khảo sát một số hoạt tính sinh học từ vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo solanum procumbens lour

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.7 MB, 84 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

--- ∞0∞---

DƯƠNG NGỌC LINH

KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO

(Solanum procumbens Lour)

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞---

Giảng viên hướng dẫn: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : Dương Ngọc Linh

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Y-Dược Mã học viên: 1853010074 Tôi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho

Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

Dương Ngọc Linh Ngày sinh: 29/02/2000 Nơi sinh: Kiên Giang

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

Học viên thực hiện: DƯƠNG NGỌC LINH Lớp:DH18YD01

Ngày sinh: 29-02-2000 Nơi sinh: Kiên Giang

Tên đề tài: “KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VI KHUẨN NỘI SINH

CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens Lour)”

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên: ...

được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng: ...

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô và Ban giám hiệu khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã dạy em những kiến thức chuyên ngành nền tảng và bài học làm người trong cuộc sống, đã hỗ trợ trang thiết bị tạo điều kiện cho em để có thể hồn thiện đề tài.

Em xin gửi đến cô Dương Nhật Linh, thầy Nguyễn Văn Minh lòng biết ơn sâu sắc vì đã hỗ trợ em trong việc lựa chọn đề tài, đã tận tình chia sẻ kiến thức chuyên

ngành và cả những bài học trong cuộc sống. Trong quá trình học việc tại phịng thí nghiệm Vi sinh, thầy cô đã truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, tiếp thêm động lực để em hoàn thành tốt đề tài.

Em cảm ơn cô Nguyễn Tiến Linh và chị Trần Thị Á Ni đã đồng hành, hỗ trợ và chỉ dẫn nhiệt tình để em hồn thiện bài báo cáo. Em cảm ơn anh Nguyễn Hoàng

Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài một cách an tồn trong tình

hình dịch bệnh hiện nay. Cảm ơn, chị Nguyễn Thị Thanh Nguyệt, bạn Phan Thị

Mỹ Long đã bên cạnh, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn trong phịng thí nghiệm Vi Sinh và Tế bào trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã ln hỗ trợ em.

Con xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Ba mẹ đã sinh ra con, đã dạy cho

con nhiều điều hay, lẽ phải và gia đình ln là chỗ dựa vững chắc giúp con lấy lại động lực mỗi khi thất bại hay vấp ngã, luôn tạo điều kiện tốt nhất để con hồn thành mong muốn và cơng việc của mình.

Cuối cùng, em xin kính chúc tất cả quý thầy cô, các anh chị, bạn bè các em và gia đình nhiều sức khỏe, bình an và thành công trong cuộc sống.

Em xin chân thành cảm ơn!

Bình Dương, ngày 29 tháng 09 năm 2022

Dương Ngọc Linh

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 14

1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens Lour)…...15

1.1 Phân loại khoa học ... 15

1.2 Đặc điểm hình thái ... 15

1.3 Phân bố, thu hái và chế biến ... 16

1.4 Thành phần hóa học ... 16

1.5 Tác dụng dược lý ... 19

2. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN NỘI SINH...19

2.1 Vi khuẩn nội sinh ... 19

2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước ... 20

3. TỔNG QUAN VỀ CÁC VI KHUẨN GÂY BỆNH THÔNG THƯỜNG...23

3.1 Vi khuẩn Escherichia coli ... 23

3.2 Pseudomonas aeruginosa ... 24

3.3 Salmonella typhi ... 25

3.4 Staphylococcus aureus ... 25

3.5 Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ... 26

4. TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI NẤM GÂY BỆNH…...27

4.1 Trichophyton rubrum ... 27

4.2 Microsporum canis... 27

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 29

1. VẬT LIỆU...30

1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ... 30

1.2 Đối tượng nghiên cứu ... 30

1.3 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất và mơi trường ... 30

3.2.3Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn nội sinh .... 36

3.3 Định danh chủng vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) có hoạt tính sinh học tiềm năng nhất ... 34

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ... 38

1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ LÀM THUẦN VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)…...39

1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo ... 39

1.2 Kết quả làm thuần và quan sát đại thể, vi thể ... 44

2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)...47

2.1 Kết quả khảo sát khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) ... 47

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

2.1.1Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn nội sinh ... 472.1.2Kết quả khảo sát khả năng kháng vi nấm gây bệnh của các chủng vi khuẩn nội sinh ... 52

2.2 Kết quả khảo sát khả năng tiêu huyết của các chủng vi khuẩn nội sinh cây

cà gai leo (Solanum proumbens L.) ... 56

2.3 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào từ các chủng vi khuẩn

nội sinh (Solanum proumbens L.) ... 58

2.4 Kết quả định danh sinh học phân tử vi khuẩn nội sinh (Solanum

proumbens L.) có hoạt tính sinh học mạnh nhất ... 62

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 661. KẾT LUẬN 67

2. KIẾN NGHỊ ...63 TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 69

Tài liệu tiếng Việt 69Tài liệu tiếng Anh 70Nguồn internet 76

PHỤ LỤC ... 77

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour) ... 12

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của steroidal alkaloid (1) và pregnane steroid (2) (Adam và cs., 1978; Adam, Huong H.T và cs., 1978) ... 16Hình 1.3 Ziganein (1), benzoic acid (2), saliyli acid (3), 4-hydroxybenzaldehyde (4), anillic acid (5) và indole-3-carbaldehyde (6) (Adam và cs., 1978; Adam, Huong H.T và cs., 1978) ... 17Hình 1.4 Solaprocumoside A (1), solaprocumoside B (2) và paniculonin B (3) (Hien và cs., 2018) ... 17Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của 8,3′-neolignan (Nguyen và cs.,2021) ... 18Hình 1.6 Dioscin (1), β-sitosterol (2), daucosterol (3) và 6’-O-acetyl-β-daucosterol (4) (Nguyen và cs., 2021) ... 18

