khảo sát thực nghiệm sự methyl hóa đảo cpg trên vùng promoter gen p16ink4α trong bệnh ung thư biểu mô vòm họng ở người việt nam

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.05 MB, 56 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM SỰ METHYL HÓA ĐẢO

BỆNH UNG THƯ BIỂU MƠ VỊM HỌNG Ở NGƯỜI VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: ThS. LAO ĐỨC THUẬN SVTH: LƯƠNG THỊ BÍCH THUẬN MSSV: 1253010378

Khóa: 2012-2016

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2016

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn chân thành đối với ThS. Lao Đức Thuận, truyền cho em ngọn lửa đam mê trong nghiên cứu, người thầy đã ln tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em trong suốt q trình thực hiện đề tài.

Kính gửi lời tri ân đến các Thầy, Cô, các anh chị, các bạn trong phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình, quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã luôn yêu thương, chăm sóc, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho con.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 5, năm 2016

Lương Thị Bích Thuận

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong trong ung thư trên thế giới Hình 1.2. Giải phẩu về vùng vịm họng

Hình 1.3. Cơ chế epigenetics

Hình 1.4. Q trình methyl hóa DNA

Hình 1.5. Cơ chế methyl hóa DNA chuyển hóa 5-cystosine (5C) thành 5 methylcytosine

Hình 1.6. Mơ hình methyl hóa DNA và ung thư

Hình 1.7. Cơ chế hoạt động và mã hóa di truyền của p16INK4α

Hình 1.8. Xử lý sodium bisulfite và sự chuyển đổi cytosine thành uracil Hình 1.9. Quá trình biến đổi Bisulfite

Hình 2.1. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR.

Hình 3.1. Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen p16INK4α trong tế bào ung thư vịm họng và tế bào bình thường

Hình 3.2. Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen p16INK4α trong tế bào

ung thư vịm họng theo loại mẫu sử dụng p16INK4α

Hình 3.3. Tần sốmethyl hóa trung bình có trọng số của các gen p16INK4α trong số mẫu ung thư vịm họng, vú, phổi

Hình 3.4. Hình A: Các đảo CpG được xác định trên promoter gen p16INK4α

Hình B: vùng promoter mồi methyl bắt cặp và các nhân tố phiên mã

Hình 3.5. Vị trí trình tự mồi methyl trên vùng trình tự promoter thuộc gen p16INK4α

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Hình 3.6. Vị trí trình tự mồi unmethyl trên vùng trình tự promoter thuộc gen

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm MSP

Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm MSP mẫu T44, T47

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Bảng mồi gen p16INK4α

Bảng 2.2. Chuẩn bị ME Wash buffer 1X Bảng 2.3. Chuẩn bị mẫu

Bảng 2.4. Các bước thực hiện biến đổi bisulfite.

Bảng 2.5. Mồi methyl và unmethyl cho gen p16INK4α

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR.

Bảng 3.1. Bảng tần số methyl hóa gen p16INK4α

Bảng 3.2. Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen p16INK4α trong tế bào ung thư vịm họng và tế bào bình thường

Bảng 3.3. Phương pháp sử dụng trong 11 cơng trình nghiên cứu Bảng 3.4. Loại mẫu được sử dụng trong 11 cơng trình nghiên cứu

Bảng 3.5. Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen p16INK4α ở tế bào ung thư vòm họng phân theo loại mẫu

Bảng 3.6. Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen p16INK4α trong tế bào ung thư và tế bào bình thường ở các loại ung thư

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát các đặc tính vật lý của mồi trên IDT Bảng 3.8. Bảng nồng độ và chất lượng DNA tách chiết

