khảo sát sự tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường trên gen apc với tính chất nhiễm hpv trên bệnh nhân người việt nam

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.95 MB, 99 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

Khảo sát sự tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường trên gen APC với tính chất nhiễm HPV trên bệnh nhân người Việt Nam

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. TRƯƠNG KIM PHƯỢNG

SVTH: Lâm Thị Thanh Tâm

MSSV: 1253010325 Khóa: 2012 - 2016

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang i

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi để giúp em hoàn thành chuyên đề thực tập này.

Em xin được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Cơ PGS.TS. Lê Huyền Ái Thúy đã hướng dẫn tận tình, truyền đạt cho em những kiến thức quý báu về cơ bản cũng như chuyên môn.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy ThS. Lao Đức Thuận đã giúp đỡ và chia sẻ cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý giá.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến cô ThS. Trương Kim Phượng đã hướng dẫn tận tình và động viên em rất nhiều trong suốt quá trình thực tập.

Tôi xin cảm ơn các bạn của tôi, các bạn trong phịng Vi sinh - Sinh học phân tử, ln giúp đỡ tơi trong q trình thực tập.

Và cuối cùng, con xin gửi lời biết ơn đến Gia đình, nơi đã sinh thành, nuôi dưỡng, động viên con, luôn bên cạnh con trong suốt thời gian qua.

Sinh viên Lâm Thị Thanh Tâm

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang ii

PHẦN I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ... 3

I.1. Tổng quan về ung thư ... 3

I.1.1. Khái niệm ung thư ... 3

I.1.2. Yếu tố nguy cơ ... 3

I.1.3. Phân loại ung thư ... 4

I.1.4. Ung thư cổ tử cung ... 4

I.1.5. Tình hình ung thư cổ tử cung ở trên thế giới ... 6

I.1.6. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam ... 7

I.1.7. Virus HPV ... 8

I.2. Epigenetics ... 10

I.2.1. Sự methyl hóa DNA ... 10

I.3. Tổng quan về gen APC ... 12

I.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen APC ... 12

I.3.2. Các cơng trình nghiên cứu khoa học về tính chất methyl hóa gen APC ... 14

I.4. Các phương pháp phân tích sự methyl hóa ... 14

I.4.1. Phương pháp MSP ... 14

I.4.2. Phương pháp BSP ... 16

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang iii

I.4.3. Phương pháp Nested-MSP ... 16

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ... 17

II.1. Vật liệu ... 17

II.1.1. Các công cụ tin sinh học ... 17

II.1.2. Các trang web ... 17

II.1.3. Xử lý số liệu ... 17

II.2. Phương pháp ... 17

II.2.1. Khai thác dữ liệu ... 17

II.2.2. Khảo sát in silico gen APC ... 18

II.2.3. Xử lý số liệu ... 19

II.2.4. Khảo sát thực nghiệm ... 19

PHẦN III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ... 27

III.1. Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico gen APC... 27

III.1.1. Kết quả khai thác dữ liệu ... 27

III.1.2. Kết quả khảo sát in silico gen APC ... 34

III.1.3. Đánh giá các thông số vật lý của mồi Nested-MSP ... 37

III.1.4. Đánh giá các thông số vật lý của mồi ... 38

III.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM ... 45

III.2.1. Tách chiết DNA và kiểm tra DNA bộ gen sau khi tách chiết ... 45

III.2.2. Thiết lập quy trình Nested-MSP ... 45

III.2.3. Khảo sát tính chất methyl hóa gen APC trong bộ mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào nhiễm HPV type nguy cơ cao bằng quy trình Nested-MSP. ... 47

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang iv

III.2.4. Kết quả giải trình tự ... 54

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AC Adenoma carcinoma

APC Adenomatous polyposis Coli

CDK Cyclin Dependent Kinase DNA Deoxyribonucleic acid DNMT DNA methyltransferases

FAP Familial adenomatous polyposis HPV Human Papilloma virus

MF Methylated forward primer MR Methylated revesre primer MSP Methylation-Specific PCR

NCBI National Center for Biotechnology Information p53 Tumor suppressor protein

PCR Polymerase Chain Reaction RB Retinoblastoma

Tm Temperature melt

UF Unmethylated forward primer UR Unmethylated revesre primer UTCTC Ung thư cổ tử cung

WHO World Health Organization BC Breast cancer

BLC Bladder cancer

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang vi CC Cervical cancer

COL Colorectal cancer GC Gastric cancer LC Lung cancer OVC Ovarian cancer

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng MSP, Nested-MSP ... 25

Bảng 3.1. Các cơng trình nghiên cứu về gen APC ... 27

Bảng 3.2. Tần số methyl hóa gen APC trong các loại ung thư ... 28

Bảng 3.3. Tần suất methyl hóa gen APC của các loại mẫu thuộc các giai đoạn trong UTCTC ... 34

Bảng 3.4. Cặp mồi ngoài trong cho phản ứng Nested-MSP trên gen APC ... 36

Bảng 3.5. Thông số vật lý của cặp mồi Nested-MSP trên gen APC ... 37

Bảng 3.6. Cặp mồi phản ứng MSP với gen APC ... 38

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát cặp mồi MSP với gen APC ... 39

Bảng 3.8. Tính chất methyl hóa đảo CpG trên vùng prompter gen APC ở các mẫu bệnh phẩm ... 46

Bảng 3.9. Kết quả khảo sát sự methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen APC ... 49

Bảng 3.10. Kết quả phân tích sự tương quan giữa tính chất methyl hóa và tính chất nhiễm HPV ... 53

