khảo sát tính chất methyl hóa bất thường trên gen brca1 và p16ink4a trên bộ mẫu ung thư vú ở việt nam phân tích tổng hợp khảo sát thực nghiệm

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.68 MB, 70 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT METHYL HĨA BẤT THƯỜNG

TRÊN GEN BRCA1 VÀ P16

INK4A

TRÊN BỘ MẪU UNG THƯ

VÚ Ở VIỆT NAM: PHÂN TÍCH TỔNG HỢP & KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

CBHD: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. TRƯƠNG KIM PHƯỢNG SVTH: NGUYỄN THỊ HOÀNG TRINH MSSV: 1553010224

KHĨA: 2015

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2019

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT METHYL HĨA BẤT THƯỜNG

TRÊN GEN BRCA1 VÀ P16

INK4A

TRÊN BỘ MẪU UNG THƯ

VÚ Ở VIỆT NAM: PHÂN TÍCH TỔNG HỢP & KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

CBHD: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. TRƯƠNG KIM PHƯỢNG SVTH: NGUYỄN THỊ HỒNG TRINH MSSV: 1553010224

KHĨA: 2015

GVHD ký xác nhận

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2019

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

1

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin kính gửi đến tất cả Quý Thầy Cô đang dạy, làm việc tại khoa Công nghệ Sinh học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh và Q Thầy Cơ chun ngành Công nghệ Sinh học Y dược đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian qua.

Đặc biệt, em xin cảm ơn PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy và ThS. Trương Kim Phượng đã hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo em không chỉ những kiến thức chun mơn mà cịn tinh thần nghiên cứu nghiêm túc và làm việc hiệu quả trong suốt quá trình thực hiện thực tập tốt nghiệp. Do trình độ chun mơn cũng như kinh nghiệm thực tiễn của em còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp từ Thầy Cơ để em có cơ hội nâng cao kiến thức chun mơn và hoàn thiện bản thân.

Xin gửi lời cảm ơn đến các anh (chị), bạn bè đã luôn theo sát, giúp đỡ, chia sẻ nhiều kinh nghiệm cho em.

Sau cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cha Mẹ đã ni dưỡng, dạy bảo để con có được ngày hơm nay.

Em xin kính chúc Q Thầy (Cơ), gia đình và bạn bè thật nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành công trong cuộc sống.

Xin Chân Thành Cảm Ơn!

Bình Dương, tháng 5 năm 2019 Sinh viên

Nguyễn Thị Hoàng Trinh

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

i

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

BRCA1 Breast cancer type 1

DCIS Ductal carcinoma in situ

P16INK4a Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A

QMSP Quantiative Methylation specific Polymerase chain reation RT-PCR Real time _ Polymerase Chain Reaction

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng II. 1 Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi Nested-MSP nhằm xác định tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu ... 12 Bảng III. 1 Đặc điểm bộ dữ liệu ung thư vú trong phân tích tổng hợp tính chất

methyl hóa gen BRCA1 ... 19

Bảng III. 2 Đặc điểm của bộ dữ liệu 11 công bố ca chứng về tính chất methyl hóa

trên vùng promoter gen p16INK4a ... 23 Bảng III. 3 Chỉ số tỷ suất chênh (OR) phản ánh sự tương quan giữa tính chất

methyl hóa gen BRCA1và p16INK4a và bệnh ung thư vú ... 31

Bảng III. 4 Chỉ số tỷ suất chênh (OR) về tính chất methyl hóa gen BRCA1và

p16INK4a trên bệnh ung thư vú (tiếp theo) ... 32 Bảng IV. 1 Thơng tin bộ mồi khảo sát tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu ... 36 Bảng IV. 2 Thông số vật lý của bộ mồi đặc hiệu trên vùng promoter gen mục tiêu 37 Bảng IV. 3 Vị trí bắt cặp của bộ mồi Nested-MSP xác định tính chất methyl hóa trên trình tự promoter gen BRCA1và P16INK4a ... 38

Bảng IV. 4 Tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen BRCA1 trên một số mẫu

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình I. 1 Vị trí gen BRCA1 trên nhiễm sắc thể số 17 ... 3

Hình I. 2 Ví trí gen p16INK4a trên nhiễm sắc thể số 9 (NCBI) ... 3 Hình II. 1 Sơ đồ quy trình Nested-MSP phân tích tính chất methyl hóa vùng

promoter gen mục tiêu ... 8 Hình II. 2 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Nested-MSP ... 12 Hình III. 1 Quy trình chọn lọc bài báo trong phân tích tổng hợp trên gen BRCA1 và p16INK4a ... 14 Hình III. 2 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số tỷ suất chênh(OR) của tính chất

methyl hóa trên gen BRCA1 trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 18

nghiên cứu ca chứng ... 20 Hình III. 3 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số nguy cơ (RR) của tính chất methyl

hóa trên gen BRCA1 trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 18 nghiên cứu

ca chứng ... 21 Hình III. 4 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số tỷ suất chênh (OR) của bộ dữ liệu 18 công bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen BRCA1

... 22 Hình III. 5 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số nguy cơ (RR) của bộ dữ liệu 18 công bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen BRCA1 .... 22

Hình III. 6 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số tỷ suất chênh(OR) của tính chất

methyl hóa trên gen p16INK4a trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 11 nghiên cứu ca chứng ... 24 Hình III. 7 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số nguy cơ (RR) của tính chất methyl

hóa trên gen p16INK4a trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 11 nghiên cứu ca chứng ... 25 Hình III. 8 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số tỷ suất chênh (OR) của

bộ dữ liệu 18 công bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen p16INK4a. ... 26

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

iv

Hình III. 9 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số nguy cơ (RR) của bộ

dữ liệu 18 công bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen p16INK4a. .. 26

Hình IV. 1 Vùng promoter trên gen BRCA1 ... 33

Hình IV. 2 Vị trí hoạt động của cặp mồi nested-MSP trên gen BRCA1 ... 34

Hình IV. 3 Vùng promoter trên gen p16INK4a ... 34

Hình IV. 4 Vị trí hoạt động của cặp mồi nested-MSP trên gen p16INK4a ... 35

Hình IV. 5 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng Nested-MSP trên gen BRCA1 trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú. ... 40

