khảo sát một số chỉ tiêu vi sinh trong nước uống đóng chai và nước khoáng thiên nhiên trên địa bàn tỉnh bình dương

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.19 MB, 86 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH TRONG NƯỚC UỐNG ĐĨNG CHAI VÀ NƯỚC KHỐNG THIÊN NHIÊN TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH

BÌNH DƯƠNG.

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ.

CBDH:

ThS. Nguyễn Văn Minh ThS. Trần Thị Ánh Nguyệt

SVTH:

Huỳnh Thị Lệ Hằng

MSSV: 1253010111 Khóa: 2012 – 2016

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

ThS. Dương Nhật Linh, ThS. Trần Thị Ánh Nguyệt và ThS. Chu Nguyên Thanh đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm giúp em hoàn thành bài báo cáo tốt nghiệp.

Qua đây, em xin chân thành cảm ơn trung tâm Kỹ Thuật Tiêu chuẩn Đo Lường Chất Lượng 3 đã tạo mọi điều kiện để em hồn thành khóa thực tập, cảm ơn tất cả các anh chị tại phòng Kiểm nghiệm Vi sinh – GMO, đặc biệt biết ơn cô Dương Thị Phương Dung, chị Nguyễn Uyên Vy đã nhiệt tình dẫn dắt và chỉ bảo em trong suốt thời gian qua.

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời tri ân chân thành đến các thầy cô trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp em được thực tập tốt nghiệp tại một nơi có uy tín và chun mơn cao. Đặc biệt, cảm ơn ban chủ nhiệm bộ môn công nghệ sinh học cùng tất cả các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.

Em xin cảm ơn các thầy cô Hội đồng chấm bài đã dành thời gian xem xét bài báo cáo cho em. Em rất mong được nhận nhiều ý kiến đóng góp quý báu từ thầy, cơ để em thêm có nhiều kiến thức, kinh nghiệm cho con đường nghiên cứu phía trước. Cuối cùng, con xin cảm ơn cha mẹ cùng những người thân trong gia đình ln động viên , cổ vũ tinh thần và tạo mọi điều kiện cho con trong suốt quá trình học tập. Cảm ơn bạn bè đã ln ở bên cạnh, ủng hộ, giúp đỡ mình trong suốt thời gian qua.

Xin chúc quý thầy cô và những người đã luôn quan tâm giúp đỡ em thật dồi dào sức khỏe, thành công trong công việc và cuộc sống.

Em xin chân thành cám ơn!

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Thị Lệ Hằng

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

ASEAN: Association of Southeast Asian Nations.

C. perfringens: Clostridium perfringens. E. coli: Escherichia coli.

P. aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa.

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

thiên nhiên . ... 10

Bảng 3.1.1.1.1: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu Coliforms trên 15 mẫu nước uống đóng

chai được lấy tại địa bàn tỉnh Bình Dương. ... 35

Bảng 3.1.1.1.2: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu E.coli trên 15 mẫu nước uống đóng chai

được lấy tại địa bàn tỉnh Bình Dương. ... 37

Bảng 3.1.1.1.3: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu Enterococci trên 15 mẫu nước uống đóng

chai được lấy tại địa bàn tỉnh Bình Dương. ... 38

Bảng 3.1.1.1.4: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu P.aeruginosa trên 15 mẫu nước uống đóng

chai được lấy tại địa bàn tỉnh Bình Dương ... 40

Bảng 3.1.1.1.5: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit trên 15

mẫu nước uống đóng chai được lấy tại địa bàn tỉnh Bình Dương ... 41

Bảng 3.1.1.2.1: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu Coliforms trên 15 mẫu nước uống đóng

chai tại phịng thí nghiệm. ... 44

Bảng 3.1.1.2.2: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu E.coli trên 15 mẫu nước uống đóng chai

tại phịng thí nghiệm. ... 45

Bảng 3.1.1.2.3: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu Enterococci trên 15 mẫu nước uống đóng

chai tại phịng thí nghiệm. ... 47

Bảng 3.1.1.2.4: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu P.aeruginosa trên 15 mẫu nước uống đóng

chai tại phịng thí nghiệm ... 48

Bảng 3.1.1.2.5: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit trên 15

mẫu nước uống đóng chai tại phịng thí nghiệm ... 50

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Bảng 3.1.2.2: Kết quả kiểm tra 5 chỉ tiêu vi sinh trên 15 mẫu nước khoáng thiên nhiên tại phịng thí nghiệm ... 54

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1.1.1.1: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ đạt và không đạt về chỉ tiêu Coliforms của

15 mẫu nước uống đóng chai được lấy tại Bình Dương ... 36

Biểu đồ 3.1.1.1.2: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ đạt và không đạt về chỉ tiêu E.coli của 15

mẫu nước uống đóng chai được lấy tại Bình Dương ... 37

Biểu đồ 3.1.1.1.3: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ đạt và không đạt về chỉ tiêu Enterococci

của 15 mẫu nước uống đóng chai được lấy tại Bình Dương ... 39

Biểu đồ 3.1.1.1.4: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ đạt và không đạt về chỉ tiêu P.aeruginosa

của 15 mẫu nước uống đóng chai được lấy tại Bình Dương ... 40 Biểu đồ 3.1.1.1.5: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ đạt và không đạt về chỉ tiêu bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit của 15 mẫu nước uống đóng chai được lấy tại Bình Dương .... 42

Biểu đồ 3.1.1.2.1: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ đạt và không đạt về chỉ tiêu Coliforms của