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Diễn tiến quá trình sinh ung ... 3

Hình 1.2. Tỷ lệ phụ nữ mắc bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới (Globocan, 2012) .... 6

Hình 1.3. Tỷ lệ số trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung ở phụ nữ trên thế giới (Globocan, 2012) ... 7

Hình 1.4. Tỷ lệ phụ nữ mắc bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt Nam (Globocan, 2012) .... 7

Hình 1.5. Tỷ lệ số trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung của phụ nữ ở Việt Nam (Globocan, 2012) ... 8

Hình 1.6. Cơ chế hoạt động của oncoprotein E6 và E7 ... 10

Hình 1.7. Phản ứng methyl hóa DNA ... 11

Hình 1.8. Vị trí gen APC (Genecard) ... 12

Hình 1.9. Con đường tín hiệu Wnt ... 13

Hình 1.10. Cơ chế biến đổi DNA bằng sodium bisulfite ... 15

Hình 1.11. Mơ tả phương pháp MSP ... 15

Hình 1.12. Minh họa phương pháp Nested-MSP ... 16

Hình 2.1. Chu trình luân nhiệt biến đổi bisulfite ... 23

Hình 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng MSP, Nested-MSP ... 25

Hình 3.1. Đồ thị mơ tả tần số methyl hóa trung bình trọng số (%) trên vùng promoter gen APC trong các loại ung thư ... 30

Hình 3.2. Đồ thị mơ tả các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để khảo sát tần số methyl hóa trên vùng promoter gen APC ... 31

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang ix Hình 3.3. Đồ thị mơ tả tần suất methyl hóa trung bình trọng số trong các loại mẫu bệnh

phẩm ung thư (mẫu máu, dịch phết tế bào, mơ) ... 31

Hình 3.4. Đồ thị mơ tả mối tương quan giữa các phương pháp sinh học phân tử và loại mẫu bệnh phẩm của các loại ung thư ... 32

Hình 3.5. Định vị đảo CpG trên vùng promoter của gen APC (Methprimer)... 35

Hình 3.6. Kết quả phân tích cặp mồi APC-NF và APC-NR trên vùng promoter của gen APC bằng cơng cụ Annhyb ... 40

Hình 3.7. Kết quả phân tích cặp mồi APC-MF và APC-MR trên vùng promoter của gen APC bằng cơng cụ Annhyb ... 42

Hình 3.8. Kết quả phân tích cặp mồi APC-UR và APC-UF trên vùng promoter của gen APC bằng cơng cụ Annhyb ... 42

Hình 3.9. Cấu trúc vùng promoter gen APC ... 44

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP gen APC các mẫu S... 47

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP gen APC ở các mẫu HA ... 48

Hình 3.12. Kết quả phân tích ghi nhận sản phẩm mẫu HA1 được khuếch đại với mồi methyl ... 55

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo báo cáo của Tổ chức y tế Thế giới (WHO, 2012), trên thế giới có khoảng 14,1 triệu trường hợp mới mắc bệnh và 8,2 triệu trường hợp tử vong do mắc các bệnh ung thư khác nhau. Ung thư cổ tử cung xếp hàng thứ tư trong nhóm bệnh ung thư thường gặp ở phụ nữ trên thế giới (WHO, 2012). Theo báo cáo của tổ chức Internation Agency for Research on Cancer (IARC, 2012), trên thế giới có khoảng 266.000 người tử vong và 528.000 trường hợp mới mắc bệnh ung thư cổ tử cung.

Theo công bố khoa học của Eileen và cộng sự (2011), Human papillomavirus (HPV) là yếu tố nguy cơ hàng đầu dẫn đến bệnh ung thư cổ tử cung[18]. Bên cạnh đó, cơng bố khoa học của Richard và cộng sự (2010) ghi nhận tính chất methyl hóa vượt mức trên các gen có chức năng đè nén u liên quan đến sự hình thành và diễn tiến các loại ung thư, điển hình là ung thư cổ tử cung.

trọng trong chu trình tế bào[98,99], ức chế con đường truyền tín hiệu Wnt, kiểm sốt sự tăng sinh tế bào, ức chế khối u[98]. Sự methyl hóa vượt mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter của gen APC dẫn đến sự bất hoạt chức năng của gen này[48]

Do vậy, việc xác định tần số methyl hóa vượt mức trên gen APC trong bộ mẫu không nhiễm hoặc nhiễm HPV (type nguy cơ cao/type nguy cơ thấp) có ý nghĩa thực tiễn trong việc tìm ra mối tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường trên các gen này và yếu tố nguy cơ dẫn đến bệnh ung thư cổ tử cung. Từ đó, hướng đến việc xác định dấu chứng sinh học tiềm năng trong tiên lượng, chẩn đoán sớm bệnh ung thư cổ tử cung.

Ở Việt Nam, cho đến thời điểm này có rất ít cơng trình nghiên cứu tính chất methyl

hóa vượt mức trên vùng promoter gen APC trong ung thư cổ tử cung và bộ mẫu có tính

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 2 HPV (type nguy cơ cao/type nguy cơ thấp) ở người bệnh Việt Nam. Do vậy, chúng tơi thực hiện chun đề khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát sự tương quan giữa tính chất

methyl hóa bất thường trên gen APC với tính chất nhiễm HPV trên bệnh nhân người Việt Nam”

Mục tiêu

Khảo sát tính chất methyl hóa DNA vượt mức của gen APCliên quan đến bệnh ung

thư cổ tử cung, cụ thể là mối liên quan giữa tính chất methyl hóa DNA gen APC và yếu

tố nguy cơ dẫn đến bệnh UTCTC - tính chất nhiễm HPV (type nguy cơ cao/type nguy cơ thấp), nhằm hướng đến phát triển phương pháp không xâm lấn (non invation) để tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh UTCTC.