Bảng 3.9. Bảng thống kê kết quả phương pháp MSP

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

NIH National institutes of health

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ... x

1.TỔNG QUAN...1

1.1 Tổng quan về ung thư...1

1.1.1 Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam...1

1.3.4 Methyl hóa DNA ...5

1.3.5 Methyl hóa DNA trong ung thư ...7

1.4 Tổng quan về gen p16INK4α...9

2.1.1 Mẫu mơ sinh thiết vịm họng ... 13

2.1.2 Dung cụ – thiết bị – hóa chất ... 13

2.2 Phương pháp tiến hành ... 14

2.2.1 Khai thác dữ liệu in silico ... 14

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

2.2.2 Đánh giá mồi... 15

2.2.3 Khảo sát thực nghiệm ... 16

2.2.4 Phương pháp biến đổi bisulfite DNA sử dụng bộ kit ... 17

2.2.5 Kỹ thuật MSP phát hiện sự methyl hóa gen p16INK4α. ... 19

2.2.6 Phương pháp điện di trên gel agarose... 20

3.3.1 Xác định cấu trúc gen, vị trí gen p16INK4α: ... 28

3.3.2 Khảo sát vị trí và cấu trúc của đảo CpG thuộc vùng promoter gen p16INK4α... 29

3.4 Đánh giá mồi ... 30

3.4.1 Kiểm tra thông số vật lý của mồi ... 30

3.4.2 Kiểm tra độ đặt hiệu của mồi qua chương trình annhyb ... 32

3.5 Khảo sát thực nghiệm ... 34

3.5.1 Kết quả tách chiết DNA ... 34

3.5.2 Kết quả phản ứng MSP trên các mẫu mơ ung thư vịm họng ... 35

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), ung thư là một thuật ngữ gọi chung cho một nhóm lớn của các bệnh có thể ảnh hưởng đến bất kỳ phần nào của cơ thể, là một trong những nguyên nhân gây nên tử vong cao trên thế giới. Trong đó, ung thư vịm họng được biết đến chiếm tỉ lệ cao người mắc bệnh ở khu vực Châu Á như ở Trung Quốc, các nước Đông và Nam Châu Á…. Theo thống kê của Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (International Agency for Research on Cancer), tính đến năm 2012, trên thế giới có đến 86.691 mắc bệnh ung thư vòm họng chiếm đến 0,6% tỉ lệ trong số các bệnh ung thư, trong đó có đến hơn 50.000 tử vong chiếm tỉ lệ khoảng 0,6%. Ở Việt Nam, có gần 5.000 người mắc bệnh ung thư vòm họng chiếm 3,9% trong số các bệnh ung thư, trong đó có hơn 2.800 người tử vong chiếm tỷ lệ khoảng 3%.

Trong những năm gần đây, bệnh ung thư vòm họng liên quan đến hiện tượng biến đổi di truyền epigenetics đang được các nhà khoa học quan tâm. Mà hiện tượng epigenetics chính là sự methyl hóa vượt mức (hypermethylation) trên các gen ức chế

khối u (tumor suppressor genes), cụ thể được biết đến là gen p16INK4α , methyl hóa vượt mức tại đảo CpG của vùng promoter của gen ức chế khối u, sự biến đổi bất thường này làm bất hoạt chức năng của gen ức chế khối u, dẫn đến sự tăng sinh vượt mức của tế bào dẫn đến sinh u.

Gen p16INK4α là gen ức chế khối u quan trọng, nằm ở vị trí 9p21 của nhiễm sắc

thể. Chức năng chính của p16INK4α là kết hợp với yếu tố phiên mã nhằm kìm hãm sự

tăng sinh tế bào. Nhưng khi gen p16INK4α bị methyl hóa tại vùng đảo CpG của vùng promoter, thì việc kết hợp yếu tố phiên mã khơng cịn, giải phóng ra yếu tố phiên mã kích thích tế bào pha G1và pha S làm tế bào tăng sinh không kiểm sốt. Trong đó, sự

methyl hóa vùng promoter của gen p16INK4α chiếm tần số khá cao trong ung thư vòm họng khoảng từ 35-66% đã được nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố như cơng trình của Ayadi và các cộng sự năm 2008, Fangyun Tian và các cộng sự năm 2013, Yang

Shao và các cộng sự năm 2014...Chính sự methyl hóa trên của gen p16INK4α đã được

ứng dụng như một dấu ấn phân tử trong việc chuẩn đoán và tiên lượng phát hiện sớm ung thư.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

Tứ những cơ sở trên cho thấy rằng sự phát triển dấu chứng sinh học phân tử (Biomarker), là cần thiết trong việc phát hiện sớm tiền ung thư rất cần thiết cho việc hỗ trợ chẩn đoán lâm sàng. Do đó, đề tài “Khảo sát thực nghiệm sự methyl hóa đảo

CpG trên vùng promoter gen p16INK4α trong bệnh ung thư biểu mơ vịm họng ở người Việt Nam”, được thực hiện với mong muốn xây dựng cơ sở lý thuyết khoa học nhằm

khẳng định sự methyl hóa ở p16INK4α được xem là một dấu chứng sinh học hỗ trợ cho

việc chẩn đoán sớm giai đoạn tiền ung thư hỗ trợ cho chẩn đoán lâm sàng cho bệnh nhân ung thư vòm họng Việt Nam.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

1.