Hình IV. 6 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng Nested-MSP trên gen p16INK4a trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú. ... 44

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

vi

MỤC LỤC

I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ... 1

I.1. Ung thư vú ... 1

I.2. Epigenetics ... 2

I.3. Sự methyl hóa DNA (DNA Methylation) ... 2

I.4. Đảo CpG ... 2

I.5. Dấu chứng sinh học (Biomarker) ... 3

I.6. Tổng quan gen ... 3

I.6.1 Gen BRCA1(Breast cancer type 1) ... 3

I.6.2 Gen p16INK4a(Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) ... 3

I.7. Tình hình nghiên cứu tính chất methyl hóa gen BRCA1 và p16INK4a trên bệnh ung thư vú ... 4

I.8. Phương pháp phân tích tổng hợp ... 5

I.9. Phương pháp MSP và Nested - MSP liên quan tính chất methyl hóa DNA ... 6

II. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP ... 7

II.1. Vật liệu... 7

II.2. Phương pháp nghiên cứu ... 7

III. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ... 14

III.1.Kết quả khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp về sự ... 14

III.2.Kết quả phân tích tổng hợp ... 15

IV. KHẢO SÁT TRÊN MÁY TÍNH ... 33

IV.1.Dữ liệu vùng gen mục tiêu BRCA1 và p16INK4a ... 33

IV.2. Khảo sát bộ mồi trong quy trình MSP ...37

IV.3. Kết quả thực nghiệm khảo sát tính chất methyl hóa vượt mức vùng promoter gen BRCA1 và gen p16INK4a trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú. ... 39

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

vii

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo số liệu thống kê của Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization – WHO, 2018), ung thư vú đứng vị trí thứ hai trong danh sách bệnh lý ung thư gây tử vong ở phụ nữ. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 2,1 triệu trường hợp ung thư vú mới được chẩn đốn và vào năm 2018 có khoảng 670.000 trường hợp tử vong do mắc ung thư vú

(Ghonche et al., 2016; WHO, 2018). Tổ chức y tế thế giới ghi nhận Việt Nam có

khoảng 15.229 trường hợp ung thư vú mới được phát hiện vào năm 2018 (WHO, 2018). Cho đến nay, có nhiều cơng trình nghiên cứu ghi nhận tính chất methyl hóa vượt mức

trên gen BRCA1, p16INK4a là dấu chứng sinh tiềm năng, ứng dụng trong tiên lượng và

chẩn đoán sớm đối với bệnh lý ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư đại thực tràng, ung thư vú và ung thư vòm họng,...( Tuo et al., 2018; Sobanski et al., 2018; Guo et al., 2017; Li et al., 2015; Cavanagh et al., 2015; Hutajulu et al., 2011; Jing et al., 2010). Cụ thể, hướng nghiên cứu tính chất methyl hóa bất thường xảy ra trên vùng

promoter gen người đã và đang được triển khai ở nhiều quốc gia. Điển hình là hướng nghiên cứu tính chất methyl hóa bất thường xảy ra trên vùng promoter gen kiểmsoát cơ chế sinh ung.

Gen BRCA1 (Breast cancer type 1) là gen ức chế khối u, nằm trên nhiễm sắc thể 17q21.31, gồm 24 exon (NCBI, gencard). BRCA1 đóng vai trị trong quá trình sửa chữa DNA, tái tổ hợp, kiểm soát chu kỳ tế bào và phiên mã (Zhang et al., 2015).

Cơng trình nghiên cứu của Yadav và cộng sự (2018) xác định tần số methyl hóa bất

thường trên gen BRCA1 là 55% trên tổng 60 mẫu bệnh phẩm ung thư vú. Cơng trình

nghiên cứu của Li và cộng sự (2015) phân tích tính chất methyl hóa trên gen BRCA1

bằng phương pháp MSP (Methylation-specific PCR). Kết quả nghiên cứu xác định tần

số methyl hóa bất thường trên gen BRCA1 là 49% trong 80 mẫu bệnh phẩm ung thư vú. Gen p16INK4a (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, CDKN2A) là một gen ức chế khối u, nằm trên nhiễm sắc thể 9p21.3, gồm 8 exon (NCBI, gencard). Gen p16INK4a

(CDKN2A) mã hóa protein p16INK4a tham gia vào cơ chế kiểm sốt chu trình tế bào, tại

giai đoạn chuyển từ pha G1 đến pha S (Liggett et al., 1998). P16INK4a liên kết với CDK4/6, tạo thành phức hợp xúc tác dẫn đến sự phosphoryl hóa protein

retinoblastoma (pRb) và dẫn đến bất hoạt chức năng pRb (Liggett et al., 1998; Rayess

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

viii

et al., 2012). Cơng trình nghiên cứu của Wu và cộng sự (2016), Lee và cộng sự (2012)

sử dụng phương pháp MSP để xác định tính chất methyl hóa bất thường trên gen

p16INK4a trên bộ mẫu ung thư vú. Các kết quả nghiên cứu này ghi nhận tần số methyl

hóa trên gen p16INK4a lần lượt 34,5% trên tổng 200 mẫu bệnh phẩm và 40% trên tổng 70 mẫu bệnh phẩm ung thư vú.

Kế thừa kết quả nghiên cứu của Thầy Cô Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh về hướng nghiên cứu tính chất methyl

hóa trên các gen có vai trị đè nén u đối với bệnh ung thư vú,..(Truong et al., 2014;

Truong et al., 2015), chúng tơi thực hiện chun đề khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát

tính chất methyl hóa bất thường trên gen BRCA1 và p16INK4a trên bộ mẫu ung thư vú ở Việt Nam: phân tích tổng hợp & khảo sát thực nghiệm”

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hố bất thường trên vùng promoter gen

BRCA1 và p16INK4a ở bệnh ung thư vú trên thế giới và tại Việt Nam, tập trung vào nội dung phân tích tổng hợp và khảo sát thực nghiệm bằng phương pháp MSP với một số mẫu mô vú của người Việt Nam

Nội dung nghiên cứu

− Phân tích tổng hợp: xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hóa vượt mức

trên vùng promoter gen BRCA1 và p16INK4a và bệnh ung thư vú, dựa vào phương pháp xác định chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio).

