khảo sát mức độ methyl hoá tại các đảo cpg thuộc vùng promoter của các gene brca1, p16ink4a, rassfia, cyclin d2 và gstp1 trên các bệnh nhân bị ung thư vú

 Y BAN NHÂN DÂN TP. HCM  GIÁO DC & ÀO TO
 KHOA HC VÀ CÔNG NGH I HC M TP. HCM
BÁO CÁO NGHIM THU
KHO SÁT MC  METHYL HÓA TI CÁC O CpG
THUC VÙNG PROMOTER CA CÁC GEN BRCA1, p16
INK4
,
RASSF1A, CYCLIN D2 VÀ GSTP1 TRÊN CÁC BNH NHÂN B
UNG TH VÚ
Ch nhim  tài: PGS.TS. Lê Huyn Ái Thúy
TS.BS. oàn Th Phng Tho
THÀNH PH H CHÍ MINH
THÁNG 1/2014
i
C LC
Trang
Tóm tt ni dung nghiên cu ii
Danh sách các ch vit tt iii
Danh sách bng iv
Danh sách hình v
ng quyt toán vii
ng d trù kinh phí giai n II viii
Phn mu 1
Phn báo cáo 7
t vn  8
I. Tng quan 9
1.1. Tng quan v epigenetics 10
1.2. Tng quan v các gen RASSF1A, BRCA1, cyclin D2, GSTP1 và p16
INK4a
14
1.2.1. Gen RASSF1A

14
1.2.2. Gen BRCA1 16
1.2.3. Gen cyclin D2 19
1.2.4. Gen GSTP1 21
1.2.5. Gen p16
INK4a
23
1.3. Các phng pháp phát hin s methyl hóa DNA 35
1.3.1. Phng pháp Methylation
-
Specific PCR (MSP)
36
1
.3.2. Phng pháp Q
-
MSP
36
1.3.3. Phng pháp BSP 37
II. Ni dung và phng pháp 38
III. Kt qu và tho lun 54
3.1. Ni dung 1 - Ly mu nghiên cu 55
3.2. Ni dung 2 - Kho sát các c m mô bnh hc 55
3.3. Ni dung 3 - Thc hin k thut hoá mô min dch vi hai th th p53 và
HER2/
neu
57
3.4. Ni dung 4- Kho sát in silico các o CpG thuc vùng promoter ca các gen
BRCA1
,
p16

INK4a
,
RASSF1A
,
cyclin D2
và
GSTP1
58
3.5. Ni dung 5 - Kho sát c m methyl hoá ti các o CpG thuc vùng
promoter ca các gen BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng
Methylation-specific-PCR
71
3.6. Ni dung 6 - Kho sát c m methyl hoá ti các o CpG thuc vùng
promoter ca các gen BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng gii
trình t
 sn phm Methylation
-
specific
-
PCR
82
3.7. Ni dung 7 – X lý s liu 83
IV. K
t lun v
à 
 ngh

99
ii
TÓM TT NI DUNG NGHIÊN CU
Ung th vú là mt cn bnh ph bin và là nguyên nhân gây cht hàng u  ph
 mc bnh này trên th gii. Bnh vn ang có xu hng gia tng trên th gii, c
bit là  các nc ang phát trin trong ó có Vit Nam. Nghiên cu s dng k thut
Methylation-specific PCR (MSP)  kho sát mc  methyl hóa trên 200 mu mô
nh c sinh thit t các bnh nhân ung th vú và 20 mu mô vú lành tính thu thp
 bnh vin i hc Y Dc thành ph H Chí Minh. Các gen BRCA1 (gen sa cha
DNA), p16
INK4a
và Cyclin D2 (nhóm gen u hòa chu trình t bào), GSTP1 (gen gii
c), và RASSF1A (gen è nén u) c chn  kim tra tn s methyl hóa.
t qu cho thy t l methyl hóa ca các gen BRCA1 là cao nht chim 85%.
Tip theo là các gen Cyclin D2, p16
INK4a
, GSTP1 và RASSF1A có t l methyl hóa ln
t 57.5, 48.5, 46.5 và 40%. Tính cht methyl hóa trên nm gen kho sát u là c
m c trng ca bnh ung th vú, và c ánh giá là làm tng nguy c dn n
nh. Kh nng phát hin s methyl hóa trong mu bnh ngi Vit Nam là rt cao
khi sàng lc cùng mt lúc nm gen bi  bao pht 100% trên s mu kho sát.
SUMMARY OF RESEARCH CONTENT
Breast cancer is the common cause of death among women in most countries
worldwide, with rapidly increases in the developing countries, including Vietnam.
The best opportunity for improving the survival is thought to be had an early detection
through the promising biomarker: DNA hypermethylation. In present study, with the
aim towards using the hypermethylation at CpG islands of promoter of candidate
genes as the biomarker for Vietnamese population, sensitive methyl specific PCR
(MSP) was carried out to analyze the hypermethylation status of the panel of five
genes including BRCA1, p16

INK4
, GSTP1, RASSF1A and Cyclin D2 in 220 samples
including 200 breast cancer specimens and 20 normal breast tissues from another
disease (not breast cancer) which were obtained Ho Chi Minh City Medical Hospital,
Vietnam. The results indicated that the hypermethylation of one or more genes
occurred in all total of 200 tumor specimens (100% diagnostic coverage), considered
to be a specific characteristic of Vietnamese breast cancer patients, with the
frequencies for methylation of each genes were 85, 57.5, 48.5, 46.5 and 40% for
BRCA1, p16
INK4
, GSTP1, RASSF1A and CyclinD2 gene, respectively.
iii
DANH SÁCH CÁC CH VIT TT
5’UTR 5‘ Untranslated Region
3’UTR 3‘ Untranslated Region
A Adenine
bp Base pair
BRCA1 Breast cancer susceptibility 1
C Cytosine
CDKN2A Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A
DNA Deoxyribonucleic acid
DNMT DNA methyltransferase
dNTP Deoxynucleoside triphosphate
G Guanine
GSTP1 Glutathione S-transferase Pi-1
IDT Integrated DNA Technology (công ty IDT)
M Methylated
mRNA messenger Ribonucleic acid
MSP Methylation specific PCR
NCBI National Center for Biotechnology Information

