khảo sát sự ảnh hưởng của các nguyên liệu tự nhiên từ thực vật đối với quy trình nuôi trồng nấm cordyceps militaris chay

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<i><b>Cordyceps militaris</b></i><b> CHAY</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC NGUYÊN LIỆU TỰ NHIÊN TỪ THỰC VẬT ĐỐI VỚI QUY TRÌNH NI TRỒNG </b>

<b>nấm</b>

<i><b>Cordyceps militaris</b></i><b> CHAY</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

Ký tên

<i>(Ghi rõ họ và tên) </i>

<b> </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>Giảng viên hướng dẫn: </b>

<b>Học viên thực hiện: Lớp: Ngày sinh: Nơi sinh: Tên đề tài: </b>

<b>Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ khóa luận trước </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

sinh học. Trong suốt bốn năm học qua, bản thân em thực sự cảm kích q thầy cơ đã cho em kiến thức, bản lĩnh, tinh thần làm việc đầy khoa học và trách nhiệm.

Xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Mở Tp. Hồ Chí Minh, Giám đốc cơ sở 3 Bình Dương và Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học đã tạo môi trường học tập và thực tập thuận lợi cho em trong suốt thời gian vừa qua.

Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Thạc sĩ Nguyễn Thị Phương Khanh là người cho bản thân em rất nhiều kiến thức quý báu. Trong suốt thời gian thực tập, em đã được cô chỉ dẫn tận tình, giúp em nỡ lực hơn trong việc học tập và hồn thành thật tốt thực tập tốt nghiệp. Một lần nữa em xin cảm ơn cô rất nhiều.

Xin cảm ơn anh Nguyễn Hồng Minh đã cho em mượn phịng và các thiết bị để em có thể hồn thành thật tốt thực tập tốt nghiệp của mình.

Xin cảm ơn anh chị trong phòng nấm và tất cả những người bạn k17 đã cùng học tập, chia sẻ kiến thức, giúp đỡ khó khăn trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp.

Xin cảm ơn bố mẹ đã chăm sóc, luôn bên cạnh và động viên con rất nhiều.

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1 </b>

<b>PHẦN I TỔNG QUAN ... 3 </b>

<b>1.1</b> <i><b>Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris ... 3 </b></i>

<b>1.2Đặc điểm sinh trưởng ... 3 </b>

<i>1.4.3 Tảo xoắn Spirulina platensis ... 8 </i>

<b>1.5</b> <i><b>Một số hợp chất có hoạt tính sinh học thu nhận từ Cordyceps militaris ... 9</b></i>

<i>1.5.1 Acid amin ... 10 </i>

<i>1.5.2 Adenosine và cordycepin ... 10 </i>

<i>1.5.3 Polysaccharide ... 10 </i>

<i>1.5.4 Acid béo ... 11 </i>

<b>1.6</b> <i><b>Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris ... 11 </b></i>

<b>1.7</b> <i><b> Đặc điểm hình thái của quả thể nấm Cordyceps militaris ... 14 </b></i>

<b>1.8</b> <i><b> Chu trình sống của nấm Cordyceps ... 15</b></i>

<b>1.9Các nghiên cứu trong nước ... 16 </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>2.1Địa điểm và thời gian thí nghiệm ... 18 </b>

<b>2.2Vật liệu ... 18</b>

<b>2.3Dụng cụ, hóa chất và thiết bị ... 18</b>

<b>PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 19</b>

<b>3.1Nôi dung thực hiện ... 19</b>

<b>3.2Các phương thực hiện ... 19 </b>

<i>3.2.1 Quy trình thực hiện thí nghiệm ... 19 </i>

<i>3.2.2 Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy ... 20 </i>

<i>3.2.3 Phương pháp thu chỉ tiêu trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris .. 21 </i>

<i>3.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng Protein Lowry ... 21 </i>

<i>3.2.5 Phương pháp xác định % Nitơ Kjeldahl ... 22 </i>

<i>3.2.6 Phương pháp đo năng suất sinh học BE% ... 22 </i>

<i>3.2.7 Phương pháp xử lý số liệu ... 22 </i>

<b>3.3Nôi dung khảo sát ... 23</b>

<i>3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của rong biển đến năng suất quả thể nấm Cordyceps militaris nuôi trên môi trường gạo lứt. ... 23 </i>

<i>3.3.2 Thí nghiệm 2: Tối ưu hàm lượng rong biển Wakame bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt. ... 25 </i>

<i>3.3.3 Thí nghiệm 3: Tối ưu hàm lượng tảo xoắn Spirulina platensis bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt. ... 27 </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<b>PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 31</b>

