phân lập và tinh chế hợp chất có hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm kháng thuốc từ cao chiết diệp hạ châu đắng phyllanthus amarus

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>-PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHÂT CĨ HOẠT </b>

<b>TÍNH KHÁNG VI KHUẨN</b>

<b><small>gramâmkháng</small></b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>x0x---ĐẶNG THỊ</b>

<b> SEN</b>

<b>PHÂNLẬP VÀ TINH CHẾ </b>

<b><small>hợpchấtcóhoạt</small></b>

<b>TÍNH KHÁNG VI KHUẨN</b>

<b><small>gramâmkháng</small></b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>GIẤY XÁC NHẬN </b>

Tôi tên là: Đặng Thị Sen

Ngày sinh: 09/02/1998 Nơi sinh: Gia Lai

Chuyên ngành: Y dược Mã sinh viên: 1653010255

Tôi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

<i> (Ghi rõ họ và tên) </i>

<i> </i> Đặng Thị Sen

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>Giảng viên hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh </b>

<b>Học viên thực hiện Đặng Thị Sen Lớp DH16YD01 Ngày sinh: 09/02/1998 Nơi sinh Gia Lai </b>

<b>Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN GRAM ÂM KHÁNG THUỐC TỪ CAO CHIẾT DIỆP HẠ CHÂU </b>

<i><b>ĐẮNG (Phyllanthus amarus)</b></i>

<b>Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên: Đặng Thị Sen </b>

<b> được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng: ... </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cơ bản để giúp em làm cơ sở cho đề tài nghiên cứu.

<b>Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến cô ThS. Dương Nhật Linh đã tận </b>

tình hướng dẫn, động viên, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt trong suốt thời gian thực hiện đề tài này.

<b>Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy TS. Nguyễn Tấn Phát </b>

đang công tác tại Viện Công nghệ Hóa học là người đã giúp đỡ em rất nhiều về mặt trang thiết bị và phương pháp thực hiện có trong đề tài của em.

<b>Em xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni đã hết lòng giúp đỡ em giải quyết các vấn </b>

đề gặp phải trong quá trình thực hiện đề tài.

<b>Và nhân dịp này em xin gửi lời cảm ơn đến Ba mẹ người đã sinh thành </b>

dưỡng dục và ni dạy em nên người để em có được ngày hôm nay.

Tôi cũng xin cảm ơn tất cả các bạn tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh- Trương Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã bên cạnh giúp đỡ tơi hồn thành tốt đề tài.

Bình Dương, Ngày 20 tháng 07 năm 2020 Sinh viên thực hiện

Đặng Thị Sen

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<b>MỤC ỤC ... II DANH MỤC VIẾT TẮT ... IV DANH MỤC BẢNG ... VI DANH MỤC HÌNH ẢNH... VII DANH MỤC BIỂU ĐỒ ... IX DANH MỤC SƠ ĐỒ ... IX </b>

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1 </b>

<b>PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 4 </b>

<b>1.1.TỔNGQUANVỀNGUYÊNLIỆU ... 5 </b>

<i>1.1.1. Sơ lược về cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus). ... 5 </i>

<i>1.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố ... 5 </i>

<i>1.1.3. Đặc điểm hình thái ... 6 </i>

<i>1.1.4. Thành phần hóa học của diệp hạ châu đắng (P. amarus) ... 6 </i>

<i>1.1.5. Giá trị dược liệu của cây diệp hạ châu đắng (P. amarus). ... 9 </i>

<b>1.2.TỔNGQUANVỀMỘTSỐVIKHUẨNGÂYBỆNHỞNGƯỜI ... 11 </b>

<i>1.2.1. Vi khuẩn sinh enzym ESBL ... 11 </i>

<i>1.2.2.Vi khuẩn sinh carbapenemase. ... 13 </i>

<b>1.3.TÌNHHÌNHNGHIÊNCỨUTRONGNƯỚCVÀNGỒINƯỚC ... 14 </b>

<b>1.4.KHÁIQUÁTVỀPHƯƠNGPHÁPCHIẾTCAODƯỢCLIỆU. ... 16 </b>

<i>1.4.1. Phân loại cao dược liệu ... 16 </i>

<i>1.4.2. Các kỹ thuật chiết dược liệu ... 17 </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<i>2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ... 24 </i>

<i>2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ... 24 </i>

<i>2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và mơi trường ... 24 </i>

<b>2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU ... 25 </b>

<i>2.2.1. Bố trí thí nghiệm ... 25 </i>

<i>2.2.2. Quy trình thu nhận và xử lý mẫu ... 27 </i>

<i>2.2.3. Xác định tên khoa học của cây thuốc ... 27 </i>

<i>2.2.4. Quy trình chiết xuất cao dược liệu từ cây diệp hạ châu đắng (P. amarus). ... 27 </i>

<i>2.2.5. Khảo sát giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết... 29 </i>

<i>2.2.6. Phương pháp khuếch tán giếng thạch ... 30 </i>

<i>2.2.7. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn gây bệnh ... 32 </i>

<i>2.2.8.Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột ... 33 </i>

<i>2.2.9. Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp tự sinh đồ ... 34 </i>

<i>2.2.10. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được ... 34 </i>

<b>PHẦN III. KẾT QUẢ – THẢO LUẬN ... 35 </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<b>3.1.KẾTQUẢGIÁMĐỊNHTÊNKHOAHỌCCỦACÂY ... 36 </b>

<b>3.2.KẾTQUẢCHIẾTCAODƯỢCLIỆU ... 36 </b>

<i>3.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đên khối lượng cao chiết thu được từ cây diệp hạ châu đắng(P. amarus) ... 36 </i>

<i>3.2.2. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết... 38 </i>

<b>3.3.KẾTQUẢĐỊNHTÍNHKHẢNĂNGKHÁNGKHUẨN ... 39 </b>

<b>3.4.KẾTQUẢXÁCĐỊNHNỒNGĐỘỨCCHẾTỐITHIỂU(MIC)CỦACAOCHIẾT ... 42 </b>

<b>3.5.ĐIỀUCHẾCÁCPHÂNĐOẠNTỪCAOETHYLACETATE ... 44 </b>

<b>3.6.KHẢOSÁTHOẠTTÍNHKHÁNGKHUẨNCỦACAOPHÂNĐOẠNETHYLACETATE. ... 45 </b>

<b>3.7.XÁCĐỊNHKHẢNĂNGKHÁNGKHUẨNBẰNGPHƯƠNGPHÁPTỰSINHĐỒ ... 52 </b>

<b>3.8.XÁCĐỊNHCẤUTRÚCCỦAHỢPCHẤTPA01 ... 53 </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>Danh mục viết tắt </b>

