đánh giá khả năng tiêu diệt sâu xanh bướm trắng pieris rapae l của một số chủng bacillus spp

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.82 MB, 67 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞---

NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TIÊU DIỆT

SÂU XANH BƯỚM TRẮNG (Pieris rapae L.) CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus spp.

Chuyên ngành: Nông nghiệp – Môi trường Mã số chun ngành

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Minh

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞---

NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TIÊU DIỆT

SÂU XANH BƯỚM TRẮNG (Pieris rapae L.) CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus spp.

Chuyên ngành: Nông nghiệp – Môi trường Mã số chuyên ngành

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Minh

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt q trình thực hiện đề tài khóa luận tơt nghiệp ở phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh 1 và 2 tại trường Đại học Mở TP.HCM cơ sở 3 Bình Dương đã để lại cho em rất nhiều bài học quý báu, kinh nghiệm bổ ích và cả những kỉ niệm đáng quý.

Đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầy

Nguyễn Văn Minh, cô Dương Nhật Linh. Thầy cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo

và sẵn sàng tư vấn cho em hướng đi đúng nhất, và động viên để em hồn thành tốt đề tài. Khơng chỉ vậy, thầy cô đã luôn tạo cho em cơ hội tốt để có thể học hỏi, mở mang kiến thức và giúp em có thêm những kinh nghiệm đáng quý cho cuộc sống sau này.

Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giảng viên khoa Công nghệ sinh học - Trường Đại học Mở TP.HCM đã hết lòng giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu làm tiền đề cho em thực hiện đề tài thành cơng.

Em xin cảm ơn anh Nguyễn Thương Tồn, anh Trần Kiến Đức và chị Trần

Thị Á Ni đã nhiệt tình chỉ dẫn và giúp đỡ em giải đáp mọi thắc mắc trong suốt quá

trình làm đề tài của mình.

Ngồi ra, tơi cũng xin cảm ơn bạn Phạm Thị Phương Thảo, bạn Đặng Thị

Sen đã luôn sãn sàng giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp. Đồng thời tôi

cũng xin cảm ơn các bạn trong phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh và các bạn tại các phịng thí nghiệm khác ln nhiệt tình giúp đỡ tơi.

Cuối cùng, em xin gửi lời cám ơn chân thành đến gia đình đã ln ở phía sau ủng hộ, động viên và yêu thương em để em có thêm động lực đối mặt với những khó khăn.

Em xin gửi đến gia đình, tập thể quý thầy cô, cán bộ công nhân viên trường Đại học Mở TP.HCM, các anh chị, bạn bè lời chúc sức khỏe, may mắn và thành cơng!

Bình Dương, ngày 20 tháng 07 năm 2020 Nguyễn Thị Lan Phương

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 3

1. TỔNG QUAN VỀ SÂU XANH BƯỚM TRẮNG (Pieris rapae L.) ... 4

1.1. Vị trí phân loại ... 4

1.2. Đặc điểm sinh vật học của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) ... 4

1.3. Tác hại của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) ... 7

1.4. Biện pháp phòng trừ sinh học sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) .. 7

2. GIỚI THIỆU VỀ Bacillus ... 8

2.1. Đặc điểm phân loại ... 8

2.2. Tình hình nghiên cứu Bacillus trong phòng trừ sinh học ... 9

3. KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH LOÀI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ (PCR) ... 11

3.1. Định nghĩa PCR ... 11

3.2. Nguyên tắc ... 9

3.3. Vùng ribosome 16S RNA ... 9

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 14

1. ĐIẠ ĐIỂM NGHIÊN CỨU ... 15

5.2. Hoạt hóa các chủng vi khuẩn tiềm năng ... 17

5.3. Khảo sát hoạt tính tiêu diệt sâu của chủng vi khuẩn tiềm năng ... 19

5.4. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa ... 20

5.5. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử ... 27

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 28

1. KẾT QUẢ HOẠT HÓA VI KHUẨN TIỀM NĂNG ... 29

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

1.1. Kết quả quan sát đại thể ... 29

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Mật độ sâu xanh bướm trắng qua các tháng khác nhau ... 5

Bảng 3.1: Hình thái đại thể của chủng vi khuẩn tiềm năng ... 29

Bảng 3.2: Hình ảnh hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn tiềm năng ... 29

Bảng 3.3: Kết quả quan sát vi thể của chủng vi khuẩn tiềm năng ... 30

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát hiệu lực tiêu diệt sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) của chủng BT1 ... 32

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát hiệu lực tiêu diệt sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) của chủng BT2 ... 33

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát hiệu lưc tiêu diệt sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) của chủng VTCC 10525 ... 34

Bảng 3.7: Kết quả test sinh hóa của chủng BT1 ... 39

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) ... 4

Hình 1.2 Các pha phát dục của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) ... 6

Hình 1.3 Sâu xanh bướm trắng hại bắp cải ... 7

Hình 3.1 Kết quả quan sát vi thể của chủng vi khuẩn tiền năng ... 31

Hình 3.2 Hình thái sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) đã chết sau 72h ... 35

Hình 3.3 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) của chủng BT1 sau 72h ... 36

Hình 3.4 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) của chủng BT2 sau 72h ... 37

Hình 3.5 Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) của chủng VTCC 10525 sau 72h ... 38

Hình 3.6 Kết quả test sinh hóa của chủng BT1 ... 40

Hình 3.7 Kết quả giải trình tự chủng vi khuẩn BT1 ... 41

Hình 3.8 Kết quả BLAST trình tự BT1 trên NCBI ... 42

Hình 3.9 Kết quả dựng cây phát sinh loài của chủng BT1 ... 43

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm ... 16

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm khơng khí cao là điều kiện thuận lợi cho các lồi sâu hại cây nông - lâm nghiệp phát triển. Côn trùng bộ cánh vảy là bộ lớn trong lớp côn trùng gồm bướm và bướm đêm, trên 180.000 lồi đã được mơ tả và có mặt ở khắp nơi trên thế giới, chúng gây thiệt hại nghiêm trọng trong nền kinh tế nông nghiệp của nước nhà (Nguyễn Thị Hiền, 2012). Để phịng trừ, kiếm sốt sâu bệnh hại, các nhóm thuốc organophosphate, carbamate và nhiều nhóm hóa chất khác thường được sử dụng nhiều (Whalon, 2013).

