sàng lọc hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh và một số hoạt tính sinh học khác từ xạ khuẩn nội sinh và cao chiết cây cà gai leo solanum procumbens l

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.8 MB, 89 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

--- ∞0∞---

PHAN THỊ DIỄM TRINH

SÀNG LỌC HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HĨA MẠNH VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

KHÁC TỪ XẠ KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT

CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞---

PHAN THỊ DIỄM TRINH

SÀNG LỌC HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HĨA MẠNH VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

KHÁC TỪ XẠ KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT

CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)

Mã số sinh viên: 1853010207 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH ThS. NGUYỄN VĂN MINH

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

KHOA CNSH

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Phan Thị Diễm Trinh

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Y dược Mã sinh viên: 1853010207

Tơi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Phan Thị Diễm Trinh

Ngày sinh: 14/06/2000 Nơi sinh: Đồng Nai

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Giảng viên hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh, ThS. Nguyễn Văn Minh Học viên thực hiện: Phan Thị Diễm Trinh Lớp: DH18 – YD01 Ngày sinh: 14/06/2000 Nơi sinh: TP. Hồ Chí Minh

Tên đề tài: SÀNG LỌC HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA

MẠNH VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC KHÁC TỪ XẠ KHUẨN NỘI

SINH VÀ CAO CHIẾT CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên được bảo vệ khóa

luận trước Hội đồng:

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

LỜI CẢM ƠN

Thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp là cột mốc lớn nhất từ trước đến nay của bản thân tơi, đó cũng là hành trang đầu tiên của tôi trước khi bắt đầu một cuộc sống mới mà không phải ln có sự đồng hành của Thầy Cơ, ba mẹ và bạn bè. Trong suốt thời gian được học tập và thực hiện đề tài khóa luận tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh – Trường đại học Mở TP.HCM dưới sự dìu dắt và hướng dẫn tận tình của Thầy Cơ và các anh chị đã giúp bản thân tơi có thêm rất nhiều kinh nghiệm và kỹ năng trong quá trình làm việc.

Lời đầu tiên yêu thương và trân trọng nhất, con xin cảm ơn ba mẹ, hai người mà con u thương nhất đã có cơng sinh thành và nuôi dưỡng con, luôn ủng hộ và động viên con, tìm mọi cách giúp con thực hiện ước mơ của mình.

Em xin gửi sự tri ân và lòng biết ơn sâu sắc nhất của mình đến cô ThS.

Dương Nhật Linh và thầy ThS. Nguyễn Văn Minh đã luôn hỗ trợ, tận tình

hướng dẫn và ln sẵn sàng giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến chị Trần Thị Á Ni, chị Nguyễn Thị Thảo

Nguyên, chị Nguyễn Ngọc Cẩm Tiên và các anh chị trong phịng thí nghiệm

đã ln giúp đỡ, hỗ trợ, đồng hành, động viên giải đáp thắc mắc cho em trong suốt quá trình từ lúc em lên ý tưởng cho đến khi viết đề cương và làm thực nghiệm tại phịng thí nghiệm.

Em xin gửi lời cảm ơn đến ban giám hiệu nhà trường và ban lãnh đạo khoa

cũng như anh Nguyễn Hoàng Minh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể

thực hiện đề tài tại phịng thí nghiệm.

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn của em, đặc biệt là các

bạn chung phịng thí nghiệm với em và bạn Bùi Thị Ngọc Lệ, cám ơn các bạn

vì đã giúp đỡ mình rất nhiều trong quá trình làm việc tại phịng thí nghiệm cũng như ngồi cuộc sống dù chúng ta không hề quen biết nhau từ trước nhưng vẫn ln coi nhau như gia đình, cám ơn rất nhiều vì đã là một phần tươi đẹp và rực rỡ nhất trong thời thanh xuân của mình.

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người!