Nội dung nghiên cứu:

Khảo sát bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter gen APC liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung và tính chất nhiễm HPV/khơng nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/type HPV nguy cơ thấp.

Khảo sát cặp mồi phù hợp với phương pháp sinh học phân tử (MSP, Nested-MSP) phù hợp nhằm khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen APC trên bộ mẫu có tính chất khơng nhiễm HPV (mẫu lành)/nhiễm HPV type nguy cơ thấp hoặc HPV type nguy cơ cao.

Khảo sát thực nghiệm dựa vào phương pháp Nested-MSP nhằm khảo sát tính chất methyl hóa gen APC trên bộ mẫu có tính chất khơng nhiễm HPV (mẫu lành)/nhiễm HPV type nguy cơ thấp hoặc HPV type nguy cơ cao.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 3

PHẦN I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

I.1. Tổng quan về ung thư

I.1.1. Khái niệm ung thư

Ung thư là một thuật ngữ chung chỉ một nhóm các bệnh lý có thể ảnh hưởng đến bất kì phần nào của cơ thể. Ung thư khởi phát từ sự tăng trưởng khơng kiểm sốt của các tế bào, có thể xâm nhập và di căn đến các vị trí khác của cơ thể thơng qua hệ thống mạch máu hay mạch bạch huyết[77]

I.1.2. Yếu tố nguy cơ

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ung thư khởi phát từ một tế bào duy nhất trải qua nhiều giai đoạn, thường là từ một sự tổn thương tiền ung thư đến các khối u ác tính. Những thay đổi này là kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của cơ thể với các loại tác nhân bên ngoài như tác nhân vật lý, hóa học, sinh học:

− Tác nhân vật lý: tia cực tím và bức xạ ion hóa[106]

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 4

I.1.3. Phân loại ung thư

− Ung thư biểu mô (carcinoma): ung thư khởi phát ở da hoặc trong các mơ lót hay lớp biểu mơ phủ bên trong các cơ quan nội tạng. Có một số dạng ung thư biểu mô như sau: ung thư tuyến, ung thư biểu mô tế bào vảy và ung thư biểu mô tế bào chuyển tiếp[97]

− U lympho bào, u tủy (lyphoma, myeloma): ung thư khởi phát từ các tế bào lympho của hệ thống miễn dịch[97]

− Ung thư hệ thống thần kinh trung ương: ung thư khởi phát trong các tế bào não hoặc tủy sống[97]

I.1.4. Ung thư cổ tử cung

Ung thư cổ tử cung là một bệnh ung thư ác tính. Hình thành trong lớp lót bên trong cổ tử cung, đường giao nhau của âm đạo và tử cung[35]

Quá trình khởi phát ung thư cổ tử cung bắt đầu trong các tế bào xung quanh cổ tử cung. Bao gồm quá trình tạo u trong biểu mô tử cung (Cervical Intraepithelial Neoplasia - CIN), sự tổn thương trong biểu mơ của các tế bào hình vảy (Squamous Intraepithelial Lesion - SIL) và sự loạn sản (dysplasia )[35]

Theo hệ thống phân loại của Tổ chức y tế Thế giới (WHO), mức độ loạn sản và tạo u ở tầng biểu mô cổ tử cung (Cervical Intaepithelial Neoplasia - CIN) được chia thành các cấp độ[106]

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 5 − CIN1: sự loạn sản ở mức độ nhẹ.

− CIN2: sự loạn sản ở mức độ vừa.

− CIN3: sự loạn sản ở mức độ nghiêm trọng.

Trong hệ thống phân loại của Bethesda, mức độ tổn thương biểu mơ và diễn tiến hình thành ung thư cổ tử cung được chia thành các cấp độ:

− LSIL (Low - grade Squamous Intraepithelial Lesion): sự tổn thương bên trong biểu mơ hình thành vảy cấp độ thấp, tương ứng CIN1[108]

− HSIL (High - grade Squamous Intraepithelial Lesion): sự tổn thương bên trong biểu mơ hình vảy cấp độ cao, tương ứng với CIN2, CIN3[108]

⮚ Các giai đoạn phát triển ung thư cổ tử cung

− Giai đoạn I: ung thư khởi phát tại các tế bào cổ tử cung. Dựa vào số lượng tế bào ung thư được tìm thấy, ung thư cổ tử cung gồm các giai đoạn IA, IB[95]

. − Giai đoạn II: ung thư đã lan rộng ra ngoài cổ tử cung nhưng chưa xâm lấn vào

vùng xương chậu hoặc phần phía dưới của âm đạo[95]

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 6 − Giai đoạn IV: ung thư đã lan rộng ra ngồi vùng xương chậu, có thể tìm thấy tế bào ung thư trong niêm mạc bàng quang, trực tràng hoặc đã lan rộng đến các bộ phận khác của cơ thể[95]

I.1.5. Tình hình ung thư cổ tử cung ở trên thế giới

Theo số liệu thống kê của Globocan (2012), ung thư cổ tử cung là loại ung thư phổ biến thứ tư trên Thế giới. Năm 2012, có khoảng 528.000 trường hợp mới, 266.000 trường hợp tử vong, chiếm 7,5% số ca tử vong do ung thư ở phụ nữ. Ở các vùng chưa phát triển, số trường hợp tử vong do ung thư xấp xỉ khoảng 87,0%. Ung thư cổ tử cung là bệnh ung thư xảy ra phổ biến nhất ở phụ nữ thuộc khu vực Đông Phi và Trung Phi[105].