Hình 1.7 Vi thể của E. coli dưới vật kính 100X (wikipedia)...19

Hình 1.11 Vi thể của MRSA dưới vật kính 100X (wikipedia) ...20

Hình 1. 12 Hình vi thể T. rubrum quan sát dưới vật kính 40X (https://

vi.wikipedia.org/wiki/ Trichophyton rubrum) ...20

Hình 1.13 Hình vi thể M. canis quan sát dưới vật kính 40X (https://

vi.wikipedia.org/wiki/ Microsporum canis) ...21

Hình 1.14 Hình vi thể T. mentagrophytes quan sát dưới vật kính 40X (https://

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Hình 3.4 Kết quả quan sát kính vi thể các chủng vi khuẩn nội sinh...43 Hình 3.5 Kết quả làm thuần các chủng vi khuẩn nội sinh...43 Hình 3.6 Kết quả đánh giá khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo...48 Hình 3.7 Kết quả đánh giá khả năng kháng nấm bệnh của vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo...55 Hình 3.8 Kết quả đánh giá khả năng tiêu huyết của vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo...57 Hình 3.9 Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo...60 Hình 3.10. Kết quả BLAST trên NCBI của chủng vi khuẩn nội sinh T3M2...61 Hình 3.11. Kết quả xây dựng cây phát sinh phân tử Neighbor-joining method...62 Hình 3.12. Kết quả xây dựng cây phát sinh phân tử Maximum Parsimony method63 Hình 3.13. Kết quả xây dựng cây phát sinh phân tử Maximum Parsimony method63

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

Bảng 2.1. Quy trình xử lý mẫu ... 29Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo ... 39 Bảng 3.2. Kết quả quan sát đại thể, vi thể vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo...42 Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của 19 chủng vi khuẩn nội sinh từ cây cà gai leo...46 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây cà gai leo...47 Bảng 3.5. Kết quả sàng lọc khả năng kháng nấm gây bệnh của chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây cà gai leo...52 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh của chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây cà gai leo...53 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khả năng tiêu huyết của chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây cà gai leo...52Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào từ chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây cà gai leo...58 Bảng 3.9. Thơng tin kết quả dị tìm mơ hình tiến hóa...61

Sơ đồ 2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ... 28

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

DANH MỤC VIẾT TẮT

Cs: cộng sự

MRSA: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

CDC: Trung tâm Kiểm sốt và phịng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ

S. procumbens: Solanum procumbens

IAA: Indole Acetic Acid

S. aureus: Staphylococcus aureus

NA: Nutrient Agar NB: Nutrient Broth TSA: Tryptone Soya Agar MHA: Mueller Hinton Agar

PBS: Phosphate Bufferd Saline (đệm phosphat) CFU: Colony Forming Units (đơn vị khuẩn lạc) TNHH: Trách nhiệm hữu hạn

NCBI: National Center for Biotechnology Information (

SD: Standard Deviation

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc sử dụng các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật trong điều trị đang thu hút nhiều sự chú ý do tiềm năng hiệu quả và khơng có tác dụng phụ (Subramani và cs., 2017). Được biết đến là một lồi cây có nhiều cơng dụng chữa bệnh, cà gai leo

(Solanum procumbens Lour) thuộc họ cà (Solanaceae) từ xưa dân gian sử dụng rễ và

trái trị mụn nhọt, lở, phong thấp (Hộ và cs., 2003). Trong cây cà gai leo có chứa các hợp chất tự nhiên như alkaloid, triterpenoid, steroid và hợp chất polyphenol; ngồi ra, cịn chứa các hoạt tính sinh học như kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng oxy hóa

và kháng viêm (Nguyen và cs., 2021). Các hợp chất phân lập từ cà gai leo (Solanum

procumbens L.) rất đa dạng trong đó có 6'-O-acetyl-β-daucosterol được cho là có khả

năng ức chế enzyme α-glucosidase hỗ trợ trong điều trị đái tháo đường (Nguyễn Xuân Hải và cs., 2018; Nguyen và cs., 2021). Tuy nhiên, việc thu nhận hợp chất từ dược liệu còn nhiều hạn chế. Việc trồng cây dược liệu cịn có hạn chế về yếu tố thời tiết, sâu bệnh và kỹ thuật canh tác. Trong khi đó vi sinh vật có một số ưu điểm so với thực vật và động vật, chúng dễ dàng nuôi cấy và duy trì; có thể được sản xuất trong các quy trình lên men quy mô lớn và trở thành một nguồn thay thế cung cấp các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học quan trọng (Anjum và cs., 2019).

Vi sinh vật nội sinh là cộng đồng sinh vật sống trong các mô tế bào thực vật không gây hại tế bào mà còn thúc đẩy sự phát triển, cung cấp nguồn dinh dưỡng và bảo vệ cây ký chủ khỏi các tác nhân sinh học (Pandey và cs., 2016). ). Thành phần loài của quần thể nội sinh phụ thuộc vào kiểu gen, điều kiện môi trường, loại đất và giai đoạn sinh trưởng của cây ký chủ (Bonito và cs., 2014). Một số hợp chất chuyến hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học được sản xuất từ vi sinh vật nội sinh, có triển vọng lớn trong dược phẩm và các ngành công nghiệp khác (Falade và cs., 2021).Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu tập trung vào nấm và rất ít nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh (Nxumalo và cs., 2020).Vi khuẩn nội sinh được đặc trưng bởi khả năng sản xuất được nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp, các tiềm năng như kháng nấm, kháng oxy hóa, kháng ung thư và các tiềm năng mới nổi như kháng sinh, kháng vi khuẩn kháng thuốc (Passari và cs., 2017; Singh và cs., 2018). Theo nghiên cứu của Singh và cộng sự

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

(2020), một dòng vi khuẩn nội sinh mới từ cây Datura metesl tạo ra các chất chuyển

hóa thứ cấp kháng những chủng vi khuẩn kháng thuốc như Methicillin-resistant

Staphylococcus aureus (MRSA) (Singh và cs., 2020). Ntabo và cộng sự (2018), đã

phân lập vi khuẩn nội sinh từ thực vật rừng ngập mặn Kenya và cho thấy chúng tạo ra protease, pectinase, cellulase, amylase và chitinase có giá trị cơng nghiệp (Ntabo và cs., 2018). Vi khuẩn nội sinh được nghiên cứu là có nhiều ứng dụng trong nơng nghiệp, y học và các ngành công nghiệp khác : cải thiện sự phát triển của cây trồng, thúc đẩy khả năng chống lại căng thẳng sinh học và phi sinh học, sản xuất các hợp chất chuyển hóa có tiềm năng y học (Wu và cs., 2021). Theo nghiên cứu của Liu và

cộng sự (2014), trong số 34 vi khuẩn nội sinh được phân lập từ lá, rễ và củ của P.