TỔNG QUAN

1.1

Tổng quan về ung thư

Theo định nghĩa của Viện Y học Quốc gia (NIH), ung thư là một thuật ngữ gọi chung cho một nhóm lớn của các bệnh có thể ảnh hưởng đến bất kỳ phần nào của cơ thể. Ung thư là sự tăng sinh vượt mức khơng kiểm sốt của tế bào dẫn đến hình thành khối u, sau đó xâm lấn vào các mơ ở gần hay ở xa, còn được gọi là di căn. Di căn là nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư [64].

Ung thư phát sinh từ một tế bào đơn lẻ bị tổn thương. Việc chuyển đổi từ một tế bào bình thường thành tế bào khối u là một quá trình nhiều giai đoạn, thường là một sự tiến triển từ một tế bào bị tổn thương tiền ung thư đến các khối u ác tính. Bệnh nhân ung thư có thể do yếu tố di truyền từ bố mẹ hoặc các tác nhân bên ngoài như: tác nhân vật lý (tia tử ngoại hoặc ion hóa), tác nhân hóa học (khói độc, aflatoxin), tác nhân sinh học (virus, vi khuẩn, kí sinh trùng) [59].

1.1.1 Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), đã thống kê tỷ lệ mắc bệnh trên thế giới vào năm 2012, số người mắc bệnh ung thư có khoảng 14,1 triệu ca mới, khoảng 8,2 triệu ca tử vong và đến 2015 thì có số người mắc ung thư tăng lên khá cáo hơn 15 triệu người mắc bệnh ung thư, trong đó có hơn 8,8 triệu người tử vong [59].

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Hình 1.1. Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong trong ung thư trên thế giới

Ở Việt Nam, theo thống kê của Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (International Agency for Research on Cancer) vào năm 2015, số người mắc phải bệnh ung thư có hơn 139.000 và có đến hơn 106.000 người tử vong [63].

1.1.2 Tình hình ung thư vòm họng

Ung thư vòm họng là một trong những dạng ung thư hiếm gặp ở hầu hết các nơi trên thế giới nhưng lại rất phổ biến ở Trung Quốc, các quốc gia phía Đơng và Nam châu Á, một số nước Bắc Phi và châu Âu. Theo thống kê của Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (International Agency for Research on Cancer) tính đến năm 2012, trên thế giới có đến 86.691 mắc bệnh ung thư vịm họng chiếm đến 0,6% tỉ lệ trong số các bệnh ung thư, trong đó có đến hơn 50.000 tử vong chiếm tỉ lệ khoảng 0,6%. Ở Việt Nam, có gần 5.000 người mắc bệnh ung thư vòm họng chiếm 3,9% trong số các bệnh ung thư, trong đó có hơn 2.800 người tử vong chiếm tỷ lệ khoảng 3% [63].

1.2

Tổng quan về ung thư vòm họng

1.2.1 Ung thư vòm họng

Ung thư vòm họng là bệnh ung thư bắt đầu từ vòm mũi họng, phần trên của

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

1.2.2 Phân loại ung thư vòm họng [61]

Theo Ủy ban Liên Hợp Mỹ về ung thư (AJCC) phân ra các giai đoạn của ung thư vòm họng:

Giai đoạn 0: các tế bào ung thư tại chỗ (in situ)

Giai đoạn I: các khối u ở vịm mũi họng và có thể đã lây lan đến các mô mềm của khoang mũi và/ hoặc vùng hầu họng.

Giai đoạn IIA: các khối u đã phát triển thành các mô ở bên trái hoặc bên phải của phần trên cổ họng.

Giai đoạn IIB: các khối u vẫn bị giới hạn trong vịng mũi họng hoặc có thể mở rộng đến các mô mềm của khoang mũi hoặc vùng hầu họng. Khối u lan rộng ra một hay nhiều hạch bạch huyết lân cận.

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Giai đoạn IIIA: khối u đã lan rộng đến các xoang hoặc các xương gần vùng mũi họng, khối u có thể hoặc không thể đã lan đến các hạch bạch huyết ở cổ hoặc phía sau cổ họng.

