Dòng hóa, biểu hiện và tinh sạch beta – galactosidase trong Escherichia coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



TRẦN ĐỨC THỤY







DÒNG HÓA, BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH
BETA – GALACTOSIDASE TRONG Escherichia coli





Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
Mã Số: 604270



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH




TP. HCM, Năm 2011
LỜI CẢM ƠN

Tình yêu và sự quan tâm từ Gia Đình là sức mạnh lớn lao đối với con. Con xin
bày tỏ lòng biết ơn đến Gia Đình vì đã cho con một chỗ dựa vững chắc về tinh
thần, cảm ơn Cha và Mẹ vì bao vất vả hy sinh cho con được có ngày hôm nay.
Xin gửi lời cảm ơn đến T.S Hoàng Quốc Khánh - Trưởng phòng Vi sinh ứng
dụng Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là giảng
viên hướng dẫn và đứng tên khóa luận đã truyền đạt những kiến thức, thường
xuyên quan tâm và động viên để Tôi có thể hoàn thành khoá luận này tốt đẹp.
Cảm ơn anh Nguyễn Duy Long, anh Ngô Đức Duy, chị Đào Thị Thu Hiền cùng
toàn bộ các anh chị phòng Vi sinh ứng dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới đã hướng
dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn tất khóa luận.
Cám ơn Ban Giám Hiệu nhà trường và quý Thầy/Cô bộ môn Di Truyền cùng
toàn thể quý Thầy/Cô khoa Sinh học Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên đã
truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm trong suốt khóa học, tạo mọi điều kiện
cho Tôi hoàn tất khóa luận.
Cảm ơn quý Thầy/Cô và các anh chị ở Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học
Công nghệ Việt Nam đã chỉ dạy trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Cảm ơn những tình cảm tốt đẹp từ bạn bè dành cho Tôi, cảm ơn tập thể cao
học Di truyền K18 Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia
Thành Phố Hồ Chí Minh cùng tất cả bạn bè xa gần đã giúp đỡ và động viên tôi
trong suốt thời gian qua.
Luôn biết ơn Em, “Người thầm lặng” đã luôn bên Tôi và cùng Tôi vượt qua

mọi khó khăn.

Tp.HCM, ngày 18 tháng 07 năm 2011

Trần Đức Thụy
Luận văn Thạc sĩ

Trần Đức Thụy

i
MỤC LỤC


Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH vii
DANH MỤC ĐỒ THỊ 9
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Enzyme beta-galactosidase 5
1.1.1 Giới thiệu 5
1.1.2. Cơ chế 6
1.1.3. Cấu trúc beta-galactosidase nguồn gốc E.coli 7
1.1.4. Ứng dụng 7
1.1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất beta-galactosidase trong và ngoài nƣớc 7
1.2. Lactose 8
1.3. Giới thiệu chung về Galacto-oligosaccharide (GOS) từ lactose 9

1.3.1. Cấu trúc GOS 9
1.3.2. Cơ chế tổng hợp GOS 10
1.3.3. Đặc điểm GOS 11
1.3.4. Ứng dụng 13
1.4. Tế bào E.coli và sự biểu hiện protein tái tổ hợp 13
1.4.1. Đặc điểm E.coli 13
1.4.2. Các chủng E.coli dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp 14
1.5. Một vài hệ thống vector biểu hiện protein 15
1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST 15
Luận văn Thạc sĩ

Trần Đức Thụy

ii
1.5.2. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP-Hệ thống pMAL 15
1.5.3. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP 16
1.5.4. Hệ thống pTrcHis trong sản xuất protein tái tổ hợp dung hợp 6xHis 16
Chƣơng 2: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu 18
2.1.1 Gen mã hóa beta-galactosidase 18
2.1.2. Chủng vi sinh vật 18
2.1.3. Plasmid dùng trong thí nghiệm 19
2.1.4. Mồi khuếch đại gen LacZ 21
2.1.5. Thang phân tử dùng trong điện di DNA/RNA 21
2.2. Dụng cụ - thiết bị 22
2.2.1. Dụng cụ thiết bị thông dụng 22
2.2.2. Thiết bị dùng trong sinh học phân tử 22
2.2.3. Thiết bị dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh 22
2.2.4 Thiết bị dùng cho tinh chế protein 23
2.3. Hóa chất và môi trƣờng 23

2.3.1 Hóa chất 23
2.3.2 Môi trƣờng 26
2.4. Phƣơng pháp 27
2.4.1. Thiết kế mồi chuyên biệt 27
2.4.2. Xác định gen LacZ trên ngân hàng gen 28
2.4.3. Phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả biến 29
2.4.4. Phƣơng pháp tách chiết thu plasmid 29
2.4.5. Phƣơng pháp điện di DNA 30
2.4.5.1. Nguyên tắc 30
2.4.5.2. Phƣơng pháp 31
2.4.6. Tạo chủng E.coli Mach1 ™ -T1R mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ
mã hóa beta-galactosidase 31
2.4.6.1. Thu nhận gen LacZ 32
Luận văn Thạc sĩ

Trần Đức Thụy

iii
2.4.6.2. Thiết lập phản ứng nối gen LacZ vào plasmid pCR®-XL-TOPO® 36
2.4.6.3. Điện biến nạp plasmid pCR®-XL-TOPO®/LacZ vào tế bào E.coli
Mach1™ -T1R khả biến. 36
2.4.7. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCR®-XL-TOPO®/LacZ 37
2.4.7.1. Kiểm tra dòng mang Plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp PCR. 37
2.4.7.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCR®-XL-TOPO®/LacZ bằng enzyme cắt
giới hạn 38
2.4.8. Tinh sạch thu băng LacZ trên gel agarose điện di với crystal violet 38
2.4.9. Tạo dòng đƣa gen LacZ vào plasmid pTrcHisB 39
2.4.9.1. Cắt tạo plasmid pTrcHisB đầu dính bằng hai enzyme XhoI và HindIII 39
2.4.9.2. Thực hiện phản ứng nối gen LacZ vào plasmid pTrcHisB 40
2.4.9.3. Điện biến nạp chuyển plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ vào E.coli

