phân lập và tinh chế hoạt chất sinh học có khả năng kháng staphylococcus aureus atcc 43300 mrsa từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành eleutherine subaphylla gagnep
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.84 MB, 82 trang )
<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">
<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH </b>
<b>--- ∞0∞--- </b>
<b>HÀ LONG </b>
<b>PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT SINH HỌC CÓ </b>
<i><b>KHẢ NĂNG KHÁNG Staphylococcus aureus ATCC </b></i>
<b>43300 (MRSA) TỪ CAO CHIẾT ETHYL ACETATE CỦA SÂM ĐẠI HÀNH </b>
<i><b>(Eleutherine subaphylla Gagnep.) </b></i>
<b>KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CƠNG NGHỆ SINH HỌC </b>
<b>THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020 </b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2"><b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH </b>
<b>--- ∞0∞--- </b>
<b>HÀ LONG </b>
<b>PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT SINH HỌC CÓ </b>
<i><b>KHẢ NĂNG KHÁNG Staphylococcus aureus ATCC </b></i>
<b>43300 (MRSA) TỪ CAO CHIẾT ETHYL ACETATE CỦA SÂM ĐẠI HÀNH </b>
<i><b>(Eleutherine subaphylla Gagnep.) </b></i>
<b>Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Y dược Mã số chun ngành </b>
<b>KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh </b>
<b>TS. Nguyễn Tấn Phát </b>
<b>THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020 </b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3"><b>LỜI CẢM ƠN</b>
Khoảng thời gian học việc và làm đề tài khóa luận tốt nghiệp tại Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh - Trường Đại học Mở Tp. Hồ Chí Minh là khoảng thời gian đáng nhớ nhất trong bốn năm đại học của tôi. Tôi đã được học hỏi được rất nhiều kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu tại đây. Cũng nơi đây, tơi có nhiều người bạn mới, dần lại trở thành gia đình lúc nào khơng hay, gắn bó với nhiều kỷ niệm vui buồn khác nhau. Để hoàn thành được đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt tình từ thầy cơ, các anh chị, các bạn và cả gia đình.
<b>Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Văn </b>
<b>Minh và cô Dương Nhật Linh. Thầy cơ đã tận tình dạy bảo cách làm người, chia sẻ </b>
những giá trị bổ ích, hướng dẫn những kiến thức chuyên ngành cũng như kĩ năng sống. Thầy cô cũng luôn tiếp động lực cho chúng em trong những lúc khó khăn để hồn thành tốt đề tài của mình.
<b>Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Tấn Phát và các anh chị tại Viện Công </b>
nghệ Hóa học - số 1, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, TP Hồ Chí Minh, đã ln hết mình hỗ trợ và giúp đỡ em rất nhiều để em có thể hoàn thành đề tài một cách tốt nhất.
Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh. Quý thầy cơ đã hết lịng giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu làm nền tảng vững chắc để em có thể hồn thành tốt cơng việc của mình.
<b>Em xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni và các anh chị trong phịng thí nghiệm đã nhiệt </b>
tình ủng hộ và giúp đỡ em giải quyết những vấn đề xảy ra trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Bên cạnh đó tơi xin cảm ơn tất cả các bạn thành viên phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh đã bên cạnh giúp đỡ tạo điều kiện để tôi
<b>hoàn thành tốt đề tài. Cảm ơn bạn Nguyễn Thị Trúc Ly và ba em Trần Thanh Trí, </b>
<b>Nguyễn Thị Thanh Nguyệt, Huỳnh Thị Ánh Xuân đã hỗ trợ tôi hoàn thành tốt đề tài. </b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4"><b>Cuối cùng con xin gửi lời cảm ơn Cha Mẹ, những người đã sinh thành, nuôi nấng </b>
và dạy dỗ con. Cảm ơn gia đình đã ln bên cạnh con, ln yêu thương và động viên những lúc con khó khăn, thậm chí là tồi tệ nhất, giúp con vững bước trên con đường mình đã chọn. Cảm ơn vì đã luôn tôn trọng và ủng hộ những quyết định của con.
Kính chúc tất cả q thầy cơ, anh chị, bạn bè, các em, cả gia đình dồi dào sức khỏe, luôn luôn hạnh phúc và gặt hái nhiều thành cơng trong cuộc sống. Xin chân thành cảm ơn!
Bình Dương, tháng 08 năm 2020
Hà Long
</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 5
<i>1.1. Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) .... 6 </i>
<i>1.2. Sơ lược về cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) ... 8 </i>
1.2.1. Phân loại khoa học ... 8
1.2.7. Các bài thuốc chữa bệnh từ sâm đại hành ... 15
1.2.8. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước ... 17
1.3. Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu ... 20
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ... 25
2.2. Vật liệu nghiên cứu ... 25
2.3. Mơi trường – hóa chất ... 25
2.4. Thiết bị và dụng cụ ... 25
</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">SVTH: Hà Long
2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ... 26
2.6. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết ... 29
<i>2.7. Khảo sát hoạt tính kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 ... 30 </i>
kháng methicillin (MRSA) các loại cao chiết ... 30
2.8. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với <i>Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) ... 31</i>
2.9. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) ... 31
2.10. Phương pháp sắc ký cột ... 32
2.11. Phương pháp hiện hình sinh học ... 33
2.12. Phương pháp xác định cấu trúc ... 34
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 35
3.1. Kết quả giám định tên khoa học của cây ... 36
3.2. Thu nhận cao chiết ethyl acetate từ cây sâm đại hành ... 36
3.3. Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết ... 37
3.4. Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của cao tổng ... 37
3.5. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn <i>Staphyloccoccus aureus ATCC 43300 (MRSA) ... 38</i>
3.6. Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột ... 40
3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng MRSA ... 42
3.7.1. Phương pháp khuếch tán đĩa giấy ... 42
3.7.2. Phương pháp hiện hình sinh học ... 44
3.8. Sắc ký cột cao chiết ... 45
3.9. Khảo sát các phân đoạn cao ES-EA1 ... 49
13.10. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất ES06 ... 52
</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">SVTH: Hà Long
TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 65 1. Tài liệu tiếng Việt ... 65 2. Tài liệu tiếng Anh ... 66
</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">SVTH: Hà Long
<b>DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ </b>
Bảng 1.1. Kết quả số lượng nấm và vi khuẩn sống có trong cao chiết ... 37 Bảng 1.2. Kết quả khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC đối với vi khuẩn MRSA từ cao chiết sâm đại hành ... 39 Bảng 1.3. Hàm lượng thu nhận các cao phân đoạn từ cao phân đoạn ethyl acetate ... 40 Bảng 1.4. Kết quả thử khả năng kháng MRSA của các phân đoạn từ cao ethyl acetate ... 42 Bảng 1.5. Kết quả khảo sát cao ES-EA1.4.1.1 ... 50 Bảng 1.6. Dữ liệu phổ <small>13</small>C (125 Hz) và <small>1</small><b>H (500 Hz) của ES06 và chất rhein đo trong </b>
<i>DMSO-d<small>6</small></i> ... 54 Biểu đồ 1.1. So sánh kết quả kháng MRSA của các phân đoạn từ cao ethyl acetate ... 44
</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">SVTH: Hà Long
<b>DANH MỤC HÌNH </b>
Hình 1.1. Hình vi thể MRSA ... 6
<i>Hình 1.2. Cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) ... 9 </i>
Hình 1.3. Cơng thức hóa học của eleutherin và isoeleutherin ... 10
Hình 1.4. Cơng thức hóa học của eleutherol và anthracene-9,10-dione-1,5-diol-4 methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester... 11
Hình 1.5. Cơng thức hóa học của eleutherinone ... 11
Hình 1.6. Cơng thức hóa học của (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, D-glucoside, isoeleuthoside C, eleutherinol, eleuthoside B, eleuthoside C, elecanacin và hongconin ... 12
eleutherinol-8-O-Hình 3.1. Thiết bị máy cô quay ... 36
Hình 3.2. Cao ethyl acetate ... 36
Hình 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng MRSA của cao tổng ... 38
Hình 3.4. Kết quả MIC kháng MRSA của cao ethyl acetate ... 40
Hình 3.5. Cột sắc ký thu phân đoạn 1 ... 41
Hình 3.6. Cột sắc ký thu phân đoạn 2 ... 41
Hình 3.7. Cột sắc ký thu phân đoạn 3 ... 41
Hình 3.8. Cột sắc ký thu phân đoạn 4 ... 41
Hình 3.9. Cột sắc ký thu phân đoạn 5 ... 42
Hình 3.10. Kết quả thử hoạt tính kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy ... 43
Hình 3.11. Kết quả thử hoạt tính kháng MRSA bằng phương pháp hiện hình sinh học ..