Giai đoạn IIIB: các khối u vẫn có thể được giới hạn ở vịm mũi họng, nó có thể phát triển thành các mô mềm của khoang mũi hoặc vùng hầu họng, bên trái hoặc bên phải của phần trên của họng. Các khối u đã di căn vào hạch bạch huyết cổ lân cận trên cả hai bên.

Giai đoạn IVA: khối u đã phát triển trong sọ hoặc dây thần kinh xương sọ, các hầu dưới (phần dưới của cổ họng), mắt, hoặc các mô lân cận của khối u. Khối u có thể hoặc khơng có thể đã lan đến các hạch bạch huyết lân cận ở cổ. Giai đoạn IVB: các khối u có thể hoặc khơng có thể đã mở rộng sang các mô mềm lân cận hoặc xương, đã lan đến các hạch bạch huyết hoặc đang nằm trong vùng vai trên xương đòn.

Giai đoạn IVC: khối u có thể hoặc khơng có thể đã mở rộng sang các mô mềm lân cận hoặc xương. Khối u có thể hoặc khơng có thể đã lan đến các hạch bạch huyết gần đó. Khối u đã lan rộng đến các vị trí ở xa.

1.3

Epigenetics

1.3.1 Định nghĩa

Epigenetics là sự thay đổi di truyền trong biểu hiện gen mà khơng đi kèm với những thay đổi trình tự DNA và được di truyền ổn định qua nhiều thế hệ [25].

1.3.2 Hiện tượng epigenetics

Hiện tượng epigenetics tham gia vào chu trình điều hịa biểu hiện gen, đặc biệt liên quan đến các gen ức chế khối u [61].

Biến đổi epigenetics bao gồm methyl hóa DNA, biến đổi histone (phosphoryl hóa, acetyl hóa, methyl hóa) và các phân tử RNA nhỏ (như microRNA, RNAi,…) [61].

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Hình 1.3. Cơ chế epigenetics [58]

1.3.3 Đảo CpG

Đảo CpG là vùng giàu dinucleotide CpG (cystosine phosphate guanine) có kích thước khoảng 0,5 - 4,0 kb, bao gồm các cystosine và guanine nằm kề nhau được liên kết với nhau bằng liên kết phosphodiester, phần trăm GC > 50%.

Đảo CpG thường kéo dài từ vùng đầu 5’ đến exon 1 thuộc thuộc vùng trình tự promoter, ở các tế bào bình thường phần lớn các đảo CpG không bị methyl hóa, chỉ những phân nhóm riêng biệt bắt đầu từ vùng promoter đến vùng exon đầu tiên của gen thì bị methyl hóa [19] [61].

1.3.4 Methyl hóa DNA 1.3.4.1 Định nghĩa

Methyl hóa DNA là q trình gắn gốc methyl (-CH3) vào carbon vị trí số 5 của vịng cytosine (C) đứng trước guanines của đảo dinucleotide CpG (cystosine-phosphate-guanine-CpG) hình thành hình thành 5-methylcytosine (5mc) [54].

Methyl hóa DNA là một hiện tượng biến đổi epigenetics. Methyl hóa DNA là một hiện tượng bình thường xảy ra trong quá trình phát triển của tế bào, chúng đóng vai trị quan trọng trong điều hòa biểu hiện gen cho nhiều loại tế bào gồm sự phát

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

phát triển phơi thai, q trình phiên mã, cấu trúc NST, bất hoạt NST số X và đánh dấu bộ gen [10] [19]. Giống như sửa đổi histone, methyl hóa DNA khơng ảnh hưởng đến trình tự DNA [54].

