFP... 9

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 10

2.1. Vật liệu nghiên cứu... 11

2.1.1.Dụng cụ-thiết bị ... 11

2.1.2.Hóa chất sửa dụng trong các thí nghiệm ... 12

2.1.3. Vật liệu sinh học ... 14

2.2. Phương pháp thực hiện ... 16

2.2.1. PCR thu gene CFP với cặp mồi đặc hiệu ... 17

2.2.2. Tạo vector tái tổ hợp pRHAU30-CFP ... 19

2.2.3. Sàng lọc dịng tế bào E. coli mang vector tái tở hợp ... 21

2.2.4. Tinh sạch, thu nhận plasmid ... 23

2.2.5. Giải trình tự ... 23

2.2.6. Biểu hiện protein tái tở hợp ... 23

2.2.7. Tinh chế protein RHAU30-CFP bằng cột HisTrap ... 25

2.2.8. Nhận diện G-quadruplex song song ... 28

PHẦN III KẾT QUẢ - THẢO LUẬN... 29

3.1. Kết quả dịng hóa tạo vector pRHAU30-CFP ... 30

3.1.1.Thu nhận gene CFP ... 30

3.1.2.Tạo vector tái tổ hợp pRHAU30-CFP ... 30

3.1.3.Giải trình tự ... 33

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

3.2.1.Sàng lọc chủng biểu hiện mang vector tái tổ hợp pRHAU30-CFP. ... 33

3.2.2. Cảm ứng biểu hiện protein RHAU30-CFP bới IPTG ... 34

3.3. Tinh chế protein RHAU30-CFP ... 35

3.4. Xác định G-quadruplex song song T95-2T bằng protein RHAU30-CFP ... 37

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc G-quadruplex………4

Hình 1.2.Các liên kết trong cấu trúc G-quadruplex ... 5

Hình 1.3. Cấu trúc nhân của G-tetrad (Nguồn Magdalena Malgowska) ... 5

Hình 1.4. Sự hình thành cấu trúc G-quadruplex trong các quá trình sinh học (Nguồn Lips., 2015) ... 6

Hình 1.5. Protien RHAU ở người (nguồn: commons.wikimedia.org) ... 8

Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pTD2... 15

Hình 2.2. Quy trình dịng hóa tạo vector tái tổ hợp chứa gene RHAU30-CFP ... 17

Hình 2.3. Chu trình nhiệt PCR thu gene RHAU30-CFP ... 18

Hình 2.4. Vị trí bắt cặp của mồi cho phản ứng PCR khuẩn lạc ... 22

Hình 2.5. Cấu trúc protein mục tiêu ... 26

Hình 2.6. Quy trình tinh chế protein RHAU30-CFP ... 26

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR gene mục tiêu CFP. M là thang DNA... 30

Hình 3.2. Ni cấy dòng tế bào E. coli chứa vector tái tổ hợp trên mơi trường LB-amp ... 31

Hình 3.3. Kết quả điện di 3 sản phẩm PCR khuẩn lạc ngẫu nhiên từ đĩa ni cấy ... 32

Hình 3.4. Kết quả giải trình tự với trình tự mồi ON30 ... ..33

Hình 3.5. Kết quả sàng lọc chủng biểu hiện mang vector pRHAU30-CFP ... 34

Hình 3.6. Kết quả biểu hiện của protein RHAU30-CFP. M: thang protein chuẩn ... 35

Hình 3.7. Kết quả tinh sạch protein RHAU30-CFP ... 36

Hình 3.8. Nhận diện cấu trúc G-quadruplex song song ... 37

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong các báo cáo gần đây, cấu trúc xoắn bốn sợi còn được gọi là G-quadruplex (G4) đã được quan sát và nghiên cứu rất nhiều vì vai trị quan trọng của chúng trong q trình sinh học của tế bào con người. Các kết quả nghiên cứu cho thấy G-quadruplex như một phân tử mục tiêu tiềm năng cho điều trị và chẩn đoán ung thư, đặc biệt là điều trị bằng các phân tử nhỏ nhắm tới những tế bào ung thư thay vì việc điều trị truyền thống là loại bỏ toàn bộ tế bào, kể cả tế bào bình thường (Xue và cộng sự., 2007). Cấu trúc bốn sợi G-quadruplex dễ dàng được hình thành từ một số trình tự acid nucleic nhất định trong tế bào giàu purin đặc biệt là chứa nhiều guanines (G) (Han và cộng sự., 2000).