15 mẫu nước uống đóng chai tại phịng thí nghiệm ... 44

Biểu đồ 3.1.1.2.2: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ đạt và không đạt về chỉ tiêu E.coli của 15

mẫu nước uống đóng chai tại phịng thí nghiệm ... 46

Biểu đồ 3.1.1.2.3: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ đạt và không đạt về chỉ tiêu Enterococci

của 15 mẫu nước uống đóng chai tại phịng thí nghiệm ... 47

Biểu đồ 3.1.1.2.4: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ đạt và không đạt về chỉ tiêu P.aeruginosa

của 15 mẫu nước uống đóng chai tại phịng thí nghiệm ... 49

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

Biểu đồ 3.1.2.1: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ đạt và không đạt về các chỉ tiêu vi sinh vật

của 15 mẫu nước khoáng thiên nhiên được lấy tại Bình Dương ... 53

Biểu đồ 3.1.2.2: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ đạt và không đạt về các chỉ tiêu vi sinh vật của 15 mẫu nước khống thiên nhiên tại phịng thí nghiệm ... 55

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.2.3: Hình ảnh E.coli dưới kính hiển vi điện tử. ... 13

Hình 1.2.4: Hình ảnh Enterococci dưới kính hiển vi điện tử. ... 15

Hình 1.2.5: Hình ảnh P. aeruginosa dưới kính hiển vi điện tử. ... 16

Hình 1.2.6 :Hình ảnh bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit dưới kính hiển vi. ... 18

Hình 3.1.4.1.1: Khuẩn lạc E. coli phát triển trên môi trường Lactose TTC. ... 57

Hình 3.1.4.1.2: Coliforms (-) trên mơi trường Lactose TTC. ... 57

Hình 3.1.4.1.3: Khuẩn lạc E. coli trên mơi trường TSA. ... 57

Hình 3.1.4.1.4: Phản ứng thử nghiệm khả năng sinh Indole của E. coli... 57

Hình 3.1.4.1.5: Thử nghiệm oxidase dương tính. ... 58

Hình 3.1.4.2.1: Khuẩn lạc Enterococci phát triển trên môi trường Slanetz- Batley. ... 58

Hình 3.1.4.2.2: Enterococci (-) trên mơi trường Slanetz- Batley. ... 58

Hình 3.1.4.2.3: Khuẩn lạc Enterococci trên mơi trường bile aesculin. ... 58

Hình 3.1.4.3.1: Khuẩn lạc Pseudomonas trêm mơi trường Pseudomonas agar. . 59 Hình 3.1.4.3.2: Khuẩn lạc Pseudomonas (-) trên môi trường Pseudomonas agar.

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

Sơ đồ 2.2.1: Quy trình kiểm tra chung. ... 24

Sơ đồ 2.2.2.1: Quy trình kiểm tra Coliforms và E.coli trên mẫu nước uống đóng

chai. ... 26 Sơ đồ 2.2.2.2: Quy trình kiểm tra bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit trên mẫu nước uống đóng chai.. ... 28

Sơ đồ 2.2.2.3: Quy trình kiểm tra Enterococci trên mẫu nước uống đóng chai .. .30 Sơ đồ 2.2.2.4: Quy trình kiểm tra P. aeruginosa trên mẫu nước uống đóng chai...33

DANH MỤC PHỤ LỤC.

Phụ lục 1 : Hóa chất và mơi trường. Phụ lục 2: Thiết bị thí nghiệm.

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1

MỤC TIÊU ... 3

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 4

1.1 Tổng quan về Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu chuẩn Đo Lường Chất Lượng 3 ( QUATEST 3 ) ... 5

1.1.1 Giới thiệu chung ... 5

1.2.5 Tổng quan về Pseudomonas aeruginosa ... 16

1.2.6 Tổng quan về bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit ... 18

1.2.7 Phương pháp màng lọc ... 19

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 20

2.1 Vật liệu ... 21

2.1.1 Mẫu kiểm nghiệm ... 21

2.1.2 Địa điểm và thời gian thực hiện ... 21

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị ... 21

2.1.4 Hóa chất và mơi trường ... 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu ... 24

2.2.1 Quy trình kiểm tra chung ... 24

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

3.1 Kết quả ... 35

3.1.1 Kết quả đánh giá 5 chỉ tiêu vi sinh của mẫu nước uống đóng chai ... 35

3.1.2 Kết quả đánh giá 5 chỉ tiêu vi sinh của mẫu nước khoáng thiên nhiên 52 3.1.3 So sánh kết quả kiểm tra 5 chỉ tiêu vi sinh trên 30 mẫu nước uống đóng chai và 30 mẫu nước khoáng thiên nhiên ... 56

3.1.4 Hình ảnh ni cấy và test sinh hóa ... 57

3.2 Thảo luận ... 61

3.2.1 Đối với mẫu nước uống đóng chai: ... 61

3.2.2 Đối với mẫu nước khoáng thiên nhiên ... 61

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ... 62

4.1 Kết luận ... 63

4.1.1 Mẫu nước uống đóng chai ... 63

4.1.2 Mẫu nước khống thiên nhiên ... 63

4.2 Đề nghị ... 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 65

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nước uống là một nhu cầu thiết yếu của con người. Xã hội không ngừng phát triển, cuộc sống con người ngày càng được cải thiện thì nhu cầu về chất lượng nước uống được quan tâm nhiều hơn.