PCR Polymerase chain reaction
RASSF1A Ras association domain family 1 isoform A
T Thymine
Taq Thermus aquaticus
Tm Melting temperature
U Unmethylated
UV Ultraviolet
iv
DANH SÁCH BNG
Trang
ng 1.1. Danh sách chn lc các biomarker tim nng cho ung th 13
B
ng 1.2. Khái quát các nghi
ên c
u v nm gen
BRCA1,
RASSF1A,
cyclin D2, GSTP1 và
p16
INK4a
25
ng 2.1. Phân  mô bnh hc 40
ng 2.2. Quy trình nhum HMMD trên máy BenchMark XT 42
B
ng 2.3. Thông s cp mi bt tr
ên gen
BRCA1
47
B
ng 2.4. Th

ành ph
n phn ng PCR
47
ng 2.5. Chu kì nhit ca phn ng PCR 47
B
ng 2.6. Chu tr
ình nhi
t  bin i bisulfite ca Epitech bisulfite Kit
48
B
ng 2.7. Th
ành p
h
n phn ng Q
-
MSP
49
ng 2.8. Chu trình nhit phn ng Q-MSP 50
ng 2.9. Chu kì nhit ca phn ng MSP 50
B
ng 2.10. Din gii ý ngha ca t sut ch
ênh (odd ratio
–
OR) và nguy c tng 
i
(Relative risk – RR)*
53
ng 3.1. Giai n ung th vú
56
B

ng 3.2. Phân loi mô hc
56
ng 3.3. Phân  mô hc
57
B
ng 3.4. T
ình tr
ng HER2/new
58
ng 3.5. Tình trng p53
58
B
ng 3.6. Tr
ình t
 mi v
à các thông s
 vt lý
69
B
ng 3.7. Nng  v
à ch
t l

ng DNA tách chit
72
ng 3.8. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca các gen vi ung
th vú
83
ng 3.9. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen
BRCA1

v
i
các yu t cn lâm sàng và c m gii phu bnh trên bnh nhân ung th vú
84
ng 3.10. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen Cyclin D2
i các yu t cn lâm sàng và c m gii phu bnh trên bnh nhân ung th vú
85
ng 3.11. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen GSTP1 i
các yu t cn lâm sàng và c m gii phu bnh trên bnh nhân ung th vú
86
ng 3.12. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen
p16
INK4

v
i
các yu t cn lâm sàng và c m gii phu bnh trên bnh nhân ung th vú
87
ng 3.13. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen RASSF1A
i các yu t cn lâm sàng và c m gii phu bnh trên bnh nhân ung th vú
88
ng 3.14. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen
BRCA1
v
i
tình trng biu hin Her2/neu và p53 trên bnh nhân ung th vú và lành tính
90
ng 3.15. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen Cyclin D2
i tình trng biu hin Her2/neu và p53 trên bnh nhân ung th vú và lành tính
91

B
ng 3.16. Mi t
ng quan gi
a
 l methyl hóa ti vùng promoter ca gen
p16
INK4

v
i
tình trng biu hin Her2/neu và p53 trên bnh nhân ung th vú và lành tính
92
ng 3.17. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen GSTP1 i
tình trng biu hin Her2/neu và p53 trên bnh nhân ung th vú và lành tính
93
ng 3.18. Mi tng quan gia t l methyl hóa ti vùng promoter ca gen
RASSF1A
i tình trng biu hin Her2/neu và p53 trên bnh nhân ung th vú và lành tính
94
ng 3.19. Mc  liên quan gia tính cht methyl hóa ti vùng promoter  gen BRCA1
i ung th vú
94
ng 3.20. Mc  liên quan gia tính cht methyl hóa ti vùng promoter  gen Cyclin
D2 i ung th vú
95
ng 3.21. Mc  liên quan gia tính cht methyl hóa ti vùng promoter  gen GSTP1
i ung th vú
96
v
ng 3.22. Mc  liên quan gia tính cht methyl hóa ti vùng promoter  gen p16

INK4a
i ung th vú
96
B
ng 3.22. Mc  li
ên quan gi
a tính cht methyl hóa ti v
ùng promoter
 gen
RASSF1A
97
ng 3.24. Các mu có ln lt không, mt, hai, ba, bn gen b methyl hóa trong b mu
nh phm ung vú
42
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1.1.
 b sung nhóm
–
CH
3
vào v trí 5’ ca cytosine nh DNMTs
10
Hình 1.2. Tóm tt vai trò sinh hc ca RASSF1A
15
Hình 1.
3.
Các vùng ch
c nng c
a BRCA1

17
Hình 1.4.  phosphoyl hóa Rb gii phóng E2F
20
Hình 1.5. Tn s methyl hóa ca nm gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 và
p16
INK4a
trong ung th vú.
26
Hình 1.6: Tn s methyl hóa ca nm gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 và
p16
INK4a
trong t bào bình thng
27
Hình 1.7: Tn s methyl hóa trung bình có trng s ca các gen
RASSF1A, GSTP1,
BRCA1, cyclin D2 và p16
INK4a
trong ung th vú nói chung và phân chia theo các giai
n bnh
29
Hình 1.8. X
 lý sodium bisulfite v
à s
 chuy
n 
i cytosine th
ành ur
36
Hình 3.1.
Hình

nh vi th các loi carcinôm xâm ln
55
Hình 3.2. Hình nh biu hin th th HER2/neu
57
Hình 3.3. Hình nh p53
58
Hình 3.4.
nh v gen RASSF1A trên nhim sc th s 3
59
Hình 3.5. u trúc gen RASSF1A
59
Hình 3.6.
Trình t gen RASSF1A và s phân b ca mt s nhân t phiên mã
60
Hình 3.7. nh v gen BRCA1 trên nhim sc th s 17
60
Hì
nh
3
.
8.
u tr
ú
c
gen
BRCA
1
61
Hình 3.9. Trình t gen BRCA1 và s phân b ca mt s nhân t phiên mã
61