Cấu trúc thứ cấp G-quadruplex xuất hiện nhiều trong một số gene sinh ung đặc biệt là tại các đầu của nhiễm sắc thể trong vùng telomeric và có liên quan một cách chặt chẽ đến các quá trình sinh học trong cơ thể con người như sao chép, phiên mã, dịch mã (Rhodes và cộng sự., 2015) (Han và cộng sự., 2000). Cấu trúc G4 xuất hiện nhiều và nằm gần vùng promoter có liên quan đến điều hịa biểu hiện của gene đã chiếm khoảng 50% gene người (Z. Chen và cộng sự, 2010). Tại vùng telomeric, telomere hiện diện trên các đầu của nhiễm sắc thể giúp ổn định nhiễm sắc thể; trong đó enzyme telomerase làm kéo dài chuỗi DNA telomere giàu G vì vậy hoạt động của enzyme này có mối tương quan cao với bệnh ung thư. Ngồi ra, cơ chế duy trì telomere là mục tiêu quan trọng để thiết kế thuốc, vì lý do này nên telomere quadruplex trở thành mục tiêu tiềm năng cho phương pháp điều trị bệnh ung thư. Trong khi G4 là những cấu trúc thứ cấp dễ dàng quan sát trong ống nghiệm đồng thời cũng dễ hình thành trong tế bào nhưng chưa có nghiên cứu cho sự bám đặc hiệu các phân tử nhỏ vào cấu trúc G4 song song (Phan, 2010). Sự ức chế telomerase và chức năng của telomere được cho là liên quan mật thiết đến việc nhắm cấu trúc mục tiêu DNA G-quadruplex, do đó G4 được đề xuất như một phân tử tiềm năng để thiết kế thuốc chống ung thư (Kerwin, 2000).

Một số thông tin nghiên cứu gần đây cho thấy rằng khả năng nhận biết và sự tương tác đặc hiệu của protein RHAU (RNA Helicase associated with AU-rich element) ở người với cấu trúc G-quadruplex là rất cao. Hơn nữa, RHAU còn thực hiện được chức năng tháo xoắn cấu trúc G4 với độ an tồn cao nhưng khơng làm biến mất tính ổn định

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

di truyền của bộ gene người. Protein RHAU cịn góp phần quan trọng thúc đẩy việc biểu hiện gene, tham gia vào các quá trình sinh học khác như phát triển, biệt hóa và miễn dịch; đặc biệt là khả năng điều chỉnh độ dài của telomere (Gueddouda và cộng sự., 2017). Việc kết hợp một protein huỳnh quang với đoạn peptide RHAU để tạo ra đầu dị protein hữu ích nhằm phân biệt các cấu trúc liên kết G-quadruplex khác nhau (Truong và cộng sự., 2020). Cyan Fluorescent Protein (CFP) là một protein huỳnh quang màu lục lam dễ biểu hiện và có tính bền. Đầu dị protein này có thể liên kết chọn lọc với cấu trúc song song G4 ở ái lực cao, cho phép dễ dàng quan sát liên kết giữa G4 song song và protein RHAU-CFP trong ống nghiệm bằng cách sử dụng Gel Doc thông thường hoặc bằng mắt thường (Truong và cộng sự., 2018). Cấu trúc gần đây của phức hợp peptide-G4 RHAU đã cung cấp cơ sở cụ thể cho việc nhận dạng giữa RHAU và G4 (Jin và cộng sự., 2020). Mặt khác, trong các thí nghiệm cho thấy G4 có thể gắn đặc hiệu vào RHAU30 peptide và khả năng liên kết mạnh mẽ của RHAU30 peptide với protein CFP cho phép G4 gắn và tạo thành phức hợp RHAU30-CFP. Việc tạo ra đầu dò RHAU30-CFP giúp cải tiến khả năng bám đặc hiệu vào cấu trúc G4 song song, từ đó dễ dàng xác định được cấu trúc G4 song song hiệu quả cao hơn.