<b>4.1Kết quả thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của rong biển đến năng suất quả thể nấm </b><i><b>Cordyceps militaris nuôi trên môi trường gạo lứt. ... 31</b></i>

<b>4.2Kết quả thí nghiệm 2: Tối ưu hàm lượng rong biển Wakame bổ sung vào </b><i><b>môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt. ... 35 </b></i>

<b>4.3</b> <i><b>Kết quả thí nghiệm 3: Tối ưu hàm lượng tảo xoắn Spirulina platensis bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo </b></i><b>lứt………….. ... 39 </b>

<b>4.4</b> <i><b>Kết quả thí nghiệm 4: Kết hợp rong biển Wakame và tảo soắn Spirulia platensis bổ sung vào môi trường nuôi nấm Cordyceps militaris. ... 43</b></i>

<b>PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 48 </b>

<b>5.1Kết luận ... 48 </b>

<b>5.2Kiến nghị ... 48 </b>

<b>TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 49</b>

<b>PHỤ LỤC ... 54</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng có trong 100g gạo lứt theo Bộ Y Tế viện dinh </b>

<b>dưỡng (Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam) ... 5 </b>

<b>Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của rong biển ... 7</b>

<b>Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng có trong 100g tảo xoắn Spirulina theo Cơng ty JAPAN ALGAE – Nhật Bản. ... 9</b>

<b>Bảng 1.4. Thành phần acid béo của Cordyceps militaris (Hur, 2008) ... 11</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<i><b>Hình 1.2. Tảo Spirulina platensis nhập khẩu từ Nhật được mua tại địa chỉ số 63 </b></i>

<b>Yên Đỗ, phường 1, quận Bình Thạnh, Tp.Hồ Chí Minh. ... 8</b>

<b>Hình 1.3. Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử (Christian et al., 1837) ... 14</b>

<i><b>Hình 1.4. Sự hình thành nấm Cordyceps sp. trong tự nhiên ... 15</b></i>

<b>Hình 3.1. Sơ đồ quy trình thực hiện thí nghiệm ... 19</b>

<b>Hình 3.2. Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 1 ... 23</b>

<b>Hình 3.3. Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 2 ... 25</b>

<b>Hình 3.4. Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 3 ... 27</b>

<b>Hình 3.5. Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 4 ... 29</b>

<b>Hình 4.1. Nghiệm thức A0 bổ sung 12% bột đậu nành (ĐC) vào môi trường nuôi </b><i><b>Cordyceps militaris ... 31</b></i>

<b>Hình 4.2. Nghiệm thức A1 bổ sung 3,7% rong Wakame vào môi trường nuôi </b><i><b>Cordyceps militaris ... 31</b></i>

<i><b>Hình 4.3. Nghiệm thức A2 bổ sung 12% rong Mơ vào môi trường nuôi Cordyceps militaris ... 32</b></i>

<i><b>Hình 4.4. Nghiệm thưc A3 bổ sung 6% rong Sụn vào môi trường nuôi Cordyceps militaris ... 32</b></i>

<b>Hình 4.5. Nghiệm thức T0 bổ sung 3,7% rong biển Wakame vào môi trường nuôi </b><i><b>Cordyceps militaris ... 35</b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>Hình 4.7. Nghiệm thức T2 bổ sung 4,5% rong biển Wakame vào môi trường nuôi </b>

<b>Hình 4.15. Nghiệm thức H1 bổ sung 3,7% rong biển Wakame vào môi trường </b>

<i><b>nuôi Cordyceps militaris ... 43</b></i>

<b>Hình 4.16. Nghiệm thức H2 bổ sung 3% rong biển Wakame và 0,6% tảo xoắn </b>

<i><b>Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris ... 43</b></i>

<b>Hình 4.17. Nghiệm thức H3 bổ sung 2,2% rong biển Wakame và 1,2% tảo xoắn </b>

<i><b>Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris ... 44</b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<b>Hình 4.19. Nghiệm thức H5 bổ sung 0,7% rong biển Wakame và 2,4% tảo xoắn </b>

<i><b>Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris ... 45</b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ </b>

<i>Hiện nay, trong chi Cordyceps có hai lồi là Cordyceps militaris và Cordyceps sinensis đang được nghiên cứu và sản xuất do có nhiều giá trị dược liệu và giá trị kinh </i>

tế cao [21]. Theo Li vs cs (2006), Stone (2008), Zhang vs cs (2012) cho thấy nấm

<i>Cordyceps sinensis là mợt lồi nấm dược liệu quý hiếm, chủ yếu được thu hái trong tự </i>

nhiên và có vùng phân bố rất hạn chế, chưa được nuôi trồng tạo quả thể thành công trên môi trường nhân tạo, do đó sản lượng nấm khơng đủ đáp ứng được nhu cầu thị trường