DH5α khả biến. 40
2.4.9.4. Kiểm tra dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ 41
2.4.10. Tạo dòng E.coli BL21(DE3) có khả năng biểu hiện beta-galactosidase hoạt
tính. 43
2.4.11. Điện di SDS-PAGE 43
2.4.11.1. Nguyên tắc 43
2.4.11.2. Phƣơng pháp SDS-PAGE 43
2.4.12. Cảm ứng biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của 6xHis- betagalactosidase 44
2.4.12.1. Cảm ứng biểu hiện 44
2.4.12.2. Kiểm tra sự biểu hiện của 6xHis-betagalactosidase bằng phƣơng pháp
SDS-PAGE 45
2.4.12.3. Kiểm tra phân đoạn thu 6xHis- betagalactosidase 45
2.4.13. Thử khả năng thu hồi 6xHis- betagalactosidase với hạt Ni-NTA, dùng
Imidazol ở tỷ lệ khác nhau 47
2.4.14. Xác định nhiệt độ, pH tối ƣu cho enzym 6x-betagalactosidase 47
2.4.15. Thử khả năng sinh GOS từ enzym beta-galactosidase thu đƣợc bằng sắc ký
lỏng HPLC. 48
Luận văn Thạc sĩ

Trần Đức Thụy

iv
Chƣơng 3: Kết Quả - Biện Luận
3.1.Tạo dòng gen LacZ trong plasmid pCR-XL-TOPO® vào tế bào E.coli
Match1TM-T1R khả biến. 50
3.1.1. Tổng hợp gen LacZ mã hóa beta-galactosidase 50
3.1.2. Tạo dòng gen LacZ vào plasmid pCR-XL-TOPO®. 51
3.2. Kiểm tra dòng E.coli Match1TM-T1R mang Plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ
53
3.2.1. Dùng phƣơng pháp cắt hạn chế kiểm tra dòng E.coli Match1TM-T1R mang

Plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ, thu gen LacZ 53
3.2.2. Giải trình tự so sánh trình gen LacZ thu đƣợc với gen LacZ trên plasmid
pAc5.1/V5-HisB/LacZ. 54
3.3. Tạo dòng gen LacZ vào plasmid pTrcHisB trong tế bào E.coli DH5α 61
3.4. Tạo dòng tế bào E.coli BL21(DE3) mang plasmid pTricHisB/LacZ, 64
3.5. Kiểm tra khả năng biểu hiện enzyme beta-galactosidase hoạt tính dạng dung
hợp 6xHis-betagalactosidase 65
3.6. Định tính khả năng biểu hiện 6xHis-betagalactosidase có hoạt tính trong E.coli
BL21(DE3). 66
3.7. Xác định phân đoạn thu 6xHis-betagalactosidase trong E. coli BL21(DE3) 69
3.8. Thử khả năng thu hồi 6xHis-LacZ với hạt Ni-NTA, dùng Imidazol ở tỷ lệ khác
nhau. 70
3.9. Xác định nhiệt độ, pH tối ƣu của enzym 6xHis-betagalactosidase 71
3.9.1. xác định nhiệt độ tối ƣu 71
3.9.2. Xác định pH tối ƣu 73
3.10. Thử khả năng sinh GOS, phát hiện sản phẩm bằng sắc ký lỏng HPLC 74
Chƣơng 4: Kết Luận – Đề Nghị
4.1. Kết luận 77
4.2. Kiến nghị 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
PHỤ LỤC 84

5

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Sự tạo thành các IRMOF ở các điều kiện tổng hợp khác nhau 34
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình tạo thành axít
azobenzen 4,4’-dicarboxylic 42

Bảng 4.1: Kết quả phân tích nguyên tố được tính toán về mặt lý thuyết so với kết

quả thực nghiệm 50

Bảng 4.3: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand AD
ở nồng độ 0,002 M, nhiệt độ 80
o
C 52
Bảng 4.4: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand AD
ở nồng độ 0,002 M, nhiệt độ 85
o
C 53
Bảng 4.5: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand AD
ở nồng độ 0,002 M , nhiệt độ 90

o
C 54
Bảng 4.6: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand AD
ở nồng độ 0,002 M , nhiệt độ 95
o
C 55
Bảng 4.7: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand AD
ở nồng độ 0,002 M, nhiệt độ 100
o
C 56
Bảng 4.28: Sự kết tinh tinh thể MOF trong dung môi DMF/DMSO tỉ lệ 5,5 : 0,5,
nồng độ AD 0,01 M, tỉ lệ AD/Zn =1 : 1 63

Bảng 5.1: Kết quả phân tích nguyên tố C, N của vật liệu 77
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát tỉ lệ mol giữa axít azobenzen 4,4’-dicarboxylic (AD)
với các muối kim loại (Mn(CH
3
COO)

2
.4H
2
O; Pb(NO
3
)
2
; Cu(CH
3
COO)
2
.H
2
O;
Ce(NO
3
)
3
.6H
2
O) ở nồng độ mol của AD ở 0,002M; 0,004M; 0,006M; 0,008M; 0,01
M trong dung môi DMF 101

Bảng 4.8: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand AD

ở nồng độ 0,004 M, nhiệt độ 80
o
C 102
Bảng 4.9: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand AD
ở nồng độ 0,004 M, nhiệt độ 85
o
C 103
Bảng 4.10: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,004 M, nhiệt độ 90
o
C 104

6

Bảng 4.11: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2

.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,004 M, nhiệt độ 95
o
C 105
Bảng 4.12: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,004 M, nhiệt độ 100
o
C 106
Bảng 4.13: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,006 M, nhiệt độ 80
o
C 107
Bảng 4.14: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2