ternata, 5 chủng có khả năng tạo ra purine alkaloids giống như cây ký chủ, 2 chủng

trong số đó có khả năng thúc đẩy sự phát triển của P. ternata (Liu và cs., 2015). Một nghiên cứu khác của Zhou và cộng sự (2016), về Atractylodes lancea một cây thuốc

cổ truyền là thành phần chính của nhiều loại thuốc nổi tiếng cho thấy vi khuẩn nội

sinh đã làm tăng hàm lượng sesquiterpenoid oxy trong cây A. lancea (Zhou và cs., 2016). Sự đa dạng của vi khuẩn nội sinh, khả năng sản xuất các hợp chất chuyển hóa

thứ cấp và sự thích nghi với các điều kiện căng thẳng đã khiến vi khuẩn nội sinh trở thành một nguồn thích hợp và khơng giới hạn trong việc tạo ra các hợp chất thứ cấp mới, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, sản xuất thực phẩm và thuốc kháng sinh (Ek-

Ramos và cs., 2019). Qua đó, vi khuẩn nội sinh được coi là một nguồn tài nguyên

tiềm năng đối với các nhà nghiên cứu về vi sinh vật nhất là ở thời điểm hiện tại. Đặc biệt, hiện nay chưa có cơng trình nào cơng bố về vi khuẩn nội sinh cây cà

gai leo (Solanum procumbens Lour) ở trong nước cũng như ngoài nước. Việc xác

định các hoạt tính sinh học có trong lồi cây này vẫn chưa có nhiều nghiên cứu và chuyên sâu. Vì vậy, dựa vào những tiềm năng của các chủng vi khuẩn nội sinh thuộc họ cà (Solanaceae) cũng như hoạt tính sinh học của cây cà gai leo tôi tiến hành thực

hiện đề tài: “KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VI KHUẨN

NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens Lour)”.

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Mục tiêu tổng quát:

Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum

procumbens Lour).

Mục tiêu cụ thể:

- Phân lập chủng vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour).

- Khảo sát một số hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo (hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và khả năng sinh enzym ngoại bào) - Định danh chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học tiềm năng.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens Lour).

1.1

Phân loại khoa học

Giới: Plantae

Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Solanales

Họ: Solanaceae

Chi: Solanum

Loài: Solanum procumbens Lour

Tên khoa học: Solanum procumbens Lour, Solanum hainanensen Hance

Tên thường gọi: Cà gai leo, cà gai dây, cà quýnh, ....

1.2

Đặc điểm hình thái

Cà gai leo là cây thân leo gỗ, sống nhiều năm, dài khoảng 1 m hoặc hơn. Cà gai leo phân cành nhiều, cành lá tỏa rộng, thân phủ rất nhiều lông che chở và gai cong màu vàng, nhọn. Thân non có màu xanh, thân già màu nâu xám. Các lá đơn, mọc cách, hình bầu dục, gốc lệch; phiến lá có thùy nơng khơng đều, dài 3-6 cm, rộng 2-5,5 cm, mặt trên xanh sẫm, mặt dưới nhạt, hai mặt đều phủ dầy lông che chở màu trắng và có gai ở gân lá, cuống lá dài 0,5-1 cm, có gai dài 4-5 mm. Bộ rễ cọc, điển hình của cây hai lá mầm; rễ non có màu trắng với lớp lơng hút phủ kín bề mặt, khi già chuyển nâu. Cà gai leo có hoa màu trắng tím, mọc thành cụm chùm từ 2-11 hoa mọc ở ngồi kẽ lá, có 4 đài màu xanh, phủ đầy lơng che chở; 4 thùy hình trái xoan nhọn; 4 nhị màu vàng. Quả có dạng mọng, hình cầu, nhẵn, khi non màu xanh lá cây nhạt đến đậm, khi chín có màu đỏ tươi, đường kính 5-7 mm; cuống dài 1-1,5 cm, phủ đầy lơng che chở, phình to ở phần sát quả. Hạt cà gai leo hình thận, màu vàng, kích thước 2-3 mm, mỗi quả có từ 15-30 hạt (Phùng Thị Thu Hà và cs., 2017).

Hình 1.1. Cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour)

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

1.3

Phân bố, thu hái và chế biến

Cà gai leo thường phân bố ở một vài nước nhiệt đới Châu Á như Trung Quốc, Lào, Campuchia và Việt Nam. Tại nước ta, cây cà gai leo mọc ở nơi nhiều ánh sáng, lẫn trong các lùm bụi thưa, bãi hoang từ vùng núi thấp đến trung du và đồng bằng ven biển, chủ yếu ở Thanh Hóa, Quảng Ngãi, Bình Định,.... Có thể được nhân giống bằng hạt, giâm cành, cà gai leo có khả năng tái sinh từ các đoạn thân, cành và gốc sau khi bị chặt. Thu hoạch rễ và cành lá quanh năm, rửa sạch, thái nhỏ, dùng tươi hay phơi khô, sấy khơ.

1.4

Thành phần hóa học

Các báo cáo hóa thực vật S. procumbens cho thấy sự hiện diện của hợp chất

chính solasodine là một steroidal alkaloid và pregnane steroid (Adam và cs., 1978; Adam, Huong H.T và cs., 1978).

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của steroidal alkaloid (1) và pregnane steroid (2) (Adam và cs., 1978; Adam,

Huong H.T và cs., 1978).

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Năm 2018, Nguyễn Xuân Hải và cộng sự đã công bố 6 hợp chất là ziganein, benzoic acid, saliyli acid, 4-hydroxybenzaldehyde, vanillic acid và indole-3-carbaldehyde (Nguyễn Xuân Hải và cs., 2018).