<i>[19] [29] [34]. Theo Li vs cs (1995), Dong vs cs (2012) cho thấy, lồi Cordyceps militaris </i>

là mợt lồi nấm ký sinh trên cơn trùng có giá trị dược liệu, chứa các hợp chất tương tự

<i>như của nấm Cordyceps sinensis, có thể nuôi trồng dễ dàng trên môi trường nhân tạo </i>

[10] [18]. Do đó, để đáp ứng nhu cầu của thị trường trong và ngoài nước, việc nghiên

<i>cứu và ứng dụng quy trình ni trồng sản xuất nấm Cordyceps militaris tại Việt Nam là </i>

một vấn đề cần thiết.

<i>ngành nấm túi Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae </i>

và gồm có hơn 400 lồi đã được tìm thấy và mơ tả, trong số đó có khoảng 36 lồi đã được nuôi trồng quả thể trong điều kiện nhân tạo [4]. Trong số những lồi này, chỉ có

<i>lồi Cordyceps militaris đã được nuôi trồng ở quy mô công nghiệp, do có thời gian sản </i>

xuất ngắn và chứa nhiều hợp chất dược liệu có dược tính [19]. Adenosine và cordycepin

<i>là hai hợp chất có dươc tính cao của nấm Cordyceps militaris. Adenosine chiếm 0,18% </i>

trong quả thể và 0,06% trong sinh khối nấm. Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh khối (0,97% so với 0,36%).[4]

Theo Phạm Quang Thu vs cs (2011) trong y học cổ truyền của Trung Quốc, nấm

<i>Cordyceps militaris được dùng để điều trị thành công các chứng rối loạn lipit máu, viêm </i>

phế quản mãn tính, hen phế quản, viêm thận mãn tính, suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mãn tính và thiểu khả năng sinh dục. Với giá trị

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

của nấm nhằm nhân nuôi hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết là vô cùng quan trọng, đây là cơ sở để bảo tồn được nguồn gen quý và gây trồng quả thể trong giá thể nhân tạo.[6]

<i>Nuôi trồng nấm Cordyceps militaris trải qua nhiều giai đoạn khác nhau. Giai đoạn </i>

nhân giống được xem là giai đoạn quan trọng vì đây là giai đoạn phát triển của các bào tử nấm, giống nấm sau khi phân lập sẽ được nuôi trong môi trường dinh dưỡng, ở giai

<i>đoạn này các ống bào tử của nấm Cordyceps militaris sẽ dần phát triển tạo nên các tế </i>

bào nấm non, sau đó được cấy sang môi trường giá môi để được lan tơ và phát triển

<i>thành quả thể nấm hồn chỉnh. Trong mơi trường ni cấy nấm Cordyrceps militaris nhu </i>

cầu hàm lượng nitơ tương đối thấp. Nếu hàm lượng nitơ quá cao sẽ làm chậm quá trình sinh trưởng hệ sợi và q trình biệt hóa hình thành quả thể.[12]

<i>Hợp chất tự nhiên như rong biển và tảo xoắn Spirulina platensis là nguồn nguyên </i>

liệu rất phổ biến mà lại rất giàu khoáng chất như magie, canxi, đồng, kali, selen, kẽm, ốt, sắt; cung cấp vitamin A, B, C, E và K và chứa rất thấp các chất béo. Rong biển và tảo xoắn Spirulina platensis cũng chứa nhiều chất chống oxy hóa, protein thực vật, chất xơ, axit béo omega-3 và tất cả các axit amin quan trọng cần thiết cho cơ thể con người.

<i>i-Trong rong biển và tảo xoắn Spirulina platensis có các thành phần dinh dưỡng như </i>

protein (N), khoáng,.. đều là nguồn dinh dưỡng phù hợp trong quy trình ni trồng nấm

<i>Cordyceps militaris. Việc thay thế nhộng bằng hợp chất tự nhiên là rất cần thiết, đáp ứng </i>

được nhu cầu cho người ăn chay nhạy cảm với mùi tanh của nhợng. Xuất phát từ tình hình thực tế đó chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Khảo sát sự ảnh hưởng của các

<i>nguyên liệu tự nhiên từ thực vật đối với quy trình ni trồng nấm Cordyceps militaris </i>