Hình 1.2. Tỷ lệ phụ nữ mắc bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới (Globocan, 2012)[104]

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 7

I.1.6. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam

Theo Globocan 2012, ung thư cổ tử cung thuộc nhóm ung thư thường gặp ở phụ nữ Việt Nam, trong nhóm bệnh lý này cịn có ung thư vú, ung thư phổi, ung thư gan và ung thư dạ dày. Có khoảng 5.146 trường hợp mắc bệnh ung thư cổ cung (9,4%). Số trường hợp tử vong là 2.864 (2,4%)[105]

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 8

− Nhóm HPV type chưa xác định nguy cơ (Unknown - risk type): 2a, 3, 7, 10, 13, 27, 28. 29, 30, 32, 34, 55, 57, 62, 67, 69, 71, 74, 77, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 91[79].

Hình 1.5. Tỷ lệ số trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung của phụ nữ ở Việt Nam (Globocan, 2012)[100]

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 9

⮚ Cơ chế gây ung thư của HPV

Trong cơ chế xâm nhiễm, HPV type nguy cơ thấp thường ở thể episome, DNA bộ gen của HPV tồn tại độc lập với bộ gen tế bào ký chủ. Thông thường, trong thể episome,

gen E2 của HPV luôn được biểu hiện sớm trong cơ chế xâm nhiễm, đây là gen có chức năng kìm hãm sự hoạt động của các “oncogene”: E6, E7[18]

Tuy nhiên, DNA bộ gen của HPV type nguy cơ cao có khả năng gắn chèn vào bộ nhiễm sắc thể tế bào ký chủ. Khi xâm nhiễm vào cơ thể ký chủ , nhóm HPV type nguy cơ cao (đặc biệt là type 16, 18) có khả năng tái bản nhanh hơn khoảng 40% so với các nhóm HPV khác[18]. Bởi vì có sự gắn chèn vào bộ gen tế bào ký chủ, gen E2 bị bất hoạt dẫn đến kích hoạt hoạt động của hai “oncogene”: E6, E7 thoát khỏi sự kiểm soát, biểu hiện tạo thành hai “oncoprotein” E6, E7[18]

Hai oncoprotein E6, E7 có ái lực cao lần lượt với protein p53 và pRB. Protein p53 thuộc nhóm protein đè nén ung và pRB (retinoblastoma) tham gia trong đường truyền tín hiệu của chu trình tế bào[18], có chức năng kiểm sốt chu trình tế bào, quá trình phân bào và các hoạt động của nhóm kinase phụ thuộc vào cyclin[79]

Protein E6 liên kết với p53 dẫn đến sự ức chế chức năng của p53, làm mất kiểm sốt chu trình tế bào (tham gia điều khiển pha G1, thoát khỏi “checkpoint”), sự chết theo chương trình (apoptosis) và quá trình sửa chữa DNA[82,18]. Protein E7 liên kết với protein RB ngăn cản sự tương tác giữa pRB và yếu tố phiên mã E2F-1, dẫn đến yếu tố phiên mã E2F-1 ở trạng thái tự do, tham gia hoạt hóa q trình phiên mã các oncogene, thúc đẩy chu trình tế bào đi từ pha G1 sang pha S[79]

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 10

I.2. Epigenetics

Epigenetics là những thay đổi di truyền trong biểu hiện gen không liên quan đến những thay đổi trong trình tự DNA. Epigenetics có vai trị điều hịa sự phân bào, sự phát triển bình thường và duy trì sự biểu hiện của gen ở tế bào động vật có vú[28]

Các cơ chế thuộc epigenetics gồm có: sự methyl hóa DNA, sự biến đổi histone, sự biến đổi cấu trúc nucleosome và microRNA (miRNA). Những cơ chế này kiểm soát sự biểu hiện gen trong tế bào lành[6]. Tính chất bất thường của epigenetics (DNA hypermethylation, DNA hypomethylation,...) có thể làm thay đổi sự biểu hiện gen và dẫn đến sự biến đổi tế bào lành thành tế bào ác tính, khởi phát q trình sinh ung[72,28]

I.2.1. Sự methyl hóa DNA

Sự methyl hóa DNA thuộc cơ chế biến đổi epigenetics, đóng vai trị quan trọng trong việc kiểm soát sự biểu hiện gen ở tế bào Eukaryote[60]. Trong tế bào lành, sự methyl

Hình 1.6. Cơ chế hoạt động của oncoprotein E6 và E7[18]

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 11 hóa DNA có vai trị kiểm sốt q trình phát triển phôi, tăng sinh và phân bào, in dấu gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X, ức chế các yếu tố lặp lại và các yếu tố chuyển vị[68,70]

. Sự methyl hóa này có vai trị kiểm sốt q trình sao chép, sửa chữa DNA[60,84]

Họ DNA methyltransferase (DNMTs) xúc tác sự methyl hóa DNA, chuyển nhóm CH3từ phân tử S-adenosyl-methionine gắn vào cytosine tại vị trí C5, hình thành 5-methylcytosine (5mC). Sự methyl hóa thường xảy ra trong các cặp dinucleotide CpG[60].