Nhận thấy được cả tiềm năng cũng như vai trò quan trọng của protein RHAU30 trong cơ thể và sự cần thiết cho việc nghiên cứu ra phương pháp mới cho việc xác định

cấu trúc song song của G-quadruplex, tôi tiến hành chọn và thực hiện đề tài: “Dịng hóa, biểu hiện và tinh chế protein huỳnh quang RHAU30-CFP ứng dụng trong xác định cấu trúc G-quadruplex song song”.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

PHẦN I TỔNG QUAN

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

1.1. Cấu trúc G-quadruplex

1.1.1. Khái niệm

Cấu trúc của phân tử DNA được cấu tạo hình thành nên chuỗi xoắn kép, được biết đến là mơ hình xoắn kép của Watson-Crick. Tuy nhiên, vào khoảng thời gian sau thập niên 80 của thế kỉ trước, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy trong bộ gene của eukaryote có sự hình thành mơ hình cấu trúc DNA mới tồn tại ở dạng xoắn tứ diện được gọi là G-quadruplex. G-quadruplex hình thành ở vùng trình tự DNA hoặc RNA giàu guanine ở dạng cấu trúc bậc hai hình thành dạng gấp cuộn với bốn sợi được tạo nên từ các mặt phẳng G-tetrad (G-G-G-G tetrad) song song và chồng lên nhau (Heddi và cộng sự., 2015). Mỗi G-tetrad chứa 4 phân tử guanine, ở trung tâm mặt phẳng có các cation hóa trị 1 thường là Na+ hoặc K+ giúp mặt phẳng giữ được sự ổn định (Chambers và cộng

sự., 2015). Cấu trúc G-quadruplex được thể hiện trong Hình 1.1.

1.1.2. Cấu trúc của G-tetrad

Mặt phẳng hình vng G-tetrad được tạo bởi sự kết hợp của bốn gốc guanine (Hình 1.2A). Nhờ vào các liên kết hydrogen Hoogsteen giữa các guanine (N1 - O6, N2 - N7)

với các nguyên tử O6 hướng vào tâm để tạo thành một khu vực anion lưỡng cực và kết

Hình 1.1. Cấu trúc G-quadruplex

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

hợp các ion kim loại xen vào vùng trung tâm để giữ được sự ổn định cho cấu trúc (Phan và cộng sự., 2006).

Các guanine trong mỗi G-tetrad liên kết với gốc đường trong nucleotide có thể là syn

glycosidic hoặc anti glycosidic như trong Hình 1.2B. Ở trung tâm là nhân kim loại hóa

trị I (Li+, Na+ hoặc K+) tích điện dương với bán kính nguyên tử khác nhau có tác động lên cấu trúc liên kết được gấp lại của các G-tetrad xếp chồng lên nhau và ảnh hưởng đến tính ổn định của G-quadruplex (Phan và cộng sự., 2006).

(A) Các liên kết trong cấu trúc G-tetrad

(B) Guanine liên kết với gốc đường ở dạng anti glycosidic và syn glycosidic.

1.1.3. Phân loại G-quadruplex

Nhân G-tetrad được tạo nên từ nhiều kiểu như là song song (bốn sợi cùng chiều), (3+1) ba sợi cùng chiều, đối song (hai sợi cùng chiều lên, hai sợi còn lại cùng chiều xuống).

Hình 1.3. Cấu trúc nhân của G-tetrad (Nguồn Magdalena Malgowska).

(A): G-tetrad song song; (B): G-tetrad đối song;

(C): G-tetrad đối song; (D): Kiểu (3+1) của nhân G-tetrad.