<b>chay”. </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

<b>PHẦN I TỔNG QUAN </b>

<b>1.1 </b>

<i><b>Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris</b></i>

Giới nấm Fungi Phân giới Dikarya Ngành Ascomycota

Phân ngành Pezizomycetidae Lớp Sordariomycetes

Phân lớp Hypocreomycetidae Bộ Hypocreales

Họ Cordycipitaceae

<i><b>Chi Cordyceps Hình 1.1. Nấm Cordyceps militaris </b></i>

<i>Loài Cordyceps militaris </i>

<b>1.2 </b>

<b>Đặc điểm sinh trưởng</b>

Theo Gao vs cs (2000) thì nhiệt đợ mơi trường có ảnh hưởng lớn đến việc tạo quả

cho sự sinh trưởng sinh khối nấm và năng suất quả thể. Tuy nhiên, quá trình này sẽ giảm

<i>độ môi trường khi trồng nấm Cordycep militaris. </i>

Theo Gao vs cs (2000) thì cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tạo quả thể nấm. Trong điều kiên che tối, việc tạo quả thể bi ức chế. Các nghiên cứu cho thấy cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng của nấm có thể dao đợng tùy

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

chủng nấm, tuy nhiên từ 500 - 1000 lux được xem là điều kiên thích hợp nhất [12]. Trong

<i>phịng ni nấm Cordycep militaris cần thiết kế các chế độ chiếu sáng phù hợp với quá </i>

trình sinh trưởng của nấm giống ngồi tự nhiên.

Đợ thoáng khı́ tốt kı́ch thích sự sinh trưởng của tơ nấm và tổng sinh khối nấm. Khoảng ẩm đơ thích hợp cho nấm dao đơng từ 70 – 90%, tương đương với độ ẩm không khí trong tự nhiên sẽ phù hơp cho việc tạo quả thể. Khi đô ẩm thấp sẽ làm môi trường khô nhanh hạn chế sự phát triển của tơ nấm cũng như quả thể. Do đó, trong phịng nấm cần bổ sung ẩm bằng máy phun ẩm với nguồn nước sạch khuẩn.[4]

<b>1.3 Dinh dưỡng nuôi trồng </b>

Gạo lứt là cơ chất tốt nhất cung cấp hàm lượng Cacbon trong muôi trường dinh

<i>dưỡng nuôi trồng nấm Cordyceps militaris, hàm lượng gạo lứt và hàm lượng nước trong </i>

môi trường nuôi cũng ảnh hưởng đến chiều cao quả thể và trọng lượng tươi nấm/chai nuôi.[3]

Nitơ cùng là thành phần dinh dưỡng không thiểu việc bổ sung nhộng tằm vào môi

<i>trường gạo lứt nhằm tạo quả thể C. militaris đã được chứng minh là tốt [3]. Tuy nhiên, hầu hết các dòng C. militaris yêu cầu hàm lượng đạm tương đối thấp, ở nồng độ đạm </i>

cao có thể ức chế sự hình thành quả thể (Gao et al. 2000) nên năng suất nấm nuôi trên côn trùng thường thấp hơn trên ngũ cốc.[12]

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

<b>1.4 </b>

<b>Thành phần dinh dưỡng</b>

<i>Trong môi trường ni trồng nấm Cordyrceps militaris, gạo là thành phần chính. </i>

Trong thành phần của gạo lứt có chứa rất nhiều dinh dưỡng gồm chất tinh bột, chất béo, chất đạm, chất xơ cùng các vitamin như B1, B2, B3, B6; các axit như paraaminobenzoic (PABA). pantothenic (vitamin B5), folic (vitamin M), phytic, các nguyên tổ vi lượng

<b>như canxi, selen, glutathion (GSH), sắt, magie, kali và natri. </b>

<b>Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng có trong 100g gạo lứt theo Bộ Y Tế viện dinh dưỡng (Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam)</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

<i>1.4.2 Rong biển </i>

<b>Giới thiệu chung về rong biển </b>

<i>❖ Phân loại và phân bố của rong biển trên thế giới </i>

Dựa vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và màu sắc, rong biển có thể được chia thành 3 ngành rong chính:

1. Ngành rong nâu (Phaeophyta) 2. Ngành rong đỏ (Rhodophyta) 3. Ngành rong lục (Chlorophyta)

Trong số 03 ngành rong trên, rong nâu là ngành rong có trữ lượng lớn nhất và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã được phân loại. Trên thế giới hiện nay chỉ riêng các lồi rong tḥc họ Sargassaseae, bợ Fucales đã phân loại được khoảng hơn 400 loài.[5]

<i>❖ Phân loại và phân bố các loài rong nâu ở Việt Nam </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