Bình Dương, ngày 4 tháng 10 năm 2022

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ... i

MỤC LỤC ... iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ... vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU ... viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ... ix

ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1

PHẦN I: TỔNG QUAN ... 4

1. TỔNG QUAN VỀ XẠ KHUẨN NỘI SINH ... 4

1.1. Sơ lược về xạ khuẩn nội sinh ... 4

1.1.1. Xạ khuẩn nội sinh ... 4

1.1.2. Xạ khuẩn ... 5

1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ... 10

1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước ... 11

1.3.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trong nước ... 11

1.3.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn trên cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) ... 11

2. TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.) ... 12

2.1. Đặc điểm thực vật học của cây cà gai leo ... 12

2.2. Đặc điểm hình thái và phân bố ... 12

2.3. Thành phần hóa học ... 13

2.4. Lợi ích và tác dụng ... 14

3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI SINH VẬT THỬ NGHIỆM ... 15

3.1.Staphylococcus aureus resistant methicillin (MRSA)... 15

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ... 20

1.2. Đối tượng nghiên cứu ... 20

1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và mơi trường ... 20

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 20

2.5.3. Đánh giá khả năng chống oxi hóa bằng sử dụng DPPH. ... 27

2.6. Khảo sát khả năng tiêu huyết từ xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) ... 27

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

2.7. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào từ xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo

(Solanum procumbens L.) ... 27

2.8. Thu nhận cao chiết dược liệu từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) ... 28

2.9. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết cây cà gai leo (Solanum

procumbens L.). ... 28

2.10. Khảo sát khả năng chống oxi hóa của cao chiết cây cà gai leo (Solanum

procumbens L.) ... 29 2.10.1. Định tính khả năng chống oxi hóa theo phương pháp của Plánder và cộng sự (2012). ... 29 2.10.2. Đánh giá khả năng chống oxi hóa bằng sử dụng DPPH. ... 29

2.11. Khảo sát khả năng chống tạo màng biofilm từ cao chiết cây cà gai leo (Solanum

procumbens L.). ... 30

2.12. Khảo sát khả năng chống ung thư từ cao chiết xạ khuẩn nội sinh và cao chiết

cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)... 30 2.13. Định danh chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) có

hoạt tính mạnh nhất. ... 31

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ... 32

1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY ... 32 2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO

(Solanum procumbens L.). ... 32

3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA XẠ KHUẨN

NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.) ... 40

4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA XẠ KHUẨN

NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.) ... 41

4.1. Định tính khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp hiện màu trên tấm sắc ký bản mỏng (TLC). ... 41 5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIÊU HUYẾT CỦA XẠ KHUẨN NỘI

SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.) ... 45

6. KẾT QUẢ KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO CỦA CHỦNG XẠ

KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.) ... 46

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

7. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CHỦNG XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI

LEO (Solanum procumbens L.) CĨ HOẠT TÍNH MẠNH NHẤT ... 48

8. THU NHẬN CAO CHIẾT DƯỢC LIỆU TỪ CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.) ... 51

9. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.). ... 52

10. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO CHIẾT CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.). ... 52

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ... 55

1. KẾT LUẬN ... 59

2. ĐỀ NGHỊ ... 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 61

Tài liệu Tiếng Việt ... 61

Tài liệu Tiếng Anh ... 62

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

pH Pondus hydrogenii - độ hoạt động của hydro

Rpm Round Per Minute- Số vòng quay trên phút

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Kết quả phân lập xạ khuẩn 4 phương pháp khác nhau ... 32

Bảng 3.2 Kết quả quan sát đại thể và của các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập được từ phương pháp tiền tăng sinh ... 37

Bảng 3.3 Kết quả định tính khả năng chống oxy hóa của các chủng xạ khuẩn ... 42

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng chống oxy hóa ... 44

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khả năng tiêu huyết ... 45

Bảng 3.6 Thông tin trình tự thu thập trên Genbank ... 50

Bảng 3.7 Kết quả đo mật độ quang và tính giá trị chống oxi hóa của cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) ... 55

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn trên mơi trường thạch đĩa ... 6

Hình 1.2 Sự phát triển khuẩn ty ở xạ khuẩn. ... 7

Hình 1.3 Các cách sắp xếp bào tử của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces ... 8

Hình 1.4 Một số ứng dụng của xạ khuẩn ... 9

Hình 1.5 Hình ảnh cây cà gai leo ( Solanum procumbens L.) ... 12

Hình 1.6 Một số hợp chất hóa học trong cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) 13 Hình 1.7 Escherichia coli ... 16

Hình 1.8 Salmonella typhi ... 17

Hình 1.9 Pseudomonas aeruginosa ... 18

Hình 1.10 Bacillus cereus ... 19

Hình 2.1 Mẫu cà gai leo được thu hái và phân loại ... 22

Hình 2.3 Quá trình thu lấy dịch lọc để thay thế mơi trường phân lập ... 24

Hình 3.1 Kết quả phân lập bằng phương pháp tiền tăng sinh từ mẫu lá ... 33

Hình 3.2 Kết quả trang nước rửa cuối mẫu sau khi đã khử trùng bề mặt ... 35

Hình 3.3 Chủng xạ khuẩn XL19 phân lập được từ cây cà gai leo (Solanum procumbens lour) bằng phương pháp tiền tăng sinh sau khi được làm thuần trên môi trường Gause I. ... 36