Trong năm 2018, hai saponin steroid mới (solaprocumoside A, B) và một hợp chất được biết là paniculonin B được Trương Thị Thu Hiền cùng cộng sự của mình

phân lập từ các bộ phận trên không của S. procumbens (Hien và cs., 2018).

Hợp chất 8,3′-neolignan mới có tên là solacanin A được phân lập thành công năm 2021 bởi Nguyễn Trung Nhân và cộng sự (Nguyen và cs.,2021)

Hình 1.3. Ziganein (1), benzoic acid (2), saliyli acid (3), 4-hydroxybenzaldehyde (4), anillic

acid (5) và indole-3-carbaldehyde (6) (Nguyễn Xuân Hải và cs., 2018)

Hình 1.4. Solaprocumoside A (1), solaprocumoside B (2) và paniculonin B (3) (Hien và cs., 2018)

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của 8,3′-neolignan (Nguyen và cs.,2021)

Theo nghiên cứu năm 2021 về thành phần hóa học của S. procumbens, 4 hợp

chất được xác định là dioscin (1), β-sitosterol (2), daucosterol (3) và daucosterol (4), trong đó hợp chất 1, 3 và 4 lần đầu tiên được phân lập từ cây cà gai leo (Nguyen và cs., 2021).

6’-O-acetyl-β-Những nghiên cứu về cà gai leo (Solanum procumbens Lour) đa phần tập trung

vào thành phần hóa học và các hợp chất thứ cấp có trong cây, chủ yếu là steroid alkaoid, saponoside, flavonoside và tinh bột.

Hình 1.6. Dioscin (1), β-sitosterol (2), daucosterol (3) và 6’-O-acetyl-β-daucosterol (4)

(Nguyen và cs., 2021)

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

1.5 Tác dụng dược lý

Các báo cáo chứng minh cơng dụng của S. procumbens có từ rất sớm. Kết quả

khảo sát sơ bộ của Nguyễn Bích Thu và cộng sự (2000), cho thấy dịch chiết glycoalkaloid tồn phần có hoạt tính chống oxy hóa mạnh (Nguyễn Bích Thu và cs., 2000).

Nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cà gai leo trên mơ hình gây tổn thương gan bằng paracetamol ở chuột trắng của Trương Thị Thu Hiền và cộng sự (2018), cho thấy cao chiết methanol của cà gai leo có tác dụng giảm tổn thương gan (Trương Thị Thu Hiền và cs., 2018).

Gần đây, Kumar và cộng sự công bố một hợp chất chính trong cà gai leo là solasodine, một loại steroid alkaloid có khả năng kháng khuẩn, chống ung thư, gây độc tế bào, bảo vệ gan, ... (Kumar và cs., 2019).

Ngồi ra, S. procumbens cịn là một cây thuốc quý trong y học cổ truyền có tác

dụng trừ phong thấp, trừ ho, cầm máu, giảm đau.

2. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN NỘI SINH

2.1

Vi khuẩn nội sinh

Thuật ngữ “endophyte” được mô tả lần đầu tiên vào năm 1809 bởi nhà thực vật học người Đức Heinrick Friedrich Link như là một nhóm riêng biệt của các loại nấm ký sinh một phần sống trong thực vật (Link, 1809).

Năm 1866, Bary là người đầu tiên phân biệt giữa vi sinh vật nội sinh và mầm bệnh thực vật (Bary, 1866). Qua nhiều định nghĩa phát triển, năm 1997 một định nghĩa phổ biến về vi sinh vật nội sinh là những vi khuẩn có thể được phân lập từ mô thực vật đã được khử trùng bề mặt hoặc chiết xuất từ bên trong cây và không gây hại cho cây trồng được Hallmann và cộng sự mô tả từ thực tế (Hallmann và cs., 1997).

Đến năm 1998, Azevedo đã định nghĩa vi sinh vật nội sinh chủ yếu là nấm và vi khuẩn sống bên trong các bộ phận của thực vật như lá, thân, rễ và thường không gây hại cho cây ký chủ, đây là định nghĩa đầy đủ nhất về endophyte và được sử dụng đến hiện tại (Azevedo, 1998). Sau đó thuật ngữ này được Dutta và cộng sự mở rộng (2014), bao gồm vi nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn chi tồn bộ hoặc một phần vịng đời

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

của chúng cư trú bên trong hoặc ngoài tế bào ở các mô khỏe mạnh của thực vật, thường không gây hại cho cây chủ (Dutta và cs., 2014).

Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào mô qua rễ nảy mầm, rễ phụ, khí khổng hoặc từ những vị trí tổn thương. Được tìm thấy trong tồn bộ cây ký chủ và giảm dần từ rễ, thân, lá (Anjum và cs., 2015).

Vi khuẩn nội sinh là nguồn thay thế các hợp chất có hoạt tính sinh học và chế phẩm sinh học do sự kháng thuốc ngày càng tăng của vi khuẩn gây bệnh đối với các loại kháng sinh hiện có (Strobel và cs., 2003).

Theo Rosenblueth và cộng sự (2006), vi khuẩn nội sinh thúc đẩy sự phát triển và năng suất của cây trồng, ngăn chặn mầm bệnh, có thể giúp loại bỏ các chất gây ơ nhiễm, hịa tan phosphat, cố định nitơ cho cây trồng (Rosenblueth và cs., 2006).

Chiết xuất thô của vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây dược liệu được cơng nhận là nguồn có giá trị của các hợp chất hoạt tính sinh học mới với các hoạt động khác nhau như kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa, ứng dụng trong y học, nơng nghiệp và các ngành công nghiệp khác (Makuwa và cs., 2021).

Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu tốt để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học do chúng dễ phân lập, dễ phát triển và khơng có tác động tiêu cực đến môi trường và năng suất nơng nghiệp (Pham cs., 2019).

2.2

Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước

Vi khuẩn nội sinh cây dược liệu là đề tài nghiên cứu đầy triển vọng trong việc phát hiện ra các chất chuyển hóa mới, nghiên cứu về các cây họ Solanaceae đang được quan tâm trong những năm gần đây.