.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,006 M, nhiệt độ 85
o
C 108
Bảng 4.15: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,006 M, nhiệt độ 90
o
C 109
Bảng 4.16: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,006 M, nhiệt độ 95
o
C 110
Bảng 4.17: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2

.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,006 M, nhiệt độ 100
o
C 111
Bảng 4.18: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,008 M, nhiệt độ 80
o
C 112
Bảng 4.19: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,008 M, nhiệt độ 85
o
C 113
Bảng 4.20: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2

.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,008 M, nhiệt độ 90
o
C 114
Bảng 4.21: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,008 M, nhiệt độ 95
o
C 115
Bảng 4.22: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,008 M, nhiệt độ 100
o
C 116
Bảng 4.23: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2

.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,01 M, nhiệt độ 80
o
C 117
Bảng 4.24: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,01 M, nhiệt độ 85
o
C 118

7

Bảng 4.25: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,01 M, nhiệt độ 90
o
C 119
Bảng 4.26: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO

3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,01 M, nhiệt độ 95
o
C 120
Bảng 4.27: Kết quả quan sát sự hình thành vật liệu từ Zn(NO
3
)
2
.4H
2
O và ligand
AD ở nồng độ 0,01 M, nhiệt độ 100
o
C 121

8

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 2.1: Cấu trúc khung hữu cơ kim loại nghiên cứu theo từng năm 14
Hình 2.2: Đường biểu diễn quá trình nghiên cứu vật liệu cấu trúc khung lỗ xốp có
kích thước micro 15

Hình 2.3: Sự tạo thành góc liên kết giữa nguyên tử kim loại chuyển tiếp - phân tử
hữu cơ imidazol - nguyên tử kim loại chuyển tiếp 16

Hình 2.4: Các loại imidazol dùng trong tổng hợp ZIF. 17
Hình 2.5: Một số loại ZIF đã được tổng hợp được trong phòng thí nghiệm của
Omar Yaghi 17

Hình 2.6: Mối liên hệ giữa diện tích bề mặt và kích thước lỗ xốp trong vật liệu ZIFs
18

Hình 2.7: a) Sự trùng ngưngcủa axít boronic thành boroxine anhydride. 19
b) Sự trùng ngưng của axít diboronic tạo thành COF-1. 19
Hình 2.8:Những phản ứng trùng ngưng của axít boric, axít diboronic được sử dụng
để tạo thành khung mạng COF mở rộng 20


Hình 2.9: Sự trùng ngưng tert-butylsilan triol A vớiaxít boronic B tạo thành khung
borosilicat C. Sự trùng ngưng A với D tạo thành E với nguyên tử Bo xảy ra ở đỉnh
của ba góc liên kết với nhau tạo thành khối tetraheral D cho ra COF-202 F 21

Hình 2.10: Mô hình liên kết giữa cầu nối hữu cơ với ion kim loại tạo thành vật liệu
MOF 22

Hình 2.11: Các cầu nối hữu cơ dùng trong tổng hợp MOF 23
Hình 2.12: Mô hình hóa cluster dùng trong tổng hợp MOF 24
Hình 2.13: Cluster của ion kim loại có cấu trúc tứ diện liên kết với cầu nối hữu cơ
có 1 tâm phối trí, cấu trúc MOF tạo thành sẽ có dạng cơ bản như mạng tinh thể kim
cương 25

Hình 2.14: Cluster của ion kim loại có cấu trúc bát diện liến kết với cầu nói hữu cơ
có 2 tâm phối trí, cấu trúc MOF tạo thành sẽ có dạng cơ bản như mạng lập phương
26

Hình 2.15: Các loại axít dicarboxylic dùng cho quá trình tổng hợp 27

9

Hình 2.16: Axít Trimesic (axít 1,3,5-benzentricarboxylic) dùng trong tổng hợp
HKUST-1 28

Hình 2.17: MOF(HKUST-1) được tạo thành với các rãnh hình vuông có đường
kính 10 Å 28

Hình 2.18: Axít 2,5-dihydroxyterephthalic dùng trong tổng hợp COP-27 29
Hình 2.19: Cấu trúc COP-27 có các rãnh đường kính 10 Å với tâm là Co (màu
hồng), các nguyên tử carbon (màu xám), các nguyên tử oxi có tính chất hấp thụ vật

lý với nước (màu đỏ) 29

Hình 2.20: Mô tả sự tạo thành MOF từ ion cluster kim loại với cầu nối hữu cơ có
góc liên kết khác nhau 30

Hình 2.21: Mô hình hóa cách tạo liên kết bên trong cấu trúc MOF-5 31
Hình 2.22: Sự tạo thành cấu trúc ba chiều trong tinh thể MOF-5. 32
a) Cấu trúc MOF-5 được tạo thành từ cluster Zn
4
O liên kết với benzen1,4-
dicarboxylat tạo thành khung mạng lập phương. 32

b) Cấu trúc MOF-5 được mô hình hóa dưới dạng cầu và que. 32
c) Cấu trúc MOF-5 được bao bọc cluster (OZn
4
)O
12
với ion benzen1,4-
dicarboxylat 32

Hình 2.23: Biểu diễn cấu trúc không gian tạo thành MOF-177. 33
a) Một phân tử 1,3,5-tribenzenbezoat liên kết với 3 cluster Zn
4
O. 33
b) Hình chiếu của cấu trúc MOF-177 xuống mặt [001]. 33
c) Một phần của cấu trúc từ một tâm của cluster Zn
4
O. 33
Hình 2.24: Các IRMOF được mô hình hóa 35
Hình 2.25: Mô hình hóa khả năng hấp thụ CO

2
của MOF-177 36
Hình 2.26: Mô tả sự lưu trữ khí H
2
của một số loại MOF 37
Hình 2.27: Sự lưu giữ khí CO
2
ở nhiệt độ phòng với các loại MOF khác nhau 37
Hình 2.28: Phản ứng Benzoic aldehyde với Me
3
SiCN sử dụng xúc tác Cd(II) 4,4’-
bipyridine ở 313K, 24 giờ, hiệu suất phản ứng 77% 38