Hình 1.2.Các liên kết trong cấu trúc G-quadruplex (Nguồn Collie, G.W. and Parkinson)

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

1.1.4. Vị trí hình thành G-quadruplex

Trong bộ gene người có hơn 300.000 trình tự có thể hình thành nên cấu trúc quadruplex, được nhận thấy qua sự mô phỏng của phần mềm máy tính (Rhodes và cộng sự., 2015). Ngồi ra, G-quadruplex cũng được tìm thấy trong DNA của vi khuẩn hay RNA của virus (Norseen và cộng sự., 2009) (Sundquist và cộng sự., 1993). Trong bộ gene, G4 tồn tại nhiều ở các telomere nơi chứa khoảng 5.000 đến 10.000 đoạn trình tự lặp lại giàu Guanine (TTAGGG) (Phan và cộng sự., 2006) (Luu và cộng sự., 2006) (Wang và cộng sự., 2011). Bên cạnh đó, trong promoter của một số gene cũng thấy sự tồn tại của G-quadruplex (Cogoi và cộng sự., 2006) (Patel và cộng sự., 2007). G-quadruplex cũng được tìm thấy trong RNA đặc biệt là những vùng không dịch mã của RNA thông tin (Bugaut và cộng sự., 2012). Sự hình thành G-quadruplex có liên quan đến nhiều quá trình sinh học trong hệ thống tế bào như sự sao chép, duy trì telomere,

G-phiên mã, và dịch mã (Hình 1.4).

(A) Phiên mã; (B) Duy trì telomere; (C) Sao chép DNA; (D) Dịch mã.

1.1.5. Chức năng của cấu trúc G-quadruplex với sự duy trì telomere

Ở động vật có vú, các đầu tận cùng của nhiễm sắc thể được bảo vệ bằng các telomere tức là những cấu trúc đặc biệt gồm các chuỗi 6 nucleotide (TTAGGG) được lặp lại, song song và kế tiếp nhau. Tuy nhiên, trong quá trình phân chia tế bào, phần cuối của các chuỗi DNA lại khơng có khả năng sao chép, vì vậy sau mỗi lần phân chia, các

Hình 1.4. Sự hình thành cấu trúc G-quadruplex trong các quá trình sinh học

(Nguồn Lips., 2015).

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

nhiễm sắc thể bị ngắn đi do mất một số lượng DNA của telomere (khoảng 50-100 bp). Khi đó các nhiễm sắc thể sẽ trở nên kém bền vững do các telomere quá ngắn. Dẫn đến việc các nhiễm sắc thể không bám vào được màng nhân tế bào, có hình dạng kỳ dị và bị dính chùm vào nhau, hậu quả là các tế bào dẫn đến quá trình apoptosis. Việc duy trì chiều dài của telomere có nhiệm vụ bảo đảm sự bền vững của các chromosome, ngăn cản quá trình apoptosis, chống lại sự tái tổ hợp sai lệch và có vai trị điều hịa gene.

Telomerase là một enzyme có vai trò giúp các phân tử DNA sao chép toàn bộ nhiễm sắc thể mà không bị mất đi đoạn cuối cùng. Telomerase tham gia vào quá trình phân chia của tế bào, giúp duy trì chiều dài phần cuối của nhiễm sắc thể. Thành phần RNA của telomerase ở người có 445 nucleotid, trong đó vị trí các nucleotid 46-56 là vị trí gắn vào đầu tận cùng của telomere, được sử dụng làm khn để từ đó thêm vào các DNA của telomere. Cơ chế bảo vệ telomere là enzyme telomerase sẽ nhận dạng đầu tận cùng của telomere thông qua các hoạt động giữa telomere và cả hai tiểu đơn vị hTR và hTERT của telomerase, sau đó thêm vào các chuỗi sáu base TTAGGG ở đầu tận cùng này giúp kéo dài thêm telomere và cứ thế tiếp tục. Ở tế bào ung thư, đây chính là cơ chế giúp chúng trở nên bất tử.

Trong nhiễm sắc thể ở người, sợi đơn ở đầu 3' của telomere (khoảng 100 - 280 nucleotide) được cho là rất thuận lợi để hình thành cấu trúc G-quadruplex. Sự hình thành cấu trúc G-quadruplex đã ngăn cản telomerase không thể bám và tương tác với telomere khiến chúng bị ức chế hoạt tính, dẫn đến telomere càng lúc càng ngắn lại (Lattmann và cộng sự., 2011) (Martadinata và cộng sự., 2011). Vì vậy, kiểm sốt chiều dài của telomere trên cơ sở can thiệp cấu trúc G-quadruplex gần đây đã mở ra một hướng mới trong phương pháp trị liệu bệnh ung thư.