Hình 3.10. nh v gen Cyclin D2 trên nhim sc th s 12
62
Hình 3.11.
u tr
ú
c
gen Cyclin D2
62
Hình 3.12. Trình t gen Cyclin D2 và s phân b ca mt s nhân t phiên mã
63
Hình 3.13.
nh v gen GSTP1 trên nhim sc th s 11
63
Hình 3.14. u trúc gen GSTP1
64
Hình 3.15.
Trình t gen GSTP1 và s phân b ca mt s nhân t phiên mã
64
Hình 3.16. nh v gen p16
INK4a
trên nhim sc th s 9
65
Hình 3.17. u trúc gen p16
INK4a
65
Hình 3.18.
Trình t
 gen p16
INK4a
và s

phân b ca mt s nhân t phiên mã
66
Hình 3.19: t qu kim tra c hiu mi methyl/BRCA1 (WT3) bng Methblast
68
Hình 3.20a.

 th biu din
k
t qu kho sát mi methyl WT7, c tr
ng cho gen
GSTP1 trên DNA chng
74
Hình 3.20b.  th biu din kt qu phân tích nhit  nóng chy ca sn phm MSP
gia mi methyl WT7 và DNA chng
75
Hình 3.21a.

 th biu din kt qu kho sát mi unmethyl WT8, c tr
ng cho gen
GSTP1 trên DNA chng
75
Hình 3.21b.  th biu din kt qu phân tích nhit  nóng chy ca sn phm MSP
gia mi unmethyl WT8 và DNA chng
76
Hình 3.22. Kt qun di sn phm MSP nhm kho sát nhit  lai ti u ca cp mi
77
vi
WT9
Hình 3.23. K
t qun di sn phm MSP vi các cp mi methyl c hiu cho các gen

BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 trên 27 mu bnh phm ung th vú
78
Hình 3.24. t qu gii trình t sn phm MSP gen RASSF1A
79
Hình 3.25. Kt qun di sn phm MSP gen BRCA1
80
Hình 3.26. Kt qu gii trình t sn phm MSP gen BRCA
82
vii
NG QUYT TOÁN
 tài: Kho sát mc  methyl hóa ti các o CpG thuc vùng promoter ca các gen
BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 và p16
INK4a
trên các bnh nhân b ung th vú
Ch nhim: TS. Lê Huyn Ái Thúy & ThS. BS. oàn Th Phng Tho
 quan ch trì:H. M TP. HCM
Thi gian ng ký trong hp ng: 24 tháng (t tháng 12/20120 n tháng 12/2012)
Thi gian thc hin giai n I: t tháng 12/2010 n tháng 12/2011
ng kinh phí c duyt: 600.000.000 VN
Kinh phí cp giai n I: 350.000.000 VN theo TB s: 233/H-SKHCN ngày 07/12/2010
VT:1000
TT
i dung
Kinh phí nm
2011
Trong ó
Ngân sách Ngun khác
I Kinh phí cp trong nm: 350.000 350.000

II Kinh phí quyt toán trong nm 350.000 350.000
1.
Công cht xám 24.000 24.000
2.
Công thuê khoán 90.488,065
90.488,065
3.
Nguyên, nhiên vt liu, dng c, ph
tùng, VPP,…
206.539, 935 206.539, 935
4. Thit b 0 0
5.
Xét duyt, giám nh, nghim thu
5.281 5.281
6.
i ngh, hi tho 5.691 5.691
7.
ánh máy tài liu 0
0
8.
Giao thông liên lc 0
9.
Chi phí u hành
18.000 18.000
III Tit kim 5% 0 0
IV Kinh phí np tr ngân sách
viii
NG S DNG KINH PHÍ GIAI N II
TT
i dung

Kinh phí nm
2011
Trong ó
Ngân sách Ngun khác
I Kinh phí cp trong nm th II: 190.000 190.000
II Kinh phí quyt toán trong nm II 190.000 190.000
1.
Công cht xám 12.000 12.000
2.
Công thuê khoán 80.000 80.000
3.
Nguyên, nhiên vt liu, dng c, ph
tùng, VPP,…
83.000 83.000
4.
Thit b 0 0
5.
Xét duyt, giám nh, nghim thu
0 0
6.
i ngh, hi tho 0 0
7.
ánh máy tài liu
0 0
8.
Giao thông liên lc 0
9. Chi phí u hành 15.000 15.000
III Tit kim 5% 0 0
IV Kinh phí np tr ngân sách
1

PHN MU
1. Tên  tài: Kho sát mc  methyl hóa ti các o cpg thuc vùng promoter ca
các gen BRCA1, p16
INK4
, RASSF1A, CYCLIN D2 và GSTP1 trên các bnh nhân b
ung th vú
Ch nhim  tài: PGS.TS. Lê Huyn Ái Thúy & TS. BS. oàn Th Phng Tho
 quan ch trì: H. M TP. HCM
Thi gian thc hin: 24 tháng (t tháng 12/2010 n tháng 6/2013)
Kinh phí c duyt: 600.000.000 VN
Kinh phí ã cp: 540.000.000 VN theo TB s: 233/H-SKHCN ngày
07/12/2010
2. c tiêu: Tìm hiu s methyl hóa ti các o CpG thuc vùng promoter ca các
gen BRCA1, p16
INK4A
, RASSF1A, cyclin D
2
và GSTP1 trên các bnh nhân b ung th
vú  ngi Vit Nam nhm ánh giá tiên liu, xác nh phng pháp u tr.
3. i dung:
- Ly mu nghiên cu, thu thp d liu v các c m: tui, gii tính
- Kho sát các c m mô bnh hc: kích thc, v trí u, mô vú xâm ln và mô vú
ung th ti ch, hóa mô min dch
- Kho sát in silico các o CpG thuc vùng promoter ca các gen BRCA1, p16
INK4a
,
RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1, nhn din các o có th xem là “hot-spot”, nhn
din vùng trình t thit k mi
- Kho sát c m methyl hoá ti các o CpG thuc vùng promoter ca các gen
BRCA1, p16