Theo Phạm Đức Thịnh vs cs (2015) ở Việt Nam đến nay có khoảng 147 loài rong nâu đã được phân loại, trong đó các lồi rong tḥc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài phân bố dọc ven biển Việt Nam và sản lượng ước tính trên 10.000 tấn khơ/năm. Theo điều tra tới năm 2011 có 39 lồi rong nâu tḥc chi Sargassum phân bố ở vùng biển Khánh Hịa, tập trung nhiều nhất và có trữ lượng lớn nhất là ở vịnh Nha Trang với 21 lồi phổ biến và sản lượng ước tính gần 4.800 tấn khơ/năm.[5]

<b>Thành phần hóa học có trong rong biển </b>

Rong biển có chứa đa dạng các thành phần hoá học, chúng đều là các thành phần rất có giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như dược liệu bao gồm: các axít amin, các axít béo nhiều nối đôi, các vitamin và khoáng chất, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, laminaran, alginat và fucoidan với tiềm năng ứng dụng rất lớn để làm dược liệu.[5]

<b>Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của rong biển Nghành </b>

<b>rong biển ^Khoáng^Protein^Glucid</b>

<b>Muối khoáng </b>

Rong Wakame [24]

Ngành rong Nâu (Phaeophyta)

Rong Sụn [1]

Ngành rong Đỏ

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

Rong Mơ [2]

Ngành rong Nâu (Phaeophyta)

<i>1.4.3 Tảo xoắn Spirulina platensis </i>

<i><b>Hình 1.2. Tảo Spirulina platensis nhập khẩu từ Nhật được mua tại địa chỉ số 63 </b></i>

<b>Yên Đỗ, phường 1, quận Bình Thạnh, Tp.Hồ Chí Minh</b>

.

Theo giáo sư Nguyễn Lân Dũng thì khi nói đến tảo xoắn Spirulina chắc nhiều

<i>người đều đã biết. Loài đang được đưa vào sản xuất hiện nay là loài Spirulina platensis. </i>

Thực ra đây khơng phải là mợt sinh vật tḥc Tảo (Algae) vì Tảo tḥc nhóm Sinh vật

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

có nhân thật (Eukaryotes). Spirulina thuộc Vi khuẩn lam (Cyanobacteria), chúng tḥc nhóm Sinh vật có nhân sơ hay nhân ngun thủy (Prokaryotes). Những nghiên cứu mới nhất cho biết chúng thuộc chi Arthrospira. Tên khoa học hiện nay của lồi này là Arthrospira platensis, tḥc bợ Oscilatoriales. Vì chúng là nhóm vi sinh vật hình xoắn khơng thấy được bằng mắt thường lại có màu xanh lục nên mọi người vẫn quen gọi là

<i>tảo xoắn Spirulina. Tảo Spirulina platensis là thực phẩm bổ sung có chứa 60-70% </i>

protein, nhiều hơn bất kỳ loại thực phẩm khác như thịt và cá. Ngoài protein thì tảo xoắn còn chứa rất nhiêu thành phần quan trong như vitamin, beta carotene, vitamin nhóm B, vitamin E, khoáng chất vi lượng thiết yếu và gamma linolenic acid (GLA).

<i><b>Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng có trong 100g tảo xoắn Spirulina theo Công ty </b></i>

<b>JAPAN ALGAE – Nhật Bản. </b>

<b>1.5 </b>

<i><b>Một số hợp chất có hoạt tính sinh học thu nhận từ Cordyceps militaris</b></i>

<i>C.militaris cho thấy loài nấm này chứa các thành phần như protein chiếm 40,69%; các </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học và nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1,52%), cordycepic acid (11,8%), polychaccaride (30%). [27]

Adenosine và cordycepin là hai hợp chất quan trọng có dược tính cao trong nấm

<i>Cordyceps militaris. Adenosine chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinh khối </i>

nấm. Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh khối (0,97% so với 0,36%).[4]

<i>Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 đươc tách chiết từ nấm Cordyceps militaris </i>

cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường monosaccharide, mannose và galactose [4]. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loai polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất. Yan et al., 2008 cho rằng tác dụng này có thể do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide từ nấm.[31]

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

<i>1.5.4 Acid béo </i>

<i>Theo Hur (2008) quả thể nấm Cordyceps militaris chứa nhiều acid béo không no, </i>

chiếm 70% tổng số acid béo, trong đó lương acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và 21,5% trong sinh khối. Lương ̣ acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối (Bảng 1.1).[13]

<i><b>Bảng 1.4. Thành phần acid béo của Cordyceps militaris (Hur, 2008) </b></i>

<b>1.6 </b>

<i><b>Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris </b></i>

<b>Các hợp chất dược liệu </b>

<i><b>Trong nấm Cordyceps militaris có rất nhiều các hợp chất dược liệu được ứng </b></i>