Hiện nay, thị trường nước uống đóng chai, nước khoáng thiên nhiên tại Việt Nam phát triển nhanh một cách nhanh chóng do tính tiện lợi trong sử dụng và kiểu dáng đẹp mắt. Theo số liệu thống kê, cả nước có hàng nghìn cơ sở sản xuất, kinh doanh nước uống đóng chai nhưng chủ yếu là do các cơ sở sản xuất quy mô vừa và nhỏ cung cấp. Thị trường nước uống đóng chai ngày càng mở rộng với các sản phẩm đa dạng, phong phú về chủng loại, thành phần và giá cả[1]. Theo số liệu thống kê năm 2009, tại thành phố Hồ Chí Minh có 326 cơ sở sản xuất nước uống đóng chai, đóng bình được cấp phép hoạt động, quản lý; tại Sóc Trăng có khoảng 70 cơ sở sản xuất; tại An Giang và Đồng Tháp là khoảng 50 cơ sở; tại Vĩnh Phúc hiện có 34 doanh nghiệp, cơ sở sản xuất nước uống đóng chai, đóng bình các loại.[24]

Bên cạnh những sản phẩm chất lượng, uy tín vẫn cịn tồn tại khơng ít các sản phẩm có chất lượng kém.Mặc dù, việc kiểm định chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm được các cơ quan chức năng thực hiện thường xuyên nhưng vẫn không kiểm sốt hết được những sản phẩm kém chất lượng trơi nổi trên thị trường. Tháng 6 năm 2015, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm tỉnh Kon Tum đã tiến hành kiểm tra 8 cơ sở sản xuất nước uống đóng chai, đóng bình trên địa bàn tỉnh Kon Tum. Sau kiểm tra, 4 cơ sở sản xuất bị xử phạt do vi phạm về các hành vi như:người quản lý, người trực tiếp sản xuất chưa được khám sức khỏe định kỳ theo quy định, khơng có giấy xác nhận kiến thức về an toàn thực phẩm; sử dụng người lao động không mang, mặc trang phục bảo hộ lao động; không bảo đảm khoảng cách an toàn đối với nguồn ô nhiễm [22]. Tháng 10 năm 2015, Chi cục VSATTP tỉnh Quãng Ngãi lập biên bản xử phạt và đình chỉ hoạt động cơ sở sản xuất nước uống đóng chai Đại Dương tại Tỉnh Quãng Ngãi do phát hiện cơ sở này sử dụng nguồn nước nguy cơ ô nhiễm cao để sản xuất nước uống đóng chai; điều kiện vệ sinh cơ sở, trang thiết bị,

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

dụng cụ sản xuất thực phẩm chưa đảm bảo; bố trí chưa theo nguyên tắc một chiều; khu chiết rót tạm bợ, có tính chất đối phó (vịi chiết rót kéo ra ngồi để chiết rót); nhân viên trực tiếp tham gia sản xuất chưa mang bảo hộ lao động…[23] Do đó, người tiêu dùng khi sử dụng những sản phẩm này sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe. Khả năng nhiễm đối với các loại sản phẩm đồ uống thuộc các thương hiệu nổi tiếng trên thị trường tuy thấp nhưng vẫn có. Chính vì thế, các bệnh liên quan tới ăn uống như rối loạn đường tiêu hóa, hơ hấp, tiêu chảy… khơng ngừng phát triển thậm chí thành dịch ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, điển hình trong những loại vi sinh vật gây hại cho sức khỏe con người có nhiều trong nước

uống đóng chai là Coliforms, Escherichia coli (chiếm đến 98%)[1]. Theo QCVN 6-1/BYT, ngoài 2 chỉ tiêu Coliforms và E. coli, 3 chỉ tiêu vi sinh là Enterococci, P.

aeruginosa,bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit cũng cần được kiểm định để đánh giá

độ an tồn của nước uống đóng chai và nước khoáng thiên nhiên .[4]

Từ thực trạng nêu trên, để đánh giá mức độ an toàn vệ sinh của các sản phẩm nước uống đóng chai trên thị trường, bản thân tơi cũng có một sự quan tâm đặc biệt đến tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm và mong muốn được thực hiện, trải nghiệm thực tế các phương pháp và kỹ năng đề kiểm tra vi sinh vật. Được sự đồng ý của khoa Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Mở thành phố Hồ Chí Minh, sự cho phép của Ban lãnh đạo Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu chuẩn Đo Lường Chất Lượng 3, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng nhiễm một số chỉ tiêu vi sinh trong nước uống đóng chai và nước khống thiên nhiên trên địa bàn tỉnh Bình Dương”, dựa trên QCVN 6-1.[4]

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

MỤC TIÊU

Khảo sát khả năng nhiễm năm vi sinh: Coliforms, Escherichia coli,

Enterococci, Pseudomonas aeruginosa, bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit trong

nước uống đóng chai, nước khoáng thiên nhiên trên địa bàn tỉnh Bình Dương từ tháng 10/2015 đến tháng 04/2016 dựa trên QCVN 6-1: 2010/BYT.[4]

NỘI DUNG

- Tìm hiểu về Coliforms, Escherichia coli, Enterococci, Pseudomonas

aeruginosa, bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit.

- Khảo sát tỷ lệ nhiễm Coliforms, Escherichia coli, Enterococci, Pseudomonas

aeruginosa, bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit trong các loại nước uống đóng chai,

nước khống thiên nhiên trên địa bàn tỉnh Bình Dương .

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

1.1 Tổng quan về Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu chuẩn Đo Lường Chất Lượng 3 ( QUATEST 3 )

1.1.1 Giới thiệu chung

QUATEST 3 là tổ chức khoa học công nghệ thuộc Tổng cục Tiêu chuẩn Đo

lường Chất lượng – Bộ Khoa học và Công nghệ, được thành lập từ tháng 5 năm 1975 trên cơ sở Viện Định chuẩn Quốc gia trước đây.

QUATEST 3 có đội ngũ chuyên viên, kỹ thuật viên được đào tạo chuyên sâu

và có nhiều kinh nghiệm, hệ thống phịng thí nghiệm với trang thiết bị hiện đại theo chuẩn mực quốc tế.

QUATEST 3 áp dụng hệ thống quản lý chất lượng theo tiêu chuẩn ISO 9001

cho hoạt động điều hành, hoạt động tư vấn đào tạo và Trang thiết bị thí nghiệm, lĩnh vực thí nghiệm được công nhận phù hợp với tiêu chuẩn ISO/IEC 17025, lĩnh vực giám định hàng hóa được cơng nhận phù hợp với ISO/IEC 17020, lĩnh vực chứng nhận sản phẩm được công nhận phù hợp với ISO/IEC Guide 65 và lĩnh vực cung cấp dịch vụ thử nghiệm thành thạo theo ISO/IEC 17043.