Hình 1.4. Q trình methyl hóa DNA

Hiện tượng methyl hóa được thực hiện sau quá trình tổng hợp DNA, phản ứng được thực hiện bởi các enzyme DNA methyltranfarase (DNMTs) bằng cách chuyển

nhóm methyl từ S-adenosylmethionine (SAM) đến vị trí C5’ của cytosine tạo ra

5-methylcytosine và S-adenosylhomocystine (SAH) [1] [54]. DNMTs được chia ra 2

nhóm: nhóm enzyme de novo methyltransferases (DNMT3A and DNMT3B) chịu

trách nhiệm tham gia trưc tiếp cho q trình methyl hóa DNA. Nhóm enzyme

methyltranferase duy trì DNA (DNMT1) [5]. Nhóm enzyme de novo

methyltranferase gắn bổ sung nhóm methyl (-CH3) vào Cystosine hình thành

5-methylcytosine (5mC) tạo vị trí methyl hóa mới, enzyme de novo biểu hiện ở mức

cao trong quá trình phát triển phơi thai và biểu hiện mức thấp trong q trình chuyên biệt hóa tế bào sinh dưỡng (tế bào soma). Nhóm enzyme methyltranferase duy trì DNA (DNMT1) là enzyme phổ biến nhất trong tế bào, đóng vai trị chủ chốt trong

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

q trình sao chép có khả năng hoạt động xuyên suốt pha S trong chu kỳ tế bào nhằm duy trì ổn định sự methyl hóa của các tế bào soma khác nhau. DNMT1 có khả năng tăng cường quá trình sinh tổng hợp DNA vì DNMT1 tương tác nhân tố DNA polymerase trong quá trình tăng trưởng tế bào [8][34][44].

Hình 1.5. Cơ chế methyl hóa DNA chuyển hóa 5-cystosine (5C) thành 5 methylcytosine

1.3.5 Methyl hóa DNA trong ung thư

Methyl hóa DNA liên quan đến điều hòa hoạt động gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X và đánh dấu bộ gen. Methyl hóa DNA cần thiết cho sự phát triển bình thường và không thể thiếu cho sự tồn tại của những tế bào biệt hóa. Tuy nhiên, methyl hóa bất thường là nguyên nhân dẫn đến nhiều bệnh lý bao gồm có ung thư [32].

Sự thay đổi bất thường methyl hóa trong các đảo CpG của vùng promter gồm sự methyl hóa vượt mức (hypermethylation) hay sự giải methyl hóa (hypomethylation) làm mất sự ổn định của di truyền và làm thay đổi biểu hiện gen, gây nên sự im lặng đối với các gen ức chế khối u, kích thích các gen tiền ung thư (oncogene) phát triển [20].

Methyl hóa vượt mức tại một số vị trí đặc biệt trên bộ gen cụ thể là các đảo CpG dẫn đến im lặng gen ức chế khối u, những gen này tham gia vào nhiều con đường điều hòa tế bào quan trọng như sửa chữa DNA, chu trình tế bào, chu trình apoptosis,…, dẫn đến tạo điều kiện thuận lợi cho việc tăng sinh tế bào không chọn

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

lọc hậu quả sinh u có mối liên quan đến một số bệnh ung thư. Nguyên nhân chủ yếu của hiện tượng methyl hóa vượt mức là do sự hoạt động quá mức của nhóm họ enzyme DNMTs, việc biểu hiện quá mức của nhóm họ enzyme DNMTs ở các tế bào bình thường có thể gây ra các hiện tượng methyl hóa bất thường của DNA quan trọng nhất là sự bất thường này làm gia tăng q trình methyl hóa DNA [32].

Methyl hóa ở mức thấp (hypomethylation) là nguyên nhân dẫn đầu làm giảm biểu hiện gen ức chế khối u, thông qua một số cơ chế gắn kết nhóm protein MBD (methyl - binding domain) vào các đảo CpG có khả năng làm cạnh tranh vị trí gắn của các nhóm methyl (CH3) trên các đảo CpG bị methyl MBD hay gắn một số chất kìm hãm như 5 -glycosylate vào các yếu tố phiên mã làm bất hoạt quá trình phiên mã gen bằng cách cạnh tranh khả năng bám của các yếu tố phiên mã vào vùng promoter của gen ức chế khối u [8][32]. Methyl hóa DNA ở mức thấp (hypomethylation) là tín hiệu di truyền hình thành khối u và xảy ra tại các vùng trình tự bộ gen bao gồm các yếu tố vùng trình tự lặp lại, vùng promoter nghèo dinucleotide CpG, điều này dẫn đến sự gia tăng kích thích xây dựng NST tiền sắp xếp bộ gen, ngoài ra là do gen bị tổn thương và tái hoạt động của trình tự endoparasitic vì vậy gây ra sự hoạt động bất thường của gen góp phần vào sự phát triển và hình thành ung thư [9][33].

Hình 1.6. Mơ hình methyl hóa DNA và ung thư [59].