<i>dụng trong điều trị và nâng cao sức khỏe con người. Trong tự nhiên nấm Cordyceps militaris rất khan hiếm. Do đó lồi nấm này có giá trị kinh tế cao và việc sản xuất ở quy mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ Cordyceps militaris </i>

<b>hiện đang là một vấn đề cấp thiết. </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

<i>Các hợp chất chống ung thư: Theo Shonkor vs cs (2010) hợp chất cordycepin </i>

(3′-deoxyadenosine) từ nấm cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch.[28]

<i>hợp chất CM-hs-CPS2 chứa trong dịch chiết nấm C.militaris có tính kháng oxy hóa, hoạt </i>

<i>Hạn chế vius cúm: Theo Yuko vs cs (2007) cho thấy acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng </i>

dụng trong điều trị cúm A. Chất này góp phần điều hịa hoạt đợng miễn dịch của các đại thực bào.[33]

<i>Kháng khuẩn kháng nấm và kháng ung thư: Theo Young-Joon và cs (2000) hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium. Các hợp chất dẫn </i>

xuất từ nấm được mong đợi ứng dụng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột [32]. Theo Seulmee vs cs (2009) cho thấy cordycepin còn ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh tiểu đường thông qua viêc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ tḥc NF-κB, do đó được hy vọng sẽ ứng dụng được như mợt chất điều hịa miễn dịch dùng trong điều trị các bệnh về miễn dịch.[26]

<i>Tan huyết khối: Thoe Jae-Sung vs cs (2006) cho thấy enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy </i>

fibrin. Enzyme này có khả năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

enzym fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất. Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy mơ lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người.[14]

<i>Tı́nh kháng viêm: Theo Wol vs cs (2010) các đại thực bào được xử lý với nồng độ khác nhau của CMWE (dịch chiết từ quả thể nấm Cordyceps militaris) làm giảm đáng </i>

kể LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dich chiết. Những ̣ kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến viêc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào.[30]

<i>Các ứng dụng trên lâm sàng của nấm Cordyceps militaris: Mặc dù nấm Cordyceps sinensis được sử dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy nhiên các ứng dụng lâm sàng của chúng cũng khá tương tự nhau. Các chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris có </i>

thể được sử dụng trong các trường hợp suy giảm chức năng phổi, ho có đờm, chóng mặt. [9][25]

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

<b>1.7 </b>

<i><b>Đặc điểm hình thái của quả thể nấm Cordyceps militaris </b></i>

<i><b>Hình 1.3. Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử </b></i>

<b>(Christian et al., 1837) </b>

<i>Theo Paul vs cs (2008) thì nấm Cordyceps militaris là loài nấm ký sinh trên bướm </i>

và sâu bướm, quả thể có màu cam, chiều dài 8-10 cm. Đầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng. Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỡng ở giữa. Các nang bào tử dài từ 300 - 510 micro mét, bề rộng 4 micro mét. Các bào tử nang hình sợi, khơng màu và phân đoạn, kích thước 3.5-6 × 1-1.5 micro mét. Các bào tử nang này trong điều kiện nghèo dinh dưỡng sẽ đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp. Nấm này có phân bố rợng, ở Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á.[23]

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

<b>1.8 </b>

<i><b>Chu trình sống của nấm Cordyceps</b></i>

<i><b>Hình 1.4. Sự hình thành nấm Cordyceps sp. trong tự nhiên </b></i>

<b>1. Bướm 2. Sâu bướm 3. Bào tử nấm xâm nhiễm vào sâu trưởng thành </b>

<i><b>4. Nấm Cosdyceps militaris (Nguồn: ) </b></i>

<i>Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, C.militaris là mợt lồi nấm ký sinh </i>

trên cơn trùng và ấu trùng của cơn trùng. Lồi này chủ yếu lây nhiễm ở giai đoạn nhợng của các lồi bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ vào mùa đơng. Bào tử nấm phát tán trong gió xuống đất dı́nh vào bên ngồi ký chủ nhợng, sau đó từ bào tử hình thành các ống nảy mầm có các thể bám. Các ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể. Sau đó hê ̣sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh mẽ chiếm tồn bợ cơ thể và gây bệnh cho ký chủ. Đến cuối hè hoặc thu các ký chủ bị bệnh sẽ ngoi lên và chết cách mặt đất khoảng 2cm, gặp nhiệt đợ thích hợp và ánh nắng kích thích sự hình thành quả thể nhơ lên khỏi mặt đất rồi phát tán bào tử vào không khí. [15][16]