10

Hình 2.29: Đường đẳng nhiệt của quá trình hấp/ giải hấp của ba vật liệu được
nghiên cứu ở nhiệt độ phòng (phần bên dưới). Từ trái sang phải phần ở trên là cấu
trúc của M-CPO-27 (M = Ni/Co), HKUST-1 và M-MIL-53 (M = Al/Cr). 39

Hình 3.1 : Sơ đồ mô tả các quá trình tổng hợp ligand AD 41
Hình 3.2 Quy trình hoạt hóa mẫu 44
Hình 4.1: Phổ NMR
1
H của sản phẩm sau 12 giờ phản ứng tại 50
o
C 45
Hình 4.2: Phổ hồng ngoại của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80
o
C 46

Hình 4.3: Phổ LC-MS của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80
o
C 47
Hình 4.4: Phổ
1
H-NMR của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80
o
C 48
Hình 4.5: Phổ
13
C-NMR của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80
o
C 49
Hình 4.6: Công thức cấu tạo của axít azobenzen 4,4’-dicarboxylic a) dạng cis b)
dạng trans 50

Hình 4.7. Tinh thể tạo thành trong hỗn hợp AD (0,008 M)/Zn (0,002 M) trong dung
môi DMF, nhiệt độ 85
o
C. 51
Hình 4.8: Tinh thể tạo thành từ AD (0,002 M) và Zn, tỉ lệ AD/Zn a) 1 : 4; b) 1: 2; c)
1 : 1; d) 2 : 1, trong dung môi DMF, thời gian 2 ngày, nhiệt độ 85
o
C. 57
Hình 4.9: Tinh thể tạo thành từ AD và Zn (0,004 M), tỉ lệ (a) 1 : 3;(b )1 :1;(c)2 : 5;
(d)1 : 4), trong dung môi DMF, thời gian 3 ngày, nhiệt độ 85
o
C 58
Hình 4.10: Tinh thể tạo thành từ ligand AD (0,006 M) và Zn ở tỉ lệ (a) 1:1; 59
(b) 3 : 1;(c) 2 : 1, (d) 3 : 4, trong dung môi DMF, thời gian 2 ngày, nhiệt độ 90

o
C . 59
Hình 4.11: Tinh thể tạo thành từ AD và Zn (0,008 M), tỉ lệ (a) 1 : 1;(b) 3 : 1; 60
(c) 1 : 3, (d) 2 : 3, trong dung môi DMF, thời gian 1 ngày, nhiệt độ 95
o
C 60
Hình 4.12: Tinh thể tạo thành từ ligand AD (0,01 M) và Zn ở tỉ lệ (a) 1 : 3; 61
(b) 1 : 2; (c)1:1, (d) 3 :4, trong dung môi DMF, thời gian 1 ngày, nhiệt độ 90
o
C 61
Hình 4.13: Tinh thể MOF kết tinh trong DMF/DMSO = 5,5 : 0,5, với nồng độ AD :
0,01M, tỉ lệ AD/Zn = 1 : 1, sau 4 ngày dung môi nhiệt tại a) nhiệt độ 80
o
C, b) nhiệt
độ 90
o
C 63

11

Hình 4.14: Ảnh tinh thể tổng hợp ở nhiệt 90
o
C, nồng độ AD 0,01 M, tỉ lệ AD / Zn =
1 : 1, sau 1 ngày, pH của dung dịch 4,22 (a), 4,32 (b), 4,54(c), 4,75 (d), 4,85(e), 5,20
(f). 64

Hình 4.15:Ảnh hiển vi của vật liệu được tổng hợp trong điều kiện tỉ lệ nồng độ AD
0,01 M, tỉ lệ AD/Zn = 1 : 1, thời gian ủ nhiệt 5 ngày tại 80
o
C,tương ứng với giá trị

pH của dung dịch là 4,4 (a), 4,68 (b), 4,86(c), 5,02 (d), 5,25(e). 65

Hình 4.16: Nhiễu xạ tia X của vật liệu trong trường hợp 1 67
Hình 4.17: Nhiễu xạ tia X của axít azobenzen 4,4’-dicarboxylic 67
Hình 4.18: Phổ nhiễu xạ tia X của vật liệu trong trường hợp 2 68
Hình 4.19: Phổ nhiễu xạ tia X của vật liệu trong trường hợp 3 69
Hình 4.20: Giản đồ phân tích nhiệt của vật liệu trong trường hợp 1 70
Hình 4.21: Giản đồ phân tích nhiệt của vật liệu trong trường hợp 2 71
Hình 4.22: Giản đồ phân tích nhiệt của vật liệu trong trường hợp 3 72
Hình 4.23: Đường hấp phụ đẳng nhiệt a) mô hình BET, b) Langmuir của vật liệu
trường hợp 1 73

Hình 4.24: Đường hấp phụ đẳng nhiệt của vật liệu tổng hợp theo trường hợp 2 theo
mô hình BET (a), mô hình Langmuir (b) 74

Hình 4.25: Đường đẳng nhiệt hấp thụ của vật liệu ở trường hợp 3 75
Hình 4.26: Sự phân bố kích thước lỗ theo phương pháp DUBININ – ASTAKHOV
(DA) 76

Hình 5.1: Mô hình hóa cấu trúc vật liệu về mặt lý thuyết bằng phần mềm crystal
maker 77

Hình 5.2. Cấu trúc đơn tinh thể của vật liệu tổng hợp ở trường hợp 3 78




8

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 2.1: Cấu trúc khung hữu cơ kim loại nghiên cứu theo từng năm 14
Hình 2.2: Đường biểu diễn quá trình nghiên cứu vật liệu cấu trúc khung lỗ xốp có
kích thước micro 15