Qua hơn 35 năm hoạt động, QUATEST 3 đã được biết đến như một đơn vị

hàng đầu tại Việt Nam trong lĩnh vực cung cấp dịch vụ kỹ thuật về tiêu chuẩn, đo lường, chất lượng và đánh giá sự phù hợp.

Với nỗ lực nâng cao năng lực kỹ thuật của các phòng thử nghiệm để được thừa nhận quốc tế và khu vực. Phòng thử nghiệm Vi sinh – GMO của QUATEST 3 được các nước ASEAN chọn là phòng thử nghiệm đối chứng ( ASEAN Reference Laboratory – ARL) theo chương trình EC – ASEAN và Phòng thử nghiệm Điện được các nước ASEAN thừa nhận kết quả thử nghiệm đối với các sản phẩm điện gia dụng theo thoả thuận thừa nhận lẫn nhau trong lĩnh vực thử nghiệm điện và điện tử (ASEAN EE MRA).

QUATEST 3 đang triển khai chương trình mở rộng sự thừa nhận của khu vực và quốc tế cho các lĩnh vực thử nghiệm khác.[16]

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

1.1.1 Nhiệm vụ

QUATEST 3 cung cấp các dịch vụ kỹ thuật về tiêu chuẩn, đo lường, chất lượng và đánh giá sự phù hợp phục vụ quản lý nhà nước và yêu cầu của các tổ chức, doanh nghiệp. Các nhiệm vụ chính bao gồm:

- Kiểm tra, giám định và thẩm định kỹ thuật về chất lượng, vệ sinh, an toàn của sản phẩm, hàng hóa, vật liệu, cấu kiện cơng trình.

- Thử nghiệm vật liệu, sản phẩm, hàng hóa.

- Kiểm định, hiệu chuẩn và đánh giá phương tiện đo.

- Chứng nhận sự phù hợp của sản phẩm với tiêu chuẩn và qui chuẩn kỹ thuật, chứng nhận rau, quả và chè an toàn phù hợp với VietGAP.

- Kiểm định và đánh giá an tồn cơng nghiệp.

- Khảo sát, quan trắc, phân tích, đánh giá thực trạng và tác động mơi trường. - Khảo sát, đánh giá các điều kiện kỹ thuật, thực trạng công nghệ, chuyển giao công nghệ.

- Đào tạo và tư vấn năng suất chất lượng, ứng dụng kỹ thuật mã số - mã vạch.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

- Đào tạo nghiệp vụ, chuyên môn và kỹ thuật về tiêu chuẩn đo lường chất lượng.

- Nghiên cứu, chế tạo và cung cấp các chuẩn đo lường, mẫu chuẩn và các phương tiện đo. Trang bị và cung cấp dịch vụ bảo trì, bảo dưỡng và sửa chữa các phương tiện đo lường, thử nghiệm, thiết bị kỹ thuật.

- Tiếp nhận đăng ký và tư vấn ứng dụng mã số, mã vạch.

- Cung cấp thông tin, tiêu chuẩn và các tài liệu liên quan đến tiêu chuẩn, đo lường, chất lượng.[16]

1.1.3

Các lĩnh vực hoạt động của Trung Tâm

- Dịch vụ thử nghiệm. - Dịch vụ do lường. - Dịch vụ giám định. - Kiểm tra.

- Chứng nhận. - Dịch vụ tư vấn.

1.1.4.2 Phương pháp thử nghiệm

TCVN, USFDA, ISO, AOAC…

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

1.1.5 Chính sách chất lượng

QUATEST 3 cam kết luôn làm hài lòng khách hàng khi cung cấp các dịch vụ kỹ thuật tiêu chuẩn, đo lường, chất lượng theo nguyên tắc:[16]

- Chính xác. - Khách quan. - Kỵp thời. - Hiệu quả.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

1.2 Tổng quan về đề tài

1.2.1 Tổng quan về nước uống đóng chai, nước khống thiên nhiên.

1.2.1.1 Nước uống đóng chai

Sản phẩm nước đóng chai là loại nước được sử dụng để uống trực tiếp, có thể

phải là nước khống thiên nhiên đóng chai và không chứa đường, các chất tạo ngọt, các chất tạo hương hoặc bất kỳ chất nào khác.

Yêu cầu chất lượng nguồn nước sử dụng để sản xuất nước uống đóng chai. Nước sử dụng để sản xuất nước uống đóng chai phải đáp ứng các yêu cầu theo QCVN 01:2009/BYT về chất lượng nước ăn uống được ban hành kèm theo Thông tư số 04/2009/TT-BYT ngày 17 tháng 06 năm 2009 của Bộ trưởng Bộ Y tế. [4]

1.2.1.2 Nước khoáng thiên nhiên

Nước khoáng thiên nhiên được phân biệt rõ ràng với các loại nước uống khác qua các tiêu chí:[4]

- Có hàm lượng một số muối khoáng nhất định với tỷ lệ tương quan của chúng và sự có mặt của các nguyên tố vi lượng hoặc các thành phần khác.

- Khai thác trực tiếp từ các nguồn thiên nhiên hoặc giếng khoang từ các mạch nước ngầm trong phạm vi vành đai bảo vệ để tránh bất kì sự ơ nhiễm nào hoặc yếu tố ngoại lai ảnh hưởng đến chất lượng lý, hóa của nước khống thiên nhiên.

- Khơng thay đổi về thành phần cấu tạo, ổn định về lưu lượng và nhiệt độ cho dù có biến động của thiên nhiên.

- Được khai thác trong điều kiện đảm bảo độ sạch ban đầu về vi sịnh vật và cấu tạo hóa học của các thành phần đặc trưng.