INK4a
, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng PCR bao gm:
+ Thit lp quy trình tách chit DNA thích hp t sinh thit mô
+ Thit lp quy trình x lý DNA bng sodium bisulfite
+ Thit lp quy trình tinh sch DNA sau x lý sodium bisulfite
+ Thit lp quy trình methylation-specific PCR (MSP) nhm phát hin s
methyl hóa ti vùng promoter trên các gen này
+ Kho sát c m methyl hoá ti các o CpG thuc vùng promoter ca các
gen BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng MSP
2
- Kho sát c m methyl hoá ti các o CpG thuc vùng promoter ca các gen
BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 ng gii trình t sn phm
methylation-specific PCR
- X lý s liu
3.1. Nhng ni dung thc hin (i chiu vi ph lc 1 - hp ng ã ký):
Công vic d kin Công vic ã thc hin
i dung 1: Ly mu nghiên cu
Thu thp c 200 mu carcinôm ng
tuyn vú xâm ln và 20 mu mô vú lành
tính
ã thu thp c 200 mu carcinôm
ng tuyn vú xâm ln và và 20 mu
mô vú lành tính
i dung 2: Kho sát các c m mô bnh hc
Thu thp s liu v các c m gii phu
nh c bn và c m i th trên 200

u carcinôm ng tuyn vú xâm ln và 20
u mô vú lành tính
ã thu thp s liu v các c m
gii phu bnh c bn và c m i
th trên 200 mu carcinôm ng tuyn
vú xâm ln và và 20 mu mô vú lành
tính
i dung 3: Thc hin k thut hoá mô min dch
ánh giá v biu hin ca p53 và HER2
trên 200 mu carcinôm ng tuyn vú xâm
n và 18 mu mô vú lành tính
ã ánh giá biu hin ca p53 và
HER2 trên 200 mu carcinôm ng
tuyn vú xâm ln và và 20 mu mô vú
lành tính
i dung 4: Kho sát in silico các o CpG thuc vùng promoter ca các gen
BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1
- Trình t các vùng promoter và/hoc exon
1 ca các gen BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A,
cyclin D2 và GSTP1
- o CpG thuc vùng promoter và/hoc
exon 1 ca các gen BRCA1, p16
INK4a
,
RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1
- Các b mi cho Methylation-specific-

- ã thu nhn trình t các vùng
promoter và/hoc exon 1 ca các gen
BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin
D2 và GSTP1
- ã thu nhn o CpG thuc vùng
promoter và/hoc exon 1 ca các gen
BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin
D2 và GSTP1
- ã thit k và ánh giá các b mi
3
PCR và gii trình t tho mãn các yêu cu
 thành phn GC, nhit  lai, kh nng
o hairpin loop, primer-dimer
cho Methylation-specific-PCR và gii
trình t tho mãn các yêu cu v
thành phn GC, nhit  lai, kh nng
o hairpin loop, primer-dimer
i dung 5: Kho sát c m methyl hoá ti các o CpG thuc vùng promoter
a các gen BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 bng Methylation-
specific-PCR (MSP)
- Quy trình tách chit DNA thích hp t
sinh thit mô
- Quy trình x lý DNA bng sodium
bisulfite

- Quy trình tinh sch DNA sau x lý
sodium bisulfite
- Quy trình MSP nhm phát hin s methyl
hóa ti o CpG vùng promoter trên các
gen BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2
và GSTP1
- D liu methyl hóa ti vùng promoter trên
các gen BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin
D2 và GSTP1 a 200 mu carcinôm ng
tuyn vú xâm ln và 20 mu mô vú lành
tính
- ã xây dng thành công quy trình
tách chit DNA thích hp t sinh thit
mô
- ã xây dng thành công quy trình
 lý DNA bng sodium bisulfite
- ã xây dng thành công quy trình
tinh sch DNA sau x lý sodium
bisulfite
- ã xây dng thành công quy trình
MSP nhm phát hin s methyl hóa
i o CpG vùng promoter trên các
gen BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A,
cyclin D2 và GSTP1

- ã có  d liu methyl hóa ti vùng
promoter trên các gen BRCA1,
p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2 và
GSTP1 a 200 mu carcinôm ng
tuyn vú xâm ln và 200 mu mô vú
lành tính
i dung 6: Kho sát c m methyl hoá ti các o CpG thuc vùng promoter
a các gen BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1 bng gii trình t
n phm Methylation-specific-PCR
- D liu methyl hóa ti vùng promoter trên
các gen BRCA1, p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin
D2 và GSTP1 a 20 mu i din cho
carcinôm ng tuyn vú xâm ln và mô vú
- ã có  d liu methyl hóa ti vùng
promoter trên các gen BRCA1,
p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2 và
GSTP1 a 20 mu i din cho
4
lành tính carcinôm ng tuyn vú xâm ln và mô
vú lành tính
i dung 7: X lý s liu
Xác nh t l, mi tng quan gia tình