Trong tế bào động vật có vú, methyl hóa DNA được thực hiện bởi họ enzyme DNA methyltransferases (DNMTs): DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b[60,8]. DNMT3a và DNMT3b có chức năng như de novo methyltransferases. DNMT2 có chức năng methyl hóa trình tự DNA tương đồng với vật liệu di truyền của Retrovirus[60]

Sự rối loạn chức năng của các enzym DNMTs dẫn đến sự methyl hóa DNA bất thường: sự methyl hóa vượt mức (hypermethylation) hoặc giải methyl hóa (hypomethylation) DNA[54]. Sự giải methyl hóa xuất phát từ sự loại bỏ các nhóm methyl trên các phân tử cytosine, dẫn đến sự mất ổn định gen và kích hoạt các gen tiền sinh ung (oncogene). Sự methyl hóa vượt mức thường xảy ra ở vùng promoter của gen ức chế khối u (tumour suppressor gene), dẫn đến “sự im lặng” của các gen này[47]

Hình 1.7. Phản ứng methyl hóa DNA[54]

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 12

❖ Đảo CpG

Đảo CpG là các đoạn trình tự DNA giàu CpG, có kích thước khoảng 200-1000 nucleotide[13,57]. Trong bộ gen người, có khoảng 60-70% đảo CpG tập trung trên vùng promoter[10,25].

Các cặp CpG có thể thuộc vào trình tự nhận biết của các yếu tố phiên mã (hot-spot) kiểm soát sự biểu hiện gen[60]. Baylin và cộng sự (2001) cho thấy sự methyl hóa ở đảo CpG giữ vai trị kích hoạt/kìm hãm sự hoạt động của các gen đè nén u.

I.3. Tổng quan về gen APC

I.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen APC

Gen APC (Adenomatous polyposis coli) định vị ở nucleotide 112.707.505 đến

112.846.239 trên trên nhiễm sắc thể số 5 (5q21.22). Gen APC có kích thước là 138.734 bp[99].

Gen APC mã hóa protein ức chế khối u có kích thước 312 kDa. Protein APC tương tác với protein β-catenin[2,53] tham gia kiểm sốt đường truyền tín hiệu Wnt, kiểm sốt sự tăng sinh tế bào, sự phân bào và biệt hóa một số loại tế bào: ruột[60,7], biểu bì[34]

, xương[81]

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 13 β-catenin có vai trị kép trong tế bào, có chức năng trong con đường tín hiệu Wnt. β- catenin ở trạng thái tự do liên kết với các thụ thể màng “frizzled” và các đồng thụ thể low-density lipoprotein receptor-related protein 5 và 6 (LRP-5 và LRP-6). β-catenin đi vào nhân tế bào và liên kết với yếu tố phiên mã TCF/LEF để kích hoạt phiên mã các gen mục tiêu của tín hiệu Wnt[2,71]

β-catenin tạo thành phức hợp với Axin, protein APC, casein kinase 1 (CK1) và glycogene synthase kinase 3 (GSK3). Khi đó, β-catenin bị phosphoryl hóa lần lượt bởi CK1 và GSK3 dẫn đến β-catenin bị thoái biến trong proteasome. Khi đó, các yếu tố T/lymphoid enhancer (TCF/LEF) tương tác với các chất đồng ức chế Groucho, dẫn đến sự ức chế quá trình phiên mã của các gen mục tiêu[71,58]

Hình 1.9. Con đường tín hiệu Wnt[53]

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 14

I.3.2. Các cơng trình nghiên cứu khoa học về tính chất methyl hóa gen APC

Trong cơng trình nghiên cứu của Tsuchiya và các cộng sự (2000), xác định tần suất methyl hóa của gen APC trong ung thư dạ dày là 82,5%. Tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen APC trong mẫu máu và mẫu mô sinh thiết ung thư trực tràng là 18% được ghi nhận trong cơng trình nghiên cứu của Esteller và các cộng sự (2000).

Cơng trình nghiên cứu của Yang và các cộng sự (2005) ghi nhận tần suất methyl hóa của gen APC là 48% (15/31) trong các mẫu khối u của bệnh bạch cầu tế bào T/lymphoma.

Cơng trình nghiên cứu của Alivand và các cộng sự (2011) ghi nhận tần suất methyl hóa của gen APC trong các mẫu mô khối u của bệnh ung thư dạ dày là 77,8% trong tổng số 36 mẫu.

Hiện nay, có rất ít cơng bố khoa học về tính chất methyl hóa vùng promoter gen APC trên bộ mẫu ung thư cổ tử cung, bộ mẫu nhiễm HPV trên người bệnh Việt Nam. Công bố khoa học của Phuong và các cộng sự (2016) ghi nhận tần suất methyl hóa vượt mức của gen APC trong các mẫu dịch phết tế bào có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao, HPV type nguy cơ thấp và HPV type không nguy cơ lần lượt là 75%, 12,5% và 30% .

I.4. Các phương pháp phân tích sự methyl hóa

I.4.1. Phương pháp MSP

Phương pháp methylation-specific PCR (MSP) mô tả lần đầu tiên bởi Herman và cộng sự (1996). Phương pháp MSP sử dụng cặp mồi đặc hiệu trạng thái allele methyl hóa và trạng thái allele khơng methyl hóa.