Tuy nhiên, tác hại của việc lạm dụng thuốc trừ sâu hóa học quá mức và rộng rãi đã tác động to lớn. Thuốc trừ sâu là nhóm lớn nhất của các hóa chất nguy hiểm có tác động trực tiếp vào môi trường. Các dư lượng tồn tại trong đất và có thể gây ơ nhiễm nước ngầm và được tích lũy trong thực vật, trái cây và rau quả ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người (Ghribi, 2007).

Theo số liệu của cục BVTV, kết quả kiểm tra năm 2000 - 2002 cho thấy ở vùng Hà Nội số mẫu có dư lượng quá mức cho phép khá cao, trên rau, nho, chè từ 10% - 26%, ở TP. Hồ Chí Minh từ 10 - 30%. Đặc biệt ở các vùng rau, quả, chè, … Kết quả điều tra năm 2010, ở vùng rau đồng bằng sông Hồng cho thấy số lần phun thuốc bảo vệ thực vật từ 26 - 32 lần (11,1 - 25,6 kg ai/ha) trong 1 năm. Còn 5,19% số hộ dùng thuốc cấm, ngồi danh mục, 10,22% khơng đúng thời gian cách ly, 51% không thực hiện theo khuyến cáo của nhãn. Thuốc BVTV làm tăng tính kháng thuốc của sâu bệnh, tiêu diệt ký sinh thiên địch, có thể gây bộc phát các dịch hại cây trồng (Cục BVTV, 2000, 2010).

Sâu xanh bướm trắng hại cải thuộc họ Bướm phấn (Pieridae), Bộ cánh vảy

phân bố ở nhiều nước trên thế giới và gây hại rau nghiêm trọng. Ở Việt Nam sâu xanh bướm trắng xuất hiện và gây hại đã lâu và nổi lên như một đối tượng dịch hại nghiêm trọng (Bộ môn côn trùng, 2004).

Các biện pháp sinh học đang rất được chú trọng ở các nước trên thế giới cũng như ở nước ta sẽ khắc phục các nhược điểm của thuốc hóa học do nó có ưu điểm:

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

không làm nhiễm bẩn môi trường, không gây độc hại cho người và gia súc, không làm mất đi hệ sinh vật có ích trong tự nhiên mà có tính chọn lọc cao. Sử dụng con đường đấu tranh sinh học để tạo ra những hệ thống tổng hợp bảo vệ cây trồng và bảo vệ môi trường đã thấy hết được ý nghĩa to lớn của chúng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật (Trần Văn Mão, 2002).

Shah P.A. và cs. (2003) cho thấy thành cơng lớn nhất trong phịng trừ sâu hại rau họ Hoa thập tự là việc nghiên cứu, sản xuất quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi các chế phẩm sinh học như NPV, GV đặc biệt là chế phẩm Bt.

Nhiều nghiên cứu về Bacillus tổng hợp độc tố diệt cơn trùng mang lại hiệu quả phịng trừ, tiêu diệt tốt các loại côn trùng khác nhau. Bacillus thuringienis (Bt), hiện

nay được sản xuất và sử dụng làm chế phẩm trừ sâu sinh học để kiểm soát dịch hại: các loại sâu ăn lá, mọt hại cây trồng và trừ muỗi (George và Crickmore, 2012).

Từ bộ sưu tập chủng Bacillus tiềm năng được phân lập ở phịng thí nghiệm

Cơng nghệ Vi sinh và Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – Đại học Quốc Gia

Hà Nội. Với những lí do trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với nội dung: “ĐÁNH

GIÁ KHẢ NĂNG TIÊU DIỆT SÂU XANH BƯỚM TRẮNG (Pieris rapae L.) CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus spp.”. Nhằm chọn ra chủng Bacillus spp. có

hoạt lực mạnh trong tiêu diệt sâu hại cây trồng làm cơ sở khoa học trong việc tạo chế phẩm.

Mục tiêu nghiên cứu:

Tuyển chọn thành công chủng Bacillus spp. có hoạt lực mạnh trong diệt sâu

xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) hại cây trồng.

Mục tiêu cụ thể:

- Hoạt hóa chủng vi khuẩn Bacillus spp. tiềm năng.

- Khảo sát hoạt tính diệt sâu xanh bướm trắng của chủng vi khuẩn Bacillus

spp.

- Định danh Bacillus spp. bằng phương pháp sinh hóa và sinh học phân tử.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

PHẦN 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

1. TỔNG QUAN VỀ SÂU XANH BƯỚM TRẮNG (Pieris rapae L.)

1.1. Vị trí phân loại

Dựa vào khóa phân loại của Linnaeus (1758), phân loại khoa học của sâu xanh

bướm trắng (Pieris rapae L.) như sau:

Giới (Kinhdom): Animalia

Ngành (Phylum): Arthopoda

Lớp (Class): Insecta

Hình 1.1 Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.)