trng methyl hoá ti các o CpG thuc
vùng promoter ca các gen BRCA1,
p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1
và các c m gii phu bnh, hóa mô
min dch (HER2 và p53) trên 200 mu
carcinôm ng tuyn vú xâm ln và 20 mu
mô vú lành tính
- ã hoàn tt
i dung 8: Vit báo cáo nghim thu
Báo cáo hoàn chnh - ã hoàn tt
i dung 9: Nghim thu  tài cp c s
Báo cáo khoa hc c Hi ng nghim
thu cp c s thông qua
- ã hoàn tt
i dung 10: Nghim thu  tài cp thành ph
Báo cáo khoa hc c Hi ng nghim
thu cp thành ph thông qua
3.2. Nhng sn phm nghiên cu (i chiu vi ph lc 2 - hp ng ã ký):
TT
Tên sn phm Yêu cu khoa hc  kin t c
1 Báo cáo tng
t  tài
Khoa hc và y  ni dung
nghiên cu, gii quyt c các
n t ra, áp ng mc tiêu
 tài
Tài liu,
a CD

×
2 Trình t các b
i cho
Methylation
Specific PCR
(MSP) ti các
o CpG
Chính xác, phn ánh úng tình
trng methyl hóa ca c vùng
promoter ca các gen BRCA1,
p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2
và GSTP1
 20 mi
(mi gen
có 4 mi)
×
(25 mi)
5
3 Quy trình k
thut MSP
Các bc c th trong quy trình
MSP:
- Quy trình tách chit DNA t
sinh thit mô
- Quy trình x lý DNA bng
sodium bisulfite
- Quy trình tinh sch DNA sau
 lý sodium bisulfite

- Quy trình MSP nhm phát
hin s methyl hóa ti các o
CpG vùng promoter trên các
gen BRCA1, p16
INK4a
,
RASSF1A, cyclin D2 và GSTP1
4 quy
trình
×
(4 quy
trình)
4 D liu methyl
hóa ti các o
CpG thuc
vùng promoter
a các gen
BRCA1,
p16
INK4a
,
RASSF1A,
cyclin D2 và
GSTP1 a 200
u carcinôm
ng tuyn vú
xâm ln và 20
u mô vú
lành tính
Có x lý thng kê, rõ ràng, áng

tin cy
1 b d
liu
×
(1 b d
liu)
5 Báo cáo phân
tích mi tng
quan gia tình
Xác nh t l, mi tng quan
gia tình trng methyl hóa ti
các o CpG thuc vùng
1 báo cáo ×
(1 báo
cáo)
6
trng methyl
hóa và các c
m gii phu
nh
promoter ca các gen BRCA1,
p16
INK4a
, RASSF1A, cyclin D2
và GSTP1 và các c m gii
phu bnh ca 200 mu
carcinôm ng tuyn vú xâm ln
6 Bài báo khoa
c
ng trên các tp chí chuyên

ngành hoc k yu hi ngh
khoa hc chuyên ngành
2-3 bài ×
(4 bài báo
ng tp
chí; 5 báo
cáo hi
trng ti
4 HNKH
Quc t và
1 HN.
CNSH
toàn quc,
2011)
7 ào to 05 khóa lun tt nghip c nhân
Công ngh Sinh hc, 01 thc s
chuyên ngành Di truyn
06 ngi ×
(08 ngi:
05 c
nhân, 02
thc s và
01 nghiên
u sinh)
7
PHN BÁO CÁO
8
T VN 
Ung th vú là loi ung th thng gp nht và gây t vong hàng u  ph n
nhiu nc công nghip. ây là mt bnh ht sc phc tp mà trong nhiu nm qua ã

có nhiu nghiên cu v nguyên nhân, bnh sinh và u tr.
Nhng nm gn ây, hin tng epigenetic (s thay i quá trình biu hin ca
gen, mc dù bn cht gen không thay i) ang c nhiu nhà nghiên cu trên th
gii quan tâm theo khuynh hng s dng chúng nh du chng sinh hc
(biomarker), và thc t cho thy có mt s liên quan ht sc cht ch gia hin tng
epigenetic vi nhiu loi ung th. Mt trong nhng kiu epigenetic c chng minh
có tim nng tr thành du chng sinh hc cao, ó là s bt hot ca các gen è nén u
(tumour suppressor gene) bng c ch methyl hoá quá mc  các nucleotide cytosine
hin din trong o CpG, và s methyl hoá quá mc này thng c ghi nhn ti
vùng promoter hay kéo dài qua n exon th nht ca các gen nói trên.
Vic tìm hiu v tính mn cm ca con ngi i vi bnh, mc  bin i
t cht di truyn ca t bào hay mc  epigenetic trên cng ng dân c Vit nam,
 là nhng d liu ban u ht sc cn thit nhm tin ti nghiên cu tìm ra mt loi
u chng sinh hc cho ung th nói chung và ung th vú nói riêng.
Nghiên cu này vì vy c thc hin nhm tìm hiu s methyl hóa ti các o
CpG thuc vùng promoter ca các gen BRCA1, p16
INK4A
, RASSF1A, CYCLIN D
2
và
GSTP1 trên các bnh nhân b ung th vú  ngi Vit Nam ánh giá, tiên liu,
nhm xác nh phng pháp u tr bnh.
9
PHN I – TNG QUAN
1.1. Tng quan v epigenetics:
10
Epigenetics c nh ngha là s thay i trong s biu hin ca gen nhng
không liên quan n bin i trình t DNA và c di truyn mt cách n nh t th
 này sang th h khác [1]. Epigenetics bao gm các hin tng sau: s methyl hóa
DNA, acetyl hóa histone, và microRNAs [2].