Hình 2.3: Sự tạo thành góc liên kết giữa nguyên tử kim loại chuyển tiếp - phân tử
hữu cơ imidazol - nguyên tử kim loại chuyển tiếp 16

Hình 2.4: Các loại imidazol dùng trong tổng hợp ZIF. 17
Hình 2.5: Một số loại ZIF đã được tổng hợp được trong phòng thí nghiệm của
Omar Yaghi 17

Hình 2.6: Mối liên hệ giữa diện tích bề mặt và kích thước lỗ xốp trong vật liệu ZIFs
18

Hình 2.7: a) Sự trùng ngưngcủa axít boronic thành boroxine anhydride. 19
b) Sự trùng ngưng của axít diboronic tạo thành COF-1. 19
Hình 2.8:Những phản ứng trùng ngưng của axít boric, axít diboronic được sử dụng
để tạo thành khung mạng COF mở rộng 20

Hình 2.9: Sự trùng ngưng tert-butylsilan triol A vớiaxít boronic B tạo thành khung
borosilicat C. Sự trùng ngưng A với D tạo thành E với nguyên tử Bo xảy ra ở đỉnh
của ba góc liên kết với nhau tạo thành khối tetraheral D cho ra COF-202 F 21

Hình 2.10: Mô hình liên kết giữa cầu nối hữu cơ với ion kim loại tạo thành vật liệu
MOF 22

Hình 2.11: Các cầu nối hữu cơ dùng trong tổng hợp MOF 23
Hình 2.12: Mô hình hóa cluster dùng trong tổng hợp MOF 24
Hình 2.13: Cluster của ion kim loại có cấu trúc tứ diện liên kết với cầu nối hữu cơ
có 1 tâm phối trí, cấu trúc MOF tạo thành sẽ có dạng cơ bản như mạng tinh thể kim

cương 25

Hình 2.14: Cluster của ion kim loại có cấu trúc bát diện liến kết với cầu nói hữu cơ
có 2 tâm phối trí, cấu trúc MOF tạo thành sẽ có dạng cơ bản như mạng lập phương
26

Hình 2.15: Các loại axít dicarboxylic dùng cho quá trình tổng hợp 27

9

Hình 2.16: Axít Trimesic (axít 1,3,5-benzentricarboxylic) dùng trong tổng hợp
HKUST-1 28

Hình 2.17: MOF(HKUST-1) được tạo thành với các rãnh hình vuông có đường
kính 10 Å 28

Hình 2.18: Axít 2,5-dihydroxyterephthalic dùng trong tổng hợp COP-27 29
Hình 2.19: Cấu trúc COP-27 có các rãnh đường kính 10 Å với tâm là Co (màu
hồng), các nguyên tử carbon (màu xám), các nguyên tử oxi có tính chất hấp thụ vật
lý với nước (màu đỏ) 29

Hình 2.20: Mô tả sự tạo thành MOF từ ion cluster kim loại với cầu nối hữu cơ có
góc liên kết khác nhau 30

Hình 2.21: Mô hình hóa cách tạo liên kết bên trong cấu trúc MOF-5 31
Hình 2.22: Sự tạo thành cấu trúc ba chiều trong tinh thể MOF-5. 32
a) Cấu trúc MOF-5 được tạo thành từ cluster Zn
4
O liên kết với benzen1,4-
dicarboxylat tạo thành khung mạng lập phương. 32


b) Cấu trúc MOF-5 được mô hình hóa dưới dạng cầu và que. 32
c) Cấu trúc MOF-5 được bao bọc cluster (OZn
4
)O
12
với ion benzen1,4-
dicarboxylat 32

Hình 2.23: Biểu diễn cấu trúc không gian tạo thành MOF-177. 33
a) Một phân tử 1,3,5-tribenzenbezoat liên kết với 3 cluster Zn
4
O. 33
b) Hình chiếu của cấu trúc MOF-177 xuống mặt [001]. 33
c) Một phần của cấu trúc từ một tâm của cluster Zn
4
O. 33
Hình 2.24: Các IRMOF được mô hình hóa 35
Hình 2.25: Mô hình hóa khả năng hấp thụ CO
2
của MOF-177 36
Hình 2.26: Mô tả sự lưu trữ khí H
2
của một số loại MOF 37
Hình 2.27: Sự lưu giữ khí CO
2
ở nhiệt độ phòng với các loại MOF khác nhau 37
Hình 2.28: Phản ứng Benzoic aldehyde với Me
3
SiCN sử dụng xúc tác Cd(II) 4,4’-

bipyridine ở 313K, 24 giờ, hiệu suất phản ứng 77% 38


10

Hình 2.29: Đường đẳng nhiệt của quá trình hấp/ giải hấp của ba vật liệu được
nghiên cứu ở nhiệt độ phòng (phần bên dưới). Từ trái sang phải phần ở trên là cấu
trúc của M-CPO-27 (M = Ni/Co), HKUST-1 và M-MIL-53 (M = Al/Cr). 39

Hình 3.1 : Sơ đồ mô tả các quá trình tổng hợp ligand AD 41
Hình 3.2 Quy trình hoạt hóa mẫu 44
Hình 4.1: Phổ NMR
1
H của sản phẩm sau 12 giờ phản ứng tại 50
o
C 45
Hình 4.2: Phổ hồng ngoại của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80
o
C 46
Hình 4.3: Phổ LC-MS của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80
o
C 47
Hình 4.4: Phổ
1
H-NMR của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80
o
C 48
Hình 4.5: Phổ
13
C-NMR của sản phẩm sau 3 giờ phản ứng tại 80

o
C 49
Hình 4.6: Công thức cấu tạo của axít azobenzen 4,4’-dicarboxylic a) dạng cis b)
dạng trans 50