− Khảo sát trên máy tính: cập nhật thông tin dữ liệu khảo sát bộ mồi phù hợp với quy trình Nested - MSP xác định tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen BRCA1 và p16INK4a đối với một số mẫu bệnh phẩm ung thư vú.

− Khảo sát thực nghiệm: thực hiện quy trình Nested - MSP để xác định tính chất

methyl hóa trên vùng promoter gen BRCA1 và p16INK4a đối với một số mẫu bệnh phẩm (mẫu mô vú) của người Việt Nam.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

1

I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

I.1. Ung thư vú

Ung thư vú là ung thư đứng vị trí thứ hai trong nhóm bệnh lý ung thư thường gặp và

gây tử vong cao đối với phụ nữ (WHO, 2018; Bray et al., 2018). Theo báo cáo của

Ghonche và cộng sự (2016) và số liệu của Tổ chức y tế thế giới (2018), tổng số trường hợp mắc ung thư vú được chẩn đoán là 2,1 triệu người và tổng số trường hợp bị tử vong do mắc bệnh ung thư vú là 670.000 người. Tính riêng ở Việt Nam, năm 2018 có khoảng 15.229 trường hợp ung thư vú mới được phát hiện (WHO, 2018).

Ung thư vú khởi phát từ sự tăng trưởng mất kiểm sốt của tế bào biểu mơ thuộc ống dẫn

sữa hoặc các thùy tuyến vú (Reilly et al., 2007). Có nhiều yếu tố dẫn đến ung thư vú,

bao gồm những biến đổi bất thường về di truyền (đột biến, “epigenetics”), rối loạn về nội tiết tố hoặc do các thói quen tiêu cực trong đời sống: uống rượu, chế độ ăn uống mất cân bằng dinh dưỡng, sử dụng thực phẩm nhiều chất béo, ít vận động...

(Damdamudi et al., 2018).

Hiện nay, các dạng ung thư vú bao gồm ung thư vú không xâm lấn (non-invasive breast cancer), ung thư vú xâm lấn (invasive breast cancer), ung thư tiểu thùy tại chỗ (LCIS-lobular carcinoma in situ), ung thư ống dẫn sữa tại chỗ (DCIS-Ductal carcinoma in situ), ung thư ống dẫn sữa xâm lấn (IDC-Infiltrating ductal carcinoma), ung thư biểu mô dạng tủy (medullary carcinoma), ung thư biểu mô dạng nhày (mutinous carcinoma), ung thư biểu mô dạng ống (Tubular carcinoma), ung thư vú dạng viêm (Inflammatory breast cancer), bệnh paget núm vú (Paget’s disease of the

nipple), bướu diệp thể vú (Phylloides tumor) (Sharma et al., 2010). Trong đó, ung thư

ống dẫn sữa tại chỗ (DCIS-Ductal carcinoma in situ) và ung thư tiểu thùy tại chỗ

(LCIS-lobular carcinoma in situ) là các dạng ung thư vú thường gặp (Reilly et al.,

2007).

Một số dạng bệnh lý khác xảy ra ở tuyến vú ở dạng lành tính nhưng là yếu tố nguy cơ dẫn đến sự khởi phát và diễn tiến ung thư vú, gồm có: tật thiếu núm vú, phì đại tuyến vú, áp xe vú, lao tuyến vú, hoại tử mỡ và các dạng bệnh lý liên quan

đến sự loạn sản các tế bào trong tuyến ống dẫn sữa hoặc nang vú: xơ nang tuyến vú,

nang vú; u nhú trong ống dẫn sữa; giãn ống tuyến sữa, u xơ tuyến, u mỡ,

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

đến các thế hệ tế bào con (Bob Weinhold et al., 2006) bao gồm: sự methyl hóa DNA

(DNA methylation), in dấu gen, biến đổi histone. Các cơ chế này liên quan đến sự bất hoạt hoặc kích hoạt sự phiên mã gen chức năng hoặc phong bế sự sinh tổng hợp protein…(Tchurikov., 2005).

I.3. Sự methyl hóa DNA (DNA Methylation)

Sự methyl hóa DNA thuộc nhóm cơ chế epigenetics, là quá trình gắn bổ sung một nhóm methyl (CH3) vào vị trí C5 của cytosine tạo thành 5-methylcytosine. Sự methyl hóa DNA thường xảy ra trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen trong bộ gen tế

bào động vật và trong tế bào người, làm ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen (Moore et al., 2013; Virani et al., 2012; Jin et al., 2011). Hơn sự methyl hóa DNA diễn ra tại các cặp

dinucleotide CpG trong tế bào sinh dưỡng và có thể xảy ra trong tế bào gốc

(ESCs-embryonic stem cells) (Jin et al., 2011).

Sự methyl hóa DNA được xúc tác bởi enzyme DNA methyltransferases (DNMTs), giúp chuyển nhóm methyl từ S - adenyl methionine (SAM) vào vị trí carbon thứ năm

của cytosine tạo thành 5-methylcytosine (5mC) (Moore et al., 2013).

Sự methyl hóa DNA giữ vai trị kiểm soát sự biểu hiện gen và cấu trúc nhiễm sắc thể trong các tế bào Eukaryote (AKM., 2016). Sự methyl hóa DNA bất thường có thể là nguyên nhân dẫn đến các bệnh lý ung thư, mặc dù không liên quan đến đột biến trên

gen hoặc thiếu hụt enzyme DNMT (Jin et al., 2011). Sự methyl hóa DNA bất thường

gồm có giảm methyl hóa (hypomethylation DNA) và tăng methyl hóa (hypermethylation DNA) xảy ra trải dài trên toàn bộ nhiễm sắc thể hoặc chỉ xuất hiện

cục bộ trên vùng đảo CpG (CGIs-CpG island) (Jin et al., 2011)

I.4. Đảo CpG

Đảo CpG là vùng trình tự DNA có chiều dài từ 300 đến 3000 bp, với tỷ lệ dinucleotide

CpG lớn hơn 50% và có thể tỷ lệ CpG/GpC lớn hơn 0,6 (Long et al., 2017). Trên bộ

gen người, ước tính có khoảng 29.000 đảo CpG và phân bố không đều, thường tập

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

3

trung trên vùng promoter gen giữ nhà (housekeeping gene) hoặc một số gen giữ vai trò điều hòa hoạt động tế bào (Goldman., 2001; Bird., 2002).