Methyl hóa DNA là mt hin tng bình thng xy ra trong quá trình phát trin
a t bào. Nó óng vai trò then cht trong vic kim soát chu trình t bào, s phát
trin ca phôi, quá trình phiên mã, s bt hot nhim sc th X … [2].  ngi, s
methyl hóa DNA c tìm thy xuyên sut c b gen, nhóm –CH
3
c b sung ti v
trí C
5
ca cytosine ng trc guanine trong cp dinucleotide CpG [3, 4]. Trong các
 bào ca ngi có khong 70-80% dinucleotide CpG b methyl hóa. Các cp
nucleotide CpG phân b không ng u trong b gen, chúng tri dài trên trình t gen
và xen k vi các vùng không b methyl hóa. Vùng DNA giàu dinucleotide CpG có
kích thc khong 0,5-4 kb gi là o CpG [2]. Các o CpG thng kéo dài tu
5’ n exon u tiên ca gen,  các t bào bình thng phn ln các o này không b
methyl hóa, ch nhng phân nhóm riêng bit t vùng promoter n vùng exon u tiên
a gen b methyl hóa [2, 5].
Hin tng methyl hóa DNA xy ra sau quá trình tng hp DNA, quá trình này
c thc hin bi các enzyme chuyn nhóm methyl t cht cung cp methyl S-
adenosylmethionine (SAM) n v trí C
5
ca cytosine (Hình 1.1) [4]. ây là mt h
enzyme chuyên bit có tên DNA methyltransferase (DNMTs) trong ó 3 enzyme
DNA methyltransferase 1, 3A, 3B (DNMT1, 3A, 3B) trc tip tham gia quá trình
methyl hóa: DNMT1 hot ng chính ng vt hu nh, nhm duy trì tính n nh
 methyl hóa ca các t bào sinh dng khác nhau trong sut quá trình sao chép
DNA. Trong khi ó, DNMT3A và DNMT3B hot ng nhm to các v trí methyl
hóa mi (de novo methylation) [4, 5].
Hình 1.1. S b sung nhóm –CH
3
vào v trí 5’ ca cytosine nh DNMTs

Hin tng epigenetics trong ung th ngi ã và ang tr thành mt lnh vc
nghiên cu mi, nhm mt trong nhng mc tiêu là nhn dng (sm) các du chng
11
epigenetic và phát trin nhanh các k thut phát hin (sm) ung th [6]. Trong nhiu
bài tng quan, các tác giu có chung nhn nh rng, trong tng lai các du chng
a trên thông tin DNA b methyl hóa c s dng trong tiên oán sm ung th bi
 methyl hóa quá mc  các o CpG này c tìm thy ph bin vi s lng “va
” trong các mu sinh thit mô t các bnh nhân ung th giai n u, trên DNA t
do trong máu, nc tiu [1, 6]. Dõi theo các công b gn ây hn, các báo cáo ã
cho thy hin tng methyl hóa bt thng có th tìm thy t các t bào trong giai
n tin ung th thông qua s bt hot do methyl hóa quá mc  các gen è nén u,
các gen u khin chu trình t bào; cng nh vic kích hot các gen gây ung th bng
 ch gim mnh methyl hóa (hypomethylation) trong vùng promoter ca gen [2, 3,
5, 6]. Ngoài ra, thông tin DNA methyl hóa cng có vai trò trong doán tr liu. Hin
nay, khuynh hng s dng thuc epigenetic - cht c ch methyl hóa, dùng riêng
hoc kt hp vi phng pháp hóa tr liu nhm tái hot ng các gen (è nén u) b
im lng trong ung th, phc hi chc nng các gen này chính là hng i mi trong
u tr ung th và ã c a vào các th nghim lâm sàng. Cht c ch DNA
methyltransferase (DNMTs), 5-azacytidine (5-AzaCR) và 5-aza2’- deoxycytidine (5-
AzadC), là nhng thuc epigenetic c công bu tiên. Nhng thuc này tác ng
ng cách gn vào DNA ti các v trí Cytosine trong quá trình tái bn DNA, tó
ngn cn hot ng ca DNMTs [7]. Nhng thuc này ã c FDA (Food and Drug
Administration) cho phép th nghim lâm sàng trên các hi chng myelodysplastic
syndrome (MDS), u trung mc ác (malignant mesothelioma), bnh tin ung th máu
(preleukemic disease), ung th vú, ung th mi hng (nasopharyngeal carcinoma -
NPC) và mt vài bnh khác [8-11]. Gn ây, Zebularine, mt cht c ch DNMT mi
i c tính thp hn nhng nhy cm trong chn lc t bào ung th cng c công
, c bit các báo cáo ã ch ra phn ng ca thuc ch trên mt s gen è nén u
quan trng ã bc ch hot ng trong các dòng t bào ung th vú cho dù  nng 
thp [12]. Hn na, mt hng chng methyl hóa mi ang c nghiên cu, c ch