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

<b>1.9 Các nghiên cứu trong nước </b>

Nguyễn Ngọc Trai (2017), Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp

<i>trường, Bước đầu nghiên cứu quy trình nuôi đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) có nguồn gốc từ Nhật Bản tại Trà Vinh, tr 17-18. </i>

<i>Nghiên cứu hình thành và phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris. Thí </i>

Thí nghiệm thực hiện bổ sung dinh dưỡng có thành phần hàm lượng D-glucose khác nhau, chỉ tiêu đánh giá số lượng quả thể/keo quả thể cũng cho thấy ảnh hưởng của là D-glucose rất lớn. Xét về tỷ lệ keo ni có nấm hình thành quả thể, ở nghiêm thức 1 (môi trường không bổ sung glucose) và nghiêm thức 4 (30 g/l) chỉ 16 quả thể/keo. Nghiệm thức bổ sung 10 g/l là 26 quả thể/keo, nghiệm thức 20 g/l là 21,6 quả thể/keo. Kết quả cho thấy khi bổ sung hàm lượng đường D-glucose ≥20 g/l thì ức chế sự hình

<i>thành qua thể nấm Cordyceps militaris. </i>

<b>1.10 Các nghiên cứu ngoài nước </b>

<i>Daniel L. Purich and Herbert J. Fromm (1972), Activation of Brain Hexokinase by Magnesium Ions and by Magnesium Ion-Adenosine Triphosphate Complex, Printed </i>

in Great Britain.

Cho biết ở phản ứng 1 của quá trình đường phân là sự vận chuyển của 1 ATP đến glucose để tạo thành glucose-6-phosphat (G6P) quá trình được xúc tác bởi enzyme hexokinase. Hexokinase là enzym khơng đặc hiệu, có trong tất cả các loại tế bào, xúc tác

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

sự phosphoryl hóa của D-glucose, D-mannose, D-fructose và hoạt động xúc tác của

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

<b>PHẦN II VẬT LIỆU </b>

<b>2.1 </b>

<b>Địa điểm và thời gian thí nghiệm</b>

- Thời gian thực hiện: 1/2020 – 6/2020

- Địa điểm thực hiện: Cơ sở 3, 68 Lê Thị Trung phường Phú Lợi thành phố Thủ Dầu Mợt tỉnh Bình Dương.

<b>2.2 </b>

<b>Vật liệu</b>

Vật liệu hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

<i>- Giống Cordyceps militaris lỏng được cung cấp tại cơ sở 3 </i>

- Khoai tây: Chọn những củ không nảy mầm, sạch bệnh, không chầy xước, cung cấp tại Đà Lạt.

- Gạo lứt

- Rong biển khảo sát

<i>- Tảo xoắn Spirulina platensis </i>

<b>2.3 </b>

<b>Dụng cụ, hóa chất và thiết bị</b>

- Nồi nấu, đĩa petri, đồng hồ, hũ thủy tinh 500 ml, đèn cồn, giấy lọc, cán dao số 3, dao mổ số 12, khăn sạch, bật lửa, erlen 250 ml, becker 250 ml và 1000 ml, phễu lọc, đũa thủy tinh, ống đong 1000 ml, bình định mức 1000 ml,…

- Máy lắc tròn, bếp gas, nồi hấp khử trùng, máy đo pH, cân phân tích (OHAUS), máy sấy, máy chụp ảnh, đồng hồ,…

- Hộp nhựa L-621 (Ø 120 x 66,5 mm), xi-lanh (20 cc).

<b>- Hóa chất: Đường D-glucose, Kalidyhydro phosphate (KH</b><small>2</small>PO<small>4.</small>3H<small>2</small>O), Magie

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

<b>PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU </b>

<b>3.1 Nôi dung thực hiện </b>

Khảo sát sự ảnh hưởng của các nguyên liệu tự nhiên từ thực vật đối với quy trình

<i>ni trồng nấm Cordyceps militaris chay. </i>

<b>3.2 Các phương thực hiện </b>

<b>Hình 3.1. Sơ đồ quy trình thực hiện thí nghiệm </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

Để thu được năng suất nấm cần khảo sát trong nghiên cứu đề tài, tôi tiến hành cấy chuyền từ giống lỏng sang các môi trường rắn (với thành phần (khảo sát), gạo lứt dịch

atm, đem bảo quản nơi thoáng mát, khô ráo để tiện dùng cho việc cấy chuyền. Từ những chai giống lỏng ban đầu, hút 10 ml giống cho vào các hợp nhựa chứa mơi trường dinh

bề mặt thì chuyển sang nuôi sáng ở cường độ ánh sáng từ 500 -1000 lux, nhiệt độ 18 –