I.5. Dấu chứng sinh học (Biomarker)

Dấu chứng sinh học là các dạng phân tử sinh học hiện diện trong máu, chất dịch cơ thể, hoặc trong mơ biểu thị tình trạng bình thường hay bất thường của tế bào hoặc mô ở cấp độ gen, protemic, metabolomic, liên quan đến một số dạng bệnh lý ung thư,…

(NCI-National Cancer Institute; Henry et al., 2012). Hiện nay, dấu chứng sinh học

được ứng dụng trong tiên lượng, chẩn đoán ung thư và đánh giá đáp ứng điều trị, theo

dõi tiến triển của các bệnh lý ung thư (Henry et al., 2012).

I.6. Tổng quan gen

I.6.1 Gen BRCA1(Breast cancer type 1)

Hình I. 1 Vị trí gen BRCA1 trên nhiễm sắc thể số 17

(

Gen BRCA1 (Breast cancer type 1) là một gen ức chế khối u nằm trên nhiễm sắc thể 17q21.31, gồm 24 exon (NCBI, gencard). BRCA1 đóng vai trị trong q trình sửa chữa DNA, tái tổ hợp, kiểm soát chu kỳ tế bào và phiên mã (Zhang et al., 2015).

I.6.2 Gen

p16

INK4a(Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)

Hình I. 2 Ví trí gen p16INK4a trên nhiễm sắc thể số 9 (NCBI)

(

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

4

Gen p16INK4a còn được gọi là CDKN2A (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), là gen ức chế khối u nằm trên nhiễm sắc thể số 9 (9p21.3), gồm 8 exon. Gen p16INK4a

(CDKN2A) mã hóa protein p16

INK4a

(CDKN2A) tham gia vào cơ chế kiểm sốt chu

trình tế bào, tại giai đoạn chuyển từ pha G1 đến pha S (Liggett et al., 1998). P16INK4a liên kết với CDK4/6, tạo thành phức hợp xúc tác dẫn đến sự phosphoryl hóa protein

retinoblastoma (pRb) và dẫn đến bất hoạt chức năng pRb (Liggett et al., 1998; Rayess et al., 2012). Hệ quả là giải phóng E2F và kích hoạt sự phiên mã gen, tham gia kiểm sốt chu trình tế bào theo hướng dẫn đến tiến trình G1sang S (Liggett et al., 1998; Nielsen et al., 1998). Do đó, sự bất hoạt chức năng của gen p16INK4a hoặc biểu hiện quá

mức của CDK4 có thể thúc đẩy quá trình hình thành khối u (Nielsen et al., 1998).

I.7. Tình hình nghiên cứu tính chất methyl hóa gen BRCA1 và p16INK4a

trên bệnh ung thư vú

Cho đến nay, có nhiều cơng bố khoa học về hướng nghiên cứu tính chất methyl hóa

trên gen BRCA1 và p16INK4a đối với bệnh lý ung thư vú ở nhiều quốc gia trên thế giới. Đa số các cơng trình nghiên cứu này đều ứng dụng phương pháp MSP để xác định tần số methyl hóa bất thường trên gen mục tiêu.

− Xét trên gen BRCA1:

Công bố của Wu và cộng sự (2016) cho thấy tần số methyl hóa trên gen BRCA1là 24%

trên 70 mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở Trung Quốc. Tiếp đến, công bố khoa học của

Hassan và cộng sự (2017); Yadav và cộng sự (2018) ghi nhận tần số methyl hóa trên

gen BRCA1lần lượt là 55% và 68% trên 60 và 75 mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở Ấn Độ.

− Xét trên gen p16INK4a:

Công bố khoa học của Cavusoglu và cộng sự (2010) cho thấy tần số methyl hóa trên

gen p16INK4a là 24,16% trên 62 mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở Thổ Nhĩ Kỳ. Tiếp theo,

nghiên cứu của Lee và cộng sự (2012) ghi nhận tần số methyl hóa trên gen p16INK4a là 34,5 % trên 200 mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở Hàn Quốc. Song song với việc phân tích

trên gen BRCA1, cơng bố khoa học của Wu và cộng sự (2016) xác định tần số methyl hóa trên gen p16INK4a là 40% trong 70 mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở Trung Quốc. Một số dữ liệu khoa học nêu trên cho thấy xu hướng nghiên cứu về tính chất methyl

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

5

hóa trên nhóm gen ức chế sinh ung (tumour suppressor gene), gen điều hịa chu trình tế bào (cell cycle regutation gene) đã và đang được phát triển. Hướng nghiên cứu này có thể chuyên sâu vào việc xác định dấu chứng sinh học tiềm năng và thiết lập các công cụ sinh học phân tử phù hợp, hiệu quả trong tiên lượng, chẩn đoán sớm các bệnh lý ung thư, cụ thể là ung thư vú. Điều quan trọng hơn nữa, tính khơng đồng nhất (tính

biến thiên) về tần số methyl hóa trên gen BRCA1, p16INK4a đối với bệnh ung thư vú ở các quần thể bệnh nhân khác nhau. Đây là cơ sở khoa học để chúng tơi thực hiện nội dung phân tích tổng hợp và quy trình thực nghiệm để cập nhật dữ liệu phản ánh sự

tương quan giữa tính chất methyl hóa trên gen BRCA1, p16INK4a và bệnh lý ung thư vú trên thế giới và ở Việt Nam.