Hình 4.7. Tinh thể tạo thành trong hỗn hợp AD (0,008 M)/Zn (0,002 M) trong dung
môi DMF, nhiệt độ 85
o
C. 51
Hình 4.8: Tinh thể tạo thành từ AD (0,002 M) và Zn, tỉ lệ AD/Zn a) 1 : 4; b) 1: 2; c)
1 : 1; d) 2 : 1, trong dung môi DMF, thời gian 2 ngày, nhiệt độ 85
o
C. 57
Hình 4.9: Tinh thể tạo thành từ AD và Zn (0,004 M), tỉ lệ (a) 1 : 3;(b )1 :1;(c)2 : 5;
(d)1 : 4), trong dung môi DMF, thời gian 3 ngày, nhiệt độ 85
o
C 58
Hình 4.10: Tinh thể tạo thành từ ligand AD (0,006 M) và Zn ở tỉ lệ (a) 1:1; 59
(b) 3 : 1;(c) 2 : 1, (d) 3 : 4, trong dung môi DMF, thời gian 2 ngày, nhiệt độ 90
o
C . 59
Hình 4.11: Tinh thể tạo thành từ AD và Zn (0,008 M), tỉ lệ (a) 1 : 1;(b) 3 : 1; 60
(c) 1 : 3, (d) 2 : 3, trong dung môi DMF, thời gian 1 ngày, nhiệt độ 95
o
C 60
Hình 4.12: Tinh thể tạo thành từ ligand AD (0,01 M) và Zn ở tỉ lệ (a) 1 : 3; 61
(b) 1 : 2; (c)1:1, (d) 3 :4, trong dung môi DMF, thời gian 1 ngày, nhiệt độ 90
o
C 61
Hình 4.13: Tinh thể MOF kết tinh trong DMF/DMSO = 5,5 : 0,5, với nồng độ AD :

0,01M, tỉ lệ AD/Zn = 1 : 1, sau 4 ngày dung môi nhiệt tại a) nhiệt độ 80
o
C, b) nhiệt
độ 90
o
C 63

11

Hình 4.14: Ảnh tinh thể tổng hợp ở nhiệt 90
o
C, nồng độ AD 0,01 M, tỉ lệ AD / Zn =
1 : 1, sau 1 ngày, pH của dung dịch 4,22 (a), 4,32 (b), 4,54(c), 4,75 (d), 4,85(e), 5,20
(f). 64

Hình 4.15:Ảnh hiển vi của vật liệu được tổng hợp trong điều kiện tỉ lệ nồng độ AD
0,01 M, tỉ lệ AD/Zn = 1 : 1, thời gian ủ nhiệt 5 ngày tại 80
o
C,tương ứng với giá trị
pH của dung dịch là 4,4 (a), 4,68 (b), 4,86(c), 5,02 (d), 5,25(e). 65

Hình 4.16: Nhiễu xạ tia X của vật liệu trong trường hợp 1 67
Hình 4.17: Nhiễu xạ tia X của axít azobenzen 4,4’-dicarboxylic 67
Hình 4.18: Phổ nhiễu xạ tia X của vật liệu trong trường hợp 2 68
Hình 4.19: Phổ nhiễu xạ tia X của vật liệu trong trường hợp 3 69
Hình 4.20: Giản đồ phân tích nhiệt của vật liệu trong trường hợp 1 70
Hình 4.21: Giản đồ phân tích nhiệt của vật liệu trong trường hợp 2 71
Hình 4.22: Giản đồ phân tích nhiệt của vật liệu trong trường hợp 3 72
Hình 4.23: Đường hấp phụ đẳng nhiệt a) mô hình BET, b) Langmuir của vật liệu
trường hợp 1 73


Hình 4.24: Đường hấp phụ đẳng nhiệt của vật liệu tổng hợp theo trường hợp 2 theo
mô hình BET (a), mô hình Langmuir (b) 74

Hình 4.25: Đường đẳng nhiệt hấp thụ của vật liệu ở trường hợp 3 75
Hình 4.26: Sự phân bố kích thước lỗ theo phương pháp DUBININ – ASTAKHOV
(DA) 76

Hình 5.1: Mô hình hóa cấu trúc vật liệu về mặt lý thuyết bằng phần mềm crystal
maker 77

Hình 5.2. Cấu trúc đơn tinh thể của vật liệu tổng hợp ở trường hợp 3 78



Luận văn Thạc sĩ


Trần Đức Thụy

1








MỞ ĐẦU

Luận văn Thạc sĩ


Trần Đức Thụy

2
Ngày nay công nghệ sinh học đang ngày càng phát triển, nó có vai trò quan
trọng và phục vụ đắc lực để cải thiện chất lượng cuộc sống của con người. Lĩnh vực
được quan tâm và đầu tư nhiều chất xám là y học - sinh học - thực phẩm nhằm tạo
ra các sản phẩm có lợi cho sức khỏe con người, phòng tránh bệnh tật Một trong
những sản phẩm đó là Galacto-oligosaccharide (GOS), chất được biết có khả năng
duy trì hệ tiêu hóa bình thường khỏe mạnh, đã và đang được nghiên cứu [17].
Trong công nghiệp chế biến phó-mát thì dịch sữa sau khi đông tụ là nguồn cơ
chất giàu lactose, có thể nghiên cứu dùng làm cơ chất tổng hợp GOS. Tuy nhiên để
tạo được GOS từ sữa thì cần phải có một enzym đặc hiệu. Ngày nay enzym beta-
galactosidase được biết có khả năng thủy phân lactose thành glucose và galactose,
đồng thời còn tạo ra các sản phẩm phụ là các GOS. Các GOS này không có giá trị
dinh dưỡng với con người, không được cơ thể con người hấp thụ nhưng lại được vi
khuẩn ở ruột già sử dụng, do đó các GOS này có tiềm năng để sản xuất prebiotic
[18].
Trên thế giới GOS đã được nghiên cứu và sản xuất thương mại, GOS được
thừa nhận và bổ sung vào thực phẩm ở châu Âu. Đã có nhiều chiến lược được đặt ra
để sản xuất GOS dạng công nhiệp. Từ những năm 1950 người ta đã biết được rằng
những oligosaccharide có thể được hình thành từ monosaccharide với xúc tác là các
acid vô cơ. Aronso đầu tiên đã thu được oligosaccharide khi thủy phân lactose trong
môi trường acid [3]. Do sản phẩm tạo ra thiếu sự đa dạng và ở điều kiện khắc nghiệt
khi dùng acid thủy phân lactose, con đường sản xuất GOS này đã không được dùng
trong công nghiệp. Một hướng khác để sản xuất GOS là sử dụng enzym glycosyl
transferase hoặc glycoside hydrolase [15]. Dù hiệu quả nhưng glycosyl transferase
không được dùng phổ biến trong sản xuất GOS do giá thương mại cao, mặt khác