Năm 2012, phân lập thành công chủng vi khuẩn Streptomyces spp. nội sinh cây

Datura stramonium L. có khả năng sản xuất enzyme như amylase, lipase và

catalase;chất chuyển hóa được sản xuất từ Streptomyces spp. cho kết quả kháng lại

nấm và khuẩn gây bệnh (VS và cs., 2012).

Năm 2015, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis (BMP01) phân lậptừ lá Solanum

trilobatum L. đã cho thấy khả năng sản xuất bacteriocins là các peptide kháng khuẩn

(Bhuvaneswari và cs., 2015).

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Năm 2017, Syed và cộng sự phân lập 3 vi khuẩn nội sinh rễ cây Capsicum annum kháng lại các chủng vi khuẩn gây bệnh cho người (Syed và cs., 2017).

Nghiên cứu đầu tiên về Solanum mauritianum ở Nam Phi của Uche và cộng sự

(2019), cho thấy các chất chiết xuất thô của 3 chủng vi khuẩn nội sinh thuộc chi Pantoea phân lập từ thân cây có hoạt động kháng lại các vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở người (Uche và cs., 2019).

Nghiên cứu mới nhất của Christian và cộng sự (năm 2022), có tổng cộng 41

chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Solanum torvum Sw, chiết xuất của vi khuẩn nội

sinh cho thấy hoạt tính kháng khuẩn và gây độc tế bào (Christian và cs., 2022). Ngoài ra, vi khuẩn nội sinh có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y học là đề tài cũng được các nhà nghiên cứu sinh vật học quan.

Năm 2017, Song và cộng sự của mình đã phân lập thành công Bacillus

altitudinis (KX230132.1) nội sinh rễ cây Panax ginseng có khả năng tích lũy và kích

thích tăng lượng ginsenoside, một chất chuyển hóa thứ cấp chính trong cây nhân sâm

(Song và cs., 2017). Năm 2021, dòng vi khuẩn nội sinh Bacillus halotolerans Hil4 được Thomloudi và cộng sự phân lập từ cây thuốc Hypericum hircinum có hoạt tính kháng nấm Botrytis cinerea gây bệnh trên cây nho, cà chua bi và rất nhiều đặc điểm thúc đẩy tăng trưởng thực vật trong ống nghiệm, cho thấy B. Haltolerans Hil4 là một

tác nhân kiểm soát sinh học và thúc đầy tăng trưởng thực vật mới đầy hứa hẹn trong tương lai (Thomloudi và cs., 2021).

Một nghiên cứu năm 2020, của Shahzad và cộng sự đã công bố một vi khuẩn

nội sinh mới, Bacillus amyloliquefaciens RWL-1 có khả năng làm tăng hàm lượng

các chất chống oxy hóa như phenolic và aglycone isoflavone trong q trình lên men đậu tương, có thể được sử dụng trong ngành công nghiệp thuốc và thực phẩm. Ngoài ra, khả năng kháng nấm, khả năng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau

và hợp mới của B. Amyloliquefaciens RWL-1 cũng đã được tác giả công bố (Shehzad

và cs., 2020).

Tại Việt Nam, đã có nhiều cơng trình nghiên cứu trên các hoạt tính của những hợp chất từ cây dược liệu tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu về đặc tính của vi khuẩn nội sinh được phân lập từ cây dược liệu. Năm 2015, Trần Trọng Hiếu đã phân lập được

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

44 chủng vi khuẩn nội sinh cây trinh nữ tại tỉnh Trà Vinh có đặc tính cố định đạm, tổng hợp IAA và hịa tan lân khó tan, kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn cho thấy có

16 chủng kháng Aeromonas hydrophila, 12 chủng kháng với Escherichia coli, 7 chủng kháng Staphylococcus aureus, 8 chủng có tính kháng với cả Aeromonas

hydrophila và Escherichia coli, 4 chủng kháng Aeromonas hydrophila và Staphylococcus aureus, 1 chủng có tính kháng với cả 3 loài vi khuẩn Aeromonas hydrophila, Escherichia coli và Staphylococcus aureus (Trần Trọng Hiến, 2015).

Năm 2018, 45 chủng vi khuẩn nội sinh từ sâm ngọc linh được phân lập bởi Nguyễn Thị Tâm và cộng sự, trong đó có 27 chủng có khả năng sinh tổng hợp β-glucosidase, một enzyme có khả năng phân cắt các gốc glycoside liên kết với aglycone của ginsenoside Rb1 (Nguyễn Thị Tâm và cs., 2018).

Năm 2019, Nguyễn Hồng Ái Vy đã phân lập được 35 dòng vi khuẩn nội sinh

cây trùm ngây (Moringa oleifera) tại tỉnh Đồng Tháp trong, 9 dịng có khả năng kháng

Escherichia coli, 13 dịng có khả năng kháng Aeromonas hydrophila và 9 dịng có

khả năng kháng Staphylococcus aureus (Nguyễn Hồng Ái Vy, 2019).

Trong những năm gần đây, các công bố trên thế giới đã cho thấy tiềm năng mới của vi khuẩn nội sinh, việc nghiên cứu tại nước ta còn nhiều hạn chế khi chưa có nhiều báo cáo về vi khuẩn nội sinh cây dược liệu, đặc biệt là vi khuẩn nội sinh cây cà

gai leo (Solanum procumbens Lour).

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

3. TỔNG QUAN VỀ CÁC VI KHUẨN GÂY BỆNH THÔNG THƯỜNG

3.1 Vi khuẩn Escherichia coli

Loài:

Escherichia coli

E. coli là trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình 2-3 µm x 0,5 µm; trong

những điều kiện khơng thích hợp (trong mơi trường có kháng sinh), vi khuẩn có thể

dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E. coli có vỏ, nhưng hầu hết có lơng và có khả năng di

động.

E. coli phát triển dễ dàng trên các mơi trường ni cấy thơng thường, hiếu khí

tùy nghi, nhiệt độ từ 5-40oC. Trong điều kiện thích hợp E. coli phát triển rất nhanh,

thời gian thế hệ chỉ khoảng 20-30 phút.