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 15 Trước khi thực hiện phản ứng MSP, trình tự DNA bộ gen được biến đổi sodium bisulfite trước. Sau quá trình biến đổi bisulfite, các cytosine (C) khơng bị methyl hóa biến đổi thành uracil (U) nhưng các cytosines bị methyl hóa (mC) khơng bị biến đổi[22]

Sau đó, trình tự DNA bộ gen đã biến đổi bisulfite đưa vào phản ứng MSP, gồm hai phản ứng PCR riêng biệt với một cặp mồi đặc hiệu allele methyl hóa (cặp mồi methyl hóa) và một cặp mồi đặc hiệu allele không methyl hóa (cặp mồi khơng methyl hóa). Trình tự các mồi hiện diện ít nhất một vị trí CpG[20]

Hình 1.10. Cơ chế biến đổi DNA bằng sodium bisulfite[23]

Hình 1.11. Mơ tả phương pháp MSP[103]

Chú thích:

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 16

I.4.2. Phương pháp BSP

Phương pháp Bisulfite sequencing PCR (BSP) là phương pháp kết hợp giữa PCR và giải trình tự. Tương tự phương pháp MSP, trình tự DNA bộ gen được biến đổi bisulfite. Sau đó, sản phẩm DNA biến đổi bằng bisulfite được đưa vào phản ứng PCR với một cặp mồi đặc hiệu với vùng trình tự mục tiêu, bao quanh các vị trí CpG cần được khảo sát (trình tự mồi xi và mồi ngược khơng chứa các vị trí CpG) để khuếch đại allele methyl hóa và allele khơng methyl hóa[37,94]

I.4.3. Phương pháp Nested-MSP

Phương pháp Nested-MSP là phương pháp MSP cải tiến nhằm khắc phục được những hạn chế của phương pháp MSP. Phương pháp này cho phép phân tích một số mẫu có đặc điểm: số lượng tế bào ít hoặc chất lượng DNA thấp (lẫn tạp nhiễm)[56]

Phương pháp Nested-MSP trải qua hai giai đoạn kế tiếp nhau. Giai đoạn 1 thực hiện phản ứng PCR đầu tiên, cặp mồi khuếch đại một vùng trình tự DNA mục tiêu trên DNA bộ gen đã được biến đổi bisulfite. Vùng trình tự DNA mục tiêu bao quanh các vị trí CpG (vị trí hot spot)[8,29,24]

. Giai đoạn 2 thực hiện 2 phản ứng PCR riêng biệt lần lượt với một cặp mồi đặc hiệu alelle methyl hóa và một cặp mồi đặc hiệu alelle khơng bị methyl hóa[24]

Hình 1.12. Minh họa phương pháp Nested-MSP[24]

Chú thích:

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 17

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

II.1. Vật liệu

Chúng tôi thu thập bộ mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào (kèm theo các chỉ tiêu lâm sàng) có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV được cung cấp bởi phịng khám Âu Lạc (cơng ty cổ phần Công nghệ Việt Á) và Công ty cổ phần dịch vụ Phân Tích Di Truyền.

II.1.1. Các cơng cụ tin sinh học

− Phần mềm Annhyb − Phần mềm ClustalX

II.1.2. Các trang web

II.2.1. Khai thác dữ liệu

Dựa trên nguồn dữ liệu của NCBI ( ), chúng tơi tiến hành tìm kiếm, thu thập các nghiên cứu khoa học liên quan đến sự xác định tính chất methyl hóa bất thường (vượt mức) trên vùng promoter của gen APC trên bệnh nhân ung thư

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 18 nói chung và trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung nói riêng ở Việt Nam và trên Thế giới, dựa vào một số từ khóa: methylation, cervical cancer, APC,…

Từ đó, chúng tơi ứng dụng cơng cụ MedCalcnhằmphân tích các nội dung:

− Xác định tần số methyl hóa bất thường của gen APC trên bộ mẫu UTCTC trên Thế giới.

− Khai thác dữ liệu về phương pháp nghiên cứu, các loại mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong những cơng trình nghiên cứu về tính chất methyl hóa bất thường của gen APC trên bộ mẫu UTCTC.

II.2.2. Khảo sát in silico gen APC

II.2.2.1. Thu thập trình tự gen, xác định cấu trúc gen APC

Chúng tơi thu thập trình tự nucleotide của gen APC, từ ngân hàng gen NCBI. Bên cạnh đó chúng tơi cũng thu thập các cặp mồi đặc hiệu allele methyl hóa và allele khơng methyl hóa trên gen mục tiêu dựa vào các cơng trình nghiên cứu khoa học liên quan.

II.2.2.2. Xác định vị trí đảo CpG, các nhân tố phiên mã

Dựa trên phần mềm trực tuyến chúng tơi xác định được vị trí của đảo CpG và thu được trình tự vùng promoter sau khi biến đổi để tiến hành khảo sát vị trí bắt cặp của hai cặp mồi methyl hóa và khơng methyl hóa.

Dựa vào phần mềm trực tuyến chúng tơi xác định vị trí các nhân tố phiên mã trên trình tự đảo CpG thuộc vùng promoter gen APC.

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 19

II.2.2.3. Đánh giá thông số vật lý các cặp mồi methyl hóa và khơng methyl hóa

Dựa trên cơng cụ trực tuyến Oligoanalyzer 3.1 ( chúng tôi xác định các thông số của mồi như: chiều dài, %GC, nhiệt độ nóng chảy, cấu trúc thứ cấp (self dimer, hetero dimer, hairpin-loop).