</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10"><b>Hình 3.18. Tinh thể của hợp chất ES06 ... 51 Hình 3.19. SKLM hợp chất ES06 ở 254 nm và sau khi tác dụng với acid và nhiệt .... 51 </b>
Hình 3.20. Sơ đồ phân lập phân đoạn ES-EA1 ... 52
<b>Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của ES06 ... 53 </b>
<b>DANH MỤC SƠ ĐỒ </b>
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ... 26 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ chiết cao sâm đại hành ... 29
</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">MIC Minimum Inhibitory Concentration
</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">SVTH: Hà Long
<b>ĐẶT VẤN ĐỀ </b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">SVTH: Hà Long
Trong các thập kỷ qua, các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ tử vong do nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh tăng đáng kể và lan truyền rộng rãi trên toàn thế giới do việc lạm dụng kháng sinh ngày càng phổ biến. Khoảng 11,000 ca tử vong liên quan đến MRSA bao gồm viêm phổi hoại tử, viêm tủy xương và nhiễm trùng huyết đã được báo cáo hàng năm (Mohammad H và cs., 2015). Tỷ lệ MRSA ở Đông Nam Á dao động từ 7% ở Philippines, ở Malaysia đến 25% và 39% ở Singapore (Lestari và cs., 2012). Từ
<i>293 chủng Staphylococcus aureus phân lập từ mẫu bệnh phẩm tại Khoa Sinh học Lâm </i>
sàng, Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đã xác định được 49,7% chủng MRSA (Phan Nữ
<i>Đài Trang và cs., 2016). S. aureus kháng methicillin (MRSA) đã trở thành nguyên nhân </i>
phổ biến của kháng kháng sinh. Tình trạng kháng methicillin gia tăng đáng kể ở các
<i>chủng S. aureus lâm sàng ở các nước châu Âu lên tới 20%. Vấn đề kháng thuốc đang gia </i>
tăng và việc khám phá ra các tác nhân mới có hiệu quả chống lại MRSA là hết sức cần thiết. Do đó việc tìm nguồn thuốc mới ngày càng cấp thiết, thực vật là nguồn quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu trong các năm gần đây.
Hiện nay, cùng với sự phát triển của y học, các bài thuốc từ thực vật cho mục đích chữa bệnh ngày càng nhiều. Việc sử dụng dược liệu đã tăng vượt bậc trong thập kỷ vừa qua. Thực vật được xem như là một trong những nguồn thay thế lý tưởng vì mức độ an tồn, khơng hoặc ít phản ứng phụ và có nhiều đích tác động khác nhau lên tế bào vi khuẩn nên ít có nguy cơ gây ra sự kháng thuốc (Raskin và cs., 2002). Dược liệu đóng một vai trị quan trọng trong chăm sóc sức khỏe với khoảng 80% dân số thế giới sử dụng thuốc y học cổ truyền chủ yếu dựa vào thực vật (Owolabi và cs., 2007). Theo WHO, cây thuốc sẽ là nguồn tốt nhất để có được nhiều loại thuốc. Thuốc có nguồn gốc thực vật đã đóng góp lớn cho sức khỏe con người (El-Astal và cs., 2005). Sự phong phú của cây thuốc trong tự nhiên và kiến thức truyền thống làm tăng sự hiểu biết về tính chất, tính an tồn và hiệu quả của cây thuốc (Nascimento và cs., 2000). Mối quan tâm về tính chất, tính an tồn và hiệu quả của cây thuốc đã được thể hiện do sự kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh trên lâm sàng đối với các kháng sinh đã được sản xuất trong những
</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">SVTH: Hà Long
thập kỷ qua (Cohen và cs., 1992; Nascimento và cs., 2000). Hiện nay, các bài báo nghiên cứu về chiết xuất hợp chất từ các lồi thực vật có hoạt tính sinh học cho mục đích làm thuốc gia tăng nhanh chóng (Nascimento và cs., 2000; Rios và cs., 2005)
<i>Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) là một loại thảo mộc trong họ La </i>
dơn, một họ thực vật bao gồm 90 chi và 1200 lồi (Schultes và cs., 1990). Sâm đại hành có tác dụng điều trị một số bệnh như kinh nguyệt không đều (Hodge và cs., 1956), rối loạn đường ruột (Van den Berg, 1984; Lin và cs., 2002). Thân rễ của sâm đại hành được sử dụng như một tác nhân cầm máu và kháng khuẩn (Dam và cs., 1990). Các loại thực vật thuộc chi này đã phân lập và xác định được một số hợp chất bao gồm elecanicin, eleutherol, isoeleutherol, eleutherin, isoeleutherin (Hara và cs., 1997), hongconin (Zhengxiong và cs., 1984) và anthraquinones (Komura và cs., 1983). Đồng thời, củ của
<i>Eleutherine americana từ lâu đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian để điều trị </i>
bệnh tim, bệnh tiểu đường, ung thư vú, đột quỵ, tăng huyết áp và rối loạn tình dục đặc biệt là rối loạn mạch vành ở đảo Hải Nam, Trung Quốc (Ieyama và cs., 2011; Chen và cs., 1981; Mahabusarakam và cs., 2010; Han và cs., 2008). Theo nhiều báo cáo, củ của
<i>E. americana chứa anthraquinones, naphthoquinones, các dẫn xuất của naphtalene và </i>
các hoạt tính sinh học quan trọng, chẳng hạn như giãn mạch vành, giảm prothrombin, chống đông máu, chữa lành vết thương, ức chế topoisomerase II, ức chế HIV, kháng nấm và chống ung thư (Alves và cs., 2003; Shibuya và cs., 1997; Francesca và cs., 2010; Chen và cs., 1986; Qiu và cs., 2005; Xu và cs., 2005).