Gạo lứt 45 g/hộp

<i>Tảo xoắn Spirulina platensis </i>

Dịch chiết khoai tây: cân 200g khoai tây bổ sung 1000ml nước cất đun sôi trong 20 phút sau đó lọc thu dịch chiết, bổ sung thêm:

<b>Hóa chất </b>

Đường D-glucose 0,005% Đường saccarozo 0,015%

Vitamin B1 1viên pH: 6,0 – 6,5 [4]

Gạo lứt và hợp chất tự nhiên (rong biển và tảo) cần trộn đều với nhau sau đó thêm dịch chiết khoai tây đạt ẩm độ 60 – 65%. Giá thể sau phối trộn được hấp khử

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

<i>3.2.3 Phương pháp thu chỉ tiêu trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris </i>

Cân trọng lượng tươi trong từng hộp: Cân khối lượng đĩa nhựa M1, cắt quả thể nấm sát đế rồi bỏ lên đĩa nhựa đem đi cân M2.

M0 = M2 – M1 M0: Khối lượng tươi

M1: Khối lượng đĩa nhựa M2: Khối lượng cả nấm lẫn đĩa

Cân trọng lượng khô trong từng hộp: Lấy khối lượng tươi M0 của từng hộp mang

<b>⮚ Xây dựng đường chuẩn </b>

Hút 0,4ml dung dịch protein có nồng đợ khác nhau từ trong ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 1-6 vào 7 ống nghiệm sạch khác (gồm 2 ống Không và 5 ống từ 2-6). Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Lắc đều và để n ở nhiệt đợ phịng trong 5 phút. Sau đó thêm 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5-10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml, đem đo mật đợ quang ở bước sóng 360nm.

Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (∆OD) theo nồng đợ protein chuẩn (µg/ml).

<b>⮚ Xác định hàm lượng protein trong mẫu </b>

Hút 0,4ml dung dịch protein cần phân tích, thêm 2ml dung dịch C, lắc đều để n ở nhiệt đợ phịng trong 5 phút. Sau đó thêm 2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 - 10 phút. Thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang ở bước song 750nm. Nên làm 3 ống nghiệm để lấy trung bình, pha lỗng mẫu nếu màu vượt ngồi đường chuẩn. Từ đường chuẩn suy ra hàm lượng protein cần phân tích.

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

<i>3.2.5 Phương pháp xác định % Nitơ Kjeldahl </i>

Tính % Nitơ khi đã xác định được % Protein từ phường pháp Lowry của nguyên liệu cần tìm.

<b>% Protein = F ∗ %N </b>

F là hệ số chuyển đổi F đậu nành: 5,71

F rong biển và tảo biển: 6,25

Năng suất sinh học BE được tính theo cơng thức sau:

<b>BE = </b>^{𝑲𝒉ớ𝒊 𝒍ượ𝒏𝒈 𝒒𝒖𝒂̉ 𝒕𝒉ê ̉𝒌𝒉ố}

Theo dõi chỉ tiêu về trọng lượng quả thể và số liệu được xử lý thống kê trên: Phần mềm Stagraphis plus 3.0

Phầm mềm Excel

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

<b>3.3 Nôi dung khảo sát </b>

<i>nấm Cordyceps militaris ni trên mơi trường gạo lứt. </i>

Mục đích: Chọn được loài rong biển phù hợp cho sự phát triện của quả thể nấm

Môi trường 1: 12% bột đậu nành (đối chứng)

Môi trường 2: 3,7% rong

Wakame Môi trường 3: 12% rong MơMôi trường 4: 8,8% rong Sụn

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

<i>3.3.1.2 Bố trí thí nghiệm </i>

<b>Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 1 </b>

<i>3.3.1.3 Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm</i>

- Năng suất: trọng lượng tươi (g), trọng lượng khô (g). - Đánh giá năng suất sinh học (%).

<b>STT KÝ HIỆU THỨC NGHIỆM KHỐI LƯỢNG ( %) %NITO </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

<i>3.3.2 Thí nghiệm 2: Tối ưu hàm lượng rong biển Wakame bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt. </i>

Mục đích: Xác định hàm lượng rong biển Wakame tối ưu để bổ sung vào môi

<i>trường nuôi nấm Cordyceps militaris. </i>

Bố trí thí nghiệm theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, 3 lần lặp lại với mỗi lần 15 hợp.

<i>3.3.2.1 Sơ đồ thí nghiệm </i>

<b>Hình 3.3. Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 2 </b>

Môi trường 1: 3,7% (đối chứng)Môi trường 2:

5,2%

Môi trường 3: 4,5%

Môi trường 4: 3%

Môi trường 5: 2,2%

Cấy chuyền

Cấy chuyền

</div>