<i>A. baumannii B. subtilis cs </i>

<i>: Acinebacter baumannii : Bacillus subtilis </i>

<small>DMSO </small>

<small>β-lactamase </small>

NA

<i>P. aeruginosa P. amarus S. typhi S. paratyphi </i>

: Nutrient Agar

:<i><b>Pseudomonas aeruginosa : Phyllanthus amarus </b></i>

:<i>Salmonella typhi </i>

:<i>Salmonella paratyphi </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<i>S. albus S. aureus S. mutans S. salivarus S. faecalis </i>

SKC SKLM

<i>: Staphylococcus albus : Staphylococcus aureus : Streptococcus Mutans : Streptococcus salivarus </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>Danh mục bảng </b>

Bảng 3.1. Hiệu suất thu cao từ dung môi chiết ...36

Bảng 3.2. Hiệu suất thu cao từ các loại dung môi chiết ...37

Bảng 3.3. Kết quả xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết ...38

Bảng 3.4. Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) của các loại cao chiết ...39

Bảng 3.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết (µg/mL) ...42

Bảng 3.6. Khối lượng của các phân đoạn thu được (g) ...45

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<b>Danh mục hình ảnh </b>

<i>Hình 1.1. Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) ... 5Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) ... 7Hình 1.3 Cấu trúc của các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P. </i>

<i>amarus) (tiếp theo) ... 8Hình 1.4. Cấu trúc của các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P. </i>

<i>amarus) (tiếp theo) ... 9</i>

Hình 2.1. Kết quả kháng vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán ... 32qua giếng thạch ... 32

<i>Hình 3.1. Thu cao n–hexane và ethyl acetat bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng .... 38</i>

Hình 3.2. Đường kính vịng kháng của các loại cao chiết ... 42Hình 3.3. Nồng độ ức chế tổi thiểu (MIC) của cao ethyl acetate từ cây diệp hạ châu

<i>đắng (P. amarus) ... 44</i>

Hình 3.4. Khả năng kháng khuẩn của 5 phân đoạn... 47

<i>Hình 3.5. Cột phân đoan 3 được chạy sắc ký cột một lần nữa với hệ dung môi n–</i>

hexane: ethyl acetate (95:5) ... 48Hình 3.6. Sắc ký lớp mỏng thu được từ cao chiết phân đoạn 3 ... 49Hình 3.7 Sắc ký cột hệ chloroform: methanol (99:1)... 50Hình 3.8. Sắc ký lớp mỏng thu được từ sắc ký cột hệ dung môi chloroform:

methanol (99:1) với UV 254 nm ... 50Hình 3.9. Sắc ký cột hệ chloroform (100%) ... 51Hình 3.10. Sắc ký lớp mỏng chất PA01 ... 52Hình 3. 11.Kết quả kháng vi khuẩn Acinetobacter 77a bằng phương pháp tự sinh đồ phun dịch vi khuẩn ... 53

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

Hình 3.11. Cấu trúc của PA01 ... 55

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

Sơ đồ 1.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ...26

<i>Sơ đồ 1.2. Sơ đồ chiết cao diệp hạ châu đắng (P. amarus) ...28</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

Trên thế giới, sự xuất hiện các vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng và giới hạn sự lựa chọn trong việc sử dụng thuốc để chữa bệnh, đặc biệt đối với sự xâm nhiễm của vi khuẩn Gram (-) và vi khuẩn Gram (+). Trong đó có các chủng kháng

<i>kháng sinh phổ biến nhất E. coli, Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) </i>

là nguyên nhân chính trong sự bùng nổ nhiễm khuẩn ở bệnh viện và ở cộng đồng trên toàn thế giới. Trong thập kỷ qua, đáng báo động là sự bùng nổ của vi khuẩn kháng thuốc sinh ESBL. Extended–spectrum β– lactamase (ESBL) chỉ định chung cho trực khuẩn Gram (-) sản xuất β–lactamase phổ rộng, enzym này có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh tiêu diệt chúng (Horie và cs., 2017). Bên cạnh đó, theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) các vi khuẩn kháng kháng sinh được xếp vào mức

<i>độ ưu tiên hàng đầu là các loại A. baumannii, P. aeruginosa có khả năng kháng </i>

Carbapenem – là một trong những loại kháng sinh mạnh nhất của con người. Theo đó, sự lan truyền của vi khuẩn kháng carbapenem là một cuộc khủng hoảng sức khỏe toàn cầu (Nicolau và cs., 2008). Vì vậy việc tìm được nguồn thuốc mới thay thế các thuốc đang sử dụng hiện tại trở thành một vấn đề vô cùng cấp thiết, trong đó thực vật là dược liệu đầy tiềm năng.

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa ẩm vì vậy có hệ thực vật được dùng làm dược liệu vơ cùng phong phú và đa dạng. Đây chính là tài nguyên hết sức quý giá. Hiện nay, việc sử dụng các bài thuốc từ tự nhiên để hỗ trợ điều trị

<i>bệnh đang ngày càng phát triển, trong đó đáng kể đến là diệp hạ châu đắng (P. amarus). Diệp hạ châu đắng (P. amarus) được dân gian sử dụng để sát khuẩn, các </i>

bệnh của hệ niệu – sinh dục, đái tháo đường, lợi tiểu trị sỏi mật và sỏi thận, chống oxy hóa (Đỗ Huy Bích và cs., 2004), chống viêm (Harikrishnan và cs., 2018), chống lại virus viêm gan B (Thyagarajan và cs., 1988; Wang và cs., 1995), chống ung thư (Joy và cs ., 1988).