1.2.

Đặc điểm sinh vật học của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.)

Theo Hồ Khắc Tín (1999), trưởng thành của sâu xanh bướm trắng có thân màu đen, hai cánh trắng, đỉnh cánh có vết đen hình tam giác. Trứng màu hơi vàng, sâu non màu xanh lục, trên lưng có những điểm đen nhỏ. Sâu non có 5 tuổi, khi đẫy sức dài khoảng 28-35 mm. Nhộng màu xanh, khi gần vũ hóa chuyển màu xanh hơi vàng.

Bướm hoạt động ban ngày. Sau vũ hóa 3 - 4 ngày thì đẻ trứng, trứng đẻ từng quả, rải rác mặt sau của lá rau. Một bướm có thể đẻ từ 50 - 200 trứng. Bướm sâu xanh sống khá lâu từ 2 - 5 tuần lễ.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Sâu non mới nở gặm chất xanh của lá rau, từ tuổi hai trở lên gặm thủng lá rau và ăn kiệt chỉ cịn gân lá. Vì vậy nếu để mật độ cao thì ruộng rau sẽ bị trơ trụi, xơ xác.

Vòng đời của sâu xanh bướm trắng từ 26 - 30 ngày. Trong đó giai đoạn trứng từ 6 - 8 ngày, sâu non 10 - 14 ngày, nhộng 7 - 8 ngày. Bướm vũ hóa sau 3 - 4 ngày thì đẻ trứng. Sâu phát sinh và gây hại nặng từ tháng 10 năm trước đến tháng 5 năm sau, nhưng thường nặng nhất từ tháng 2 đến tháng 5 vì thời tiết lúc này phù hợp với sinh trưởng và phát triển của sâu. Sâu xanh thường tập trung và gây hại nặng ở những ruộng rau xanh tốt. Vì vậy trong kỹ thuật thâm canh cần lưu ý bón phân hợp lý, cân đối và đúng thời kỳ sinh trưởng của cây.

Sâu xanh bướm trắng hại chủ yếu trên lá rau, vì vậy khi phát hiện có thể dùng biện pháp thủ công (dùng tay) giết sâu non và nhộng.

Trường hợp mật độ quá cao, phải dùng thuốc hóa học để phịng trừ kịp thời. Để việc phịng trừ đạt hiệu quả cao, cần phải theo dõi phát hiện thời kỳ bướm nở rộ và đẻ trứng để phun thuốc kịp thời khi sâu non vừa nở.

Theo Nguyễn Văn Đĩnh (2004), Sâu xanh bướm trắng có mật độ khác nhau giữa các tháng trong năm thể hiện qua bảng sau:

Bảng 1.1: Mật độ sâu xanh bướm trắng qua các tháng khác nhau

Tên Việt Nam Tên khoa học Mức độ phổ biến qua các tháng

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Hình 1.2: Các pha phát dục của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.)

(Nguồn: Nguyễn Mạnh Phương, 2011)

(A): Pha trứng, (B): Sâu non tuổi 1, (C): Sâu non tuổi 2, (D): Sâu non các tuổi 2, 3, 4, 5, (E): Sâu non tuổi 5, (F): Pha nhộng,

(G): Trưởng thành cái, (H): Trưởng thành đực.

A

F

H G

D

E C

B

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

1.3.

Tác hại của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.)

Theo John L. Capinera (2000), ấu trùng của Pieris rapae L. thường ăn lá cây

kí chủ, nếu khơng tiêu diệt chúng thì sẽ ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây. Thậm chí sâu non cịn chui vào bắp của cải hoa, cải bắp để gây hại. Đặc biệt là chất thải

của chúng rất lớn ảnh hưởng sự sinh trưởng của cây rau. Pieris rapae L. thường gây

hại trên diện rộng, tạo những lỗ thủng rải rác trên lá. Sâu non thường nằm trên lá, chúng có thể ăn thủng lá hoặc gặm ngoài cạnh lá sâu vào trong. Sâu non khi cịn nhỏ thường ăn vịng ngồi lá, khi lớn hơn chúng có thể ăn các phần lá già hơn. Khi

bị Pieris rapae L. phá hại sẽ gây ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây, ở mật độ cao

chúng làm cho các ruộng rau trở nên xơ xác, mất năng suất.

Hình 1.3: Sâu xanh bướm trắng hại bắp cải

1.4.

Biện pháp phòng trừ sinh học sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.)

Theo Ronald F.L.Mau (2007), sau khi thu hoạch, các tàn dư cây trồng được tiêu hủy và tiến hành cày lật đất. Các loại cây hoang dại có chứa tinh dầu mù tạt cần

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

được chặt bỏ trong những khu vực quanh ruộng để ngăn sâu non của Pieris rapae L.

phát sinh vào vụ sau.

Theo John L. Capinera (2000), một số loại vi khuẩn đã được nghiên cứu để

diệt trừ Pieris rapae L.và có tiềm năng phát triển mạnh mẽ tiến tới hình thành thuốc trừ sâu vi khuẩn. Pieris rapae Granulosis vius (Pieris rapae L. GV) có tác dụng tiêu diệt Pieris rapae L. trong cả phịng thí nghiệm lẫn trên đồng ruộng, nhưng phải mất

4-10 ngày sau phun thuốc mới phát huy tác dụng và hiệu quả không cao bằng sử

dụng Bacillus thuringiensis để phòng trừ.