phân tử đường cho trong phản ứng phải chứa nucleoside phosphate hoặc lipid
phosphate [13].
Hiện nay các glycoside hydrolase (GH) được sử dụng trong công nghiệp sản
xuất GOS. Lactose được xem là cơ chất tự nhiên của các enzym có hoạt tính beta-
galactosidase thuộc họ GH1 và GH2 [3]. Họ GH2 gồm hai loại beta-galacotosidase
Luận văn Thạc sĩ


Trần Đức Thụy

3
từ vi khuẩn, enzym beta-galactosidase được mã hóa bởi gen LacZ từ E.coli là một
trong hai loại đó [52].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng GOS thì chưa được rộng rãi trong
công nghiệp do thiếu nguồn enzym beta-galactosidase, với mục đích nhằm sản xuất
ra lượng lớn loại enzym beta-galactosidase có hoạt tính tạo GOS hiệu suất cao
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài này.
Về mặt khoa học, mục tiêu của đề tài nhằm nghiên cứu sản xuất beta-
galactosidase tái tổ hợp có hoạt tính bao gồm: tạo dòng E.coli tái tổ hợp biểu hiện
beta-galactosidase, lên men, xử lý tạo enzym có hoạt tính cao bằng nhiều phương
pháp khác nhau. Ý nghĩa thực tiễn mang lại là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ
lên men và công nghệ protein để tạo ra một loại enzym có hoạt tính thủy phân và
hiệu suất tạo GOS cao, ứng dụng trong lĩnh vực trị bệnh khó tiêu hóa lactose và làm
nguyên liệu cho sản xuất prebiotic, bổ sung vào sữa cho trẻ.
Tuy nhiên do thời gian làm luận văn bị hạn chế, đề tài này chỉ tập trung
nghiên cứu các vấn đề sau:
Tạo gen mã hóa beta-galactosidase bằng PCR với mồi đặc hiệu.
Tạo dòng gen mã hóa beta-galactosidase vào plasmid pTrcHisB trong E.coli
DH5α.
Cấu trúc chủng E.coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ

biểu hiện protein dung hợp với đuôi 6xHis ở dạng tan trong tế bào chất.
Thử khả năng thu hồi enzym 6xHis-betagalactosidase bằng hạt Ni-NTA.
Xác định hoạt tính enzym tái tổ hợp 6xHis-betagalactosidase thu được, xác
định pH, nhiệt độ tối ưu.
Thử khả năng sinh GOS của enzym tái tổ hợp 6xHis-betagalactosidase.
Luận văn Thạc sĩ


Trần Đức Thụy

4










Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận văn Thạc sĩ


Trần Đức Thụy

5
1.1. Enzym beta-galactosidase

1.1.1. Giới thiệu

Beta-galactosidases (beta-D-galactoside galactohydrolases [E.C.3.2.1.23]) là
một trong những enzym được biết rõ, ngày xưa nguồn enzym thu nhận chủ yếu từ
E.coli tuy nhiên nó còn phổ biến trong tự nhiên, được tìm thấy ở thực vật (quả hạnh,
đào, mơ, táo,…), cơ quan động vật, nấm men, nấm mốc và vi khuẩn [1].

Theo cấu trúc vật lý và nguồn gốc tiến hóa beta-galactosidases được xếp
trong 4 của gần 100 họ có hoạt tính GH (glycosyl hydrolases): GH1, GH2, GH35,
và GH42. Tuy nhiên chỉ một vài enzym thuộc họ GH1, GH2 xem lactose là cơ chất
tự nhiên, họ GH2 gồm 2 loại beta-galactosidases vi khuẩn: lacZ (E.coli) và beta-
galactosidases (nấm) [34].










Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của enzym beta-galactosidase thuộc nhóm
GH1 (lactococcus lactic/Pbg) và GH2 (gen LacZ của E.coli)

Một số beta-galactosidase mới, ngày nay đã được tạo dòng và/hoặc cô lập từ
những dòng vi khuẩn khác nhau [28]. Beta-galactosidase có cấu trúc đa dạng từ cấu
trúc bậc một đến cấu trúc bậc bốn sắp xếp theo khối lượng từ nhỏ đến lớn như
protein nhỏ monomeric của Thermus sp.A4 có Mr 75kDa [41] và oligomeric beta-
galactosidase của Thermus aquaticus YT-1 có Mr lớn hơn 700kDa [8]. Nhiều

Luận văn Thạc sĩ


Trần Đức Thụy

6
Hình 1.3. Cơ chế phản ứng chuyển nhóm tạo oligosaccharide của
beta-galactosidase

Phức hợp
β-Galactosidase-galactose
di hoặc oligosaccharide tách rời
khởi vị trí hoạt độngcủa β-
Galactosidase
mono hoặc disaccharide
nghiên cứu cho thấy pH tối ưu gần như khác nhau ở các loài: pH tối ưu của beta-
galactosidase thu từ nấm Aspergillus khoảng 2,5-4,5; của Kluyveromyces hoặc
Saccharomyces sp. thường từ 6,0-7,0; E. coli pH tối ưu thường từ 6,5-7,5.