- Được đóng chai tại nguồn với các yêu cầu vệ sinh nghiêm ngặt và chỉ được phép xử lý để đóng chai bằng cách sử dụng một hoặc kết hợp các giải pháp kỹ thuật dưới đây nếu các giải pháp đó khơng làm thay đổi hàm lượng các thành phần cơ bản của nước khoáng thiên nhiên so với nguồn:

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

• Tách các thành phần không bền vững cũng như các hợp chất chứa sắt, mangan, sulfid hoặc asen bằng cách gạn và/hoặc lọc và trong trường hợp cần thiết có thể xử lý nhanh bằng phương pháp sục khí nước.

• Khử hoặc nạp khí carbon dioxyd.

• Tiệt trùng bằng tia cực tím.

1.2.1.3 Các chỉ tiêu vi sinh vật của nước uống đóng chai, nước khoáng thiên nhiên

Bảng 1.2.1.3: Các chỉ tiêu vi sinh vật trong nước uống đóng chai, nước khống thiên nhiên.[4]

I. Kiểm tra lần đầu

Phân loại

chỉ tiêu

TCVN 6187-1:2009 (ISO 9308-1:2000,

With Cor 1:2007) A

2. Coliform tổng

số

1 x 250 ml

Nếu số vi khuẩn (bào tử) ≥1 và ≤2 thì tiến hành kiểm

tra lần thứ hai. Nếu số vi khuẩn (bào tử) > 2 thì loại

bỏ.

TCVN 6187-1:2009 (ISO 9308-1:2000,

With Cor 1:2007) A

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

5. Bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit

(ISO 6461-2:1986) A

II. Kiểm tra lần thứ hai

lấy mẫu

loại chỉ tiêu 6)

khử sulfit

6191-2:1996 (ISO 2:1986)

6461-A

6) Chỉ tiêu loại A: bắt buộc phải thử nghiệm để đánh giá hợp quy.

7) n: số đơn vị mẫu được lấy từ lô hàng cần kiểm tra.

8) c: số đơn vị mẫu tối đa có thể chấp nhận hoặc số đơn vị mẫu tối đa cho phép vượt quá chỉ tiêu vi sinh vật m. Nếu vượt quá số đơn vị mẫu này thì lơ hàng được coi là khơng đạt.

9) m: số lượng hoặc mức tối đa vi khuẩn có trong 1 gam sản phẩm; các giá trị vượt q mức này thì có thể được chấp nhận hoặc không được chấp nhận.

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

10) M: là mức vi sinh vật tối đa được dùng để phân định giữa chất lượng sản phẩm có thể đạt và không đạt.

1.2.2 Tổng quan về Coliforms

1.2.2.1 Đặc điểm của của Coliforms

Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng

trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các loại vi sinh vật khác, chúng được sử dụng rộng rãi vì dễ phát hiện và định lượng.

Coliforms gồm những vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi, Gram âm,

khơng sinh bào tử, hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy lỏng ở 37οC trong 24 đến 48 giờ.

Phân loại: Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: - E.coli.

- Citrobacter. - Klebsiella. - Enterobacter.

Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men đường lactose

sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi ủ ở 44οC trong môi trường canh EC.

Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh

indole khi ủ khoảng 24 giờ ở 44οC trong canh Trypton.[7]

1.2.2.2 Phân bố

Coliforms có thể được tìm thấy trong đất, trên thảm thực vật hoặc trên mặt

nước. Một số Coliforms sống trong ruột của người và động vật máu nóng. [13]

1.2.2.3 Khả năng gây bệnh

Hầu hết vi khuẩn Coliforms không gây bệnh cho con người nhưng một số có

thể gây ra các bệnh nhẹ và một số ít có thể dẫn các bệnh nghiêm trọng lây truyền qua đường nước.[15]

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

1.2.3 Tổng quan về Escherichia coli

Hình 1.2.3: Hình ảnh E.coli dưới kính hiển vi điện tử.[18]

1.2.3.1 Đặc điểm của của Escherichia coli

Escherichia coli là vi sinh vật hình que, Gram âm, thuộc nhóm Faecal Coliform, hai đầu trịn, có lơng quanh tế bào, kích thước trung bình 2-3 µm x 0,5

µm. E.coli thường đứng riêng lẻ, đơi khi xếp thành chuỗi ngắn, di động, khơng hình

thành nha bào, có tính chất sinh hóa đặc trưng: thử nghiệm IMViC ( ++--).

Các loại độc tố: E. coli sinh nội độc tố và ngoại độc tố.

- Nội độc tố: gồm hai loại là enterotoxin LT ( không bền với nhiệt, gây tiêu chảy mất nước) và enterotoxin ST ( kích thích bài tiết nước muối gây tiêu chảy).

- Ngoại độc tố: mang tính kháng ngun. Đặc điểm ni cấy:

- E. coli có nhiệt độ phát triển thích hợp là 37οC, pH = 7,4.

- Mọc tốt trên môi trường dinh dưỡng thông thường, chịu được nhiệt độ biến thiên từ 4 – 45οC.

- Môi trường thạch dinh dưỡng tạo khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng đục hơi lồi để lâu có dạng khơ rìa hơi nhăn.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

- Trên thạch máu có chủng dung huyết α hoặc β. - Trên thạch gelatin không tan chảy.

- Môi trường canh dinh dưỡng: làm đục đều môi trường, sau khi lắng xuống đáy, có màu tro nhạt đơi khi có màu xám, có mùi trứng thối.

- Trên môi trường Eosin mythylen blue (EMB) tạo khuẩn lạc tím ánh kim. - Mơi trường MacConkey (MCK) tạo khóm đỏ hồng.

- Mơi trường Kligler iron agar (KIA) lên men đường glucose và lactose (vàng / vàng), sinh gas, không sinh H2S.