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

1.4

Tổng quan về gen

p16INK4α

Gen p16INK4α có chức năng điều hịa âm chu kỳ tế bào (negative-regulation) chủ

yếu theo con đường pRb / E2F [61]. p16INK4α điều hịa chu trình tế bào giai đoạn pha G1-S bằng cách ức chế sự gắn kết của phức hợp CDK4/6 và cyclin D1, ức chế phosphoryl hóa pRB dẫn đến ức chế được yếu tố phiên mã E2F nên ngăn cản quá trình tăng trưởng của tế bào [16] .

Gen p16INK4α còn kết hợp với RNA polymerase II CTD (C-terminal domain) và TFIIH chứa yếu tố phiên mã chứa CDK7, ức chế sự phosphoryl hóa CTD qua việc

ngăn cản hình thành phức hợp CTD/CDK7, điều này cho thấy p16INK4α có thể trực tiếp điều hịa q trình phiên mã qua sự phosphoryl hóa CTD trong chu kỳ tế bào [2].

p16INK4α còn tham gia vào con đường jnks (N-terminal kinase), p16INK4α gắng kết với JNK1 hoặc JNK3 tại các miền N-terminal có chứa các vòng giàu glycine, ức chế sự phosphoryl hóa c-jun dẫn đến điều hịa trong q trình phiên mã [3][38].

Sự methyl hóa vùng promoter gen p16INK4α gây nên im lặng trong phiên mã của

gen [17]. Làm p16INK4α mất kiểm sốt chu trình tế bào không ức chế CDK4/6, pRB bị phosphoryl hóa giải phóng yếu tố phiên mã E2F thúc đẩy chu trình tế bào chuyển

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

từ pha G1 sang pha S làm tế bào tăng sinh, cộng thêm sự mất đi chức năng sửa sai

của p53 dẫn đến sự tăng sinh của tác tế bào hư hỏng, góp phần tạo nên khối u [17][53]

Hình 1.7. Cơ chế hoạt động và mã hóa di truyền của p16INK4α

1.4.3 Tình hình nghiên cứu sự methyl hóa gen p16INK4α trong ung thư vòm họng

Sự tạo thành khối u trong ung thư vịm họng là một q trình nhiều bước và liên quan đến di truyền và sự thay đổi biểu sinh. Trong những thập niên này, trên thế giới các nhà nghiên cứu đã tập trung vào việc nghiên cứu các nền tảng phân tử của ung thư và mở rộng ra triển vọng cho sự phát triển nhằm làm các dấu chứng cho việc chẩn đoán sớm và chiến lược điều trị mới. Ngày nay có nhiều bằng chứng chứng tỏ rằng sự thay đổi trong phân bố của 5-methylcytosine là một yếu tố quan trọng trong các bước gây ung thư. Những thay đổi này bao gồm sự giải methyl hóa (hypomethylation) hay methyl hóa vượt mức (hypermethylation) các vị trí CpG trên vùng 5’-promoter làm mất sự ổn định của di truyền và làm thay đổi biểu hiện gen, gây nên sự im lặng đối với các gen ức chế khối u, kích thích các gen tiền ung thư

[22]. Yang Shao et a., (2014) [57], Fangyun Tian et al., (2013) [9], S. Challouf et al.,

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

trí CpG vùng promoter được cơng bố, sự methyl hóa vượt mức đã được đưa ra là một

cách để làm bất hoạt gen ức chế khối u p16INK4α cũng như các gen khác trong ung thư. Tại Việt Nam, sự methyl hóa của các gen ức chế khối u trong các ung thư khác nhau đã được đưa vào nghiên cứu như cơng trình nghiên cứu của Trương Kim Phượng

và et al., (2015) [36], nhưng chưa có cơng trình nghiên cứu nào được cơng bố liên quan đến sự methyl hóa đảo CpG vùng promoter của gen p16INK4α trong ung thư vòm họng.

1.5

Các phương pháp phát hiện methyl hóa

Việc phân tích sự methyl hóa của DNA được tiến hành với bước đầu tiên là biến đổi sodium bisulfite DNA bộ gen. Phản ứng xử lý sodium bisulfite được sử dụng để phân biệt cystosine khơng methyl hóa và cystosine methyl hóa (5mC) trong DNA. Dưới tác dụng của sodium bisulfite tất cả các cystosine khơng bị methyl hóa sẽ được chuyển hóa thành uracil trong khi đó các cystosine methyl hóa khơng bị tác động và vẫn giữ nguyên [6][8].