Hiện nay các nghiên cứu, bài báo khoa học trong nước về khả năng chữa bệnh trong các bộ phận của cây sâm đại hành còn rất hạn chế cũng như còn khá ít các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của cao chiết sâm đại hành. Kế thừa kết quả từ đề tài
<i>nghiên cứu trước “Phân lập và tinh chế hoạt chất kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) từ cao chiết sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)” cho thấy </i>
kết quả cao ethyl acetate có khả năng kháng mạnh với MRSA (25,67 ± 0,86 mm). Do đó chúng tơi tiến hành khảo sát khả năng kháng MRSA ở người từ các phân đoạn của cao
</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">SVTH: Hà Long
ethyl acetate đồng thời phân lập và tinh chế các hoạt chất khác có hoạt tính sinh học nói
<b>trên. Chính vì thế, chúng tơi thực hiện đề tài “Phân lập và tinh chế hoạt chất sinh học </b>
<i><b>có khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)” </b></i>
- Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết sâm đại hành:
+ Khảo sát khả năng kháng khuẩn của sâm đại hành bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy.
+ Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với MRSA
-
<b>Xác định cấu trúc của hợp chất ES06.</b></div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">SVTH: Hà Long
<b>PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU </b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">MRSA đề kháng penicillin M chủ yếu qua trung gian gen mecA mã hóa cho protein 2A gắn penicillin (PBP 2A hoặc PBP 2’). Khi được tạo ra, PBP 2A nằm ở vách tế bào vi khuẩn và có ái lực thấp với kháng sinh β-lactam, nhờ vậy mà làm cho vi khuẩn kháng được khơng chỉ penicillin M mà cịn với tất cả các kháng sinh β-lactam (Phạm Hùng Vân, 2013).
Kể từ những năm 1960, MRSA trở nên phổ biến trên toàn cầu và là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn ở bệnh viện và cộng đồng. Các chủng MRSA mang gen mã hóa protein làm cho vi khuẩn kháng với hầu hết các kháng sinh nhóm β-lactam (như methicillin) (Lee và cs., 2018).
<b>Phân loại khoa học </b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">SVTH: Hà Long
<i>methicillin được đưa vào sử dụng rộng rãi nhưng chỉ 1 năm sau, chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin được phân lập (Jevons và cs., 1961). </i>
Kể từ lần đầu tiên xuất hiện vào năm 1960 (Jevons và cs., 1961) tình trạng kháng
<i>methicillin ở các chủng S. aureus đã trở nên phổ biến trong các bệnh viện. Hệ thống </i>
giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia (NNISS) đã ghi nhận sự gia tăng MRSA tại các bệnh viện lớn ở Hoa Kỳ, từ 4% vào những năm 1980 lên 50% vào cuối những năm 1990. Ở một số bệnh viện, đã ghi nhận được tỷ lệ kháng thuốc cao tới 80% (Wenzel và cs., 1991). Sự gia tăng các trường hợp nhiễm khuẩn MRSA khởi phát tại bệnh viện, với ước tính khoảng 18.900 trường hợp trong năm 2005 (Klevens và cs., 2007).
<i>Các bệnh nhiễm trùng hầu hết do S. aureus kháng methicillin (MRSA) gây ra: </i>
Đông Nam Á hơn 25%, Đông Địa Trung Hải hơn 50%, Châu Âu 60%, Châu Phi 80%, Tây Thái Bình Dương 80%, Châu Mỹ 90% (WHO, 2018). MRSA là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng da và mơ mềm trong bệnh viện cộng đồng ở những người khỏe mạnh khác. Tần suất tử vong hàng năm từ MRSA đang gia tăng nhanh chóng và vượt qua những người gây ra bởi virus suy giảm miễn dịch ở người/hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV/AIDS) (Bancroft và cs., 2007), từ năm 1999 đến 2005, số ca nhập viện liên quan đến nhiễm trùng MRSA tăng 119%, hay 14% mỗi năm (Klein và cs., 2007), khoảng 1.650 trường hợp nhiễm dòng máu và 500 trường hợp tử vong hàng năm ở Úc (Turnidge và cs., 2009), 11.000 người chết mỗi năm tại Hoa Kỳ (Dantes và cs., 2011) và một chi phí vượt quá hàng năm cho hệ thống chăm sóc sức khỏe của châu Âu là 380 triệu euro (Köck và cs., 2010).
<i>Đứng trước tình hình S. aureus kháng với penicillin do gần 100% có khả năng tiết </i>
được enzyme penicillinase phá huỷ được penicillin, các nhà lâm sàng phải chỉ định
<i>penicillin M để điều trị các nhiễm khuẩn do S. aureus. Tuy nhiên hiện nay các bác sĩ điều trị phải đối phó với thách thức là tác nhân S. aureus kháng được penicillin M </i>
(MRSA) với tỷ lệ ngày càng gia tăng. Tại Việt Nam, một nghiên cứu đa trung tâm thực
<i>hiện năm 2005 trên 235 chủng S. aureus phân lập được từ các trường hợp lâm sàng </i>
</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">SVTH: Hà Long
<i>nhiễm khuẩn do S. aureus cho thấy tỷ lệ MRSA là 47%. Tổng kết tại Bệnh Viện Chợ </i>
Rẫy và Bạch mai cũng cho thấy tỷ lệ MRSA là 57% và 43%. Tổng kết của GARP:VN cho thấy tỷ lệ MRSA ghi nhận từ 15 bệnh viện tại VN vào năm 2008 là từ 30% đến 64%. Bệnh viện Thống Nhất TP. HCM từ năm 2005 đến 2007 đã ghi nhận có đến 79%
<i>Staphylococcus saprophyticus và 40% S. aureus phân lập từ nhiễm khuẩn đường tiết </i>
niệu kháng methicillin. Chỉ định kháng sinh dành cho MRSA là vancomycin, tuy nhiên hiện nay chỉ định này đang phải đối diện với một thách thức mới, không phải là do xuất
<i>hiện đề kháng vancomycin mà là do MIC của vancomycin đối với S. aureus bị tăng vượt </i>
quá 1,5 μg/mL gây thất bại điều trị vancomycin trên lâm sàng. Thách thức này hiện nay đã được ghi nhận tại bệnh viện Bạch Mai và bệnh viện Chợ Rẫy với ghi nhận 46% các chủng MRSA là có MIC của vancomycin ≥ 2 μg/mL và 93% có MIC ≥ 1,5 μg/mL (Phạm Hùng Vân, 2016).