Vào năm 1934, ở Hawaii, Fullaway và cs. (1945) cho thấy: sử dụng Apanteles

glomeraus được nhập vào từ Nhật Bản có tác dụng kí sinh và khống chế Pieris rapae L. một cách có hiệu quả. Tác nhân gây bệnh, Nosema mesilini là một dạng kí sinh nội bào trong cơ thể trong thời gian lâu dài, dẫn tới Pieris rapae L. cái trưởng

thành giảm khả năng sinh sản. Tác nhân gây bệnh này có tác dụng cao nhất đối với sâu non và trung bình đối với sâu trưởng thành. Ngồi ra cịn có các loại vi khuẩn

gây bệnh như Chalcis obscurata cũng có tác dụng đối với Pieris rapae L., có thể

ứng dụng vào thực tế.

2.

GIỚI THIỆU VỀ Bacillus

2.1. Đặc điểm phân loại

Theo khóa phân loại của Holt và cs. năm 1990, Bacillus được phân loại như sau:

Giới (Kinhdom): Bacteria

Ngành (Phylum): Firmicutes

Lớp (Class): Bacilli

Chi (Genus): Bacillus

Chi Bacillus là một chi lớn (51 loài đã được xác định chính xác và nhiều lồi khác chưa được phân loại rõ ràng) và đa dạng, thuộc họ Bacillaceae. Họ này chia làm 5 chi gồm: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina,

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

Desulfotomaculum. Đặc trưng của họ này là sự hình thành nội bào tử, một cấu trúc

không sinh trưởng được tạo ra bên trong tế bào vi khuẩn và là chiến lược để sống sót trong mơi trường đất.

Đặc điểm cụ thể về chi này được mô tả như sau: tế bào hình que thẳng hoặc gần thẳng, kích thước 0,3 – 2,2 x 1,2 – 7,0 µm. Thường di động, roi điển hình nằm hai bên. Hình thành bào tử chịu nhiệt, chỉ có một bào tử trong một tế bào. Sự hình thành bào tử khơng bị ngăn cản bởi tiếp xúc với khơng khí. Gram dương hoặc chỉ cho Gram dương ở giai đoạn đầu của sự phát triển. Trao đổi chất kiểu hô hấp nghiêm ngặt hoặc cả hơ hấp và lên men đồng thời, địi hỏi nhiều thành phần. Chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyển hố hơ hấp là oxi phân tử. Hầu hết cho catalase dương tính.

Việc phân loại Bacillus ban đầu dựa trên hai đặc điểm là sự phát triển trong

điều kiện hiếu khí và sự hình thành nội bào tử, kết quả là đã xếp nhiều vi khuẩn có những đặc điểm sinh lý và đặc tính khác nhau. Do đó, tính khơng đồng nhất về sinh

lý học, sinh thái học, di truyền học làm cho việc phân loại chi Bacillus khó khăn.

Bacillus có khả năng chịu đựng và tồn tại trong một thời gian dài trong điều

kiện bất lợi, nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều

nguồn.Trong đất, Bacillus chủ động trao đổi chất khi có sẵn các cơ chất thích hợp

cho sự tăng trưởng của nó có sẵn, và nó tạo bào tử khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt. Đây cũng là chiến lược sinh tồn của vi sinh vật sống trong mơi trường đất. Vì đa số

các lồi Bacillus có thể phân giải hiệu quả các loại cao phân tử sinh học (proteins,

tinh bột, pectin...), nên chúng đóng một vai trò quan trọng trong vịng tuần hồn sinh học của cacbon và nitơ (Holt và cs., 1994; Harwood và cs., 1990).

2.2. Tình hình nghiên cứu Bacillus trong phịng trừ sinh học

2.2.1. Trên thế giới

Bacillus popilliae là một trong những Bacillus sinh độc tố diệt côn trùng được

nghiên cứu và ứng dụng đầu tiên. Thực tế B. popilliae chỉ có thể phát triển và sinh bào tử trong ruột ấu trùng bị nhiễm (Bulla và cs., 1978). B. sphaericus sinh độc tố

kép gồm 2 polipeptid có tác dụng gây độc với ấu trùng của một số loài muỗi.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

Protein này được tổng hợp trong quá trình hình thành bào tử giống protein tiền độc

tố của B. thuringiensis (Meadow và cs., 1990).

Một số loài Bacillus cho kết quả kiểm soát quần thể một số lồi sâu hại nơng

nghiệp thuộc nhóm lepidoptera, diptera, bọ cánh cứng (Cavados và cs. 2001, Cory và cs. 2012).

Phần lớn các chủng B. thuringiensis phân lập được ngiên cứu về tác dụng gây

bệnh với côn trùng bộ cánh vảy, nhưng một số tiền độc tố cũng có tác dụng với bộ hai cánh, bộ cánh cứng và có thể cả giun trịn (Edwards và cs., 1990). Từ các mẫu đất ở khu vực nuôi tằm, Xavier và cs. (2007) đã phân lập được 30 chủng Bt mang

gen Cry1 có khả năng diệt sâu xanh Heliothis armigera. Đặc biệt là 2 chủng BTRX 24 (RathinamXavier 24) và BTRX28 (RathinamXavier 28) có độc tính mạnh hơn

các chủng cịn lại, có sự hiện diện của nhiều gen Cry và có khả năng diệt sâu tơ

Plutella xylostella.

Bacillus thuringiensis có thể tạo ra một loại độc tố có thể tiêu diệt cơn trùng và

do đó đã được sử dụng làm thuốc trừ sâu, trong quá trình sinh bào tử , nhiều chủng

B. thuringiensis tạo ra protein tinh thể, được gọi là endotoxin , có tác dụng diệt côn

trùng (Joan L. Slonczewski & John W. Foster, 2011).