Hình 1.8. Xử lý sodium bisulfite và sự chuyển đổi cytosine thành uracil

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

1.5.1 Phương pháp Methylation-Specific PCR (MSP)

Phương pháp MSP giúp đánh giá nhanh tình trạng methyl hóa của hầu hết các vùng CpG thuộc đảo CpG. Đầu tiên, DNA được biến đổi bởi sodium bisulfite, chuyển những Cytosine không bị methyl hóa thành Uracil [30].

Phương pháp MSP được thực hiện bằng kỹ thuật PCR nhằm xác định allele methyl hóa và khơng methyl hóa dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi riêng biệt methyl hóa và khơng methyl hóa. Cặp mồi methyl được thiết lập có chứa những đoạn CpG đã được methyl hóa. Cặp mồi unmethyl được thiết kế để bắt cặp với đoạn mồi không bị methyl hóa tại vị trí bắt cặp với mồi và do đó có sự thay thể C bằng T trong trình tự mồi. Cặp mồi được thiết kế có chứa vùng CpG và chứa ít nhất 3 trình tự CG [15]

Hình 1.9. Quá trình biến đổi Bisulfite

1.5.2 Phương pháp BSP (Bisulfite sequencing PCR)

BSP là phản ứng PCR diễn ra qua hai bước: bước đầu tiên là biến đổi sodium bisulfite DNA, rồi sau đó thực hiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự DNA đã được biến đổi bởi các mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR có thể được sử dụng theo ba cách sau: (1) giải trình tự sau khi tạo dịng, (2) giải trình tự trực tiếp, (3) kết hợp với các enzyme cắt giới hạn [22]

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1

Vật liệu

2.1.1 Mẫu mơ sinh thiết vịm họng

Thu thập mẫu mô sinh thiết ung thư vòm họng và mẫu dịch phết được giữ trong PBS từ bệnh viện Chợ Rẫy TP.HCM.

2.1.2 Dung cụ – thiết bị – hóa chất 2.1.2.1 Dụng cụ

Các dụng cụ thơng thường trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử bao gồm: kẹp lấy mẫu, đèn cồn, eppendorf, pipetteman, đầu típ, ống đong, erlen…

2.1.2.2 Thiết bị

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý)

Máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức) Bộ điện di DNA (BioRad)

Tủ lạnh (LG) Tủ đông (Sanyo)

Tủ ủ nhiệt (Multitemp III) Cân kỹ thuật (Satorious, Đức) Tủ hút khí độc (Ascent Max)

Máy quang phổ kế (Scanning UV/VIS, Smart Spec, BioRad) Máy luân nhiệt (My-Cycler Thermal, BioRad)

Máy chụp ảnh gel (Gel Doc XR System, BioRad) Lị vi sóng (Sharp)

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Dung loại protein: Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1 v/v/v). Dung dịch tủa và rửa: NaOAc 3M. Ethanol 95%-99%. Ethanol 70%. Dung dịch bảo quản DNA: TE buffer: Tris 1M pH 8,0; EDTA 0,5 M.

Hóa chất biến đổi bisulfite: Sử dụng bộ kít MethylEdge™ Bisulfite Conversion System N1301 của Promega.

Hóa chất dùng để PCR: Mastermix (2X), ddH2O (đã hấp). Hóa chất điện di:

Agarose 1,5 g

Ethidium bromide 1,7 µl

2.2

Phương pháp tiến hành

2.2.1 Khai thác dữ liệu in silico

Thu thập thông tin, khai thác các dữ liệu từ các bài báo khoa học về ung thư

vòm họng và các ung thư khác liên quan đến tần số methyl hóa của gen p16INK4α thơng qua các cơ sở dữ liệu sinh học pubmed- NCBI ( bằng

các từ khóa: p16INK4α, DNA methylation (methyl hóa DNA), epigenetics, nasopharyngeal carcinoma (ung thư vòm họng), lung cancer (ung thư phổi) breast cancer (ung thư vú), cervicial cancer (ung thư cổ tử cung) …

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Khảo sát in silico, thống kê các nguồn mẫu được sử dụng, tần số methyl hóa của gen p16INK4α và phương pháp được sử dụng để phát hiện tần số methyl hóa của gen

p16INK4α .