I.8. Phương pháp phân tích tổng hợp

Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) được thực hiện chủ yếu dựa vào phương pháp thống kê, liên quan đến các nghiên cứu thực chứng và nghiên cứu dịch tễ học. Phân tích tổng hợp giúp xác định, đánh giá một cách hệ thống về sự biểu thị một biến số/chỉ số dựa trên các kết quả nghiên cứu khác nhau, độc lập của các công bố khoa học

(Mead et al., 1995). Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) được xem là “studying the studies” (Mead et al., 1995), do đó bước tiên quyết là trích xuất dữ liệu dựa trên các

tiêu chuẩn, điều kiện định sẵn và phải đảm bảo kết quả chính xác với độ tin cậy cao (Confidence Interval: 95%CI) so với phương pháp phân tích, đánh giá dữ liệu truyền

thống (Haidich et al., 2010). Trong q trình phân tích tổng hợp, một số bước cơ bản

cần được thực hiện như sau:

− Đặt nghi vấn (câu hỏi, từ khóa) giúp giải quyết các vấn đề phân tích tổng hợp (dựa theo PICO_Participant-Intervention-Comparator-Outcomes);

− Tìm kiếm cơng bố khoa học dựa trên các cơ sở dữ liệu: Pubmed/Medline, Google Scholar,...;

− Đọc tóm tắt và tiêu đề của các cơng bố khoa học;

− Chọn lọc và trích xuất dữ liệu của các công bố khoa học dựa trên nội dung tồn văn;

− Xác định tính chất bất đồng nhất (I2 – Index of heterogeneity) của bộ dữ liệu;

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

6

− Đánh giá biến số dựa vào phương pháp thống kê với chỉ số tỷ suất chênh Odds ratio (OR), sử dụng mơ hình ảnh hưởng bất biến “Fixed effects model” hoặc mơ hình ảnh hưởng ngẫu nhiên “Random effects model” và xây dựng đồ thị “Forest plot”;

− Xác định tính thiên vị với đồ thị “Funnel plot”;

− Tiến hành chia nhóm phân tích và kiểm tra kết quả phân tích tổng hợp.

I.9. Phương pháp MSP và Nested MSP liên quan tính chất methyl hóa DNA

− Phương pháp Methylation specific PCR (MSP)

Phương pháp Methylation – specific PCR (MSP) là phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA trên đảo CpG, dựa trên nguyên tắc của PCR (Polymerase chain

reaction) được thực hiện đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả (Derks et al., 2004; Garibyan et al., 2013). Nguyên tắc của MSP tiến hành với hai cặp mồi đươc thiết kế đặc hiệu khuếch đại trình tự DNA đã được biến đổi bisulfite (Herman et al., 1996; Derks et al., 2004). Một cặp mồi khuếch đại đặc hiệu trình tự DNA khơng bị methyl

hóa và một cặp mồi methyl hóa khuếch đại đặc hiệu với trình tự DNA bị methyl hóa

(Derks et al., 2004).

− Phương pháp Nested Methylation specific PCR (Nested-MSP)

Phương pháp Nested-MSP được cải tiến từ phương pháp MSP, cho phép tăng độ nhạy

và độ đặc hiệu so với phản ứng MSP (Rahman et al., 2013). Nguyên tắc của phương

pháp Nested-MSP dựa vào ba cặp mồi được thiết kế đặc hiệu khuếch đại trình tự DNA

đã được biến đổi bisulfite (Rahman et al., 2013). Trong phản ứng thứ nhất, cặp mồi

thứ nhất khuếch đại trình tự gen mục tiêu (vùng promoter chứa đảo CpG) nhưng không phân biệt trạng thái bị methyl hóa hoặc khơng bị methyl hóa. Trong hai phản ứng tiếp theo sử dụng sản phẩm của phản ứng thứ nhất, phản ứng thứ hai sử dụng một cặp mồi khuếch đại đặc hiệu trình tự DNA khơng bị methyl hóa, phản ứng thứ ba sử

dụng một cặp mồi khuếch đại đặc hiệu trình tự DNA bị methyl hóa (Rahman et al.,

2013).

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

7

II. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP II.1. Vật liệu

Chúng tôi sử sụng một số phần mềm và các công cụ trực tuyến: - Phần mềm Excell

- Phần mềm MedCalc v18

- NCBI ( - Gencard ( - Google (

- BLAST ( - MethPrimer (http://www. urogene.org/methprimer/)

II.2. Phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp

Chúng tôi tập trung thực hiện các nội dung nghiên cứu như sau:

(1). Tìm kiếm, thu thập dữ liệu khoa học (Bài báo khoa học) trên nguồn cơ sở dữ liệu của PubMed hoặc PubMed Central (National Center for Biotechnology

Information–NCBI), Google,…với một số từ khóa: BRCA1, p16INK4a, DNA methylation, breast cancer,…

(2). Thực hiện các bước cơ bản trong quy trình phân tích tổng hợp đã đề cập ở nội dung 1.7. Trong bước trích xuất dữ liệu, chúng tơi tập trung các tiêu chí nhằm khai thác thơng tin về tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen mục tiêu

BRCA1, p16INK4a trên bộ mẫu ung thư vú/bộ mẫu lành trên thế giới; phương

pháp sinh học phân tử (MSP, MS-HRM,…) phù hợp để xác định sự methyl hóa

của gen BRCA1, p16INK4a trên quần thể người bệnh ung thư vú, cụ thể như sau: - Gen mục tiêu: BRCA1, p16INK4a

- Số lượng mẫu bệnh phẩm; Số lượng mẫu đối chứng;

- Số mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu đối chứng xuất hiện sự methyl hóa gen mục tiêu; - Tần số xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu: BRCA1, p16INK4a

- Chỉ số biểu thị mức độ nguy cơ (Hazard ratio - HR), tỷ suất chênh (Odds ratio - OR),… với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals - Cis);

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

8

- Phương pháp nghiên cứu: MSP, MS-HRM,…;

- Thông tin mẫu bệnh phẩm: loại mẫu (blood, tissue,…); - Thông tin bệnh nhân: độ tuổi, quốc tịch - chủng tộc;

- Đặc điểm bệnh học ung thư vú: giai đoạn bệnh (stage), phân độ mơ học (grade), kích thước khối u (tumor size),…

II.2.2 Khảo sát trên máy tính

Chúng tơi tập trung thu thập trình tự gen BRCA1 và p16INK4a, promoter, vị trí các đảo

CpG ,...trên các cơng trình nghiên cứu trên thế giới: châu Á, châu Âu, châu Phi,…và Việt Nam. Đồng thời, chúng tôi dựa vào một số công cụ tin sinh học để cập nhật, tái kiểm tra các thông số của bộ mồi phù hợp với phương pháp Nested-MSP hoặc MSP

nhằm phân tích tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen BRCA1, p16INK4a đối với

bệnh ung thư vú.