Ngoài ra, G-quadruplex cũng đóng một vai trị quan trọng trong sự tái bản, phiên mã và dịch mã. Có khoảng một nửa tổng số gene ở người có cấu trúc G-quadruplex nằm ở gần vùng promoter liên quan đến điều hòa biểu hiện của gene (Martadinata và cộng sự., 2011). Sử dụng những phân tử nhỏ hay protein để kiểm soát cũng như làm ổn định cấu trúc G-quadruplex là tiền đề quan trọng giúp điều hịa các q trình sinh học của tế bào. Đặc biệt, một cơ chế sinh học được quan tâm nhiều hiện nay là RNA G-quadruplex (r(UUAGGG) lặp lại gọi là TERRA) có liên kết đặc hiệu với protein RHAU (RNA

Helicase Associated with AU-rich Element) và bị protein này tháo xoắn (Hình 1.4).

Trong những nghiên cứu gần đây người ta đã chứng minh được rằng protein RHAU

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

không chỉ liên kết được với RNA quadruplex mà còn liên kết được với cả DNA quadruplex (Heddi và cộng sự., 2015).

Protein này gồm 3 vùng như trong Hình 1.5:

- Vùng NTR (vùng đầu N N-Terminal Region) kéo dài từ amino acid 1 đến 203 và chứa trình tự RSM (RHAU-specific motif) có khả năng tương tác đặc hiệu với G-quadruplex. - Vùng HCR (vùng lõi Helicase Core Region) gồm các motif từ I tới VI thể hiện hoạt tính ATPase hoặc helicase và kéo dài từ amino acid 204 đến 615.

- Vùng CTR (vùng đầu C C-Terminal Region) kéo dài từ amino acid 616 tới 1008.

1.3. Sự tương tác giữa G-quadruplex và protein

Trong tế bào, hệ thống protein RHAU (thuộc nhóm helicase) được tổng hợp để nhận diện và tháo xoắn cấu trúc G-quadruplex (Vaughn và cộng sự., 2005). Ở người, protein RHAU gồm có 1008 amino acid, protein này cũng có liên kết với vùng trình tự giàu Adenine và Uracil của RNA (Vaughn và cộng sự., 2005) (Norseen và cộng sự., 2009). Khi tế bào chịu áp lực căng thẳng, protein RHAU sẽ liên kết với RNA thông tin (mRNA) và tạo thành phức hợp protein và RNA có nồng độ cao để giúp bảo vệ RNA khỏi bị phân hủy trong những điều kiện không thuận lợi đối với tế bào (Bugaut và cộng sự., 2012). Ngoài ra, những nghiên cứu gần đây cho thấy, khi có sự hiện diện của ATP, protein RHAU được kích hoạt sẽ nhận diện và bám lên cấu trúc DNA, RNA G-

Hình 1.5. Protien RHAU ở người (nguồn: commons.wikimedia.org)

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

quadruplex song song mục tiêu và thực hiện chức năng là mở xoắn các cấu trúc quadruplex này (Lattmann và cộng sự., 2011).

G-Protein RHAU có khả năng nhận diện và bám vào được cả DNA và RNA với ái lực cao là nhờ trình tự peptide đặc hiệu ngắn (RSM, RHAU54-66) ở vùng đầu N của protein (Lattmann và cộng sự., 2010). Vì trình tự RHAU peptide nhận biết được và bám đặc hiệu vào cấu trúc song song của G-quadruplex DNA hoặc RNA nên nó có thể được xem là một ligand tiềm năng đặc hiệu cho cấu trúc G-quadruplex song song.. Tuy nhiên khảo sát ái lực tương tác cho thấy giữa RHAU peptide 18 aa (vị trí amino acid từ 53 đến 70) hay RHAU peptide 23 aa (vị trí amino acid từ 53 đến 75) đối với G-quadruplex song song có ái lực tương tác yếu. Điều này làm giới hạn khả năng ứng dụng của những RHAU peptide này trong quá trình nghiên cứu tương tác giữa ligand với G-quadruplex trong các quá trình sinh học của tế bào. Trong đó, đoạn trình từ RHAU dài 30 amino aicd (từ vị trí amino acid 53 tới 82) có chứa vùng RSM và được chứng minh là có ái lực mạnh với G-quadruplex (đề tài sẽ gọi là RHAU30) được chọn sử dụng để nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện để tạo tiền đề cho việc phát hiện cấu trúc G-quadruplex song song.