Một nghiên cứu tương đối rộng ở 3 tỉnh (Đà Nẵng, Cần Thơ và Tp. Hồ Chí Minh) của Phạm Hùng Vân và Phạm Thái Bình cho thấy MRSA kháng lại hầu hết các loại kháng sinh thông dụng, kể cả kháng sinh thế hệ mới (gentamycin: 42%, erythromycin: 63%, azithromycin: 68%, ciprofloxacin: 39%, cefuroxime: 38%, amoxillin-acid clavuanic: 30%, chloramphenicol: 38%, methicillin: 47%) (Phạm Hùng Vân và cs., 2005)
<i><b>1.2. Sơ lược về cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) </b></i>
<b>1.2.1. Phân loại khoa học </b>
<b>Giới: </b> Plantae </div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">SVTH: Hà Long
<b>Loài: </b> <i>Eleutherine subaphylla Gagnep. </i>
<i><b>Hình 1.2. Cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) </b></i>
<i>Tên khoa học: Eleutherine subaphylla Gagnep. </i>
<i>Tên đồng nghĩa: Eleutherine bulbosa (Mill.) Urban, E. longifolia Gagnep. </i>
Còn gọi là: tỏi lào, sâm cau, sâm đại hành, hành lào (Hịa Bình), tỏi mọi, kiệu đỏ, co nhọt (Lào), phong nhan, hom búa lượt (Thái).
Người ta dùng củ tươi hay phơi hoặc sấy khô của cây sâm đại hành làm thuốc với
<i>tên khoa học Bul-bus Eleutherinis subaphyllae (Đỗ Tất Lợi, 2006). </i>
<b>1.2.2. Đặc điểm hình thái </b>
Là cây thảo sống lâu năm, cao trung bình từ 30-60 cm. Dị hình trứng dài 4-5 cm, đường kính 2-3 cm, giống như củ hành nhưng dài hơn, bên ngoài phủ vẩy màu đỏ nâu, phía bên trong màu nâu hồng đến đỏ nâu. Lá hình mác, gân lá song song, dài 40-50 cm, rộng 3-5 cm. Từ đó mọc lên một cán mang hoa dài 30-40 cm. Hoa mọc thành chùm, 3
</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">SVTH: Hà Long
lá đài, 3 cánh hoa màu trắng hay vàng nhạt, 3 nhị màu vàng. Bầu hình trứng, 3 cạnh 3 ngăn dài 1 mm, vòi dài 2,5 mm trên xẻ thành 3 trông như 3 mũi dùi. (Đỗ Tất Lợi, 2006).
<b>1.2.3. Phân bố, thu hái và chế biến </b>
Sâm đại hành thường mọc hoang ở các sườn đồi, bìa rừng hoặc dưới tán rừng. Cây còn được trồng để lấy củ làm thuốc ở nhiều nơi như: Hịa Bình, Hà Tây, Nghĩa Lộ, Nghệ An, Hà Tĩnh,… Ở Hà Nội và một số địa phương cũng có nhà trồng, trồng (tỏi đỏ) rất đơn giản, chỉ việc vùi cây xuống đất như trồng hành, trồng tỏi.
Thân hành thu hái ở cây đã trồng được 1 năm trở lên, vào lúc thân lá đã tàn úa. Nếu chưa dùng ngay, tách ra từng nhánh, rũ sạch đất, để nguyên cả rổ và lớp vỏ khơ ở ngồi, cắt bỏ phần thân lá, để trong cát ẩm hay chỗ mát cho củ lâu khơ. Với cách này, có thể bảo quản dược liệu dược vài tháng. Khi dùng, rửa sạch thân rễ, thái mỏng phơi khô, để nguyên miếng hoặc tán bột.
Vị thuốc có màu đỏ, dùng ngâm rượu mùi vị rất thơm ngon.
<b>1.2.4. Thành phần hóa học </b>
Năm 1951, lần đầu tiên cây sâm đại hành được nghiên cứu bởi Schmid và cộng sự, hai hợp chất là eleutherin và isoeleutherin đã được cô lập (Schmid và cs., 1951).
<b>Hình 1.3. Cơng thức hóa học của eleutherin và isoeleutherin </b>
Năm 1975, Bianchi và cộng sự đã cô lập từ củ của cây sâm đại hành hai hợp chất là eleutherin và eleutherol (Bianchi và cs., 1975).
</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">SVTH: Hà Long
Năm 1982, từ củ Sâm đại hành người ta đã cô lập được một anthraquinon mới là anthracene-9,10-dione-1,5-diol-4-methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester (Weniger B và cs., 1982).
<b>Hình 1.4. Cơng thức hóa học của eleutherol và diol-4-methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester </b>
anthracene-9,10-dione-1,5-Năm 2003, Helmut Kloos và cộng sự đã công bố kết quả cô lập được hợp chất eleutherinone cũng từ thân rễ của cây sâm đại hành.
<b>Hình 1.5. Cơng thức hóa học của eleutherinone </b>
Thành phần hóa học của cây sâm đại hành, 4 hợp chất polyketit mới được phân lập gồm (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-D-glucoside và isoeleuthoside C (dihydroisoeleutherin-5-O-D-gentiobioside) cùng với các chất đã được cơ lập trước đó gồm eleutherin, isoeleutherin, eleutherinol, eleutherol, eleuthoside B (eleutherol-4-O-D-gentiobioside), eleuthoside C (dihydroeleutherin-5-O-Dgentiobioside), elecanacin và hongconin (4-oxodihydroisoeleutherin) (Francesca và cs., 2010).
</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">SVTH: Hà Long
<b>Hình 1.6. Cơng thức hóa học của (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-D-glucoside, isoeleuthoside C, eleutherinol, eleuthoside B, </b>
<b>eleuthoside C, elecanacin và hongconin </b>
Ở Việt Nam, chưa có nhiều các nghiên cứu về thành phần hố học của lồi sâm đại hành, ngồi cơng bố cơ lập được 4 hợp chất là eleutherin C<small>16</small>H<small>16</small>O<small>4</small> độ chảy 175<sup>o</sup>, izoeleutherin C<small>16</small>H<small>16</small>O<small>4</small> độ chảy 177<small>o</small>, eleutherola C<small>14</small>H<small>12</small>O<small>4 </small>độ chảy 202-203<small>o</small> và một chất chưa xác định được đặt tên là Ex của Lê Văn Hồng và Nguyễn Văn Đàn. SKLM của dịch chiết cịn cho biết có 16 vết trong đó 9 vết màu vàng đậm nhạt khác nhau, 6 vết phát quang lơ và một vết màu hồng nhạt. Cả 3 hoạt chất đều có tác dụng kháng sinh đối
<i>với chủng S. aureus (Lê Văn Hồng và Nguyễn Văn Đàn, 1973). </i>
</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">SVTH: Hà Long
Như vậy, trên thế giới đã có các nghiên cứu về cây sâm đại hành từ rất sớm. Các nghiên cứu cho thấy thành phần hoá học chủ yếu của sâm đại hành là các hợp chất quinone và dẫn xuất.