II.2.3 Khảo sát thực nghiệm

Các phương pháp chính được sử dụng trong quá trình khảo sát thực nghiệm nhằm

phân tích tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen BRCA1, p16INK4a đối với bệnh

ung thư vú được mô tả ở hình..

Hình II. 1 Sơ đồ quy trình Nested-MSP phân tích tính chất methyl hóa vùng promoter gen mục tiêu

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

9

II.2.3.1 Tách chiết DNA bộ gen

Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA bộ gen người từ các mẫu bệnh phẩm (mơ đúc paraffin). Trong đó, paraffin được loại bỏ bằng xylen, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh (SDS) kết hợp sử dụng enzym proteinase K. Sau đó, protein sẽ được biến tính và bị loại bỏ bằng phenol/chloroform. DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol tuyệt đối và trữ lạnh.

Thiết bị: Máy ly tâm lạnh, máy vortex

Hóa chất: Phenol, Chloroform, SDS 10%, NaCl 5M, Tris HCl 10mM (pH=8,2),

EDTA 1M (pH=8), Amonium acetate, Ethanol 100%, Ethanol 70%, Ethanol 50%,

Protein K, Xylene

Các bước tiến hành:

- Cắt nhỏ mẫu bệnh phẩm cho vào eppendorf loại 1,5 ml.

- Bổ sung 1ml dung dịch xylen, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút. Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi.

- Bổ sung 1ml dung dịch ethanol tuyệt đối, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vịng/phút trong 2 phút. Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi.

- Bổ sung 1ml dung dịch ethanol 70%, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vịng/phút trong 2 phút. Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi.

- Bổ sung 1ml dung dịch ethanol 50%, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vịng/phút trong 2 phút. Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi. Để khô trong 30 phút. - Bổ sung một thể tích phù hợp hỗn hợp dung dịch ly giải tế bào (NaCl 5M,

Tris-HCl 1M (pH=8), dung dịch đệm EDTA 0,5M (pH=8), SDS 10%, nước cất hai lần vơ trùng và 10 µl proteinase K (nồng độ 20 ng/ml). Trộn đều hỗn hợp, ủ 560C trong 24-48 giờ.

- Bổ sung một thể tích phù hợp của dung dịch phenol:chloroform (tỷ lệ 1:1), trộn đều. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút. Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf sạch.

- Thêm một lượng dung dịch chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được, trộn nhẹ. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút. Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf sạch.

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

10

- Bổ sung một lượng ammonium acetate (NH4OAc) 5M và một lượng ethanol tuyệt đối theo tỷ lệ 0,2: 2,5 thể tích so với thể tích dịch nổi. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Loại bỏ phần dịch nổi, thu tủa.

- Bổ sung một thể tích ethanol 70% trữ lạnh để rửa sạch kết tủa. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. Thu tủa, loại bỏ dịch nổi (dung dịch ethanol). Để khô trong 30 phút.

- Hòa tan kết tủa DNA trong 30-50µl nước cất hai lần vô trùng. Bảo quản DNA ở 40C đến -200C.

II.2.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ

Nguyên tắc:

- Hàm lượng, nồng độ DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm, thông qua độ hấp thụ (Absorbance) A260= OD = 50

µg/ml DNA sợi đơi (Barbas et al., 2007)

- Độ tinh sạch của DNA được đánh giá thông qua tỷ lệ A260/A280, dung dịch DNA sạch, không nhiễm protein thường có tỷ lệ A260/A280 =1,8-2 (Gallagher., 2011). Cơng thức xác định nồng độ DNA:C (µg/ml) = 50 x A260 x d.

Chú thích:A260: độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm; A280: độ hấp thụ cực đại của protein ở bước sóng 280 nm; d: độ pha lỗng.

Thiết bị-Hóa chất: Máy đo quang phổ, cuvette, nước cất hai lần.

II.2.3.3 Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite với bộ kit EZ DNA Methylation-Gold

Các bước tiến hành:

- Chuẩn bị dung dịch biến đổi EZ1: bổ sung 900 µl dung dịch nước cất 2 lần, 300 µl dung dịch EZ2 và 50 µl dung dịch EZ3 vào ống CT Conversion Reagent, trộn đều trong 10 phút.

- Bổ sung 130 µl dung dịch CT Conversion Reagent (EZ1) vào 20 µl dung dịch DNA đã hút vào eppendorf 250 µl, trộn đều. Sau đó đưa vào chu trình luân nhiệt như sau: 980C: 10 phút, 640C: 2,5 giờ, 40C: ∞.

- Bổ sung 600 µl EZ4 vào cột Zymo-spinTMIC (C1), sau đó thêm dung dịch DNA (đã chạy chu trình nhiệt) vào cột C1, đảo trộn thật đều. Sau đó, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng. Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm.

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

Phương pháp Nested-MSP, gồm ba phản ứng PCR riêng biệt:

- Phản ứng thứ nhất: phản ứng khuếch đại phổ quát vùng trình tự mục tiêu bao quanh các vị trí “hot spot”. Sản phẩm PCR này là DNA bản mẫu cho hai phản ứng PCR riêng biệtcủa phương pháp Nested-MSP:

(i) Phản ứng đặc hiệu cho allele methyl hóa (phản ứng methyl hóa): tiến hành với một cặpmồi chuyên biệt cho DNA bị methyl hóa (M).

(ii) Phản ứng đặc hiệu cho allele khơng methyl hóa (phản ứng khơng methyl hóa): tiến hành với một cặp mồi chun biệt cho DNAkhơng bị methyl hóa (U).