E. coli là vi khuẩn thường trú đường tiêu hóa ở người, có thể được tìm thấy ở

đường hô hấp trên hay đường sinh dục. E. coli đứng đầu trong các vi khuẩn gây bệnh

tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết.

E. coli có khả năng gây bệnh khi xâm nhập vào những vị trí trong cơ thể mà bình

thường chúng khơng hiện diện (Nguyễn Thanh Bảo, 2008).

Hình 1.7. Vi thể của E. coli dưới vật kính 100X

(wikipedia)

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Lồi:

Pseudomonas aeruginosa

P. aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong nhưng khơng xoắn,

hai đầu trịn, dài 1-5 µm, rộng 0,5-1 µm, ít khi có vỏ có một ít lơng ở một đầu, di động, khơng sinh nha bào, bắt màu Gram âm. Chúng mọc ở biên độ nhiệt rộng (10-44oC), tối ưu ở 35oC. Trong môi trường đặc hiệu, có thể gặp hai loại khuẩn lạc: một loại to, nhẵn, bờ trải dẹt, giữa lồi lên; một loại khác xù xì.

Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện: khi cơ thể suy giảm miễn dịch, bệnh ác tính hay mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc dùng kháng sinh tùy tiện,...Gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da chảy nước ở

các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác mạc,...Ngoài ra, P. aeruginosa là căn

nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương, xương khớp, dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp (Nguyễn Thanh Bảo, 2008).

Hình 1.8. Vi thể của P. aeruginosa dưới vật kính

100X (wikipedia)

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Lồi:

Salmonella typhi

S. typhi là trực khuẩn Gram âm, có lơng xung quanh thân, có khả năng di động,

khơng sinh nha bào. Kích thước khoảng 0,4-0,6 x 2-3 μm. S. typhi là vi khuẩn hiếu

khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thơng thường. Trong mơi trường thích hợp sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước trung bình 2-4 mm.

S. typhi chỉ gây bệnh cho người, chủ yếu gây bệnh thương hàn. Bệnh thương

hàn có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột. Một số biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Nguyễn Thanh Bảo, 2008).

3.4 Staphylococcus aureus

Ngành: Firmicute Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales

Họ: Staphylococcaceae

Chi:

Staphylococcus

Lồi:

Staphylococcus aureus

Hình 1.9. Vi thể của S. typhi dưới vật kính

100X (wikipedia)

Hình 1.10. Vi thể của S. aureus dưới vật kính 100X

(wikipedia)

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

S. aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5-1,5 µm có thể đứng

riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùm nho, đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên da và màng nhầy của người và động vật máu nóng. Trên mơi trường Bair Parker, khuẩn lạc có vịng sáng rộng 2-5 mm.

Nhiễm độc có thể do hoạt tính của một hoặc một vài sản phẩm của S. aureus

(độc tố) mà không cần có sự hiện diện của vi khuẩn. Như hội chứng sốc nhiễm độc,

hội chứng phỏng ngoài da, hội chứng ngộ độc thức ăn. Nhiễm trùng là do S. aureus

xâm nhập vào cơ quan bảo vệ của vật chủ khi bị tổn thương hay giảm chức năng. Như nhiễm trùng da và mô mềm, hệ hô hấp, hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng nội mạch, xương,…(Nguyễn Thanh Bảo, 2008).

3.5 Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA)

Ngành: Firmicute Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales

Họ: Staphylococcaceae

Chi:

Staphylococcus

Loài:

Staphylococcus aureus

MRSA là viết tắt của Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng kháng Methicillin). S. aureus kháng methicillin nghĩa là kháng được tất cả các β-

lactam và có thể kháng được aminoglycosides và macrolides. Hiện nay, các chủng đề kháng methicillin (gọi tắt là MRSA), một kháng sinh được coi là mạnh nhất trong nhóm β-lactam đã phát triển một cách đáng lo ngại, nhất là trong các trường hợp

Hình 1.11. Vi thể của MRSA dưới vật kính 100X

(wikipedia)

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

methicillin trên S. aureus có thể được xem như phát hiện một thông số chỉ điểm được vi khuẩn S. aureus kháng đa kháng sinh (CLSI, 2004). MRSA là các chủng S. aureus

biểu hiện cơ chế kháng qua mecA thông qua cơ chế kháng methicillin khác.

4. TỔNG QUAN VỀ CÁC LỒI NẤM GÂY BỆNH

4.1 Trichophyton rubrum

Hình 1. 12. Hình vi thể T. rubrum quan sát dưới vật kính 40X

(https:// vi.wikipedia.org/wiki/ Trichophyton rubrum)

T. rubrum là một loại nấm sợi sừng hóa, là tác nhân gây bệnh da liễu phổ biến

nhất trên toàn thế giới, chủ yếu ở bàn chân, da và giữa các móng tay của con người.

T. rubrum được biết đến là một trong những loài nấm da liễu nổi bật nhất, một loại

nấm thường gây bệnh ngoài da, xuất hiện với nhiều màu trắng, vàng, nâu và đỏ. Nó cũng có thể được tìm thấy trong các kết cấu khác nhau, có dạng sáp, bơng hoặc mịn.

Nhiễm trùng T. rubrum cực kỳ khó chẩn đốn và khó phân biệt với các loại nấm da

khác (Castellani, 1910)

4.2 Microsporum canis

Hình 1.13. Hình vi thể M. canis quan sát dưới vật kính 40X

(https:// vi.wikipedia.org/wiki/ Microsporum canis)

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Sợi nấm sinh trưởng nhanh, bề mặt khuẩn lạc trắng tới vàng sẫm, mặt sau màu vàng sáng hoặc màu vàng cam. Bào tử đỉnh lớn dạng hình thoi và bào tử trưởng thành giới hạn trong những chỗ phình riêng. Khoảng 6-15 ngăn, kích thước 8-20 µm x 40-

150 µm. M. canis thường gây ra những tổn thương ở bất kì nơi nào trên cơ thể (từ

gan, bàn chân, mũi). Bề mặt bệnh khơng có lơng được bao trùm bởi những vảy xám, trường hợp bệnh nặng da có thể trở nên đỏ, chảy dịch (Gräser và cs., 2000).