<b>1.2.5. Tác dụng dược lý </b>
Dịch chiết toàn phần củ sâm đại hành có tác dụng ức chế rõ rệt in vitro đối với
<i>phế cầu khuẩn, liên cầu tan máu, tụ cầu vàng, tác dụng yếu với Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, có tác dụng chống viêm cấp tính và </i>
mãn tính; khơng gây biểu hiện độc tính; khơng ảnh hưởng đến thành phần máu và chức phận gan, thận, trong thử nghiệm độc tính bán cấp. (Đỗ Huy Bích và cs., 2006)
Sâm đại hành có tác dụng làm tăng hồng cầu và huyết sắc tố chuột cống trắng được gây mơ hình thiếu máu bằng acetate chì. Có tác dụng an thần, làm giảm hoạt động tự nhiên của chuột nhắt trắng, làm giảm sự khéo léo, nhanh nhẹn của chuột nhắt trắng trong thí nghiệm chuột leo ống và có tác dụng kéo dài thời gian giấc ngủ gây bởi thuốc ngủ evipan, đồng thời có tác dụng ức chế sự hưng phấn gây bởi cafein và co giật gây bởi strychnin. (Đỗ Huy Bích và cs., 2006)
Các hợp chất: eleutherin, isoeleutherin, eleutherol, isoeleutherol là những thành phần trong sâm đại hành có hoạt tính kháng khuẩn và làm tăng lưu lượng tuần hoàn ở tim cô lập chuột lang. Thuốc viên và mỡ từ cao khô sâm đại hành dùng điều trị cho 20 bệnh nhi (8 ca nhọt, 4 ca chốc, 4 chốc chàm hóa, 2 chàm tiếp xúc, 1 viêm da mủ, 1 chàm vi khuẩn), đã chữa khỏi 80%. Làm kháng sinh đồ thấy 7/9 trường hợp có tụ cầu vàng hoặc liên cầu týp B, hầu hết vi khuẩn kháng với tất cả các kháng sinh. Thuốc không gây tác dụng khơng mong muốn. (Đỗ Huy Bích và cs., 2006)
Viên sâm đại hành điều trị 53 cháu bị viêm nhiễm đường hô hấp trên do nhiễm vi khuẩn nhẹ, hoặc nhiễm siêu vi khuẩn (cảm cúm nhẹ và vừa) có kết quả tốt thay thế được kháng sinh. Thuốc đã chữa khỏi nhanh các triệu chứng và đạt số ngày nằm điều trị tương tự như với thuốc kháng sinh. Thuốc không gây tác dụng phụ. Viên sâm đại hành dùng
</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">SVTH: Hà Long
phối hợp với INH và pyrazinamid điều trị lao phổi, đã có tác dụng làm giảm sốt, giảm khạc đờm, giảm ho ra máu, làm cho dễ ngủ và ăn ngon. Viên Đại can gồm sâm đại hành và xạ can có tác dụng tốt đối với viêm họng cấp tính nhẹ (85% kết quả khá và tốt); đối với viêm họng mạn tính, tỷ lệ khỏi và khá thấp hơn, khoảng 63,8%. Có thể dùng viên Đại can cho mọi lứa tuổi, ngậm hoặc uống. Thuốc có tác dụng chống viêm rõ rệt, đồng thời có tác dụng long đờm, có thể dùng điều trị chứng ho thơng thường, khơng gây tác dụng khơng mong muốn. (Đỗ Huy Bích và cs., 2006)
Viên sâm đại hành còn dùng điều trị cho 25 trường hợp sau phẫu thuật ruột thừa chưa có biến chứng, dùng thuốc từ ngày thứ 2 sau mổ trong 7 ngày, các vết mổ tiến triển tốt, khơng có mủ. Thuốc khơng gây tác dụng phụ. Viên sâm đại hành có tác dụng tốt khi áp dụng để phòng nhiễm khuẩn sau đặt vòng tránh thai. Sâm đại hành cũng có tác dụng tốt đối với các vết thương có mủ, vết bỏng. Viên sâm vơng gồm sâm đại hành và lá vơng có tác dụng gây ngủ, tác dụng tốt với chứng mất ngủ do bệnh mạn tính như viêm đại tràng, loét dạ dày; tác đụng hạn chế đối với những bệnh nhân có hội chứng nhiễm khuẩn gây mất ngủ và đối với suy nhược thần kinh. Tác dụng tốt với bệnh nhân mất ngủ đầu giờ, ngủ khơng sâu. (Đỗ Huy Bích và cs., 2006)
<b>1.2.6. Công dụng </b>
Thuốc bổ máu chữa thiếu máu, vàng da, xanh xao, hoa mắt, choáng váng, nhức đầu, mệt mỏi. Thuốc cầm máu dùng trong băng huyết, ho ra máu, bị thương chảy máu (dùng củ tươi, giã đắp). Còn dùng chữa ho gà, viêm họng, mụn nhọt, chốc lở.
Ở Indonesia, rễ sâm đại hành được dùng theo kinh nghiệm dân gian làm thuốc lợi tiểu, trị lỵ, viêm và sa trực tràng. Ở Philippine, nhân dân dùng rễ củ giã nát đắp lên vết cắn của cá độc, để nhổ gai ở chân, và đắp vào vết châm đốt của sâu bọ, vết thương, nhọt. Rễ củ nướng, giã nát, xát vào bụng chữa đau bụng, ở Peru, thổ dân vùng Amazon dùng sâm đại hành trị rối loạn tiêu hóa và bệnh ngồi da. Ở vùng trung Hải, rễ sâm đại hành trị vô kinh dưới dạng thuốc sắc hoặc ngâm rượu uống.
</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">SVTH: Hà Long
<b>1.2.7. Các bài thuốc chữa bệnh từ sâm đại hành </b>
<i>1.2.7.1. Bài thuốc chữa thiếu máu và sa trực tràng </i>
Bài thuốc từ sâm đại hành chữa thiếu máu và sa trực tràng cần tích hợp thêm một số vị thuốc khác. Trong đó chẳng hạn như đẳng sâm 15 g, xuyên khung 6 g, huỳnh kỳ 15 g và sâm đại hành 15 g. Sau đó đem tồn bộ thuốc tạo thành 1 thang và sắc uống với liều lượng vừa đủ.
Mỗi ngày nên uống khoảng 2-3 bát thuốc. Duy trì điều độ liều lượng như vậy trong vịng 1 tháng là có thể cải thiện bệnh. Đặc biệt nếu trong vịng 1 tháng tình trạng bệnh có phần thun giảm thì có thể giảm liều lượng thuốc lại.
<i>1.2.7.2. Bài thuốc chữa mụn nhọt và sưng tấy </i>
Sâm đại hành 4 g vừa đủ sắc với 16 g bông trang, 16 g sài đất. Đi kèm với đó là 16 g đơn tướng qn, bồ cơng anh. Sắc chung các vị thuốc trong một cái nồi với lượng nước vừa đủ và dùng trong 1 ngày. Với những thành phần dưỡng chất trong các vị thuốc, mụn nhọt sẽ giảm sưng tấy và lành dần.