Năm 2010 theo nghiên cứu của Adegoke và cộng sự, cho thấy cao chiết

<i>ethanol của lá cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) có sự hiện diện của alkaloid, tannin và flavonoid và có tác dụng kháng lại các vi khuẩn S. aureus, E. coli và Klebsiella spp. (Adegoke và cs., 2010). </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

Dhandapani và cộng sự (2017) đã nghiên cứu sàng lọc sơ bộ hợp chất tự

<i>nhiên của cao chiết từ lá và rễ diệp hạ châu đắng (P. amarus) cho thấy có sự hiện </i>

diện của các alkaloid, phytosterol, hợp chất phenolic và tannin, protein và amino acid, lignin và saponin. Các hợp chất này đều cho thấy khả năng kháng khuẩn

<i>chống lại các chủng vi khuẩn gây bệnh như các vi khuẩn Gram (+) S. aureus, S. albus, B. subtilis và vi khuẩn Gram (-) như E. coli (Dhandapani và cs., 2007). </i>

Hiện nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu được công bố về việc sử

<i>dụng các hợp chất tự nhiên trong cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) để kháng lại </i>

<b>với các vi khuẩn kháng thuốc. Vì vậy chúng tơi thực hiện đề tài “PHÂN LẬP VÀ </b>

<b>TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN GRAM ÂM </b>

<i><b>KHÁNG THUỐC TỪ CAO CHIẾT DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus)”. </b></i>

<b>Mục tiêu: Phân lập và tinh chế hợp chất có hoạt chất kháng vi khuẩn Gram </b>

<i>âm kháng thuốc từ cao chiết diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus). </i>

Nội dung thực hiện bao gồm:

<i>- Chiết xuất cao dược liệu từ cây diệp hạ châu đắng (P. amarus). </i>

- Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc của cao chiết diệp hạ châu đắng

<i>(P. amarus). </i>

- Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethyl acetate diệp hạ châu

<i>đắng (P. amarus) với vi khuẩn kháng thuốc. </i>

- Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột. - Xác định hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc của cao phân đoạn ethyl acetate.

<i>- Phân lập hợp chất tự nhiên trong cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) có khả năng </i>

kháng khuẩn bằng phương pháp sắc ký cột.

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

<b>PHẦN I. </b>

<b>TỔNG QUAN TÀI LIỆU </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

<b>1.1. Tổng quan về nguyên liệu </b>

<i>1.1.1. Sơ lược về cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus). </i>

<i>Tên khoa học: Phyllanthus amarus, thuộc họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae), tên </i>

thường gọi: chó đẻ thân xanh, chó đẻ răng cưa, cam kiềm, rút đất, kham ham. Vị trí phân loại:

Giới: Plantae

Ngành: Angiospermae Lớp: Dicotyledoneae Bộ: Tubiflorae Họ: Euphorbiaceae

<i>Chi: Phyllanthus </i>

<i>Loài: Amarus Schum.et Thonn </i>

(Hemant Dhongade và cs., 1999)

<i>1.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố </i>

<i>Diệp hạ châu đắng (P. amarus) là loài cây nhiệt đới, có nguồn gốc xa xưa ở </i>

vùng nhiệt đới Nam Mỹ và hiện nay phân bố rải rác khắp các vùng nhiệt đới cổ. Ở Châu Á gồm các nước Ấn Độ, Malaysia, Phillippin, Indonesia, Campuchia, Thái Lan, Lào, Việt Nam, Nam Trung Quốc và cả ở vùng đảo Salawesi (Đỗ Huy Bích và

<i>cs., 2004). Ở Việt Nam, diệp hạ châu đắng (P. amarus) mọc rải rác khắp nơi, từ các </i>

tỉnh ở vùng đồng bằng, ven biển, các đảo lớn đến các tỉnh ở trung du và miền núi, có độ cao dưới 800 m. Ở các nước Đông Nam Á, độ cao phân bố của diệp hạ châu

<i>đắng (P. amarus) có thể lên tới 1.000 m. Chi Phyllanthus L. có nhiều loài, gồm </i>

những cây thảo đến các cây bụi hay gỗ nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.

<i><b>Hình 1.1. Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

Ở Việt Nam, chi này có khoảng 40 lồi. Trên thế giới, các lồi này cũng có phân bố rộng rãi ở một số nước nhiệt đới Châu Á như Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, Campuchia, Lào và ở cả Nam Trung Quốc.

<i> Diệp hạ châu đắng (P. amarus) là cây ưa ẩm và ưa sáng hoặc có thể hơi chịu </i>

bóng, thường mọc lẫn trong các bãi cỏ, ở ruộng cao, nương rẫy, vườn nhà và đôi khi ở vùng đồi không chịu được ngập úng. Cây sống được trên nhiều loại đất (đất bazan, đất pha cát, đất cát, đất phù sa…) pH từ 5,0 đến 6,5. Cây con mọc từ hạt vào cuối mùa xuân; sinh trưởng nhanh trong mùa hè và tàn lụi vào giữa mùa thu. Biên độ nhiệt thích hợp cho cây sinh trưởng là 25–30<small>o</small>

C. Do khả năng ra hoa kết quả nhiều, hạt giống phát tán gần nên cây thường mọc thành đám dày đặc, đôi khi lấn át cả các loại cỏ dại và cây trồng khác, vòng đời kéo dài 3–5 tháng (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).

<i>1.1.3. Đặc điểm hình thái </i>

Cây thảo, sống hằng năm hay sống dai, cao khoảng 20–30 cm, có thể đến 60–70 cm. Thân nhẵn, mọc thẳng đứng, lá mọc so le, hình bầu dục, xếp sít nhau thành hai dãy như một lá kép hình lơng chim. Phiến lá thn, dài 1–1,5 cm, rộng 3–4 mm, đầu lá nhọn hay hơi tù, mép có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới lá màu xanh lơ; cuống lá rất ngắn. Hoa mọc ở kẽ lá, có cuống ngắn, đơn tính cùng gốc; hoa đực ở đầu cành có 6 lá dài, 3 nhị, chỉ nhị ngắn; hoa cái ở cuối cành, 6 lá dài, bầu hình trứng. Quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống dưới lá, có khía mờ và có gai, hạt hình 3 cạnh. Mùa hoa: tháng 4–6; mùa quả: tháng 7–9 (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).

<i>1.1.4. Thành phần hóa học của diệp hạ châu đắng (P. amarus) </i>

<i>Diệp hạ châu đắng (P. amarus) là loại cây thân thảo chứa nhiều hợp chất như </i>

alkaloids, saponin, tannin, flavonoid, glycoside cyanogen, lignan và steroid mang lại nhiều tác dụng hữu ích.