Bảng thống kê tần số methyl hóa của gen p16INK4α trong ung thư vòm họng và các ung thư khác.

STT

pháp

Loại mẫu

Bảng 2.1. Bảng mồi gen p16INK4α

tham khảo

M-p16INK4α-F TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC

[50] [9] [22]

M-p16INK4α-R GACCCCGAACCGCGACCGTAA

U-p16INK4α-F TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT

U-p16INK4α-R CAACCCCAAACCACAACCATA

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Ghi chú: M-p16INK4α-F (methyl forward): mồi xuôi, M-p16INK4α-R (methyl reverse):

mồi ngược. Gạch chân là C thuộc CpG, p16INK4 -S1_F: mồi xuôi sequence, p16INK4 S1_R: mồi ngược sequence.

-2.2.3 Khảo sát thực nghiệm

Phương pháp tách chiết phenol/chloroform

Nguyên tắc: Đề tài sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA. Trong đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh. Sau đó protein sẽ được biến tính bằng phenol/chloroform và bị loại bỏ. DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol lạnh.

Quy trình tách chiết DNA cho mẫu mơ ung thư vịm họng:

Các bước tiến hành

Bước 1 Mẫu mô được cắt nhỏ và cho vào một eppendorf (1,5 ml), cho 1000μl dung dịch trữ mẫu, vortex nhẹ và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, thu cắn.

Bước 2 Thêm 100μl dung dịch đệm PBS, vortex nhẹ và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, thu cắn.

Bước 3 Tiến hành phá vỡ màng tế bào với 700 µl lysis buffer (NaCl, EDTA, Tris HCl, SDS, Proteinase K và ddH2O), ủ qua đêm ở nhiệt độ 56oC. Bước 4 Mẫu sau khi ủ được đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu

dịch nổi. Loại bỏ protien: Bổ sung 700 µl PCI (phenol:chloroform:isoamyl alcohol tỷ lệ 25:24:1) rồi vortex nhẹ, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút và thu phần dịch nổi bên trên.

[lưu ý bước này có thể lặp lại nhiều lần tùy thuộc vào kết quả biến tính protein]

Bước 5 Bổ sung 1V chloroform, đảo trộn nhẹ và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút thu phần dịch nổi.

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Bước 6 Tủa DNA: bổ sung 0.1V NH4OAC 5M (hoặc NaOAc 3M) và 1V isopropanol 100%, ủ qua đêm ở nhiệt độ -4oC. Thực hiên ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút và loại bỏ phần dịch nổi.

Bước 7 Rửa mẫu bằng 1ml Ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/15 phút, phơi DNA qua đêm.

Bước 8 Bảo quản DNA: bổ sung 50 µl TE 1X và bảo quản ở -20oC.

Đánh giá DNA tách chiết bằng Phương pháp đo quang phổ:

Nguyên tắc: hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm. Giá trị mật độ quang OD260 (Optical Density 260 nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch (với OD260= 1OD = 50 μg/ml DNA sợi đôi). Độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ OD260/OD280

nằm trong khoảng giá trị từ 1.8-2.0. Song song đó, chỉ số OD230 cũng được tiến hành đo chung với chỉ số OD260 và OD280. Chỉ số OD230 cho thấy khả năng nhiễm tạp chất của mẫu chẳng hạn bị nhiễm carbohydrate hoặc phenol và tỷ lệ OD260/230 đạt trong khoảng giá trị là từ 2.0-2.2 thí mẫu tách chiết sẽ tinh sạch.

Các bước tiến hành: DNA sau khi tách chiết được pha loãng 50 lần bằng TE. Sau đó chuyển tất cả dung dịch vào cuvette và đo nồng độ DNA ở các bước sóng 230 nm, 260 nm và 280 nm. Độ tinh sạch của dung dịch được xác định bằng OD260/OD280

[65]

2.2.4 Phương pháp biến đổi bisulfite DNA sử dụng bộ kit

Bảng 2.2. Chuẩn bị ME Wash buffer 1X.

Cách tiến hành

Bước 1 Thêm 24 ml ethanol 100% vào 6ml ME-Wash buffer. Bước 2 Trộn đều hỗn hợp, ở nhiệt độ phòng.

</div>