II.2.3. Xử lý số liệu

Chúng tôi sử dụng phần mềm Excel, MedCalc (version 16.4.3) nhằm tổng hợp số liệu, phân tích tần số methyl hóa vượt mức trên gen APC liên quan đến một số bệnh ung thư, tập trung trên bệnh ung thư cổ tử cung và tính chất nhiễm HPV trong nội dung khai thác dữ liệu và phân tích kết quả thực nghiệm. Đồng thời, chúng tơi khảo sát dữ liệu về các phương pháp sinh học phân tử và các loại mẫu bệnh phẩm sử dụng trong những nghiên cứu thực nghiệm thuộc cùng hướng nghiên cứu. Số liệu thống kê theo kiểm định Chi bình phương (p<0,05).

II.2.4. Khảo sát thực nghiệm II.2.4.1. Tách chiết DNA

❖ Nguyên tắc

Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA bộ gen người từ các mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào. Trong đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh (SDS) kết hợp sử dụng enzym proteinase K. Sau đó, biến tính và loại bỏ protein bằng phenol/chloroform. DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol tuyệt đối, trữ lạnh.

❖ Hóa chất

− Phenol

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 20 − Chloroform

− SDS 10% − NaCl 5M

− Proteinase K (nồng độ=20 ng/ml) − EDTA 0,5M (pH=8)

− Tris HCl 1M (pH=8)

− Ammonium acetate (NH4CH3CO2) 5M − Ethanol tuyệt đối

− Bể ổn nhiệt (Thermo Final Test)

❖ Các bước tiến hành tách chiết DNA từ các mẫu Pap’smear

− Cho mẫu bệnh phẩm chuyển vào ống eppendorf loại 1,5 ml

− Bổ sung một thể tích phù hợp hỗn hợp dung dịch ly giải (NaCl 5M, Tris-HCl 1M (pH=8), dung dịch đệm EDTA 0,5M (pH=8), SDS 10%, và H2O cất hai lần). Bổ sung proteinase K (nồng độ 20 ng/ml).

− Trộn đều hỗn hợp ủ 480C trong 2h, thỉnh thoảng lắc nhẹ.

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 21 − Bổ sung một thể tích phù hợp của dung dịch phenol/chloroform (tỷ lệ 1:1), trộn đều. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút. Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới.

− Thêm một lượng dung dịch chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được, trộn nhẹ. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới (thể tích V1).

− Bổ sung một lượng Ammonium acetate (NH4CH3CO2) 5M và một lượng Ethanol tuyệt đối theo tỷ lệ 0,2: 2,5 thể tích so với thể tích V1.

− Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút, 40C. Loại bỏ phần dịch nổi, thu tủa. − Bổ sung 500 µl Ethanol 70%. Ly tâm 13.000 vịng/phút trong 5 phút, 40

C. − Loại bỏ dịch nổi, thu tủa. Để khơ trong 30 phút.

− Hịa tan DNA trong 30-50 µl nước cất hai lần vơ trùng. Bảo quản DNA ở 40

C đến -200

: C (ng/µg) = OD260nm x 50 x d

Chú thích: d: độ pha loãng.

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 22

II.2.4.3. Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite bằng bộ kit EZ DNA Methylation-Gold

❖ Nguyên tắc

Các mẫu DNA bộ gen được xử lý với hỗn hợp biến đổi sodium bisulfite để chuyển cytosine thành uracil (ngoại trừ các 5mC) sẽ được cố định trên màng của cột, sau đó rửa sạch muối và DNA được thu hồi lại.

❖ Hóa chất

− CT conversion reagenet ( EZ1) − M-Dilution buffer (EZ2) − M-Dissolving buffer (EZ3) − M-Binding buffer (EZ4) − M-Wash buffer (EZ5)

− M-Desulphonation buffer (EZ6) − M-Elution buffer (EZ7)

❖ Các bước tiến hành

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 23 − Chuẩn bị chất biến đổi EZ1: trộn đều 900 µl dung dịch nước cất 2 lần và 300 µl dung dịch EZ2, 50 µl dung dịch EZ3 vào ống CT Conversion Reagenet, trộn đều trong 10 phút.

− Bổ sung 130 µl dung dịch CT Conversion Reagenet (EZ1) và 20 µl dung dịch DNA đã hút vào eppendorf 250 µl, trộn đều. Sau đó, đưa vào chu trình luân nhiệt.

− Xử lý dung dịch DNA theo chu trình luân nhiệt:

− Bổ sung 600 µl EZ4 vào cột Zymo-spinTMIC (C1), sau đó thêm dung dịch DNA (đã được xử lý bằng chu trình nhiệt) vào cột C1, đảo đều. Sau đó, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch sau ly tâm, giữ lại cột C1.

− Bổ sung 100 µl EZ5 vào cột C1, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng. Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm.

− Bổ sung 200 µl EZ6 vào cột C1, để nhiệt độ phòng 15-20 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây. Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm.

− Bổ sung 200 µl EZ5 vào cột C1, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng, lặp lại bước này 1 lần.

Hình 2.1. Chu trình luân nhiệt biến đổi bisulfite

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 24 − Đặt cột C1 vào Eppendorf 1,5 ml, thêm 10 µl EZ7, ly tâm 13.000 vòng/phút

trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng.

− Thu dung dịch DNA đã được biến đổi bisulfite, bảo quản ở -200

II.2.4.4. Phản ứng MSP, Nested-MSP

Sau khi thực hiện quá trình biến đổi DNA bằng sodium bisulfite, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng MSP, Nested-MSP trên DNA bộ gen của các mẫu bệnh phẩm có tính chất nhiễm/hoặc khơng nhiễm HPV với cặp mồi đặc hiệu allele methyl hóa (MF, MR) và cặp mồi đặc hiệu allele khơng methyl hóa (UF, UR) trên vùng promoter gen

APC.