<i>Diệp hạ châu đắng (P. amarus) có các hợp chất chủ yếu như lignans, </i>

geraniin và 5 hợp chất của flavonoids như quercertin, astralgin, quercertrin, isoquercitrin và rutin (Sharma và cs., 1993; Somanabandhu và cs., 1993). Theo

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

<i>Pereira và cộng sự (2016) đã xác định trong toàn cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) </i>

có 7 hợp chất lignan là 5–demethoxy–niranthin, phyllanthin, filtetralin, 5–demethox nirtetralin, nirtetralin, hipophyllanthin và niranthin, trong đó chiếm chủ yếu là phyllanthin và hipophyllanthin (Pereira và cs., 2016). Đồng thời trong cây diệp hạ

<i>châu đắng (P. amarus) cũng chứa những hợp chất nhỏ như hydrolysable tannin là </i>

phyllanthusiin D (Houghton và cs., 1996), amariin (Foo, 1993), amarulone (Rao và Bramley, 1971), amarinic acid, alkaloid như ent–norsecurinine, sobubbialine, epibubbialine, diarylbutane, nyrphyllin và neolignan, phyllnirurin.

<i><b>Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) </b></i>

<b>Phyllanthin </b>

<b>Rutin Quercertin</b>

<b>Isoquercitrin</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

<b>AmariinPhyllanthusiin D</b>

<i><b>Hình 1.3 Cấu trúc của các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) (tiếp theo) </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

<i>1.1.5. Giá trị dược liệu của cây diệp hạ châu đắng (P.amarus). </i>

<i>Diệp hạ châu đắng (P. amarus) là loại cây thân thảo chứa nhiều hợp chất như </i>

alkaloids, saponin, tannin, flavonoid, glycoside cyanogen và steroid mang lại nhiều tác dụng hữu ích.

Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, tất cả bộ phận cây

<i>diệp hạ châu đắng (P. amarus) được phơi khô, sắc uống dùng chữa đau viêm họng, </i>

đinh râu, mụn nhót, viêm da, lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi,

<b>PhyllnirurinEpibubbialine</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

<i>chàm má. Người Ấn Độ sử dụng diệp hạ châu đắng (P. amarus) để trị ho, viêm phế quản, hen phế quản, lao,… Ngồi ra diệp hạ châu đắng (P. amarus) cịn có khả năng </i>

làm hạ men gan, tăng cường chức năng gan và ức chế sự phát triển của virus viêm gan siêu vi B (Break Stone và cs., 1982). Năm 1992, các nhà khoa học Nhật Bản cũng đã khám phá được tác dụng ức chế sự phát triển HIV–1 từ cao chiết diệp hạ

<i>châu đắng (P. amarus). </i>

Theo nghiên cứu của Trường Đại học Dược Santa Catarina (Brazil, 1984) đã

<i>phát hiện alkaloid có trong diệp hạ châu đắng (P. amarus) có tác dụng chống co thắt </i>

cơ vân và cơ trơn, các nhà khoa học đã nhờ vào điều này để giải thích hiệu quả điều trị sỏi thận, sỏi mật.

Theo Thyagarajan và cộng sự (1988) đã nghiên cứu cho thấy cao chiết từ bột

<i>của cây P. amarus có khả năng làm mất kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B </i>

trong thời gian điều trị là 30 ngày tạo tiền đề cho những nghiên cứu về chiết xuất

<i>của P. amarus sau này (Thyagarajan và cs., 1988). </i>

<i>Năm 2000, Ali và cộng sự đã nghiên cứu cao chiết P. amarus có hoạt động </i>

ức chế α–Amylase hỗ trợ trong điều trị bệnh tiểu đường.

<i>Cao chiết methanol của lá cây P. amarus </i>có chứa các hợp chất saponin, phenolics, flavonoid và proanthocyanidin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, bắt các gốc tự do và ức chế peroxid hóa lipid (Nguyen và cs., 2017).

❖ Chữa viêm gan B:

<i>Diệp hạ châu đắng (P. amarus) 30 g, nhân trần 12 g, sai hồ 12 g, chi từ 8 g, </i>

hạ khô thảo 12 g, sắc (nấu) uống ngày 1 thang. ❖ Chữa xơ gan cổ trướng thể nặng:

<i>Diệp hạ châu đắng (P. amarus) sao khô 100 g sắc nước 3 lần. Trộn chung </i>

nước sắc, thêm 150 g đường, đun nấu cho tan đường, chia nhiều lần uống trong ngày (thuốc rất đắng), liệu trình 30–40 ngày.

❖ Chữa sốt rét:

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

<i>Dùng diệp hạ châu đắng (P. amarus) 8 g, thảo quả, dây hà thủ ô, lá mãng cầu </i>

ta tươi, thường sơn, dây gắm mỗi vị 10 g, bình lang (hạt cau), ơ mai, dây cóc mỗi vị 4 g đem sắc với 600 mL nước, còn 200 mL, chia uống 2 lần trường khi lên cơn sốt rét 2 giờ. Nếu không hết cơn, thêm sài hồ 10 g.

<b>1.2. Tổng quan về một số vi khuẩn gây bệnh ở người </b>

<i>1.2.1. Vi khuẩn sinh enzym ESBL </i>

<i>1.2.1.1. Giới thiệu tổng quan về enzym ESBL </i>

Đầu những năm 1980, các cephalosporins thế hệ 3 được đưa vào để điều trị các vi khuẩn kháng thuốc. Sự ra đời các kháng sinh β–lactams mới này đặc biệt là cephalosporin thế hệ 3, đã là thành công lớn của khoa học trong cuộc chiến đấu lâu

<i>dài với vi khuẩn sinh enzym β–lactamase (ví dụ chủng E. coli tiết ra enzym TEM–1 kháng ampicillin, chủng K. pneumoniae sinh enzym SHV–1 β–lactamase). Nhưng </i>

một loại enzym β–lactamase có khả năng phân hủy các cephalosporins thế hệ 2, 3 và monobactams, có nguồn gốc do TEM–1, TEM–2, SHV–1 đột biến thay đổi một số amino acid gọi là ESBL phổ rộng đã xuất hiện (Paterson và cs., 2005).