2.2.2. Ở Việt Nam

Lê Văn Trịnh và cs. (1996), Nguyễn Quý Hùng và cs. (1995), đã tiến hành nghiên cứu sử dụng Bt để trừ sâu tơ. Kết quả cho thấy chế phẩm Bt có hiệu lực trừ sâu rất tốt đối với lượng dùng 3 kg/ ha, khi trời rét đậm thì lượng dùng 5kg/ha, khi mật độ sâu cao có thể dùng kép 2 lần. Sử dụng chế phẩm Bt đã góp phần làm tăng năng suất bắp cải, suplơ và giá trị thu hoạch cao hơn hẳn so với dùng thuốc hố học. Viện Cơng nghệ Sau thu hoạch đã thành công trong việc phân lập tuyển chọn

và sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học B. thuringiensis có hiệu quả khi thử

nghiệm để phịng trừ cơn trùng bộ cánh vảy ở kho thóc, đồng thời cịn có tác dụng

diệt một số sâu rau như sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera liura), sâu xanh (Helicoverpa arigera) (Nông nghiệp Việt Nam, 2000).

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Sau khi ăn phải tinh thế độc của B. thuringiensis thì cơn trùng ngừng ăn vì

ruột bị tê liệt nhưng pH của máu và bạch huyết không tăng, sau 3 - 4 ngày thì cơn trùng chết mặc dù sâu non khơng bị tê liệt tồn thân (Phạm Thị Thùy, 2004).

Năm 2003, Bùi Thị Hương và cs. đã tiến hành phân lập các chủng Btk ở Việt Nam tại Viện Công nghệ Sinh học. Kết quả đã phân lập được 36 chủng Bt, trong đó có 10 chủng Btk đều mang gen cry1Ab. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu thì cả 10 chủng có hiệu quả diệt 100% đối với sâu ngài gạo.

Ngoại độc tố β – exotoxin của vi khuẩn B. thuringiensis rất có hiệu quả trong

việc phòng trừ sâu non của các lồi cơn trùng mẫn cảm. Nó gây ra những trì trệ trong việc chuyển hóa lột xác của sâu hại và có tác động đối với cả con trưởng thành được phát triển từ các ấu trùng khi đã ăn phải độc tố dưới ngưỡng gây chết (Trần Quang Hùng 1995). Ngoại độc tố β có phổ hoạt tính rộng, kháng cơn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng thuộc bộ cánh cứng và côn trùng thuộc bộ hai cánh (Ngơ Đình Bính, 2010).

3.

KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH LOÀI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ (PCR)

3.1.

Định nghĩa PCR

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction. Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Phương pháp PCR dùng trong phịng thí nghiệm để khuếch đại các đoạn DNA đặc biệt lên hàng triệu lần trong vòng vài giờ qua 20 - 30 chu kỳ nhiệt, mỗi chu kỳ bao gồm ba mức nhiệt độ: biến tính ở 90 - 95oC, bắt cặp với mồi ở 40 - 65oC hoặc hơn và tổng hợp mạch mới nhờ DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) ở 70 - 72oC. PCR có ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán y học, phân tích sự đa dạng sinh học, chọn giống và trong nhiều lĩnh vực khác (Nguyễn Hoàng Lộc và cs., 2007).

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

3.2.

Nguyên tắc

PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu trong điều kiện

in vitro dưới xúc tác của enzyme DNA polymerase. PCR cho phép khuếch đại theo

cấp số nhân các đoạn DNA khuôn mẫu. Đoạn DNA khuôn mẫu đã khuếch đại được nhận diện bằng cặp mồi đặc hiệu: mồi xi và mồi ngược có chiều dài khoảng 20 - 30 nucleotide. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu kì nhiệt lặp lại. Mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn: biến tính (denaturation), bắt cặp (annealing), kéo dài (extension) được lặp lại khoảng 20 - 35 chu kì:

• Giai đoạn biến tính DNA (denaturation): hỗn hợp phản ứng được nâng nhiệt độ lên 95oC cao hơn nhiệt độ nóng chảy Tm của phân tử trong khoảng 0 giây đến 1 phút. Ở nhiệt độ này các liên kết hydro của phân tử DNA bị đứt làm tất cả các mạch xoắn kép của DNA đề được tách ra tạo thành các sợi đơn dùng làm khuôn cho các đoạn mồi và DNA polymerase.

• Giai đoạn bắt cặp (annealing): nhiệt độ được hạ xuống (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với DNA mục tiêu theo nguyên tắc bổ sung. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55oC - 70oC, tùy thuộc vào độ dài trình tự mồi và mức độ đặc hiệu cần thiết cho từng phản ứng PCR cụ thể.

• Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ nâng lên khoảng 72oC, ở nhiệt độ này DNA polymerase hoạt động tốt nhất kéo dài các mạch DNA. Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài khoảng 0 giây đến vài phút. Mỗi phản ứng PCR gồm nhiều chu kì liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu kì trước là khn cho chu kì tiếp theo, nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số nhân.

Nếu một phản ứng PCR được thực hiện trong 30 chu kì thì số bản sao DNA tạo ra lên đến 230.

3.3.

Vùng ribosome 16S RNA

Hiện nay các nghiên cứu hiện đại thường dựa vào phân tích các chuỗi RNA ribosome 16S để xác định phân loại các chủng vi khuẩn, loại phân tích này đã trở thành một tiêu chuẩn thực tế cho phân loại sinh vật nhân sơ (Yu S. và cs., 2019).