Mặt khác cũng có thể áp dụng cách 2 để chữa mụn nhọt. Chỉ cần sắc 20 g sâm đại hành cùng 12 g ké đầu ngựa và 12 g đơn đỏ, 12 g bạch chỉ. Sắc nồi thuốc cho đến khi chỉ cịn 3-4 bát là có thể dừng.
Mỗi lần uống thuốc cần đắp thêm hỗn hợp lá táo chua và rễ cau lên mụn nhọt. Cần giã nát lá táo chua và rễ cau để các thành phần trong thuốc có thể phát huy tác dụng.
<i>1.2.7.3. Bài thuốc cải thiện giấc ngủ </i>
Mỗi giấc ngủ ngon luôn giúp cho cơ thể khỏe mạnh và tràn đầy sức sống. Vì thế để có thể chữa trị bệnh mất ngủ và stress thì có thể áp dụng bài thuốc từ kiệu đỏ. Từ những dưỡng chất trong kiệu đỏ có thể giúp cơ thể điều hịa và cải thiện giấc ngủ tốt.
</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">Ngoài ra cũng có thể chế tạo thành từng viên thuốc để dùng cũng được. Phương pháp này có thể giúp bạn tiết kiệm tối đa thời gian khi thực hiện sắc thuốc. Cách đơn giản là bạn chỉ cần nấu thành cao và nén chúng thành viên rồi bảo quản tốt là ổn.
<i>1.2.7.4. Bài thuốc chữa ho và viêm phế quản </i>
Để trị ho và viêm phế quản cần chuẩn bị khoảng 20 g sâm đại hành. Đi cùng với đó là 12 g cam thảo nam, 20 g lẻ bạn, 12 g lá chanh và 20 g rễ dâu. Đem rửa sạch các thảo dược rồi đem cho vào nồi và sắc uống mỗi ngày 1 thang.
Tuy nhiên đối với trẻ nhỏ thì bài thuốc chữa ho và viêm phế quản lại khác. Cần chuẩn bị 100 g sâm đại hành đem sắc chung với 50 g xạ can, sắc theo dạng cơ đặc hỗn hợp cịn lại 300 mL là được. Mỗi ngày cho bé uống khoảng 12-30 mL là được.
Bên cạnh đó đối với trường hợp viêm phế quản có chứa nhiều đờm thì cần áp dụng cách khác. Để áp dụng bài thuốc này cần 100 g sâm đại hành tươi, 20 g phèn phi, 50 g gừng khơ. Đi kèm với đó là 20 g trần bì, 200 g hạt đinh lịch và 30 g bán hạ. Sau đó thực hiện như sau:
+ Đầu tiên, thái sâm đại hành tươi thành từng lát mỏng và phơi khô.
+ Tiếp đó đem hạt đinh lịch sao đen, bán hạ chế. Còn các vị khác đem tán nhỏ.
+ Sau đó, đem gừng và các nguyên liệu trộn chung và sắc lên với lượng nước vừa đủ.
</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">SVTH: Hà Long
+ Cuối cùng, chia đều thuốc thành từng phần bằng nhau và dùng trong ngày
<i>1.2.7.5. Bài thuốc chữa bệnh về gan </i>
Bài thuốc chữa bệnh gan từ sâm đại hành rất dễ dàng. Dùng khoảng 12 g sâm đại hành, 12 g lá vọng cách, 30 g cây bìm bịp, 12 g lá quao. Sau đó đem sắc chung với 20 g rau ngơ, 10 g trần bì và 1000 mL nước.
Một khi sắc nồi thuốc, đun với lửa vừa và nhỏ để tránh nước thuốc trào ra ngoài. Đun như vậy khoảng 30 phút để cho lượng nước cạn dần đi là có thể dùng được. Mỗi ngày chia thành 3 lần cho người bệnh uống là có thể chữa được bệnh.
<i>1.2.7.6. Bài thuốc chữa rắn cắn </i>
Sâm đại hành có tác dụng chữa vết rắn cắn rất tốt. Dùng một lượng nhỏ sâm đại hành đem rửa sạch rồi đập dập và vắt lấy nước. Tiếp đó dùng bã của cây đắp vào vết thương còn phần nước thì uống. Cơng đoạn này sẽ giúp cho các thành phần trong kiệu đỏ rút hết phần độc của rắn.
<b>1.2.8. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước </b>
<i>1.2.8.1. Trên thế giới </i>
Sâm đại hành có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Mỹ, củ màu đỏ thuôn dài đã được người dân địa phương sử dụng như một loại thuốc dân gian để điều trị bệnh tim mạch, đặc biệt là rối loạn mạch vành (Ding và cs., 1983). Ngồi ra, sâm đại hành cịn được sử dụng như một thuốc truyền thống để tống hơi trong ruột ra. Củ sâm đại hành kết hợp với riềng để điều trị tình trạng cảm lạnh và tắc nghẽn mũi ở trẻ em (Saralamp và cs., 1996). Các chiết xuất dichloromethane từ sâm đại hành: eleutherinone, eleutherin,
<i>isoeleutherin, và eleutherol cũng đã được chứng minh chống lại Cladosporium sphaerospermum. Tất cả các hợp chất cô lập được đều cho thấy các hoạt tính kháng nấm </i>
mạnh mẽ trừ eleutherol (Alves và cs., 2003).
</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">SVTH: Hà Long
Sirirak và cộng sự (2011) đã báo cáo sâm đại hành là một ứng cử viên cho việc
<i>kiểm sốt lồi Campylobacter. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết ethanol của cây sâm đại hành chống lại Campylobacter spp. đã được nghiên cứu. Sáu mươi lăm chủng Campylobacter, bao gồm 39 chủng phân lập từ người và 26 chủng phân lập từ gà đã </i>
được thử nghiệm. Các chiết xuất ethanol của củ sâm đại hành chứng minh hoạt tính kháng khuẩn chống lại tất cả các chủng thử nghiệm. Các vùng ức chế dao động trong khoảng 10-37 mm.
Subramaniam và cộng sự (2012) tiến hành xác định thành phần hóa học của củ sâm đại hành đã tìm thấy sự hiện diện của phenol, sterol, phlobatannins, protein, steroids, tannin và đường. Chiết xuất ethanol của củ sâm đại hành đã được thử nghiệm chống lại mầm bệnh kháng đa thuốc và cho thấy đó là một nguồn tiềm năng của tác nhân kháng
<i>khuẩn chống lại Methicillin resistant S. aureus và Acinetobacter baumannii, với hoạt </i>
tính kháng khuẩn cao hơn so với thuốc kháng sinh tiêu chuẩn.