Là một loại enzym β–lactamase do trực khuẩn Gram (-) sinh ra. ESBL đề kháng với penicillin (trừ temocillin), cephalosporin thế hệ thứ ba (ví dụ ceftazidime, cefotoxime, ceftriaxone), aztreonam, cefamandole, cefoperazone, tuy nhiên nó rất nhạy cảm với methoxy–cephalosporin (cephamycins và carbapenems) và có thể bị ức chế bởi các thuốc ức chế β–lactamase như acid clavulanic, sulbactam, hoặc tazobactam (Giedraitiene và cs., 2011). ESBL chủ yếu có nguồn gốc từ các thành viên của TEM–, SHV–, và OXA– β–lactamase có một hoặc nhiều amino acid thay thế.

ESBL có nguồn gốc từ đột biến của β–lactamase do cephalosporin thế hệ 3 cảm ứng tạo thành. Những đột biến này do sự thay đổi ở một nhóm khoảng từ 1 đến 7 amino acid nằm gần vị trí tâm hoạt động của enzym. Những thay đổi trên đã tạo ra vị trí tâm hoạt động của enzym linh hoạt hơn, tiến hóa hơn vì thế gia tăng ái lực và

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

tăng hoạt động thủy phân đối với cephalosporins thế hệ 3 (như ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone,…) và monobactam (aztreonam) (Brafold, 2001).

<i>2.2.1.2. Tình hình vi khuẩn sinh ESBL trên thế giới và Việt Nam </i>

Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng tính kháng kháng sinh của vi

<i>khuẩn E. coli đã được báo cáo nhiều ở các nước phát triển và cả những nước đang phát triển. Các nghiên cứu tại Ấn Độ đã ghi nhận được các chủng E. coli sinh ESBL </i>

chiếm 24,8%–63,8% vi khuẩn sinh ESBL (Kumar và cs., 2006; Goyal và cs., 2009). Trong một báo cáo tiến hành tại một bệnh viện đại học ở Mwanza, Tanzania, tỷ lệ vi khuẩn ESBL (+) trong tất cả các vi khuẩn Gram (-) chiếm tới 29%, trong đó, tỉ lệ

<i>K. pneumoniae tiết ESBL chiếm tới 64% và E. coli tiết ESBL chiếm 24% (Mshana </i>

và cs.,2009). Trong năm 2013, tại 17 trong số 22 nước Châu Âu phân lập được

<i>85%–100% E. coli sinh ESBL (EARS–Net, 2014). Tỷ lệ mắc các bệnh nhiễm trùng </i>

gây ra bởi kháng sinh β–lactams do việc sản xuất các enzym khác nhau có tăng trong những năm gần đây. Phát hiện vi khuẩn ESBL (+) là hết sức cần thiết cả trong bệnh viện và cộng đồng. Các học viên kiểm soát lây nhiễm và bác sĩ lâm sàng cần nhanh chóng xác định và mô tả các loại vi khuẩn đề kháng kháng sinh khác nhau. Điều này là cấp thiết để giảm thiểu sự lây lan của các vi khuẩn và giúp chọn kháng sinh thích hợp trong điều trị (Shaikh và cs., 2015; Phumart và cs., 2012).

Theo báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt

<i>Nam năm 2008–2009, đã cho thấy tỷ lệ ESBL (+) của các chủng E. coli và Klebsiella spp.dao động giữa các bệnh viện, cao nhất ở bệnh viện Nhiệt đới Trung ương với 54,7% trên E. coli và 72,7% Klebsiella spp., sau đó là bệnh viện Chợ Rẫy </i>

với 49% và 58,2%, bệnh viện Việt Đức với 57,3% và 48,5%, bệnh viện Bình Định

<i>và 2 bệnh viện Nhi với tỷ lệ gần 40% trên E. coli và 50% trên Klebsiella spp.. Đây cũng là các bệnh viện có tỷ lệ E. coli và Klebsiella spp. kháng cephalosporins thế hệ </i>

3 cao hơn các bệnh viện khác (GARP–Vietnam, 2010). Tại Việt Nam, theo số liệu giám sát trong năm 2012 tại bệnh viện Nhiệt đới Trung ương tỉ lệ kháng ampicillin

<i>của E. coli lên tới 81,4%; kháng amoxicillin/clavulanic và ampicillin/sulbactam </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

khoảng 40%. Các kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ 3 cũng bị kháng đến gần một nửa và nhóm fluoro–quinolon cũng bị kháng khoảng 45% (Trần Thị Thùy Giang và cs., 2014).

<i>1.2.2.Vi khuẩn sinh carbapenemase. </i>

<i>1.2.2.1. Giới thiệu tổng quát về enzym carbapenemase. </i>

Carbapenemase là enzym thuộc họ β–lactamase bất hoạt được tất cả các loại β–lactams như Pencillin, Cephalosporin phổ rộng và kể cả kháng sinh mạnh nhất hiện nay là Carbapenem, vũ khí kháng sinh duy nhất giúp các bác sĩ điều trị nhiễm khuẩn do vi khuẩn tiết ESBL gây ra (Queenan và cs., 2007; Phạm Hùng Vân, 2013). Các gen mã hoá cho các loại carbapenemase nằm trên plasmid hay integron của nhiễm sắc thể nên có khả năng lây lan cao. Các loại carbapenemase hiện nay đã xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới và đang được xem là “ác mộng” đề kháng kháng sinh đối với con người (Phạm Hùng Vân, 2013). Có hai loại carbapenemase được cảnh báo gần đây, đó là blaKPC và NDM–1. KPC là một loại β–lactamase lớp A

<i>nguồn gốc plasmid phát hiện trên K. pneumoniae, lưu hành ở Hoa Kỳ, Nam Mỹ và </i>

Châu Âu và hiện cũng lây lan ra một số loài khác (Yigit và cs., 2001). NDM–1 được cảnh báo là nguy hiểm nhất vì lan truyền cao, thuộc lớp B, metallo–β–

<i>lactamase, có nguồn gốc plasmid và intergon được phát hiện trên K. pneumoniae và E. coli, được lưu hành cao ở Ấn Độ, Pakistan (Yong và cs., 2009). Chính vì vậy, </i>

việc phát hiện vi khuẩn tiết ra enzym này rất quan trọng để cảnh báo nguy cơ lây lan tính đề kháng kháng sinh này trong cộng đồng (Phạm Hùng Vân, 2013).