DNMT thông qua siRNA, ribozymes, và antisense oligonucleotides, cng ã c 
ngh tuy ch mi là nhng th nghim bc u. Mt vài thuc ã chng minh c
hiu qu tác ng trên h thng nuôi cy t bào, mô hình ng vt và k c th
nghim lâm sàng [13]. Có th k tên các “thuc” tiêu biu: MG98, mt antisense
12
oligonucleotide tác ng trc tip lên DNMT1 [14, 15], và RG108 [16, 17], mt phân
 nh, mi, gn lên trung tâm hot ng ca DNMT. Vic kt hp cht c ch
acetyl hóa histone (histone deacetylases inhibitors - HDACIs), ví d nh TSA và
phenylbutyrate [18], vi cht c ch DNMT c bit ha hn tính hiu qu trong u
tr ung th. Hn na, vic mt biu hin ca estrogen receptor (ER) bng methyl hóa
t thng và bin i histone ã dn n h qu là kháng antiestrogen – mt liu
pháp trong cha tr ung th vú. Mt vài nghiên cu ã ch ra rng vic kt hp dùng
5-azacytidine vi TSA có th cm ng tái biu hin chc nng ca ER, chính vì vy
làm tng  nhy ca nhng dòng t bào ung th vú trc ó th hin âm tính vi ER
trong liu pháp tamoxifen [19, 20]. Kt hp HDACIs, trastuzumab (Herceptin), mt
kháng thn dòng t ngi kháng li HER2 a n hiu qu tác ng trong àn áp
 phát trin và cm ng apoptosis  các dòng t bào ung th vú [21, 22]. Hn na,
vic kt hp các thuc epigenetic vi các cht hóa tr liu hay các cht n kiêng t
nhiên (natural dietary ingredients) cng làm tng hiu quu tr. Mt nghiên cu
tin lâm sàng ã ch ra rng 5-AzadC kt hp vi docetaxel (mt cht kháng phân
bào, dùng trong hóa tr liu) có th tng hiu qu chng t bào ung th, th nghim
tin hành trên các dòng t bào ung th vú [23]. 5-AzadC kt hp vi mt cht khác,
amsacrine hay idarubicin cng cho thy hiu quu tr. Polyphenol trà xanh, (-)-
epigallocatechin-3-gallate (EGCG), có th là nguyên nhân dn n tái mô hình hóa
u trúc si chromatin ca vùng promoter ER bng vic thay i tình trng acetyl
hóa histone và methyl hóa, và chính vì vy, h qu là tái hot hóa ER. Kt hp TSA,
EGCG dn n tái hot ng ca rt nhiu gen è nén u bng sc ch trc tip hay
gián tip hot ng DNMTs [24]. Dietary sulforaphane (SFN) [25], mt cht c ch
 acetyl hóa histone, c ch rt hiu qu tính sng và tng sinh ca các t bào ung
th vú nhng không nh hng n t bào bình thng. Chính vì vy, các liu pháp

t hp  methyl hóa là rt ha hn trong u tr ung th vú. Ví d th nghim lâm
sàng kt hp trastuzumab vi HDACI trong u tr ung th vú [26], và th nghim
c phase II trong ung th vú - kt hp valproic acid (VPA) vi FEC100 (5-
fluorouracil, epirubicin, và cyclophosphamide) cng ang c tin hành [27].
Trong công b tng quan vào nm 2013 [28], các tác giã tóm tt tình hình th
nghim lâm sàng hin ti ca các biomarker ã c nghiên cu rng rãi và ánh giá
13
hiu lc tt, da trên thông tin methyl hóa bt thng ca DNA trong nhiu loi ung
th nh sau:
ng 1.1. Danh sách chn lc các biomarker tim nng cho ung th
Tên gen Chc nng gen ng dng Loi ung th Loi mô s dng
SEPT9
Kim soát chu k
 bào
Chn oán sm
(early detection)
Rut Máu
TFP12
Protein nn ngoi
bào
Chn oán sm Rut Phân
CDKN2A
& CDH13
Kim soát chu k
 bào và tính kt
dính t bào
Tiên lng bnh
(prognosis)
Phi không t
bào nh

Mô, sinh thit
u bch huyt
trung tht
(mediastinal
lymph node
biospy)
MGMT
a cha DNA oán tính
nhy vi thuc
(predicting drug
sensitivity)
U thn kinh m
(glioma), rut,
phi, ung th h
ch huyt
(lymphoma)
Mô
GSTP1
Gii c oán tính
nhy vi thuc
Tuyn tin lit,
vú, thn
Mô, nc tiu
ng quan m ca hai tác gi Fukushige và Horii (thuc i hc Tohoku,
Nht bn, B môn Bnh hc Phân t) trong công b va nêu  trên [28], là các tác gi
khác nh Baylin và John (2011) [29], Heyn và Esteller (2012) [30], Thông tin v
tính cht methyl hóa bt thng trên các gen c chn làm du chng cng nh hiu
bit v chc nng ca chúng trong ung thang gia tng nhanh chóng cng nh vào
các thành qu nghiên cu trên tng th b gen (genome-wide), s phát trin ca
nhng k thut phát hin rt nhy – bao gm c công ngh nano, tính tin li trong

phát hin tính cht methyl hóa t nhiu loi bnh phm khác nhau, trong ó các tác
giu c bit nhn mnh v kh nng s dng các loi mu nh máu và các dch c
14
th khác (c thu nhn ch bng nhng th thut xâm ln ti thiu – minimally
invasive procedures). ây chính là m li th ca mt biomarker tim nng khi s
ng tính cht methyl hóa bt thng trong tiên lng và chn oán sm bnh ung
th.
1.2. Tng quan v các gen RASSF1A, BRCA1, cyclin D2, GSTP1 và
p16
INK4a
:
1.2.1. Gen RASSF1A:
1.2.1.1. Cu trúc và chc nng:
RASSF1A (Ras association domain family 1 isoform A) hay còn c bit n
i các tên khác nh 123F2, NORE2A, RAD32, REH3P21 là mt gen è nén u nm
trong vùng 3p21.3 trên nhim sc th s 3 ca b gen ngi [31]. RASSF1 dài khong
18000 bp, bao gm 8 exon và 7 intron, to thành 8 vùng phiên mã khác nhau t
RASSF1A ti RASSF1H [31]. Trong ó, RASSF1A bao gm các exon 1, 2, 3, 4, 5,
6 mã hóa cho mt chui polypeptide ngn vi 340 amino acid có trng lng phân t
là 38,8 kD [32, 33].
Trong t bào bình thng, RASSF1A là gen è nén u tham gia vào con ng
u hòa s phát trin và cht theo chu trình ca t bào [32]. RASSF1A cùng nh v
(co-localizes) vi các si thoi  kì trung gian, vi các si t vô sc và trung th trong
sut quá trình nguyên phân, m bo tính n nh các si thoi và bo v t bào chng
i các tác nhân phân hy polymer thành các monomer. Khi RASSF1A liên kt vi
các si thoi thì các bin i ca nó b thiu ht dn ti c ch tng hp DNA và c
ch s phát trin ca t bào [32, 34].
Bên cnh ó, RASSF1A có th gây kìm hãm chu trình t bào thông qua protein
Rb (Retinoblastoma protein)  kim soát chu trình t bào. Nó c ch quá trình tích
y ca cyclin D1 - gen u khin hin tng phosphoryl hóa Rb và kim soát