Thiết bị-Hóa chất: Máy PCR, master mix 2X, mẫu DNA, mồi, nước cất hai lần. Các bước tiến hành:

Chúng tôi thực hiện phản ứng PCR với tổng thể tích 50μl với bộ mồi Nested MSP nhằm khuếch đại vùng trình tự promoter gen mục tiêu. Thành phần và phản ứng PCR thể hiện trong Bảng II.1.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

12

Bảng II. 1 Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi Nested-MSP nhằm xác định tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu

Chú thích: X: thể tích DNA phù hợp; Y = 50-(25+0,5+0,5+X)

Hình II. 2 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Nested-MSP

Chú thích: Ta: nhiệt độ lai tối ưu; x: số chu trình luân nhiệt; NC: Số chu trình luân nhiệt (Numbers of Cycle).

II.2.3.5 Phương pháp điện di

Nguyên tắc:

Nucleic acid là các phân tử tích điện âm, do đó có khả năng di chuyển về phía cực dương của điện trường. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng và cấu trúc, sự tích điện của phân tử DNA. Các phân tử nucleic acid hiện diện trong bản gel agarose sẽ được ghi lại dưới tia tử ngoại (UV) nhờ chất nhuộm GelRed. Kích thước của các phân tử DNA nucleic acid được xác định dựa vào kích thước đã biết trước của thang

chuẩn (Lee et al., 2012)

Thiết bị-Hoá chất: Buồng điện di, khuôn gel, hệ thống đọc gel (Gel Doc, Biorad) ,

Agarose; dung dịch TAE (1X); dung dịch nạp mẫu (6X GelRedTM loading buffer with

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

14

III. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

III.1. Kết quả khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp về tính chất methyl hóa

trên vùng promoter gen BRCA1 và p16INK4a

Dựa vào các cơ sở dữ liệu của National Center for Biotechnology Information – NCBI (PubMed, PubMed Central,…), Google scholar, Google,…và sử dụng các từ khóa:

BRCA1, p16INK4a, DNA methylation, breast cancer,…được cập nhật đến tháng 4 năm 2019, chúng tôi thực hiện việc thu thập và chọn lọc bộ dữ liệu cơng trình nghiên cứu

liên quan đến tính chất methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 và p16INK4a (tính chất

methyl hóa trên gen BRCA1, p16INK4a) theo tiến trình được mơ tả ở hình III.1

Hình III. 1 Quy trình chọn lọc bài báo trong phân tích tổng hợp trên gen BRCA1 và p16INK4a

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

15

Chú thích:

Cập nhật đến tháng 4/2019, chúng tôi thu thập các bộ dữ liệu:

(1) Bộ dữ liệu gen BRCA1 gồm 18 công bố khoa học ca chứng (Case control) về tính chất methyl hóa gen BRCA1 trên bệnh ung thư vú (bảng III.1).

(2) Bộ dữ liệu gen p16INK4a gồm 11 công bố khoa học ca chứng (Case control) về tính

chất methyl hóa gen p16INK4a trên bệnh ung thư vú (bảng III.2).

Các bộ dữ liệu này được chọn lọc theo các tiêu chí trích xuất dữ liệu và đưa vào phân tích tổng hợp theo mơ hình phân tích ảnh hưởng cố định hay bất biến (Fixed, F) hoặc mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random, R) với khoảng tin cậy 95%CI trong phân tích tổng hợp (CI >= 1 và/hoặc xấp xỉ 1).

III.2. Kết quả phân tích tổng hợp

Hai bộ dữ liệu được đưa vào vào phân tích tổng hợp với theo chỉ số tỷ suất chênh (OR) và chỉ số nguy cơ (RR) nhằm xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hóa trên

gen BRCA1 và p16INK4a và bệnh lý ung thư vú, gồm có:

(1) Bộ dữ liệu gen BRCA1 (bảng III.1) có tổng số mẫu bệnh ung thư vú là 1540 mẫu

(76 mẫu máu, 1464 mẫu mô), tổng số mẫu lành là 907 mẫu (169 mẫu máu, 738 mẫu mô).

(2) Bộ dữ liệu gen p16INK4a (bảng III.2) có tổng số mẫu bệnh ung thư vú là 1067 mẫu (134 mẫu máu, 933 mẫu mô), tổng số mẫu lành là 761 mẫu (263 mẫu máu, 498 mẫu mô).

Dựa vào chỉ số bất đồng nhất (I2, Index of heterogeneity) của các bộ dữ liệu nêu trên, q trình phân tích tổng hợp chọn lọc mơ hình phân tích ảnh hưởng phù hợp:

(1) Bộ dữ liệu gen BRCA1 đưa vào phân tích chỉ số OR, RR lần lượt thể hiện giá trị I2

= 76,36% (18 công bố khoa học) và I2= 72,77% (18 cơng bố khoa học), do đó áp dụng mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model - R) với khoảng tin cậy 95% CI. Kết quả thể hiện ở hình III.2, hình III.3.

Tổng số cơng bố khoa học

Bộ dữ liệu gen BRCA1 37 6 31 5 26 2 24 5 18

Bộ dữ liệu gen p16INK4a 30 6 24 5 19 3 16 5 11

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

16

(2) Bộ dữ liệu gen p16INK4a đưa vào phân tích chỉ số OR, RR lần lượt thể hiện giá trị I2= 66,74 (11 công bố khoa học) và I2= 90,13% (11 công bố khoa học), do đó áp dụng mơ hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model - R) với khoảng tin cậy 95% CI. Kết quả thể hiện ở hình III.4, hình III.5.

III.2.1. Chỉ số OR và RR tổng số phản ánh sự tương quan giữa tính chất

methyl hóa trên gen BRCA1 và p16INK4a ❖ Xét tính chất methyl hóa trên gen BRCA1

Đối với bộ dữ liệu thứ nhất (18 công bố khoa học ca chứng), cập nhật đến tháng 4 năm 2019, kết quả phân tích ghi nhận chỉ số tỷ suất chênh (OR) tổng số: OR = 8,979 (95%CI = 4,359 - 18,497; P < 0,0001; mơ hình ảnh hưởng ngẫu nhiên - R); phản ánh

độ chênh có ý nghĩa thống kê về sự xuất hiện tính chất methyl hóa gen BRCA1 trên

nhóm mẫu bệnh ung thư vú so với nhóm mẫu lành là 8,979 lần. Để tiến hành được nội dung nghiên cứu này, chúng tôi tham khảo và kế thừa kết quả nghiên cứu của các

giảng viên hướng dẫn, cụ thể là công bố khoa học của Le Huyen Ai Thuy et al., (2017).