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

Vùng 16S rRNA từ lâu được biết như là thước đo về sự biến đổi trong hệ gen của các vi sinh vật. Do có số lượng nucleotide lý tưởng (khoảng 1500 cặp nu) vùng gen này đã được nhiều nghiên cứu ứng dụng nhằm tìm ra sự khác biệt di truyền của các chủng vi sinh vật (Kim M. và cs., 2011).

Phân loại gene RNA ribosome 16S (16S rRNA), đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu và mô tả các thành phần cộng đồng vi khuẩn trong nhiều loại hệ sinh thái bao gồm các cộng đồng liên kết với vật chủ, nhƣ hệ vi sinh vật nội sinh của con người, vật chủ các cộng đồng tự do, như môi trường đất và đại dương. Đầu tiên, nó có mặt khắp nơi trong cuộc sống thuộc nhóm Prokaryotic. Thứ hai, kích thước và mức độ bảo tồn chức năng cao của nó dẫn đến tỷ lệ đột biến trong suốt quá trình tiến hóa của sinh vật nhân sơ. Thứ ba, và quan trọng nhất, gen 16S rRNA bao gồm cả các khu vực được bảo tồn, có thể được sử dụng để thiết kế các đoạn mồi khuếch đại trên khắp các đơn vị phân loại, được sử dụng một cách hiệu quả để phân biệt giữa các đơn vị phân loại (Yu S. và cs., 2019).

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

PHẦN 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

1. ĐIẠ ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện từ tháng 9/2019 đến tháng 07/202 tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh.

2. VẬT LIỆU

Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) gây hại bắp cải và súp lơ, thu nhận từ

vườn rau ở huyện Krông Năng, tỉnh Đăk Lăk.

Chủng vi sinh vật từ phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở Tp. Hồ Chí Minh và Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – Đại học Quốc Gia Hà Nội.

3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU

3.1. Thiết bị và dụng cụ

✔ Tủ cấy vô trùng ✔ Nồi hấp (autoclave) ✔ Kính hiển vi

✔ Cân phân tích ✔ Máy lắc (nhiệt) ✔ Tủ sấy

✔ Tủ lạnh ✔ Tủ ấm ✔ Bếp điện ✔ Máy ly tâm ✔ Cân kỹ thuật ✔ Ống nghiệm ✔ Đĩa petri

✔ Lame

✔ Pipet (thủy tinh và pipetman)

✔ Becher ✔ Erlen ✔ Ống đong ✔ Phễu

✔ Đũa thủy tinh ✔ Que cấy ✔ Que cấy trang ✔ Đèn cồn

✔ Màng lọc 0.2 µm. ✔ Giấy đo pH

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

4. MƠI TRƯỜNG, HĨA CHẤT

- Mơi trường: NA, NB, NA bổ sung sữa gầy, NA bổ sung tinh bột, NB bổ sung NaCl, Clark –Lubs, môi trường đường, Simmon’s Citrate, khử Nitrat. - Thuốc Nhuộm: Crystal violet, safranin O, lugol.

- Thuốc thử: giấy thử oxidase, giấy thử ONPG, Kovac’s, Gress A, Gress B, catalase H2O2 5%, phenol red, NaOH 40%, TTC.

Khảo sát hoạt tính diệt sâu của chủng vi khuẩn được phân lập

Định danh sinh hóa

Thu nhận mẫu sâu xanh

Định danh sinh học phân tử

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

5.2. Hoạt hóa các chủng vi khuẩn tiềm năng

Sau khi nhận giống vi sinh vật từ phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở Tp.HCM tiến hành cấy phân lập.

5.2.1. Quan sát đại thể

Bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay nhận xét về kích thước, màu sắc, hình thái,… của khuẩn lạc trên đĩa NA.

Nguyên tắc:

Tách rời các tế bào vi sinh vật.

Nuôi cấy các vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để mọc thành các khuẩn lạc riêng rẽ, tách biệt nhau (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2011).

Cách tiến hành:

Việc nhuộm Gram được thực hiện như sau:

Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch. Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính cho đến khơ.

Phủ hồn tồn vết bơi với Crystal violet. Để yên 1 – 2 phút rồi nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm dư bằng nước.

Nhỏ dung dịch Lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước. Tẩy cồn 96 o từ 15 – 30 giây, sau đó rửa nước. Phủ hồn tồn vết bơi với Safranin O và để yên trong 1 phút. Rửa với nước.

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Thấm khơ phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khơ hồn tồn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100X.

Đọc kết quả:

• Tế bào vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím. • Tế bào vi khuẩn Gram (–) bắt màu hồng. • Cách sắp xếp, hình thái.

Phương pháp nhuộm bào tử vi khuẩn. Nhuộm Carbolic Fuchsin (Nguyễn Lân Dũng, 1999).

Vật liệu, hoá chất: - Dung dịch A:

• 10 ml dung dịch Fuchsin kiềm bão hồ trong etanol (khoảng 10%) • 100 ml dung dịch acid carbolic (phenol) 5% (trong nước).

- Dung dịch B:

• 100 ml Etanol 95% • 3 ml HCl đậm đặc - Dung dịch C:

• 30 ml dung dịch Xanh metylen (Methylene blue) bão hồ trong etanol (khoảng 2%)

• 100 ml dung dịch KOH 0,01% trong nước.

Các bước tiến hành:

Làm vết bơi trên phiến kính, cố định tế bào.

Nhỏ dung dịch A lên vết bơi, hơ nóng nhẹ bên dưới để bay hơi, tránh để sôi. Thêm dần dần thuốc nhuộm để không bị khô cạn, giữ trong 5 phút. Đợi nguội, đổ thuốc nhuộm đi.