- Môi trường Brilliant green agar (BGA) tạo khuẩn lạc xanh lá mạ.[1,7]

1.2.3.2 Phân bố

E. coli tồn tại trong hệ tiêu hóa của người và động vật máu nóng. Hầu hết các

chủng E.coli khơng gây bệnh, chúng chỉ gây bệnh khi hệ miễn dịch của vật chủ suy

yếu, gây ngộ độc thực phẩm, viêm phúc mạc,…[10]

E. coli có mặt rất nhiều trong phân người và động vật. Trong phân tươi, đậm

độ của chúng có thể đến 109/g. Chúng được tìm thấy trong nước cống rãnh, trong các công đoạn xử lý và trong tất cả các nguồn nước và đất vừa mới bị nhiễm phân

từ người, động vật hoặc do sản xuất nông nghiệp, sự có mặt của E. coli trong nước

chỉ mức độ ô nhiễm trực tiếp với vấn đề phân.[1,13]

1.2.3.3 Khả năng gây bệnh

Hiện có hàng trăm chủng E. coli, nhưng chỉ có một số chủng E. coli gây bệnh

E. coli có thể gây nhiễm trùng tiêu chảy, đường tiết niệu, bệnh đường hô hấp, nhiễm

trùng máu, và các bệnh khác.[14]

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

1.2.4 Tổng quan về Enterococci

Hình 1.2.4: Hình ảnh Enterococci dưới kính hiển vi điện tử.[19]

1.2.4.1 Đặc điểm của Enterococci

Enterococci là cầu khuẩn Gram dương, đường kính 0,5 và 1,25 µm, thường tụ

tập thành từng cặp hoặc chuỗi ngắn, không di động, không sinh bào tử.[17] Đặc điểm nuôi cấy:[7]

- Vi sinh vật hiếu khí có khả năng phát triển trong một phạm vi nhiệt độ rộng, có khả năng phát triển ở cả hai nhiệt độ 45οC và 10οC.

- Trên môi trường thạch máu: chủ yếu không tan máu nhưng một số chủng tan máu alpha và beta.

- Trên môi trường MC: lên men đường lactose, tạo khuẩn lạc màu đỏ sậm. - Trên môi trường CLED ( cysteine lactose electrolyte-deficient ) agar: tạo khuẩn lạc nhỏ màu vàng.

- Enterococci species cũng có thể phát triển trên môi trường có chứa 6,5 %

sodium chloride và 40% muối mật.

- Khi phát triển trên môi trường có chứa aesculin, Enterococci khử aesculin, tạo khuẩn lạc màu đen.

Tính chất sinh hóa:

- Lên men sinh hơi đường glucose, lactose, manitol và các loại đường khác. - Catalase: ( -).

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

- Lên men lactose ( manitol và các loại đường khác ). - Khử aesculin

- Giảm quỳ sữa.

1.2.4.2 Phân bố

Enterococci có mặt hầu như ở khắp mọi nơi, bao gồm cả đất, thực phẩm,

nước, nhà máy, đường tiêu hóa của động vật và đường sinh dục nữ... Ở người, mật

độ của Enterococci bình thường trong phân lên đến 108 CFU/gram.[12]

1.2.5 Tổng quan về Pseudomonas aeruginosa

Hình 1.2.5: Hình ảnh P. aeruginosa dưới kính hiển vi điện tử.[20]

1.2.5.1 Đặc điểm của P. aeruginosa

P. aeruginosa là trực khuẩn Gram âm, thuộc họ Pseudomonadaceae, hình

que, tồn tại riêng lẻ, bắt cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn, thường khơng có vỏ và không sinh bào tử, kích thước tế bào khoảng 0,5-10 x 1,5-5,0 µm, di động bằng

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

tiêm mao, giới hạn nhiệt độ rất rộng từ 4 đến 43οC, nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là 37οC.[7, 11]

Đặc điểm nuôi cấy:

- P. aeruginosa là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nhưng P. aeruginosa có thể

phát triển trong mơi trường kỵ khí nếu có NO3- làm chất nhận điện tử. - Nhiệt độ phát triển tối ưu ở 37οC.

- Tăng trưởng trên môi trường nghèo dinh dưỡng chỉ gồm khoáng và một nguồn cacbon thích hợp duy nhất như acetate, pyruvate, succinate, glucose, L-valine, β-alanine, 2-ketogluconate, DL-arginine. [7]

Đặc điểm sinh hóa chính:[7] - Khơng lên men đường glucose.

- Có khả năng thủy giải gelatin, tinh bột. - Khử nitrate (+).

- Pyocyanine là sắc tố màu xanh ở pH trung tính hay kiềm, có màu đỏ trong môi trường acid, là yếu tố tạo màu xanh trong mũ xanh.

1.2.5.2 Phân bố

Pseudomonas aeruginosa sống tự do, thường được tìm thấy trong mơi trường

ẩm ướt như đất, đầm, nước, thực vật, động vật, một số thực phẩm hỏng.[7]

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

1.2.5.3 Khả năng gây bệnh

Pseudomonas aeruginosa ít khi gây bệnh ở người khỏe mạnh, chúng là một

tác nhân cơ hội gây bệnh trên người, nhiễm bệnh khi có những biến đổi làm suy yếu hệ miễn dịch của vật chủ, ảnh hưởng rộng đến khả năng hồi phục của bệnh nhân trong bệnh viện, xơ nang, bệnh về phổi, tổn thương giác mạc, bỏng, gãy xương hở Gustilo, bệnh nhân đặt nội khí quản dài hạn, nhiễm trùng máu, viêm màng não mủ và áp xe não, các bệnh liên quan đến suy giảm miễn dịch ở người già…[7,11]

Các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi Pseudomonas aeruginosa thường đề kháng

với điều trị bằng nhiều loại kháng sinh dẫn đến nhiễm trùng nghiêm trọng và dai dẳng.[7]

1.2.6 Tổng quan về bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit

Hình 1.2.6: Hình ảnh bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit dưới kính hiển vi.[21]

1.2.6.1 Đặc điểm của bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit

Clostridia là vi trực khuẩn kỵ khí, có cả hai lồi vi khuẩn gram dương và gram

âm, nhưng phần lớn là vi khuẩn gram dương, bị chết khi tiếp xúc với O2 nhưng các bào tử của chúng có thể tồn tại trong thời gian dài khi ở trong khơng khí.[8]

Đặc điểm sinh hóa.[8]

- Clostridia có khả năng lên men đường lactose.