<i>2.2.2.2. Tình hình vi khuẩn sinh enzym carbapenemase trên thế giới và Việt Nam </i>

Hiện nay vấn đề vi khuẩn kháng thuốc kháng Carbapenem đang là vấn đề khủng hoảng toàn cầu và đáng lo ngại của thế giới đối với sức khỏe. Tỉ lệ

<i>Acinetobacter spp. gây nhiễm khuẩn bệnh viện đã tăng lên đều đặn trong những </i>

năm gần đây trên thế giới. Cùng với tỉ lệ nhiễm khuẩn tăng, tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn cũng đang tăng một cách đáng lo ngại. Ở Anh, các ca nhiễm khuẩn

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

<i>bệnh viện do Acinetobacter spp. kháng các loại Carbapenem đã xảy ra từ năm 2000. </i>

Cụ thể hơn, khoảng thời gian năm 2004–2008, tỉ lệ kháng Meropenem đã tăng từ 13

<i>đến 29%. Riêng tại Mĩ, các ca nhiễm khuẩn bệnh viện bởi Acinetobacter spp. đa </i>

kháng thuốc là 65–75% và không nhạy với Carbapenem tăng từ 9% trong năm 1995

<i>lên 57% trong năm 2008 (WHO, 2011). Tỉ lệ P. aeruginosa gây nhiễm khuẩn bệnh </i>

viện đã tăng dần trong những năm gần đây trên thế giới và cả Việt Nam. Cùng với sự gia tăng về tỉ lệ nhiễm khuẩn là sự gia tăng về khả năng kháng kháng sinh, cụ thể là khả năng kháng với Carbapenem (Hồng Dỗn Cảnh và cs., 2014).

<b>1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước </b>

❖ <i>Ngoài nước: </i>

Theo Aliyu và cộng sự (2008) đã nghiên cứu cao chiết methanol của toàn cây

<i>diệp hạ châu đắng (P. amarus) có chứa các hợp chất alkaloids, flavonoids, saponins, </i>

tannins và glycoside tim có khả năng kháng MRSA cho đường kính vịng vơ khuẩn 13 mm (Aliyu và cs., 2008).

Theo Akinjogunla và cộng sự (2010) đã nghiên cứu cao chiết ethanol thô của

<i>rễ và lá của P. amarus có chứa akaloid, saponin, flavonoids, terpenes và glycosides tim có khả năng ức chế E. coli–ESBL (Akinjogunla và cs., 2010). </i>

<i>Theo Bhat và cộng sự năm (2015) đã nghiên cứu cao chiết ethanol của P. amarus cho thấy ức chế chống lại S. mutans và S. salivarus có đường kính vịng </i>

kháng khuẩn lần lượt là 5,7 mm và 6,3 mm (Bhat và cs., 2015).

<i>Theo Valle và cộng sự (2015), chiết xuất dung dịch nước và acetone của P. amarus đã được nghiên cứu chống lại các chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc (B. subtilis, S. aureus, Enterococcus fecalis, S. typhi, S. paratyphi B, Proteus Vulgaris và Serratia marsescens) (Valle và cs., 2015). </i>

Theo nghiên cứu của Oluboyo và cộng sự (2016), đã nghiên cứu cao chiết

<i>ethanol của cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) có khả năng kháng với S. aureus và </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

<i>P. aeruginosa có đường kính vịng kháng khuẩn lần lượt là 17,82 mm và 10,82 mm </i>

ở nồng độ 10 mg/mL (Oluboyo và cs., 2016).

Theo Akporowhe và cộng sự (2016), đã nghiên cứu cao chiết ethanolic thô

<i>của lá diệp hạ châu đắng (P. amarus) có chứa các hợp chất flavonoids, tannins, </i>

saponins, alkaloids, terpenoids, gycosides và anthroquinones có khả năng chống oxy hóa ở chuột (Akporowhe và cs., 2016).

<i>Theo Putakala và cộng sự (2017) cao chiết nước của P. amarus có chứa các </i>

flavonoids, quercetin và rutin, các lignans phyllanthin và hypophyllanthin, saponin và các hợp chất phenolic acid galic có tác dụng bảo vệ tim mạch khi tiến hành nghiên cứu trên chuột (Putakala và cs., 2017).

<i>Các chất chiết xuất từ lá P. amarus đã được kiểm tra để phân tích hóa học </i>

hồn chỉnh cùng với tiềm năng chống vi khuẩn của chúng. Các chất chiết xuất ổn

<i>định khác nhau, ví dụ, n-hexane (59%), acetone (57%) và chiết xuất nước (48 %) đã </i>

được điều chế, có chứa nhiều alkaloid, saponin, anthraquinone, tannin và phenolics trong mơi trường acid. Nhìn chung, việc kết hợp chiết xuất lá với bacitracin hoặc erythromycin đơn thuần có tác dụng hiệp lực, do đó mơ tả lợi thế quan trọng của sự

<i>kết hợp giữa các kháng sinh phổ quát này với chiết xuất P. amarus để điều trị các </i>

bệnh nhiễm trùng khác nhau (Senjobi và cs., 2017).

Theo Senjobi và cộng sự (2017) nghiên cứu cao chiết thô của lá diệp hạ châu

<i>đắng (P. amarus) có khả năng kháng các nấm Aspergillus niger, Aspergillus tamari, Candida albicans và Fusarium oxysporium với đường kính vịng kháng trung bình </i>

từ là 4–6 mm (Senjobi và cs., 2017).

<i>Theo Ribeiro và cộng sự (2019) nghiên cứu P. amarus </i>là một nguồn giàu tannin thủy phân (ellagitanin), flavonoid, các akaloid, triterpen, sterol và lignan. Phyllanthin và hypophyllanthin là lignans đặc trưng chính của cây đã cho thấy các đặc tính estrogen, làm giảm căng thẳng mạch máu và bảo vệ tế bào gan. Cao chiết

<i>dung dịch nước và acetone của lá và toàn cây của P. amarus</i> đã được báo cáo cho thấy một số hoạt động sinh học như chống oxy hóa, bảo vệ dạ dày, tác dụng bảo vệ

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

<i>tim mạch. Các nghiên cứu trước đây đã xác minh rằng cao chiết P. amarus thu được </i>

từ lá của cây cho thấy hoạt động kháng khuẩn chống lại một số nhóm mầm bệnh, bao gồm cả vi khuẩn đa kháng thuốc (Ribeiro và cs., 2019).