4.3 Trichophyton mentagrophytes

Hình 1.14. Hình vi thể T. mentagrophytes quan sát dưới vật kính 40X

(https:// vi.wikipedia.org/wiki/ Trichophyton mentagrophytes)

Có 2 dạng khuẩn lạc: dạng có hạt và dạng có lơng tơ. Dạng hạt mịn hoặc dạng hạt thô, mặt trên màu kem đến màu da bò sáng. Mặt dưới thay đổi từ màu rám da bị đến nâu tối. Dạng có lơng tơ, khuẩn lạc ni cấy lâu ngày có dang kem, mặt dưới biến đổi từ màu trắng sang vàng đến nâu đỏ. Bào tử có hình điếu thuốc, thành mỏng,

có 3-7 ngăn và kích thước 4-8 µm x 20-50 µm. T. mentagrophytes thường gây những

tổn thương ở những vùng môi, mặt và tay, chân. Biểu hiện ban đầu là những nốt sần sùi, mụn nước, mụn mủ, sau đó phát triển thàn vảy cứng màu vàng, trường hợp nặng vết thương đỏ, sưng tấy (Halteh và cs., 2016).

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

1. VẬT LIỆU

1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 09 năm 2022 tại phịng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

1.2 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour) được thu nhận từ các tỉnh Bình

Định, Bình Dương và được giám định tên khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên-Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh.

Các chủng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh được cung cấp bởi phịng thí nghiệm

Cơng nghệ Vi sinh-Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh, gồm các chủng: E.

coli, S. aureus, S. typhi, P. aeruginosa,

Staphylococcus aureus kháng methicillin

(

MRSA), M. canis, T. rubrum.

1.3 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất và mơi trường

⮚ Thiết bị: cân kỹ thuật, nồi hấp, tủ lạnh, tủ mát, tủ cấy, máy ly tâm, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, máy vortex, lị vi sóng,....

⮚ Dụng cụ: ống nghiệm, đèn cồn, đĩa petri, giá ống nghiệm, pipette, micropipette, bơng gịn, bình scotte, erlen, que cấy vịng, đũa khuấy, kéo, kẹp sắt, ….

⮚ Hóa chất: ethanol 70o, ethanol 96o, sodium hypochlorite 5 %, thuốc nhuộm tím kết tinh (crystal violet), thuốc nhuộm lugol, thuốc nhộm safranin O ⮚ Môi trường: NA, NB, TSA, MHA, SDA.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

SVTH: DƯƠNG NGỌC LINH

2. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

Sơ đồ 2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Cây cà gai leo (Solanum

Định danh tên khoa học

Định danh tên khoa học Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ các

chủng vi khuẩn nội sinh cà gao leo Làm thuần trên môi trường

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

3.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương pháp phân lập

thực hiện

Nội dung thực hiện

Thời Gian thực hiện (phút)

Lá Thân Rễ

Rễ, thân, lá của cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) được rửa dưới vòi

nước chảy mạnh trong 5 phút, cắt mẫu thành các đoạn nhỏ 2-4 cm để dễ thao tác.

2 Ngâm mẫu trong ethanol 70 % và lắc nhẹ. 3 7 10

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Thực hiện phân lập theo 3 phương pháp sau:

⮚ Phương pháp 1 đặt mẫu trực tiếp trên môi trường TSA: Mẫu sau khi đã

được xử lý xong, tiến hành đặt mẫu trên môi trường TSA. Các đĩa petri đã đặt mẫu được ủ ở 37oC. Sau 3-5 ngày tiến hành quan sát các khóm khuẩn mọc lên từ vị trí mẫu đặt trên đĩa petri.

⮚ Phương pháp 2 trải dịch chiết cà gai leo trên môi trường TSA: Các bước

thực hiện được tham khảo từ quy trình của Nxumalo và cộng sự (2020) Bước 1: Nghiền nát các mẫu đã được khử trùng trong túi vô trùng và trộn với 1 ml dung dịch đệm phosphat vô trùng (PBS, pH 7,0).

Bước 2: Hút 1 ml dịch chiết trải trên môi trường TSA, ủ ở 37oC trong tối đa 5 ngày, quan sát sự sinh trưởng của khóm vi sinh vật và làm thuần (Nxumalo và cs., 2020).

⮚ Phương pháp 3 trải dịch chiết cà gai leo trên môi trường bổ sung dược

liệu: Thay thế môi trường dinh dưỡng thông thường bằng mơi trường có bổ

sung dịch xay cây cà gai leo

Bước 1: Chuẩn bị môi trường phân lập, cây cà gai leo sau khi thu nhận sẽ được rửa sạch dưới vòi nước mạnh để loại bỏ đất. Sau đó, nghiền mẫu với nước cất bằng máy xay (1:1/v:v), bổ sung 2 % agar và đem hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20

- Quan sát đại thể: bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay nhận xét

về kích thước, hình thái, màu sắc,… của khuẩn lạc vi khuẩn nội sinh.

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

- Quan sát vi thể: quan sát bằng cách nhuộm Gram và quan sát dưới kính

hiển vi vật kính 100 X. Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến làm tiêu bản nhuộm vi khuẩn

Các bước làm tiêu bản nhuộm vi khuẩn:

Bước 1: chuẩn bị vết bơi: dùng que cấy vơ trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa lam kính. Hơ nhanh vết bơi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để cố định tế bào vi khuẩn

Bước 2: đặt lam kính đã phết vi khuẩn và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U. Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1-2 phút, rửa nước, thấm khô.

Bước 3: nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Bước 4: tẩy màu bằng ethanol 96o, khoảng 15-30 giây (cho đến khi vừa thấy giọt cuối trên lam mất màu), rửa nước, thấm khô.

Bước 5: nhuộm bằng dung dịch safranin O trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Bước 6: nhỏ dầu soi và quan sát bằng vật kính 100 X

Kết quả: vi khuẩn Gram dương bắt màu tím crystal violet, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng safranin.