1.4. Protein huỳnh quang CFP

Cyan Fluorescent Protein (CFP) là một protein huỳnh quang màu lục lam dễ biểu hiện và có tính bền. Đầu dị protein này có thể liên kết chọn lọc và hình dung cấu trúc song song G4 ở ái lực cao, cho phép dễ dàng quan sát hình ảnh song song G4 của RHAU-CFP trong ống nghiệm bằng cách sử dụng Gel Doc thông thường hoặc bằng mắt thường (Truong và cộng sự,2018). Cấu trúc gần đây của phức hợp peptide G4 RHAU đã cung cấp cấu trúc cơ sở cụ thể cho việc nhận dạng giữa RHAU và G4 (Jin và cộng sự, 2020). Mặt khác, G4 có thể gắn đặc hiệu vào RHAU30 peptide và sự liên kết chặt chẽ của RHAU30 peptide với protein CFP cho phép G4 lựa chọn để gắn và tạo thành phức hợp RHAU30-CFP. Việc tạo ra đầu dò RHAU30-CFP giúp cải tiến khả năng bám đặc hiệu vào cấu trúc G4 song song, từ đó có thể xác định được cấu trúc G4 song song hiệu quả cao hơn.

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Dụng cụ-thiết bị

- Bàn soi gel UV (Imagemaster VDS) - Bộ điện di DNA (Cleaver Scientific) - Bộ điện di protein (BioRad)

- Bộ nguồn (Cleaver Scientific) - Máy đo pH (TRANS Instrument) - Máy đo quang phổ (Eppendorf)

- Máy đo quang phổ chuyên dụng (Nanodrop®) - Máy gia nhiệt (Benchmark)

- Máy phá tế bào bằng sóng siêu âm (Qsonica) - Máy khuấy từ gia nhiệt (Benchmark)

- Máy lắc (Pol-Eko)

- Máy ly tâm lạnh (Hermle) - Máy ly tâm eppendorf (Hermle) - Máy PCR (Eppendorf)

- Máy vortex (Biocote)

- Máy đọc đĩa CLARIOStar (BMG Labtech) - Đĩa ELISA 96 giếng (Nunc)

- Nồi hấp (SS325 -TOMY) - Tủ ấm (Pol-Eko)

- Tủ lạnh -20oC (Lucland Fukusima) - Tủ lạnh 4oC (Lucland Fukusima) - Tủ lạnh sâu -80oC (Telstar)

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

- Cột Histrap HP (GE Healthcare)

- Bộ Pipet, tip dùng riêng cho thao tác RNA

- Máy chụp hình gel Polyacrylamide (Gel company) - Các vật liệu khác: eppendorf, tip,...

2.1.2. Hóa chất sửa dụng trong các thí nghiệm 2.1.2.1. Hóa chất dùng trong PCR

- Dung dịch điện di DNA TAE 1X.

2.1.2.3. Hóa chất dùng trong phản ứng cắt giới hạn và nối

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

2.1.2.4. Hóa chất dùng trong tạo tế bào E.coli khả nạp

- Dung dịch CaCl2 100 mM. - Dung dịch glycerol 100%. - dH2O.

2.1.2.5. Hóa chất dùng tạo dòng biểu hiện và tinh chế prontein

- IPTG 1 M - PMSF 1 M. - EDTA 500 mM.

- DTT 1 M. (thử nghiệm kinase) - Dnase I 100 mg/ml.

- Lysis Buffer: 25 mM Tris-HCl pH 8,0; 250 mM Succrose.

- Binding Buffer: 30 mM Tris-HCl pH 8,0; 500 mM NaCl; 5% glycerol.

- Dung dịch bảo quản protein: 100 mM KCl; 20 mM potassium phosphate pH 7,4.

2.1.2.6. Hóa chất dùng trong điện di SDS - PAGE

- Dung dịch nạp mẫu SDS-PAGE 5X: 250 mM Tris-HCl pH 6,8; 10% SDS; 30% glycerol; 500 mM DTT; 0,02% bromophenol blue.