❖ <i>Trong nước: </i>

Theo Huỳnh Kim Diệu và cộng sự năm (2011) nghiên cứu cây diệp hạ châu

<i>đắng (P. amarus) có hoạt tính kháng lại 8 chủng vi khuẩn S. aureus, S. faecalis, E. coli, P. aeruginosa, Salmonella spp. và Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Kết quả cho thấy tác động mạnh nhất đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila (MIC = 64–512 µg/mL) (Huỳnh Kim Diệu và cs., 2011). </i>

<i>Cao chiết methanol của lá cây P. amarus </i>có chứa các hợp chất saponin, phenolics, flavonoid và proanthocyanidin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, bắt các gốc tự do và ức chế peroxid hóa lipid (Nguyen và cs., 2017).

<b>1.4. Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu. </b>

Theo dược điển Việt Nam IV năm 2009, cao dược liệu là chế phẩm được chế bằng cách cô đặc hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ cao dược liệu thực vật hay động vật với dung môi. Các dược liệu khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khơ và nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp).

<i>1.4.1. Phân loại cao dược liệu </i>

Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó có cồn và nước đóng vai trị dung mơi chính. Nếu khơng có chỉ dẫn khác,

<i>quy ước 1 mL cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế. </i>

Cao đặc: là khối đặc quánh, hàm lượng dung mơi cịn lại trong cao không quá 20%.

Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao khơ khơng được có độ ẩm lớn hơn 5%.

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

Có nhiều phương pháp để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây thuốc. Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng – lỏng và chiết rắn – lỏng. Trong thực nghiệm việc chiết rắn – lỏng được áp dụng nhiều hơn, chiết rắn –lỏng gồm: ngấm kiệt (percolation), ngâm chiết (maceration), chiết với máy Soxhlet,... chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc. Ngồi ra cịn có chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method), (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Từ Minh Koóng, 2007).

<i>1.4.2. Các kỹ thuật chiết dược liệu </i>

<i>1.4.2.1. Kỹ thuật ngấm kiệt (Percolation) </i>

Dụng cụ: bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết. Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để chứa dung mơi tinh khiết.

Tiến hành: bột cây được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm, mẫu không được xay quá mịn hay có tính nhầy nhụa hoặc có thể trương nở… sẽ cản trở dịng chảy. Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bơng thủy tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bơng thủy tinh, lên gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung mơi cần chiết vào bình cho đến khi dung mơi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt.

Để yên sau một thời gian, thường là 12–24 giờ. Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mở khóa bình lóng để dung mơi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này.

Ưu điểm: dược liệu được chiết kiệt, giữ được hoạt tính.

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

Nhược điểm: năng suất thấp, thủ công, phức tạp, tốn dung mơi (Từ Minh Kng, 2007).

<i>1.4.2.2. Kỹ thuật ngâm chiết (Maceration) </i>

Bột cây được chứa trong một bình thủy tinh hay bình thép khơng rỉ có nắp đậy. Rót dung mơi trong bình cho đến xấp xấp bề mặt của bột dược liệu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên.

Sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung mơi sẽ có được cao chiết. Tiếp tục rót dung mơi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm một vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngồi). Mỗi lần ngâm dung mơi chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung mơi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hịa tan dung mơi đến đạt mức bão hịa, khơng thể hịa tan thêm được nhiều hơn, có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian. Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung mơi.

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền. Phương pháp làm ở nhiệt độ phịng nên giữ hoạt tính của các hoạt chất chiết được.

Nhược điểm: năng suất thấp, thao tác thủ công, chiết nhiều lần tốn dung mơi và thời gian chiết (Từ Minh Kng, 2007).

<i>1.4.2.3. Kỹ thuật chiết Sohxlet </i>

Bột cây xay thô được đặt trực tiếp trong túi vải trắng hay giấy lọc dày rồi cho vào trụ chiết (đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy để tránh làm nghẹt ống thông nhau), không được để lượng bột cây cao hơn mức thông nhau của trụ chiết.

Rót dung mơi vào bình cầu cho thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu (khơng được để lượng thể tích trong bình cầu nhiều hơn hai phần ba thể tích bình cầu).

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

Kiểm tra hệ thống kín. Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi. Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung mơi trong bình cầu sơi nhẹ đều. Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây. Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài, rút lấy một giọt dung môi và thử lên mặt kiếng, nếu thấy khơng có vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt. Sau khi hồn tất lấy dung mơi ra khỏi bình cầu A, đuổi dung mơi thu được cao chiết.

Đối với dịch chiết ethanol 100 mL, chiết liên tục 10 g bột dược liệu ở 60–80^oC trong 10 giờ, dịch chiết đem sấy khô 40^oC, ly tâm 5.000 vịng/10 phút, lọc với giấy lọc, cơ quay cho bay ethanol.

Ưu điểm: tiết kiệm dung môi, không tốn thao tác lọc và châm dung môi, chiết kiệt hợp chất trong bột cây.

Nhược điểm: hạn chế lượng bột cây cần chiết do kích thước máy nhỏ, các hợp chất kém bền nhiệt có chứa trong bột cây dễ bị phân hủy. Giá thành máy khá cao, máy làm bằng thủy tinh nên dễ vỡ, nhất là các nút mài được gia công bằng thủ công nên khi bị vỡ rất khó tìm được bộ phận khác để thay thế (Từ Minh Kng, 2007).

<i>1.4.2.4. Cơ đặc và sấy khô </i>

Để điều chế cao dược liệu, thường phải tiến hành bốc hơi dung mơi.

Có thể dùng nhiều thiết bị cô, sấy khác nhau, nhưng tốt nhất là tiến hành ở áp suất giảm và ở nhiệt độ sao cho sự phân hủy hoạt chất là tối thiểu (thường không quá 60^oC). Tránh cô hoặc sấy kéo dài ở nhiệt độ cao (Từ Minh Koóng, 2007).

Cao dược liệu phải đạt các chỉ tiêu chất lượng cao thuốc được quy định trong dược điển Việt Nam IV năm 2009:

- Cảm quan: cao thuốc phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định; có mùi, vị của dược liệu tương ứng,...