- Thủy phân gelatine.

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

- Khử nitrate.

1.2.6.2 Phân bố

Clostridia được tìm thấy trong đất, nước, trầm tích, chất thải, trong đường ruột

bình thường của người và động vật.[9]

1.2.6.3 Khả năng gây bệnh

Hầu hết các Clostridia sống hoại sinh, nhưng một số ít gây bệnh cho con người, chủ yếu là Clostridium perfringens, C. difficile, C. tetani và C. botulinum.

Clostridium là tác nhân cơ hội liên quan đến một số bệnh ở người già và trẻ em, tác

nhân gây bệnh uốn ván và bệnh ngộ độc do thực phẩm ( Clostridium perfringens hoặc Clostridium botulinum), nhiễm trùng vết thương (C. perfringens), nhiễm trùng bệnh viện (Clostridium difficile)…[9]

1.2.7 Phương pháp màng lọc

Phương pháp màng lọc thường được dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trong mẫu nước khi tiến hành các thử nghiệm mơi trường nơi có mật độ vi sinh vật tương đối thấp, là phương pháp kết hợp giữa phương pháp lọc vô trùng và phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa petri.

Màng lọc thường dùng là màng lọc kỵ nước, in các ô vuông ngăn cản sự mọc lan của khuẩn lạc. Kích thước lỗ lọc là 0,45 µm hay 0,2 µm.

Phương pháp màng lọc bao gồm hai bước cơ bản:

- Lọc: tập trung vi sinh vật trên một mẫu nước trên màng lọc.

- Xác định số tế bào vi sinh vật dựa trên số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt màng lọc trên môi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho vi sinh vật cần kiểm định.

Dựa trên khối lượng mẫu nước ban đầu và quy ước một khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào vi sinh vật, người ta quy ra số lượng vi sinh vật đó trong một đơn vị thể tích.[7]

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

2.1.2 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm: Phịng thí nghiệm vi sinh – GMO trung tâm QUATEST 3, số 7, đường số 1, khu cơng nghiệp Biên Hồ 1, Đồng Nai.

Thời gian thực hiện: Từ 10/2015 đến 04/2016.

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

2.1.3.1 Dụng cụ

Dụng cụ thuỷ tinh: đĩa petri, ống đong, cốc đong, chai thuỷ tinh, becher, ống nghiệm.

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

Các dụng cụ khác: màng lọc ( kích thước lỗ lọc: 0,45 µm), phễu lọc vơ trùng, kẹp gấp, đèn cồn, que cấy, pipet, kéo, đầu típ pipet các loại, bút lông dầu, bông thấm nước, túi đựng mẫu vô trùng, găng tay vô trùng, khẩu trang…

2.1.3.2 Thiết bị

− Tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy vô khuẩn. − Tủ bảo quản môi trường.

− Nồi hấp tiệt trùng. − Buồng UV.

− Lò viba.

− Kính hiển vi điện tử. − Cân.

− Máy vortex.

− Máy hút chân khơng.

2.1.4 Hóa chất và mơi trường

2.1.4.1 Hóa chất

− Cồn 70ο, cồn 96ο. − Nước cất .

− Đệm phosphate. − Thuốc thử Oxidase. − Thuốc thử Kovacs’. − Thuốc thử Nessler.

2.1.4.2 Môi trường

− Lactose TTC agar. − Tryptone soya agar. − Tryptophan broth. − Ferit Sulfit agar. − Slanet & Bartley agar. − Bile aesculin azide agar.

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

− Pseudomonas Agar base/ CN agar. − Acetamid broth.

− King’s B. − Nutrients agar.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quy trình kiểm tra chung

Sơ đồ 2.2.1: Quy trình kiểm tra chung. Đồng nhất mẫu:

Lắc đều mẫu sao cho các vi sinh vật phân bố càng đều càng tốt bằng cách đổi chiều bình đựng mẫu liên tục hạn chế hiện tượng tạo bọt hoặc để bọt tan hết mới hút mẫu. Thời gian lắc đến khi phân tích mẫu không quá 3 phút (Theo TCVN 6263:1997, ISO 8261).

Lưu trữ và bảo quản mẫu:

Mẫu nước nếu chưa được phân tích thì lưu giữ nhiệt độ 2οC đến 5οC, phân tích trong vòng 8 giờ ( Theo TCVN 5993, ISO 5667- 3).

Các mẫu sau khi phân tích cũng cần lưu giữ ở nhiệt độ trên.

2.2.2 Phương pháp phân tích vi sinh vật

2.2.2.1 Phát hiện và định lượng Coliforms và Escherichia coli bằng phương pháp màng lọc theo TCVN 6187-1:2009, ISO 9308-1:2000

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

− Ủ TSA ở (36 ± 2) οC/ (21 ± 3) giờ và thực hiện phản ứng oxidase.

− Ủ ống canh thang Tryptophan ở (44 ± 0.5) οC/ (21 ± 3) giờ và kiểm tra khả năng sinh Indole bằng cách nhỏ 0,2 – 0,5 ml thuốc thử Kovacs’. Nếu màu đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường thì chứng tỏ có sinh Indole.[5]

2.2.2.1.4 Kết luận

− Khuẩn lạc có phản ứng oxidase âm tính thì được coi là Coliforms.