Trả lời tiêu bản nhuộm Gram: hình dáng vi khuẩn, cách sắp xếp các vi khuẩn, cách bắt màu của vi khuẩn.

3.2 Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ các chủng vi khuẩn nội sinh cây

cà gai leo (Solanum procumbens L.)

3.2.1. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh của vi khuẩn nội sinh

⮚ Chuẩn bị dịch ly tâm từ vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo:

Các chủng vi khuẩn nội sinh được nuôi cấy trong môi trường NB, ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Ly tâm dịch ni vi khuẩn 10000 vịng/phút trong 10 phút, thu lấy dịch nổi.

⮚ Chuẩn bị dịch vi sinh vật gây bệnh:

- Chuẩn bị dịch vi khuẩn gây bệnh: Vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas

aeruginosa, Salmonnela typhi, E. coli, MRSA, Staphylococcus aureus được

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

nước muối vô trùng và điều chỉnh dịch khuẩn tương ứng với mật độ vi khuẩn là 108 CFU/ml (0,5 McFarland).

- Chuẩn bị dịch vi nấm gây bệnh: Vi nấm gây bệnh Trichophyton rubrum,

Microsporum canis được cấy trên môi trường SDA ủ 37oC trong 7 ngày, pha lỗng trong nước muối vơ trùng đến mật độ tế bào tương đương 106

CFU/ml.

Dịch vi khuẩn và vi nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút.

⮚ Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh bằng

phương pháp khuếch tán giếng thạch:

- Hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh:

Bước 1: Dùng tăm bông vô trùng trải điều dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị trên mặt thạch MHA

Bước 2: Đục 4 lỗ có đường kính 6 mm trên thạch đã trải dịch khuẩn bằng dụng cụ đục lỗ.

Bước 3: Dùng micropipet hút 70 μl dịch nổi vi khuẩn nội sinh đã chuẩn bị vào 3 giếng, giếng còn lại làm đối chứng ủ ở 37oC, đọc kết quả sau 24 giờ.

Chứng dương: kháng sinh Ofloxacin

Kết quả kháng vi khuẩn gây bệnh là đường kính của vùng ức chế đo bằng mm (Sharma và cs., 2019).

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

3.2.2. Khảo sát khả năng tiêu huyết của vi khuẩn nội sinh

Các chủng vi khuẩn nội sinh được cấy trên môi trường thạch BA bổ sung 10 % máu cừu. Ủ nuôi trong 18-24 giờ ở 37°C.

Sau khi ủ quan sát khả năng tiêu huyết α (vùng xanh xung quanh khuẩn lạc), tán huyết β (vùng sáng xung quanh khuẩn lạc) hoặc tán huyết γ (không có vùng xung quanh khuẩn lạc).

3.2.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn nội sinh

Theo phương pháp của Nxumalo và cộng sự (2020):

Dùng tăm bông vô trùng vệt một khuẩn lạc chấm lên đĩa môi trường NA đã bổ sung cơ chất theo bảng dưới và ủ ở 37oC, đọc kết quả sau 24 giờ (Nxumalo và cs., 2020).

Bổ sung cơ chất vào môi trường NA để đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào theo bảng tóm tắt sau:

Enzyme amylase

Môi trường thử nghiệm bổ sung 1% tinh bột.

Đọc kết quả với thuốc thử lugol’s iodine. Vùng sáng màu đo được là khả năng phân giải tinh bột của vi khuẩn nội sinh.

Enzyme cellulase

Môi trường thử nghiệm bổ sung 1% CMC (carboxy methyl cellulose).

Dùng lugol’s iodine để làm thuốc thử. Vùng sáng màu là vùng phân giải cellulose của vi khuẩn nội sinh.

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

</div>

khảo sát một số hoạt tính sinh học từ vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo solanum procumbens lour

<b>--- ∞0∞--- </b>

<b>DƯƠNG NGỌC LINH </b>

<i><b>KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO </b></i>

<i><b>(Solanum procumbens Lour) </b></i>

<b>KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC </b>

<b>TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 </b>

<b>BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO </b>

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞--- </b>

<b>Giảng viên hướng dẫn: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH </b>

<b>Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN </b>

<b>LỜI CẢM ƠN </b>

DANH MỤC HÌNH ẢNH

<b>DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ </b>

<b>DANH MỤC VIẾT TẮT </b>

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ </b>

<b>PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU </b>

<i><b>1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens Lour). </b></i>

<b>Phân loại khoa học </b>

<b> Đặc điểm hình thái </b>

<b> Phân bố, thu hái và chế biến </b>

<b> Thành phần hóa học </b>

<b>2. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN NỘI SINH </b>

<b>Vi khuẩn nội sinh </b>

<b>Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước </b>

<b>3. TỔNG QUAN VỀ CÁC VI KHUẨN GÂY BỆNH THÔNG THƯỜNG </b>

<i><b>3.1 Vi khuẩn Escherichia coli </b></i>

<i> Escherichia coli</i>

<i>Pseudomonas aeruginosa</i>

<i> Salmonella typhi </i>

<i><b>3.4 Staphylococcus aureus </b></i>

<i>Staphylococcus</i>

<i>Staphylococcus aureus </i>

<i><b>3.5 Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) </b></i>

<i>Staphylococcus</i>

<i>Staphylococcus aureus </i>

<b>4. TỔNG QUAN VỀ CÁC LỒI NẤM GÂY BỆNH </b>

<i><b>4.1 Trichophyton rubrum </b></i>

<i><b>4.2 Microsporum canis </b></i>

<i><b>4.3 Trichophyton mentagrophytes </b></i>

<b>PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU </b>

<b>1. VẬT LIỆU </b>

<b>1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu </b>

<i>Staphylococcus aureus kháng methicillin </i>

(

<b>1.3 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất và mơi trường </b>

<b>2. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM </b>

<b>PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU</b>

<b>3.2 Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ các chủng vi khuẩn nội sinh cây </b>

<i><b>cà gai leo (Solanum procumbens L.) </b></i>

<b>PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU </b>

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về