1.1.2. Cơ chế

Beta-galactosidase đặc trưng thủy phân beta-D-galactosides và alpha-L-
arabinosides, enzym này cũng có khả năng xúc tác tổng hợp một vài
oligosaccharide theo phản ứng chuyển nhóm galactosyl [32].

Phức hợp β-Galactosidase-galactose +
glucose
Phân tử lactose ở vị trí hoạt động của β-galactosidase
+
Hình 1.2. Cơ chế phản ứng thủy phân lactose tạo glucose và galactose

Luận văn Thạc sĩ


Trần Đức Thụy

7
1.1.3. Cấu trúc beta-galactosidase nguồn gốc E.coli

Cùng có hoạt tính beta-galactosidase nhưng cấu trúc và khối lượng phân tử
của enzym thu từ nguồn vi sinh vật khác nhau thì khác nhau. Beta-galactosidase
E.coli là cấu trúc gồm bốn chuỗi đơn giống nhau, cấu tạo bởi 1023 acid amin. Gen
LacZ E.coli mã hóa enzym beta-galactose hoạt tính có khả năng xúc tác thủy phân
lactose, và thuộc nhóm GH2 [32].
1.1.4. Ứng dụng

Enzym beta-galactosidase được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực
phẩm: bánh nướng, công nhiệp rượu bia, công nghiệp bánh kẹo, sản xuất kem và
thực phẩm ăn kiêng. Ngoài ra enzym beta-galactosidase còn được ứng dụng trong
công nghiệp sữa, ứng dụng làm gen chỉ điểm trong tạo dòng [32].
1.1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất beta-galactosidase trong và ngoài nƣớc

Trên thế giới việc tạo dòng và nghiên cứu sản xuất enzym beta-galactosidase
đã được biết đến từ lâu. Gần đây, một vài công trình tiêu biểu của Petzelbauer and
others (2000), Hansson and Adlercreutz (2001), Splechtna and others (2001), Park
and others (2008), Petzelbauer and others (2002), Petzelbauer and others (2000b),
được trích dẫn trên các tạp chí quốc tế lớn cho thấy nguồn gen mã hóa beta-
galactosidase đã được phân lập từ các nguồn vi khuẩn khác nhau và được tạo dòng
và biểu hiện trong E.coli. Những kết quả báo cáo cho thấy những tác giả này đã xác
định được điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu và xác định được nồng độ lactose ban đầu
cần thiết để cho khả năng tạo GOS là cao nhất.
Ở Việt Nam chưa cho thấy có báo cáo kết quả tạo được beta-galactosidase
ứng dụng tạo GOS. Tuy nhiên đề tài “Nghiên cứu biểu hiện beta-galactosidase trong
E.coli” của tác giả Trần Văn Giang đăng trên tạp chí Đại Học Huế số 55 cho thấy
tác giả đã bước đầu tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa trong hệ plasmid pET-22b(+),
bước đầu xác định được thời gian cảm ứng thu enzym. Ngoài ra còn có công trình

nghiên cứu của PGS.TS Trương Nam Hải với đề tài cấp quốc gia “Nghiên cứu phân
Luận văn Thạc sĩ


Trần Đức Thụy

8
lập tuyển chọn và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym
beta-galactosidase có hiệu suất cao và ứng dụng trong thực phẩm” đã thành công
trong biểu hiện và xác định hoạt tính beta-galactosidase. Do những đề tài này biểu
hiện enzym tái tổ hợp trong hệ plasmid pET nên protein thu được đa phần nằm
trong dạng thể vùi dẫn đến gặp khó khăn trong việc thu hồi enzym có hoạt tính cao
ứng dụng trong qui mô công nghiệp sau này. Kế thừa những thành quả đạt được
chúng tôi đưa ra mục tiêu sẽ tạo dòng và biểu hiện một protein dung hợp với
6xhistidine phục vụ trong công việc thu hồi, quan trọng hơn protein này được biểu
hiện dưới hệ promoter Ptrc là một promoter dạng lai giữa trp-lac promoter, cho
phép biểu hiện mức cao protein nhưng không quá mạnh để tạo thể vùi. Chúng tôi hy
vọng sẽ thu hồi được enzym dạng thể tan trong tế bào chất của chủng E.coli được
dùng biểu hiện. Enzym thu nhận được sẽ được xác định hoạt tính, kiểm tra điều kiện
nhiệt độ và pH tối ưu và dựa trên cơ sở đó cho thử nghiệm tạo GOS. Đây là hướng
mới của đề tài so với những công trình trên.
1.2. Lactose

Lactose (β-D-galactopyranosyl-(1 →4)- α-D-glucopyranose) là một disac-
charide hiện diện trong sữa của tất cả các động vật có vú, trừ vài trường hợp ngoại
lệ, tỷ lệ trong sữa khoảng từ 2,0% đến 10% (w/v). Với sữa bò thì lactose trung bình
khoảng từ 4,4% và 5,2% [23]. Trong sản xuất phó-mát, gần như các lactose có trong
sữa nằm lại trong dịch nước sữa, dịch này trước đây thường được đổ bỏ rất lãng phí.
Ngày nay dịch thải này được sử dụng vừa mang lại hiệu quả kinh tế đồng thời tránh
gây ô nhiễm môi trường. Dịch sữa có thể được sấy khô để sản xuất các loại bột sữa

khác nhau hoặc dùng công nghệ màng để sản xuất những sản phẩm protein sữa
chứa lactose [22], [33].

Phương pháp chung cho sản xuất số lượng lớn lactose trực tiếp từ dịch sữa là
tinh thể hóa ở trạng thái dung dịch quá bão hòa. Trong năm 2006, khoảng 870,000
tấn lactose tinh thể đã được sản xuất trên toàn thế giới và dự tính sẽ tăng khoảng 3-
5% mỗi năm cho đến năm 2010 [4], [54]. Lactose có nhiều ứng dụng rộng rãi trong