− Khuẩn lạc có phản ứng oxidase âm tính và dương tính với Indole là E.coli.[5]

2.2.2.1.5 Kết quả

Số lượng Coliforms và E.coli được tính như sau:[5]

BxVxC

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Sơ đồ kiểm nghiệm được tóm tắt theo sơ đồ 2.2.2.1:

Sơ đồ 2.2.2.1: Quy trình kiểm tra Coliforms và E.coli trên mẫu nước uống

đóng chai, nước khoáng thiên nhiên.

Chuẩn bị, đồng nhất mẫu

- Oxidase (-), Indole (+): E. Coli.

Chọn khuẩn điển hình ( màu vàng ) cấy vào ống mơi trường Tryptophan.

Ủ 44οC/21 giờ.

Thử Indole (thuốc thử Kovac’s).

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

2.2.2.2 Phát hiện và định lượng bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit bằng phương pháp màng lọc theo TCVN 6191-2:1996, ISO 6461-2:1986

− Đặt màng lọc và phễu lọc lên máy hút chân khơng, rót mẫu vào phễu lọc, tiến hành lọc mẫu.

− Sau khi lọc, tháo màng lọc bằng kẹp đã tiệt trùng.

− Đặt màng lọc lên thạch đĩa mơi trường sulfit sao cho khơng có bọt khí dưới màng lọc, rót khoảng 18 ml môi trường thạch sulfit đã làm nguội đến 50οC. Ủ kỵ khí ở (37 ± 1) οC / (20 ± 4) giờ và (44 ± 4) giờ.[6]

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

Sơ đồ kiểm nghiệm được tóm tắt theo sơ đồ 2.2.2.2:

Sơ đồ 2.2.2.2: Quy trình kiểm tra bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfit trên mẫu nước uống đóng chai, nước khống thiên nhiên.

2.2.2.3 Phát hiện và định lượng Enterococci bằng phương pháp màng lọc theo TCVN 6189-2:2009, ISO 7899-2 : 2000

− Lọc 250 ml thể tích mẫu để kiểm tra.

− Tháo phểu lọc ra và chuyển màng lọc lên đĩa môi trường Slanet & Bartley bằng kẹp vô trùng.

Đọc kết quả: (+): khuẩn lạc màu đen.

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Tính theo cơng thức:[3]

Trong đó:

X: số CFU trên một thể tích tham chiếu Vr của mẫu.

a: tổng số khuẩn lạc đếm được trên màng lọc từ các độ pha loãng d1, d2…di.

V: thể tích tham chiếu để biểu diễn số lượng vi sinh vật có trong mẫu.

Vf: tổng thể tích mẫu ban đầu sử dụng để phân tích. Vt là tổng các thể tích riêng biệt

lấy từ mẫu kiểm tra (mẫu hoặc dung dịch pha loãng mẫu) hoặc được tính bởi cơng thức:

Vf = (n1V1d1)+(n2V2d2)+…..+(niVidi)

Trong đó:

n1,n2,..ni: số lượng đĩa tương ứng với các độ pha lỗng d1,d2,…di.

V1,V2,…Vi: thể tích mẫu sử dụng tươn ứng với các độ pha loãng d1,d2,…di.

d1,d2,…di: độ pha lỗng sử dụng tương ứng với các thể tích mẫu V1,V2,…Vi.

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

Sơ đồ kiểm nghiệm được tóm tắt theo sơ đồ 2.2.2.3:

Sơ đồ 2.2.2.3: Quy trình kiểm tra Enterococci trên mẫu nước uống đóng chai,

nước khống thiên nhiên.

2.2.2.4 Định tính và định lượng Pseudomonas aeruginosa bằng phương pháp màng lọc theo TCVN 8881:2011, ISO 16266: 2006

Chuẩn bị, đồng nhất mẫu. Lọc (250 ml).

Đặc màng lọc lên đĩa môi trường Slanet & Bartley.

(+): khuẩn lạc màu nâu đỏ.

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

− Kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật trên màng lọc sau (22 ± 2) giờ và (44 ± 4) giờ. − Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu xanh (blue/ green) do tạo ra pyocyanine. Các

khuẩn lạc này được xem là P. aeruginosa.

− Kiểm tra dưới đèn UV ở bước sóng (360 ± 20) nm, đếm tất cả các khuẩn lạc khơng có màu xanh không tạo ra pyocyanine nhưng phát huỳnh quang. Các khuẩn lạc này

được xem như P. aeruginosa giả định và tiếp tục thử phản ứng acetamide.

− Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu nâu đỏ, khơng phát huỳnh quang. Các khuẩn lạc

này được xem như P. aeruginosa giả định và tiếp tục thử phản ứng oxidase,

acetamide và phản ứng phát huỳnh quang trên mội trường King’s B.[2]

− Nhỏ từ 2- 3 giọt thuốc thử oxidase lên giấy lọc.

− Phết khuẩn lạc lên trên tấm giấy lọc (lưu ý: không sử dụng que cấy Ni chrome). − Phản ứng dương tính khi có màu tím xanh xuất hiện trong vòng 10 giây.

❖ Phản ứng phát huỳnh quang trên môi trường King’s B.

− Cấy những khuẩn lạc màu nâu đỏ mà có phản ứng oxidase dương tính sang môi trường King’s B.

− Ủ ở (36 ± 2) οC/24 giờ.

− Kiểm tra sự phát triển dưới đèn UV hàng ngày và ghi nhận sự phát huỳnh quang − Ghi nhận những khuẩn lạc có phản ứng phát huỳnh quang đến 5 ngày.

❖ Phản ứng sinh ammonia từ acetamide broth.

− Cấy những khuẩn lạc có yêu cầu thực hiện phản ứng trên (khuẩn lạc phát huỳnh quang khơng có màu xanh và khuẩn lạc màu nâu đỏ có phản ứng oxidase dương tính) lên mơi trường acetamide broth.

</div>