Hình 3.4 Mặt trên và mặt dưới của chủng xạ khuẩn XL9 có tiết sắc tố làm đổi màu mơi trường Gause I... 36

Hình 3.5 Hình ảnh mặt trên mà mặt dưới của chủng XL10 trên mơi trường Gause I ... 37

Hình 3.6 Kết quả quan sát vi thể chủng xạ khuẩn XL8 phân lập từ lá cây cà gai leo (Solanum procumbens l.) ... 40

Hình 3.7 Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn mrsa của chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens l.) XL21 đã phân lập được. ... 41

Hình 3.8 Quá trình thu nhận cao chiết thô từ chủng xạ khuẩn đã phân lập được ... 42

Hình 3.9 Kết quả định lượng khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp hiện hình trên tấm tlc dưới đèn uv ... 43

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Hình 3.10 Kết quả blast trên ncbi chủng xạ khuẩn có hoạt tính mạnh nhất ... 49 Hình 3.11 Kết quả dựng cây phả hệ neighbor-joining method ... 50 Hình 3.12 Cây cà gai leo xay (trái) và cao chiết cây cà gai leo (phải) ... 52 Hình 3.13 Kết quả định tính khả năng chống oxi hóa của cao chiết cây cà gai leo

(Solanum procumbens L.) ... 54

Hình 3.14 Kết quả định lượng khả năng chống oxi hóa mẫu chứng dương (vitamin c)(*) ... 54 Hình 3.15 Kết quả định lượng khả năng chống oxi hóa mẫu cao chiết cây cà gai leo

(Solanum procumbens L.)(*) ... 55

Hình 3.16 Kết quả khảo sát chống tạo màng biofilm từ cao chiết cây cà gai leo

(Solanum procumbens L.) ... 56

Hình 3.17 Kết quả khảo sát khả năng ức chế tế bào ung thư từ cao chiết cây cà gai

leo (Solanum procumbens L.) ... 56

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bên cạnh những lợi ích của oxy hóa, sự oxy hóa tế bào hay cịn gọi là sự xuất hiện của các gốc tự do mang lại khơng ít những tác hại đáng báo động. Sự xuất hiện của các gốc tự do làm lão hóa, tổn thương các tế bào khác thậm chí là gây ảnh hưởng đến cấu trúc DNA đó là nguyên nhân dẫn đến các bệnh như tiểu đường, các bệnh về tim, mất trí nhớ và ung thư. Sự oxy hóa cấu trúc DNA làm thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể và hoạt hóa các gen sinh ung (Pham và cs., 2008). Đặc biệt, khi môi trường sống bị ô nhiễm, căng thẳng hay lớn tuổi các gốc tự do sản sinh ra ngày càng nhiều làm ảnh hưởng đến sức khỏe. Hiện nay, các nhà khoa học đang không ngừng nỗ lực tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa vì chúng được cho là không mang lại tác dụng phụ và an toàn. Là một loại thảo dược quý dùng trong điều

trị bệnh về gan, cà gai leo thuộc họ cà (Solanaceae) tên khoa học là Solanum

procumbens Lour, chúng có dạng thân bị, cành có gai dẹp, lá có lơng chủ yếu ở mặt

dưới, hoa có vành tím; quả trịn khơng lơng, khi chín màu đỏ; hột màu vàng, dẹp. Chúng thường mọc thành bụi rải rác ven rừng, ven đường, bãi hoang (Hợp và cs., 2003). Trong dân gian người dân lấy rễ và trái trị mụt nhọt, lở, phong thấp (Hộ và cs., 2003). Bên cạnh việc sử dụng theo liệu pháp dân gian truyền thống để chữa bệnh, thời gian gần đây các nhà khoa học cũng đã có những nghiên cứu sâu hơn về

loài cây này. Trong cà gai leo (Solanum procumbens L.) có nhiều hợp chất tự nhiên

như alkaloid, glycoalkaloid có vai trị ức chế sự nhân lên và làm bất hoạt virus viêm gan B; ngồi ra chúng có khả năng bắt các gốc tự do và ngừa xơ gan hiệu quả; tồn cây có chứa alkaloid, nhiều nhất là ở rễ có chứa solasodin và solasonidin (Hộ và cs.,