❖ Hóa chất

− Dung dịch Master mix 2X (Bioline)

− Cặp mồi methyl và unmethyl trên gen APC (hãng IDT)

− Nước cất hai lần

❖ Thiết bị

− Máy luân nhiệt (Thermo cycler, hãng BioRad)

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 25

II.2.4.5. Phương pháp điện di

❖ Nguyên tắc

Các phân tử nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường các phân tử DNA sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng MSP, Nested-MSP Thành phần Thể tích (µl)

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 26 khối lượng và cấu trúc, sự tích điện của phân tử nucleic acid. Kết quả điện di được xác định dựa vào sự phát sáng của ethidium bromide dưới tia tử ngoại (UV) ở bước sóng λ=300 nm. Ethidium bromide có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid. Kích thước của các phân tử nucleic acid sẽ được xác định khi so sánh với kích thước đã biết trước của thang chuẩn (thang phân tử).

❖ Thiết bị, hóa chất

− Buồng điện di

− 50X TAE Buffer Bio Rad − Ethidium bromide Bio Rad − Thang chuẩn 50bp Bioline

❖ Các bước tiến hành

Hòa trộn 5-10 µl DNA với 1-2 µl dung dịch nạp mẫu (6X) và nạp vào các giếng trên bản gel agarose 1,5%. Quá trình điện di được thực hiện ở hiệu điện thế 70 Volt trong 30 phút. Sau đó, bản gel được nhuộm với dung dịch ethidium bromide và được đọc trên bàn đèn UV của thiết bị Gel Doc (Bio Rad).

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 27

PHẦN III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

III.1. Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico gen APC

III.1.1. Kết quả khai thác dữ liệu

III.1.1.1. Bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa gen APC trong các loại ung thư

Nhằm tìm hiểu tính chất methyl hóa trên đảo CpG trên gen APC liên quan đến bệnh ung thư, chủ yếu trên bệnh ung thư cổ tử cung, chúng tôi thu thập dữ liệu trên NCBI với các từ khóa: “ APC gene”, “cervical cancer”, “methylation of APC gene”…. Chúng tôi thu thập được 36 bài báo khoa học bằng tiếng Anh có liên quan đến gen APC (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Các cơng trình nghiên cứu về gen APC

bài báo Tài liệu tham khảo

1 Tổng quan gen APC 9 [2] [7] [34] [48] [60] [71] [53] [58] [81]

Nghiên cứu thực nghiệm về tính chất

methyl hóa trên gen APC

[51] [25] [88] [89] [67] [66] [87] [93] [42] [31] [44] [49] [59] [69] [11] [27] [26] [30] [33] [64] [86] [87] [91] [4] [50]

[16] [10]

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 28 Chúng tôi thu thập được 9 bài báo khoa học đề cập đến chức năng gen APC trong chu trình tế bào và q trình hình thành, diễn tiến ung thư. Các cơng bố khoa học này được xuất bản từ năm 1998 đến năm 2009.

Song song, chúng tơi tìm hiểu về tần số methyl hóa gen APC trong ung thư cổ tử cung và các ung thư khác và các phương pháp sinh học phân tử, loại mẫu được sử dụng trong 27 công trình nghiên cứu thực nghiệm khảo sát tần suất methyl hóa ở đảo CpG trên vùng promoter của gen APC (số liệu cập nhật đến tháng 3 năm 2016).

Tuy nhiên, mặt hạn chế của chúng tôi là chưa thu thập được nhiều công bố khoa học

xác định tần số methyl gen APC trong bộ mẫu nhiễm HPV hoặc không nhiễm HPV. Bộ

dữ liệu về tần số methyl hóa gen APC trong ung thư cổ tử cung và các ung thư khác. Dựa trên các cơng trình nghiên cứu từ năm 2000 đến năm 2016, chúng tơi ghi nhận tính chất methyl hóa của gen APC trong UTCTC và một số loại ung thư khác (ung thư vú, bàng quang, đại trực tràng, phổi, dạ dày và ung thư buồng trứng), kết quả được trình bày ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Tần số methyl hóa gen APC trong các loại ung thư

Loại ung thư Tần suất methyl hóa % (n)

Tần số methyl hóa trung bình

54,1(98) 22,8(92)

40,4 [51] [25] [88] [89] [67] [66] 32,1(53) 17,9(28)

56,7(60) 50(39)

Ung thư vú 44,2(77) 39,5(76) 31,7 [87] [93] [42]

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 29 15,1(93)

Ung thư đại trực tràng

75(12) 61,3(199)

47,3 [31] [44] [49] [59] [69] 35,6(45) 29,5(61)

35,2(125) Ung thư

[91] 24,1(58) 65(40)

95(91) 52,8(106) 56,7(78) 65(40)

Ung thư dạ dày 82,2(73) 77,5(80) 79,7 [4] [50]

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 30

Chú thích: BC (Breast cancer): ung thư vú, BDC (Bladder cancer) : ung thư bàng quang, CC (Cervical cancer): UTCTC, COLC (Colorectal cancer): ung thư đại trực tràng, GC (Gastric cancer): ung thư dạ dày, LC (Lung cancer): ung thư phổi, OVC (Ovarian cancer): ung thư buồng trứng.

Hình 3.1. Đồ thị mơ tả tần số methyl hóa trung bình trọng số (%) trên vùng promoter gen APC trong các loại ung thư

</div>