- Dung dịch chạy SDS-PAGE 1X: 25 mM Tris base; 192 mM glycine; 0,1% SDS. - Dung dịch bảo quản protein: 100 mM KCl; 20 mM potassium phosphate pH7,4. - Gel điện di polyacrylamide

- Gel gom: 4% acrylamide/bis-acrylamide 29:1; 125 mM Tris-HCl pH 6,8; 0,1% SDS; 0,07% APS; 0,1% TEMED.

- Gel phân tách: 12% acrylamide/bis-acrylamide 29:1; 375 mM Tris-HCl pH 8,8; 0,1% SDS; 0,07% APS, 0,1% TEMED.

- Dung dịch nhuộm gel SDS-PAGE: 50% acid acetic; 25% ethanol; 0,25% Coomassie Brilliant Blue.

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

- Dung dịch giải nhuộm: Ethanol tuyệt đối 100 ml; Glacial Acetic 100 ml pha trong 1 lít dung dịch.

2.1.2.7. Các hóa chất khác

- Kháng sinh: Amp 200 mg/ml được bổ sung vào môi trường nuôi cấy E. coli với

nồng độ cuối là 100 μg/ml. Kháng sinh được giữ ở -20oC.

- IPTG: 1 mM (hịa tan trong nước cất vơ trùng), bảo quản ở -20oC.

2.1.3. Vật liệu sinh học 2.1.3.1. Chủng vi sinh vật

- Chủng E. coli DH5𝛼: F– φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1

hsdR17(rK–, mK+) phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1 (Invitrogene): sử dụng cho dịng hóa tạo vecter tái tổ hợp pRHAU30-CFP.

- Chủng E. coli BL21 (DE3): F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3)

(Invitrogene): sử dụng cho biểu hiện protein RHAU30-CFP dưới sự cảm ứng của IPTG.

2.1.3.2. Plasmid , RNA và Protein

Plasmid:

- pTD2: Chứa gene mã hóa cho protein RHAU30 (được cung cấp bởi Trung tâm khoa học và công nghệ sinh học Trường Đại học KHTN, TP. HCM).

- pRHAU30-CFP: Chứa gene mã hóa protein RHAU30-CFP.

Plasmid pTD2 có chứa T7 promoter dung hợp với gene mã hóa cho peptide RHAU có chiều dài 30 amino acid được dùng làm vector khung sườn cho dịng hóa. T7 promoter là một promoter mạnh, sau vài tiếng đã cảm ứng 50% tế bào tổng hợp protein mục tiêu. T7 promoter chỉ nhận diện một loại RNA polymerase duy nhất là

T7 RNA polymerase, vì vậy RNA polymerase khác của E. coli không thể bám vào

vùng T7 promoter và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu.

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Ngoài ra plasmid pTD2 cịn chứa vùng gene lacI, mã hóa cho lac repressor. Khi chưa có chất cảm ứng IPTG, lac repressor sẽ bám vào lac operon không cho gene T7

tạo ra T7 RNA polymerase, lúc này gene mục tiêu vẫn chưa được biểu hiện. IPTG là đồng phân của allolactose, có chức năng cảm ứng như lactose nhưng khơng bị phân cắt trong tế bào vì vậy có thể cảm ứng protein liên tục trong thời gian tế bào

tăng trưởng. Việc kết hợp gene lacI và chất cảm ứng tổng hợp IPTG sẽ dễ tầm soát

sự biểu hiện protein. Bên cạnh đó plasmid pTD2 cịn chứa gene kháng kháng sinh

Ampicillin để sàng lọc tế bào E. coli BL21(DE3) mang gene mục tiêu. Vùng gene

mã hóa đi 6×His được dung hợp với protein RHAU là yếu tố quan trọng giúp tinh chế tốt protein mục tiêu.

Protein:

- Protein RHAU30-CFP nhận từ trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.

- Enzyme cắt giới hạn: Hai enzyme cắt giới hạn BamHI, XhoI được sử dụng trong thí

nghiệm cắt và nối gene mục tiêu vào plasmid.

2.1.3.3. Mời (primer)

Các trình tự mồi sử dụng trong đề tài được trình bày ở bảng 2.1: Bảng 2.1. Các trình tự mồi sử dụng trong thí nghiệm.

Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pTD2.

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">