Đối với bộ dữ liệu khoa học gồm 24 cơng bố khoa học được nhóm tác giả Le Huyen Ai Thuy và cộng sự đưa vào phân tích tổng hợp, độ chênh có ý nghĩa thống kê về sự

xuất hiện tính chất methyl hóa gen BRCA1 trên nhóm mẫu bệnh ung thư vú so với

nhóm mẫu lành là OR = 4,312 (95%CI = 2,395 - 7,765, P < 0,0001; mơ hình ảnh hưởng ngẫu nhiên - R).

Sự thay đổi có chiều hướng tăng của độ chênh giữa kết quả nghiên cứu trong chuyên

đề khóa luận tốt nghiệp này so với công bố của Le Huyen Ai Thuy et al., (2017) có thể

được lý giải do chúng tơi trích xuất dữ liệu và sàng lọc (loại trừ) các công bố khoa học bộc lộ độ chênh (OR) có khoảng tin cậy (CI: < 1), dẫn đến số lượng công bố ca chứng trong nội dung nghiên cứu này ít hơn so với thời điểm nhóm tác giả Le Huyen Ai

Thuy et al., (2017) cơng bố.

Tuy nhiên, kết quả phân tích trong chun đề khóa luận này hồn tồn đồng thuận với

kết quả nghiên cứu của Le Huyen Ai Thuy et al., (2017) và làm rõ mối tương quan giữa giữa tính chất methyl hóa trên gen BRCA1 và bệnh lý ung thư vú trên thế giới. Mặc dù tần số methyl hóa trên gen BRCA1 được ghi nhận khác nhau trong các công

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

17

trình nghiên cứu trên thế giới, tuy vậy, chỉ số tỷ suất chênh về sự xuất hiện tính chất

methyl hóa trên gen BRCA1 trên các tế bào ung thư cao gấp 4,312 - 8,979 so với tế bào

lành.

Song song, dựa vào bộ dữ liệu thứ nhất (18 công bố khoa học ca chứng), chúng tôi xác định chỉ số nguy cơ (RR) tổng số: RR = 4,973 (CI%= 2,523 – 9,802, P < 0,0001; mơ hình ảnh hưởng ngẫu nhiên - R) phản ánh nguy cơ mắc bệnh ung thư vú cao gấp 4.973 lần khi tế bào có sự xuất hiện tính chất methyl hóa bất thường trên vùng promoter gen

BRCA1.

❖ Xét tính chất methyl hóa trên gen p16INK4a

Trên tổng số 11 công bố ca chứng thuộc bộ dữ liệu gen p16INK4a, kết quả phân tích ghi nhận giá trị chỉ số OR tổng số: OR = 12,925 (CI%= 4,585 – 36,429, P < 0,0001; mơ hình ảnh hưởng ngẫu nhiên - R) phản ánh độ chênh về sự xuất hiện tính chất methyl

hóa trên vùng promoter gen p16INK4a trên nhóm mẫu bệnh ung thư vú so với nhóm mẫu lành là 12,925 lần. Đồng thời, bộ dữ liệu gen p16INK4a biểu thị giá trị chỉ số (RR) tổng số: RR = 8,92 (CI%= 2,203 – 36,1101; P = 0,002, mơ hình ảnh hưởng ngẫu nhiên-R). Giá trị RR phản ánh nguy cơ về sự xuất hiện tính chất methyl hóa trên vùng promoter

gen p16INK4a trên nhóm mẫu bệnh ung thư vú so với nhóm mẫu lành là 8,92 lần.

Tóm lại, phương pháp xác định chỉ số tỷ suất chênh (OR) và chỉ số nguy cơ (RR) tổng

số phản ánh sự tương quan chặt giữa tính chất methyl hóa gen BRCA1, p16INK4a và bệnh ung thư vú với độ chênh giữa bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành lần lượt là OR = 8,979 lần và OR = 12,925 lần và nguy cơ mắc bệnh ung thư khi có sự xuất hiện tính

chất methyl hóa gen BRCA1, p16INK4a lần lượt là RR = 4,973 lần và RR =8,92 lần. Hơn nữa, xét tính thiên vị của các bộ dữ liệu đưa vào phân tích được hiển thị theo đồ thị Funnel plot (Hình III.4, Hình III.9), chuyên đề khóa luận tiếp tục thực hiện khảo sát giá trị OR trên một số phân hạng đặc trưng cho các dạng công bố khoa học ca chứng (loại mẫu bệnh phẩm, chủng tộc/quần thể người bệnh ung thư vú, phương pháp phân tích tính chất methyl hóa trên DNA,...) và một số đặc điểm bệnh học ung thư vú (độ tuổi,.. ). Các dữ liệu này có thể phản ánh chi tiết về sự gắn chặt giữa tính chất methyl hóa trên các gen mục tiêu này và sự hình thành và diễn tiến của bệnh ung thư vú, từ đó làm cơ sở khoa học ủng hộ phát triển hướng nghiên cứu chọn lọc dấu chứng sinh học

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

18

tiềm năng ứng dụng tiên lượng, chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú ở thế giới và ở Việt Nam.

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Mẫu bệnh ung thư vú Mẫu lành Mẫu methyl

hóa

Tổng mẫu

Mẫu methyl hóa

Tổng mẫu

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

20

Hình III. 2 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số tỷ suất chênh(OR) của tính chất methyl hóa trên gen BRCA1 trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 18 nghiên cứu ca chứng

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

21

Hình III. 3 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số nguy cơ (RR) của tính chất methyl hóa trên gen BRCA1 trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 18 nghiên cứu ca chứng

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

Loại mẫu bệnh

Mẫu bệnh ung thư

vú Mẫu lành Mẫu

methyl hóa

Tổng mẫu

Mẫu methyl

hóa

Tổng mẫu

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

24

Hình III. 6 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số tỷ suất chênh(OR) của tính chất methyl hóa trên gen p16INK4a trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 11 nghiên cứu ca chứng

</div>