chng trình cht ca t bào t pha G1. Tó, RASSF1A có thc ch s tip din
a chu trình t bào ti giai n chuyn i G1/S. ng thi, s kìm hãm phát trin
 bào ca RASSF1A cng có th mt i do s biu hin sai ca các cyclin [33, 35].
t khác, chu trình t bào có th b kim soát gián tip khi RASSF1A liên kt vi
Cdc20 - mt nhân tu hòa chu trình t bào ch yu cn thit cho vic hoàn tt quá
trình nguyên phân, nó hot ng nh tác nhân kích hot ca phc hp kích thích kì
15
sau APC (anaphase-promoting complex). Sau khi liên kt vi RASSF1A, Cdc20 s
không kích hot APC và chu trình t bào s b chn li ti thi m trc kì gia
nguyên phân [31, 32, 34]. Nh vy, RASSF1A hot ng trong giai n trc kì
gia ca nguyên phân s trì hoãn quá trình này din ra, tó ngn chn hin tng
t gãy ca các cyclin và n nh chúng [36]. Tuy nhiên, theo nghiên cu ca Liu và
ng s, s tng tác gia RASSF1A và phc hp Cdc20-APC ã không c xác
nhn [37]. Vì vy, vai trò ca Cdc20-APC trong vic RASSF1A kim soát gián tip
chu trình t bào cn c nghiên cu sâu hn [31, 32].
Vai trò ca RASSF1A còn c chng minh nh mt nhân t kích hot con
ng cht theo chng trình ca Ras-protein hot ng liên quan n tng cng s
phát trin, chuyn hóa và tn ti ca t bào [31, 32]. Cng nh NORE1A (novel Ras
effector 1 isoform A)-nhân t kích hot Ras, RASSF1A có th t hp vi các
enzyme u hòa quá trình “tin apoptosis” (pro-apoptosis), serine/threonine kinase
MST1, MST2 (mammalian sterile twenty) u khin Ras theo con ng cht
theo chng trình [32-34]. Tht vy, khi RASSF1A và NORE1A tng tác vi MST1
o phc hp NORE1A/RASSF1A-MST1 s kích hot cho con ng cht theo chu
trình t bào. Phc hp này i din cho con ng cht theo chu trình bt thng
c u khin bi Ras trong t bào [38], tó dn ti kìm hãm s phát trin ca
khi u. Có th tóm tt vai trò sinh hc ca RASSF1A bng s sau:
Hình 1.2. Tóm tt vai trò sinh hc ca RASSF1A
1.2.1.2. S methyl hóa ca RASSF1A trong ung th:
16
Các hot ng methyl hóa bt thng ti các o CpG thuc vùng promoter

óng vai trò ch yu trong vic làm mt i chc nng sinh hc cnh ca các gen è
nén u và hin tng này i vi gen RASSF1Aã c chng minh khá rõ. Hin
ng mt biu hin ca gen RASSF1A do s methyl hóa quá mc  vùng promoter ã
c phát hin trong nhiu loi ung th nh: ung th vú, ung th c t cung, ung th
phi, ung thu và c, ung th d dày, ung th bung trng, … [39, 32, 40, 41] và
tính cht methyl hóa này ca RASSF1A him khi c tìm thy trong các mô bình
thng và chc tìm thy trong vài mu mô không ung th gn k vi các khi u
[32]. Chính vì vy, có th xem hin tng methyl hóa quá mc ca RASSF1A là mt
 kin xy ra sm trong quá trình phát sinh ung th; hn na hot ng ca gen này
tuân theo mô hình Knudson trong s tích ly t bin  hình thành ung th: s
methyl hóa ti các o CpG thuc vùng promoter dn n s bt hot c xem là
din ra trc (“first hit”), và tip theo là s mt n  vùng 3p (“second hit”) [40,
42].
1.2.2. Gen BRCA1:
1.2.2.1. Cu trúc và chc nng:
BRCA1 (Breast cancer gene 1) hay còn c bit n vi nhiu tên gi khác nh
IRIS; PSCP; BRCAI; BRCC1; PNCA4; RNF53; BROVCA1 là mt gen è nén u nm 
vùng 17q21 nm trên nhim sc th s 17 ca b gen ngi. BRCA1 dài khong
80000 bp bao gm 24 exon trong ó có 22 exon mã hóa cho protein. mRNA do
BRCA1 phiên mã có kích thc 7,8 kb và mã hóa cho mt phân t protein gm 1863
amino acid vi trng lng phân t là 220 kDa [43]. Trình t protein ca BRCA1
không tng ng vi các trình t protein khác ã c bit, nhng các trình t bo
n c nhn thy trên gen ã cho thy mt vài manh mi  suy lun v chc nng
a nó. BRCA1 có mt vùng “RING” u N, là ni có th gián tip to các tng
tác protein - DNA hoc protein-protein [43, 44] (Hình 1.3). Thông qua vùng RING
này, BRCA1 s tng tác vi BARD1 (BRCA1 associated RING domain 1)  to
thành phc hp BRCA1-BARD1 tham gia vào quá trình ubiquitin hóa [45]. Bên cnh
ó, trên BRCA1 có cha các trình t nh v nhân NLS (Nuclear localization
sequence) và các vùng gia tng t l biu hin gen [46]. BRCA1 còn có vùng trình t
o tn lp li. S lp li ca BRCT u C (BRCA1 C-terminal) là ca các motif