2003). Cà gai leo (Solanum procumbens L.) rất giàu saponin steroid và flavonoid,

đây là các hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn và gây độc tế bào (Anh, 2017). Trong những nghiên cứu gần đây cũng đã chứng minh rằng glycoalkaloid trong các cây họ cà có nhiều hoạt tính sinh học, có khả năng chống khối u, kháng nấm, kháng virus (Zha và cs., 2007; Blankemeyer và cs., 1998). Sau khi được công bố về công dụng và hiệu quả trị bệnh thời gian gần đây người ta đã

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

nghiên cứu để trồng trọt và thu hoạch chúng, tuy nhiên việc trồng trọt và thu hoạch còn nhiều bất cập do người dân chưa có nhiều kinh nghiệm trong việc chăm sóc cây dược liệu. Theo xu hướng phát triển y học hiện đại, các vi sinh vật nội sinh cây dược liệu được coi là nhiều triển vọng và là một nguồn cung cấp hợp chất quan trọng trong y học.

Vi sinh vật nội sinh là nhóm vi sinh vật sống cộng sinh trong các mô tế bào thực vật mà không gây hại cho vật chủ. Sự liên kết của những vi sinh vật nội sinh với các cấu trúc thực vật làm cho chúng cũng có khả năng sinh tổng hợp, chuyển hóa và sinh ra các chất giống cây chủ, vì vậy các vi sinh vật nội sinh có vai trị vơ cùng lớn (Golinska và cs., 2015). Xạ khuẩn là cộng đồng vi sinh vật có nhiều đóng góp cho con người trong nhiều lĩnh vực, chúng phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái dưới nước, trên cạn và đặc biệt là trong đất có vai trị quan trọng trong việc phân hủy sinh học tạo chất mùn cho cây, bên cạnh đó là khả năng phân hủy các thành phần như kitin, keratin, lignocelluloses và những chất khó phân hủy như polymer (Sharma, 2014). Trong tổng số hợp chất có hoạt tính sinh học được tạo ra bởi vi sinh vật xạ khuẩn chiếm 50% (Singh và cs., 2018); 75% trong số các loài xạ khuẩn là nguồn sản xuất ra lượng lớn chất kháng sinh tiềm năng cho nền y học bên cạnh đó là khả năng sản sinh ra chất ức chế enzyme, chống oxi hóa, kháng khuẩn và kháng ung thư (Golinska và cs., 2015). Trong nghiên cứu mới đây của Singh và cộng sự (2020)

chủng xạ khuẩn nội sinh Streptomyces californicus ADR1 phân lập từ cây cà độc dược (Datura metel) sinh ra các hợp chất thứ cấp có khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn rất hiệu quả với các vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Methicilline

resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium và Enterococcus faecali.

Hiện nay các nghiên cứu về xạ khuẩn chưa nhiều và chưa có nghiên cứu nào về

xạ khuẩn nội sinh trên cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) được công bố ở Việt

Nam.

Dựa trên những tiềm năng của nguồn xạ khuẩn nội sinh cũng như hoạt tính sinh học của xạ khuẩn trong tự nhiên đặc biệt là trên cây dược liệu, với mong muốn tìm ra nguồn hợp chất chống oxi hóa và kháng ung thư phục vụ cho nền y học chúng tôi tiến

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

hành thực hiện đề tài: “SÀNG LỌC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI

HĨA MẠNH VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC KHÁC TỪ XẠ KHUẨN

NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)”.

• Mục tiêu nghiên cứu: Sàng lọc hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh và một số

hoạt tính sinh học khác từ xạ khuẩn nội sinh và cao chiết cây cà gai leo (Solanum

procumbens L.)”.

• Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập xạ khuẩn nội sinh từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L.).

- Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh và cao chiết cây cà gai

leo (Solanum procumbens L.).

- Khảo sát khả năng chống oxi hóa từ các chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo

(Solanum procumbens L.).

- Định danh chủng xạ khuản nội sinh cây cà gai lep (Solanum procumbens L.)

tiểm năng nhất

- Chiết cao dược liệu cây cà gai leo (Solanum procumbens L.).

- Khảo sát khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh từ xạ khuẩn nội sinh và cao

chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)

- Khảo sát khả năng chống oxi hóa từ cao chiết cây cà gai leo (Solanum

procumbens L.).