Theo nhóm nghiên cứu của Fitri và cộng sự (2014), đã nghiên cứu về tác dụng ức chế chu kỳ tế bào và thúc đẩy sự chết theo chương trình của chiết xuất sâm đại hành trên tế bào ung thư vú. Kết quả kiểm tra gây độc tế bào trong điều trị với tế bào T47D (tế bào T47D là một dạng của các tế bào ung thư vú đã bị đột biến p53 có khả năng kháng với cơ chế chết theo chương trình − cơ chế sinh lý của tế bào cắt giảm để sửa chữa các mô
<i>và để xử lý các tế bào bị hư hỏng mà có thể nguy hiểm cho cơ thể). Các chiết xuất </i>
n-hexane, ethyl acetat và chiết xuất ethanol của sâm đại hành cho các giá trị IC50 (nồng độ gây chết 50% tế bào) tương ứng là 265,023 µg/mL, 147,124 µg/mL và 3782,29 µg/mL. Đối với chu kỳ tế bào, kết quả là ức chế chu kỳ tế bào trên phase G<small>0</small>-G<small>1</small> với một tỷ lệ 40,88%.
<i> Năm 2018, Harlita và cs đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của Eleutherine palmifolia L. (Merr) đối với vi khuẩn gây bệnh kết quả từ thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chỉ ra rằng các chất chiết xuất từ n-hexane, ethyl acetate và ethanol 96% ức chế tích cực sự tăng trưởng của MRSA, Bacillus cereus, Shigella spp., và Pseudomonas </i>
</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">SVTH: Hà Long
<i>aeruginosa. Các loại chiết xuất và nồng độ khác nhau có các hoạt động ức chế khác </i>
nhau. Do đó, nồng độ của chiết xuất được sử dụng càng cao thì hoạt tính ức chế càng cao.
<i>1.2.8.2. Tại Việt Nam </i>
<i>Tại Việt Nam theo Đỗ Tất Lợi (2006), sâm đại hành (Eleutherine subaphylla </i>
Gagnep.) có tác dụng kháng sinh, chống viêm,…đã được sử dụng phổ biến trong dân gian.
Năm 2011, Huỳnh Kim Diệu đã nghiên cứu về sự thuần chủng và tính kháng khuẩn của sâm đại hành kết quả cho thấy sâm đại hành không thuần chủng, được chia làm 11 dịng, tính kháng khuẩn của các dịng trên vi khuẩn được thử nghiệm có sự khác
<i>nhau, nhưng tất cả đều tác động rất tốt trên S. aureus (MIC = 256-512 µg/mL), kế đến Streptococcus faecalis (MIC = 512-1024 µg/mL), yếu hơn trên P. aeruginosa và Aeromonas hydrophila (MIC = 2048-4096 µg/mL), kháng khuẩn yếu nhất trên Escherichia coli và Salmonella spp. (MIC = 4096 µg/mL). </i>
<i>Nghiên cứu về hợp chất eleutherine trong sâm đại hành Việt Nam (E. subaphylla </i>
Gagnep.) của tác giả Trương Minh Lương và Trần Văn Huy (2012) đã xác định cấu trúc, mơ tả tính chất vật lý và tổng hợp các dẫn xuất của eleutherine (Trương Minh Lương và cộng sự, 2012).
Nguyễn Thị Hồng Vân và cộng sự (2013) đã nghiên cứu quy trình tách chiết hợp
<i>chất eleutherin và isoeleutherin từ củ sâm đại hành (Eleutherine bulbosa), đánh giá tác </i>
dụng kháng sinh của chúng trên động vật thực nghiệm. Kết quả đã cô lập được 10 hợp chất sạch và xây dựng được quy trình phân lập hỗn hợp eleutherin và isoeleutherin quy mơ pilot, đồng thời đánh giá được chế phẩm từ sâm đại hành có tác dụng kháng khuẩn
<i>mạnh ở các mức nồng độ thấp trên những chủng vi khuẩn đã thử là S. aureus, Bacillus subtilis, S. flexneri DT 112, Proteus mirabilis BV 108 và Bacillus pumilus (Nguyễn Thị </i>
Hồng Vân và cộng sự, 2013).
</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">Cao dược liệu được chia thành ba loại:
Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó có cồn và nước đóng vai trị dung mơi chính. Nếu khơng có chỉ dẫn khác, quy ước 1 mL cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế.
Cao đặc: là khối đặc qnh. Hàm lượng dung mơi cịn lại trong cao không quá 20%.
Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao khơ khơng được có độ ẩm lớn hơn 5%.
Có nhiều phương pháp để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây thuốc. Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng - lỏng và chiết rắn - lỏng. Trong thực nghiệm việc chiết rắn - lỏng được áp dụng nhiều hơn, chiết rắn - lỏng gồm: ngấm kiệt (percolation), ngâm dầm (maceration), chiết với máy Soxhlet... chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc. Ngồi ra cịn có chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method),…. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Từ Minh Koóng, 2007).
<b>1.3.2. Kỹ thuật chiết ngâm chiết (Maceration) </b>
Bột cây được chứa trong một bình thủy tinh hay bình thép khơng rỉ có nắp đậy. Rót dung mơi trong bình cho đến xấp xấp bề mặt của bột dược liệu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên.
</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">SVTH: Hà Long
Sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung mơi sẽ có được cao chiết. Tiếp tục rót dung mơi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm một vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý tránh nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngồi).
Mỗi lần ngâm dung mơi chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung mơi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hịa tan dung mơi đến đạt mức bão hịa, khơng thể hịa tan thêm được nhiều hơn, có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian. Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung mơi.
Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền. Phương pháp làm ở nhiệt độ phòng nên giữ hoạt tính của các hoạt chất chiết được.
Nhược điểm: năng suất thấp, thao tác thủ công, chiết nhiều lần tốn dung mơi và thời gian chiết. (Từ Minh Kng, 2007).
<b>1.3.3. Phương pháp chiết lỏng - lỏng </b>
Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng. Sử dụng lần lượt các dung mơi hữu cơ để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực nước khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi). Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung
<i>mơi phân cực thí dụ như: ester dầu hỏa và n-hexane, ether ethyl, chloroform, ethyl </i>
acetate, butanol… với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung mơi; chiết đến khi khơng cịn chất hịa tan vào dung mơi thì đổ sang chiết với dung mơi có tính phân cực hơn. Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na<small>2</small>SO<small>4</small>, MgSO<small>4, </small>CaSO<small>4, …</small>, đuổi dung môi, thu được cao chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">SVTH: Hà Long
Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi (solvent extraction). Cao alcol thô ban đầu (ví dụ bột cây được tận trích với methanol 80%, đuổi dung môi thu được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (ví dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến khơng phân cực vì thế rất khó cơ lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.
Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (ví dụ ester dầu hỏa...) sẽ hịa tan tốt các hợp chất có tính khơng phân cực (ví dụ các alcol béo, ester béo...), dung môi phân cực trung bình ( ví dụ dietyl ester, chlorofrom...) hịa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình ( các hợp chất có chứa nhóm chức ester –O–, aldehyd –CH=O, ceton –CO–, ester –COO– ...) và dung môi phân cực mạnh (ví dụ methanol...) hịa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh ( các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH...) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
<b>1.3.4. Cô đặc và sấy khô </b>
Để điều chế cao dược liệu, thường phải tiến hành bốc hơi dung mơi. Có thể dùng nhiều thiết bị cô, sấy khác nhau, nhưng tốt nhất là tiến hành ở áp suất giảm và ở nhiệt độ cao cho sự phân hủy hoạt chất là tối thiểu (thường không quá 60<sup>o</sup>C). Tránh cô hoặc sấy kéo dài ở nhiệt độ cao. (Từ Minh Koóng, 2007)
Cao dược liệu phải đạt các chỉ tiêu chất lượng cao thuốc được quy định trong dược điển Việt Nam IV năm 2009:
+ Cảm quan: cao thuốc phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định; có mùi, vị của dược liệu tương ứng,...
+ Độ tan: cao lỏng phải tan hồn tồn trong dung mơi đã dùng để điều chế cao.
</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34"><i>500 trong 1 g (mL), khơng được có Salmonella trong 10 g (mL), mẫu khơng có E. coli, P. aeruginosa, S. aureus trong 1 g (mL), tổng số enterobacteria không quá </i>
500 trong 1 g (mL).
</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">SVTH: Hà Long
<b>PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP</b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">SVTH: Hà Long
<b>2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu </b>
-
Thời gian: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 07 năm 2020- Địa điểm:+ PTN Công nghệ Vi Sinh - cơ sở 3, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 68 Lê Thị Trung, Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương. + Phịng 19, Phịng hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Cơng nghệ Hóa học, 01 Mạc Đĩnh Chi, Bến Nghé, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh.
+ Phòng 4.4, Phòng hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Cơng nghệ Hóa học, TL29, Thạnh Lơ ̣c, Quận 12, TP. Hồ Chí Minh.
<b>2.2. Vật liệu nghiên cứu </b>
Các mẫu củ cây sâm đại hành được thu mua ở Đồng Tháp được giám định khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM.
<i><b>Chủng S. aureus ATCC 43300 (MRSA) được cung cấp bởi công ty Nam Khoa </b></i>
Biotek.
<b>2.3. Mơi trường – hóa chất </b>
- Nutrient Broth (NB), Nutrient Agar (NA), Mueller Hinton Agar (MHA). - Cồn 96<sup>o</sup>, 70<sup>o</sup>, NaCl, HCl, NaOH, H<small>2</small>SO<small>4</small> 10%.
- <i>Các dung môi : n-hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol và nước. </i>
- Nước muối sinh lý 0,85%, nước cất. - Silica gel 60 (0.063 – 0.200 mm)
<b>2.4. Thiết bị và dụng cụ </b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">SVTH: Hà Long
<i>Thừa kế quy trình thu nhận cao chiết bằng dung môi n-hexane từ cơng trình </i>
nghiên cứu trước, tiếp tục thực hiện quy trình thu nhận cao chiết bằng dung mơi ethyl acetate để thực hiện tiếp các thí nghiệm.
Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung mơi là 1:5, nhiệt độ chiết xuất là ở nhiệt độ phịng, thời gian trích ly là 72 giờ.
- <i>Cách thực hiện: </i>
Tiến hành sấy khô củ sâm đại hành 50<sup>o</sup>C trong 72 giờ và xay nhuyễn sau khi định danh tên khoa học được. Bột dược liệu thu được được chiết xuất bằng phương pháp ngâm dầm với các dung mơi có độ phân cực khác nhau. Tiến hành ngâm phân đoạn bột dược liệu với ethanol 96<sup>o</sup> trong bình ngâm chiết ở nhiệt độ phòng. Sau 72 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc. Dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách cô quay ở 50<small>o</small>C và bốc hơi
</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">SVTH: Hà Long
hết dung môi để thu cao thơ. Đem cân số cao này bằng cân phân tích. Cao thơ được hịa
<i>tan với nước theo tỉ lệ 1:10 và đem chiết lỏng - lỏng qua các hệ dung môi n-hexane, ethyl </i>
acetate và nước với tỉ lệ 1:1. Sau khi chiết lỏng - lỏng dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách phương pháp tương tự như trên. Đem cân các cao phân đoạn này bằng cân phân tích (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Khi có cao chiết ethyl acetate tiến hành khảo sát khả năng kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC. Sau đó sắc ký cột cao chiết ethyl acetate thu các phân đoạn, khảo sát khả năng kháng MRSA của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy để chọn ra phân đoạn kháng mạnh nhất với MRSA. Tiến hành khảo sát kháng MRSA của phân đoạn kháng mạnh nhất bằng phương pháp hiện hình sinh học. Sau đó tiến hành sắc ký cột phân đoạn kháng mạnh nhất với MRSA để thu nhận chất. Khi chất được tinh sạch thì tiến hành gửi giải phổ <small>13</small>C-NMR, <small>1</small>H-NMR để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất thu được.
Hiệu suất thu hồi các loại cao được tính theo cơng thức: H(%) = A/B x 100
</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">SVTH: Hà Long
Sâm đại hành Định danh tên khoa học
Sấy khô và xay
Bột dược liệu
Chiết với các dung môi
Cô thành cao dược liệu
Khảo sát khả năng kháng MRSA Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC
Chạy cột sắc ký thu phân đoạn
Khảo sát khả năng kháng MRSA của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy và hiện hình sinh học
Chọn phân đoạn kháng MRSA tốt nhất tiếp tục chạy sắc ký cột để thu nhận chất
Xác định cấu trúc của các hợp chất thu được
<b>Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm</b>
</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">SVTH: Hà Long
<b>2.6. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết </b>
Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn có trong cao thuốc theo dược điển Việt Nam IV (Bộ y tế, 2009).
- <i>Chuẩn bị mẫu </i>
Mẫu cao chiết được hòa tan trong DMSO 1% theo tỉ lệ 1 mg/mL và được giữ trong chai thủy tinh nhỏ đã được hấp vô trùng.
- <i>Đếm tổng số nấm men – nấm mốc, vi sinh vật hiếu khí </i>
Đối với mẫu đếm tổng số nấm men - nấm mốc: dùng môi trường Sabouraud dextrose agar. Đối với mẫu đếm tổng vi khuẩn hiếu khí dùng mơi trường NA.
Từ dung dịch mẫu thử 10<sup>-1</sup>, pha loãng bằng dung dịch NaCl 0,85% để được nồng độ pha loãng thấp hơn 10<small>-2</small>, 10<small>-3</small>,….
Đun chảy môi trường, để nguội khoảng 40-45<small>o</small>C. Dùng pipet vô trùng cấy vào mỗi đĩa petri 1 mL mẫu thử. Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15-20 mL mơi trường. Sau đó, xoay đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để mẫu thử được trộn đều trong môi trường cấy.
Để thạch đông tự nhiên, sau đó lật ngược đĩa lại và ủ trong tủ ấm 37<small>o</small>C/ 24-48 giờ đối với mẫu đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, 28-30<small>o</small>C/5 ngày đối với mẫu đếm tổng số nấm men – nấm mốc.
</div>