- Độ tan: cao lỏng phải tan hồn tồn trong dung mơi đã dùng để điều chế cao.

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

- Mất khối lượng do làm khô: thông thường cao đặc không quá 20%, cao khô không quá 5%.

<i>1.4.3. Phương pháp chiết lỏng – lỏng </i>

Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng. Sử dụng lần lượt các dung mơi hữu cơ để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực nước khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi). Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến

<i>dung môi phân cực thí dụ như: ester dầu hỏa và n–hexane, ether ethyl, chloroform, </i>

ethyl acetate, butanol… với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung mơi; chiết đến khi khơng cịn chất hịa tan vào dung mơi thì đổ sang chiết với dung mơi có tính phân cực hơn. Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na<small>2</small>SO₄, MgSO₄, CaSO₄, …, đuổi dung môi, thu được cao chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi (Solvent extraction). Cao alcol thơ ban đầu (ví dụ bột cây được tận trích với methanol 80%, đuổi dung môi thu được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (ví dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến khơng phân cực vì thế rất khó cơ lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.

Ngun tắc của sự chiết là dung mơi khơng phân cực (ví dụ ester dầu hỏa...) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính khơng phân cực (ví dụ các alcol béo, ester béo...), dung mơi phân cực trung bình ( ví dụ dietyl ester, chlorofrom...) hịa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình ( các hợp chất có chứa nhóm chức ester –O–, aldehyd –CH=O, ceton –CO–, ester –COO– ...) và dung mơi phân cực mạnh (ví dụ

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

methanol...) hịa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh ( các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH...) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

<i>- Chuẩn bị cột </i>

• Chọn cột phù hợp với lượng cao chuẩn bị phân lập, làm khô cột.

• Cho một ít bơng gịn ở đáy cột (ngay phía dưới vịi nhỏ giọt) để silica gel khơng chảy ra ngồi.

• Cân lượng silica gel vừa đủ cho vào cốc thủy tinh cùng với dung mơi ít phân cực và trộn đều.

• Đổ hỗn hợp silica gel vào cột cùng với một ít dung mơi, mở cột cho dung môi nhỏ giọt để ổn định cột.

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

H₂SO₄ 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Cách thực hiện: Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản hoặc micropipet để đưa mẫu lên bản mỏng. Thể tích dung dịch từ 0,001–0,005 mL đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,1–0,2 mL khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch. Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5–2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8–1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2–6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ. Ðặt bản nhôm gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung mơi khai triển. Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi.

Đọc kết quả: Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung mơi, làm bay hơi dung mơi cịn đọng lại trên bản mỏng rồi chụp ảnh, đo khoảng di chuyển của dung mơi và các chất cần tách. Tính hệ số Rf:

Rf = a/b Trong đó:

a: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử (cm).

b: là khoảng các từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết (cm). 0 < Rf < 1.

Để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được, sử dụng các phương pháp

<b>phổ hiện đại, đồng thời kết hợp tra cứu tài liệu thamkhảo. </b>

−<b> Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR):</b>Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT–NMR (sử dụng TMS làm chất nội chuẩn), ¹H– (500 MHz)và ¹³C– (125 MHz) tại Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.

.

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

<b>PHẦN II. </b>

<b>VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

<b>2.1. Vật liệu </b>

<i>2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu </i>

- Thời gian: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 08 năm 2020 - Địa điểm:

+ PTN Công nghệ Vi Sinh – cơ sở 3, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 68 Lê Thị Trung, Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương.

+ Phòng 19, Phòng hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Cơng nghệ Hóa học, 01 Mạc Đĩnh Chi, Bến Nghé, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh.

+ Phòng 4.4, Phòng hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Cơng nghệ Hóa học, TL29, Thạnh Lộc, Quận 12, TP. Hồ Chí Minh.

<i>2.1.2. Đối tượng nghiên cứu </i>

<i>- Diệp hạ châu đắng (P. amarus) được thu hái ở tỉnh Tây Ninh. </i>

- Các chủng vi khuẩn được cung cấp bởi khoa Y, Trường Đại học Y dược Tp. Hồ Chí Minh

<i>+ Chủng vi khuẩn sinh ESBL: E. coli 128a </i>

<i>+ Chủng vi khuẩn sinh Carbapenemase: Klebsiella 26k, Acinetobacter 77a, E. coli 49e. </i>

<i>2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và mơi trường </i>

❖ Hóa chất

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

<i>- Dung môi để chiết cao diệp hạ châu đắng (P. amarus): nước, n–hexane, </i>

diclorometan (CH₂Cl₂), ethanol. Dung mơi hịa tan cao chiết: Dimethyl sulfoxid (DMSO).

- Ống mẫu Mc Farland 0,5:

+ Dung dịch H<small>2</small>SO<small>4</small> 1% 9,95 mL. + Dung dịch BaCl<small>2</small> 1% 0,05 mL

Ống Mc Farland 0,5 có độ đục tương đương với 1–1,5 x 10<small>8</small>

<i> vi khuẩn/mL. </i>

❖ Môi trường

Nước muối sinh lý 0,85%, NA (Nutrient Agar), MHA (Muller Hinton Agar).

<b>2.2. Phương pháp nghiên cứu </b>

<i>2.2.1. Bố trí thí nghiệm </i>

Dựa vào mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, chúng tơi bố trí thí nghiệm:

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

<i><b>Sơ đồ 1.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm </b></i>

Sấy khơ và xay

Bột dược liệu

Chiết với các dung môi

Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn kháng

thuốc bằng phương pháp khuếch tán

giếng thạch

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC của

cao ethyl acetate Cô thành cao dược

liệu

Chạy cột sắc ký thu phân đoạn Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn kháng

thuốc của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch tán giếng

thạch

Chọn phân đoạn kháng vi khuẩn kháng thuốc

tốt nhất tiếp tục chạy sắc ký cột để thu nhận

và phân lập hợp chất trong cây diệp hạ châu

<i>đắng (P. amarus) Diệp hạ châu đắng (P. </i>

<i>amarus) </i> Định danh tên khoa học

Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được có trong cây diệp hạ châu

<i>đắng (P. amarus) </i>

Xác định khả năng kháng khuẩn của hợp chất bằng phương pháp

tự sinh đồ

</div>