Dùng dịch B rửa cho đến khi vừa thấy vừa hết màu đỏ, rửa nước. Nhuộm lại bằng dung dịch B trong 2-3 phút, rửa nước, thấm khơ. Kết quả:

• Bào tử bắt màu đỏ, tế bào bắt màu xanh

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

5.3. Khảo sát hoạt tính tiêu diệt sâu của chủng vi khuẩn tiềm năng

Cấy một thể tích xác định dịch mẫu đã pha lỗng lên đĩa petri mơi trường thích hợp. Đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời gian ni cấy vì mỗi khuẩn lạc là kết quả phát triển của một tế bào.

Cách tiến hành:

Để đếm số lượng bào tử ta tiến hành xử lý mẫu ở 70 o

C trong 10 phút rồi pha loãng mẫu. Lấy 0,1 ml ở nồng độ pha loãng cuối (10-5) cấy trang vào các đĩa thạch vô trùng chứa môi trường đếm số lượng bào tử (3 đĩa). Để vào tủ ấm ở 28 oC trong 24h rồi đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa.

Số lượng bào tử trong 1 ml dịch lên men sẽ được tính theo cơng thức: X = n.10/a (CFU/ml)

X: số tế bào vi khuẩn / 1 ml dịch mẫu. n: số khuẩn lạc trung bình trong 1 đĩa

a: nồng độ pha loãng mẫu. (Nguyễn Xuân Cảnh và cs., 2003)

Phương pháp thử hoạt tính diệt sâu Nguyên tắc:

Tiêu chuẩn sâu thí nghiệm: đồng đều về tuổi (tuổi 2, tuổi 3).

Xác định hoạt tính diệt sâu của chủng Bacillus spp. tiềm năng.

Thức ăn cho sâu: lá rau cải tươi

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Đối tượng sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.).

Cách tiến hành:

Thí nghiệm được bố trí gồm 2 nghiệm thức:

NT đối chứng: thức ăn của sâu được giữ ngun khơng chứa dịch khuẩn.

Các NT thí nghiệm: thức ăn của sâu được nhúng vào dịch khuẩn Bacillus spp.

đã chuẩn bị được pha loãng với nước cất theo từng nồng độ khác nhau: NT1: 1 (dịch nguyên), NT2: 1:2, NT3: 1:4, NT4: 1:8.

Các nghiệm thức thí nghiệm bố trí trong các hộp vô trùng (mỗi nghiệm thức 3 hộp) với số lượng sâu như nhau (10 sâu/hộp).

Các hộp được phủ kín bằng vải màn thưa để đảm bảo môi trường trong hộp luôn được thống khí và sâu khơng bị ra ngồi. Đặt các hộp thí nghiệm trong phịng có nhiệt độ 25 oC.

Theo dõi và thống kê số lượng sâu sống/chết; tình trạng sâu sau 24h, 48h, 72h ở tất cả các lơ thí nghiệm.

Hiệu lực tiêu diệt sâu được tính theo cơng thức Abbott (Abbott, 1925): A=(C-T).100/C

5.4. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa

Sau khi tiến hành thử nghiệm trên chúng tơi tiến hành định danh bằng phương pháp sinh hóa cho chủng có hoạt tính cao theo khóa phân loại Cowan và Steel. (Feltham và Barrow, 1993; MacFaddin, 2000).

5.4.1. Nhuộm Gram

Được trình bày ở mục 1.1.2.

5.4.2. Thử nghiệm catalase

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Nguyên tắc:

Các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy nghi để có enzym catalase (trừ

Streptococcus spp.). Catalase thủy phân hydrogen peroxidase H2O2 thành H2O và O2. Sự thủy phân hydrogen peroxidase sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí, dựa vào đặc tính này để thử khả năng sinh enzym catalase của vi khuẩn.

Cách tiến hành:

Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiến kính sạch, nhỏ một giọt H2O2 5% lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính và quan sát. Vi khuẩn sinh catalase sẽ sủi bọt khí, ngược lại không thấy hiện tượng.

5.4.3. Thử nghiệm oxidase Nguyên tắc:

Các loại vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối có enzym oxydase (cytochrom oxydase). Có thể phát hiện oxydase bằng cách sử dụng thuốc thử là giấy tẩm N – Dimethel – paraphenyldiamine.

Các loại vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối có enzym cảm ứng (fl-galactosidase). Có thể phát hiện bằng cách sử dụng thuốc thử là giấy tẩm ONPG.

Cơ chế phản ứng:

fl-galactosidase

ONPG o-nitrophenol (không màu) (màu vàng)

Cách tiến hành:

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

- Dùng qua cấy vòng lấy vi khuẩn trong đĩa vi khuẩn đã nuôi cấy, phết lên giấy tẩm thuốc thử. Đọc kết quả trong vòng 30 giây – 1 phút.

- Phản ứng oxydase (+): giấy tẩm thuốc thử chuyển sang màu vàng. - Phản ứng oxydase (-): giấy tẩm thuốc thử vẫn giữ màu trắng.

5.4.5. Indol Nguyên tắc:

Vi sinh vật tiết enzym Tryptophanase, chuyển hóa Tryptophan thành Indol. Indol sẽ kết hợp với para – dimethylaminobenzaldehyd trong thuốc thử Kowac’s, tạo thành phức chất Rosindol màu đỏ.

Cách tiến hành:

- Cấy vi khuẩn vào môi trường NB, ủ 37 oC/ 24h. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovacs’ trực tiếp vào canh cấy. Đọc kết quả.

- Ống (+): lớp mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ.

- Ống (-): lớp mặt mơi trường có màu vàng chanh hoặc màu xanh nhạt.

5.4.6. Nitrate Nguyên tắc:

Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng nguồn nitrate làm nguồn hydro cơ chất trong q trình hơ hấp kỵ khí, đồng thời sử dụng nguồn nitrate như nguồn nitơ duy nhất, do khả năng tổng hợp ezyme nitratreductase. Nitrate bị khử thành nitrit rồi có thể bị khử tiếp thành NH3 hoặc N2.

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

- Tiếp tục cho bột kẽm vào, nếu xuất hiện màu đỏ thì âm tính, nếu khơng đổi màu là dương tính

5.4.7. Citrate Nguyên tắc:

Một số vi sinh vật có enzym citrat permease có khả năng sử dụng citrat trong mơi trường có Na. Chúng giải phóng ra mơi trường ion Na+ khi sử dụng citrat, làm pH môi trường tăng. Đồng thời những vi sinh vật này cũng có khả năng sử dụng muối amonium vô cơ NH4H2PO4 làm nguồn nitơ, giải phóng NH3 ra mơi trường làm kiềm hóa mơi trường, sự thay đổi pH được nhận diện bằng chỉ thị màu bromothymol blue.

Một số vi khuẩn có tiêm mao (Flagella) nên có khả năng di động trong môi trường bán lỏng và làm đục môi trường hay mọc giống như rễ cây xung quanh đường cấy.

Khi cần có thể dùng muối tetrazolium trong môi trường thử di động, tuy nhiên chất này có tính cức chế vài loại vi sinh vật. Triphenyltetrazolium chloride (TTC) thường được pha trước với nồng độ 1%, thanh trùng bằng màng lọc vi khuẩn 0,45 µm. Việc bổ sung TTC giúp phát hiện di động dễ dàng hơn, đặc biện những trường hợp khó đọc kết quả.

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

- Phản ứng di động dương (+): Vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy, xa hay gần tùy theo khả năng di động của vi khuẩn mạnh hay yếu.

- Phản ứng di động âm (-): vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy.

5.4.9. Phản ứng tìm khả năng phân giải Casein Nguyên tắc:

Casein là một protein sữa, không thể thấm qua màng tế bào vi khuẩn. Cho nên trước khi vi khuẩn sử dụng casein như là nguồn cacbon và năng lượng của chúng, thì casein phải được phân giải thành các amino acid. Do đó vi khuẩn cần phải tiết ra enzyme proteolytic để phân giải casein thành các amino acid để có thể chuyển vào trong tế bào.

Khi sữa được phối trộn vào trong môi trường thạch dinh dưỡng, casein trong sữa làm cho mơi trường có màu trắng đục. Sau quá trình ủ, vi khuẩn tiết ra enzym protease (ví dụ như caseinase) tạo ra một vùng bị phân giải (vùng trong xung quanh khuẩn lạc) đối với phản ứng dương tính. Khi phản ứng âm tính thì mơi trường xung quanh khóm vi khuẩn vẫn đục.

Cách tiến hành:

Thử nghiệm bằng môi trường NA bổ sung 5% sữa gầy. Cấy chấm điểm vi khuẩn đã được hoạt hóa sau 24 giờ. Ủ 37 oC / 48 giờ/ 5% CO2, quan sát khả năng phân giải casein sau hai ngày nuôi cấy.

5.4.10. Phản ứng tìm khả năng thủy phân tinh bột Nguyên tắc:

Vi sinh vật tiết enzym amylase, enzym này khuếch tán ra xung quanh khóm, phân giải tinh bột có trong mơi trường thành đường. Khi nhỏ dung dịch thuốc thử Lugol vào, nơi nào trên môi trường có tinh bột thì Iod tác dụng với tinh bột tạo màu xanh tím.Nếu quanh khóm VSV khơng cịn tinh bột thì quanh khóm có vịng trong.

Cách tiến hành:

- Cấy chấm điểm vi khuẩn bằng tăm bông lên đĩa mơi trường NA có bổ sung 1% tinh bột, ủ 37 oC/24 – 48h, lấy ra nhỏ 1 – 2 ml dd Iod 0.02N hay Lugol, đọc kết quả.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

- Phản ứng dương tính (+): mơi trường xung quanh vi khuẩn khơng màu, trong suốt. Đó là vịng phân giải tinh bột. Nơi khác có màu xanh tím.

- Phản ứng âm tính (-): tồn bộ mơi trường xung quanh nấm màu xanh.

5.4.11. Voges – Proskauer (VP) Nguyên tắc:

Vi sinh vật chuyển hóa glucose thành acid pyruvic.Rồi tiếp tục chuyển hóa acid pyruvic thành acetyl methyl carbinol (AMC). AMC tác dụng với a – naphtol trong môi trường kiềm tạo thành diacetyl. Diacetyl phản ứng với nhân guanidine (arginine) có trong pepton để cho hợp chất màu hồng đỏ.

Cách tiến hành:

- Cấy vi khuẩn vào môi trường lên men đường cần khảo sát, ủ 37 oC/24h. - Ống (+): màu vàng

- Ống (-): giữ nguyên màu đỏ

5.4.13. Khả năng phát triển ở 10% NaCl Nguyên tắc:

Thử nghiệm chịu đựng muối sử dụng môi trường NB, bổ sung NaCl để tạo ra mơi trường có nồng độ muối 10%. Môi trường này dùng để thử nghiệm khả năng tồn tại của vi sinh vật trong mơi trường có nồng độ muối cao. Một số chủng

</div>