- Khảo sát khả năng kháng dòng tế bào ung thư từ cao chiết xạ khuẩn nội sinh

cây cà gai leo và cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.).

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

PHẦN I: TỔNG QUAN

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

1. TỔNG QUAN VỀ XẠ KHUẨN NỘI SINH 1.1. Sơ lược về xạ khuẩn nội sinh

1.1.1. Xạ khuẩn nội sinh

Định nghĩa đầu tiên về vi sinh vật nội sinh được đưa ra năm 1866 bởi De Bary, sau đó năm 1986 Petrini cũng sử dụng định nghĩa này, định nghĩa được đưa ra như sau: “ Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sống bên trong các mô của thực vật”. Vi sinh vật nội sinh không gây hại tế bào cây ký chủ mà còn thúc đẩy sự phát triển, cung cấp nguồn dinh dưỡng và bảo vệ cây ký chủ khỏi các tác nhân sinh học (Pandey và cs., 2016).

Xạ khuẩn nội sinh là vi sinh vật nội sinh được quan tâm đặc biệt với khả năng sinh ra chất có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Xạ khuẩn nội sinh được định nghĩa là những vi sinh vật sống trong phần bên trong của thực vật, không gây ra những thay đổi cho vật chủ của chúng. Xạ khuẩn nội sinh đóng những vai trò cụ thể như bảo vệ cây chủ chống lại côn trùng và bệnh tật. Chúng là một phần lớn của sinh quyển, chúng cũng được tìm thấy bên trong thực vật, trong đó các lồi được nghiên cứu rộng rãi là từ

chi Frankia, có khả năng cố định đạm và một số loài thuộc chi Streptomyces (Benson và cs., 1993). Tóm lại, xạ khuẩn nội sinh chủ yếu thuộc chi Streptomyces, tuy nhiên một vài chi khác như: Streptoverticillium, Nocardia, Micromonospora, Kitasatospora,

Pseudonocardia, Microbispora, Kibdelosporangium, Actinopolyspora, Nocardioides, Brevibromonospium, Actinomadura, Glycomyces cũng được tìm thấy trong thực vật

như Palicourea longifolia, Calycophyllum acreanum, Monstera spruceana, Croton

lechleri, Cantua buxifolia, Siparuna crassifolia, và Eucharis cyaneosperma (Ranjani

Anandan và cs., 2016). Để giải quyết các vấn đề về vi khuẩn kháng kháng sinh và tìm ra loại kháng sinh mới cần phải nghĩ ra các cách tiếp cận mới để tìm kiếm các phân tử mới. Một trong số đó là “sự phục hưng trong khám phá kháng khuẩn từ xạ khuẩn” (Baltz, 2008). Việc tìm kiếm các hệ sinh thái mới với các phương pháp phân lập mới của các chi / lồi xạ khuẩn mới góp phần cho việc xác định các cụm gen mới và do đó tạo ra các sản phẩm mới (Xu và cs., 2010). Các nhà nghiên cứu hiện đang tập trung vào việc phân lập xạ khuẩn từ các môi trường sống đa dạng như đại dương (Subramani và

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Aalbersberg, 2013), môi trường khắc nghiệt (Tang và cs., 2003; Hamedi và cs., 2013), các mô bên trong của thực vật (Chankhamhaengdecha và cs., 2013), phân động vật (Cao và cs., 2012), tảo và địa y (González và cs., 2005; Yamamura và cs., 2011). Do đó, rất khuyến khích việc khám phá các xạ khuẩn sống trong các hệ sinh thái đặc biệt như thực vật ưa cực để phát hiện ra các chủng chưa được khai thác cho đến nay. Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái dưới nước , trên cạn và đặc biệt là trong đất có vai trò quan trọng trong việc phân hủy sinh học tạo chất mùn cho cây, bên cạnh đó là khả năng phân hủy các thành phần như kitin, keratin, lignocelluloses và những chất khó phân hủy như polymer (Sharma M, 2014). Bên cạnh các loài vi sinh vật phổ biến như vi khuẩn và vi nấm, xạ khuẩn cũng góp phần khơng nhỏ trong đời sống của con người. Xạ khuẩn chiếm 45% trong tổng số hợp chất có hoạt tính sinh học được tạo ra bởi vi sinh vật; 75% trong số các loài xạ khuẩn là nguồn sản xuất ra lượng lớn chất kháng sinh tiềm năng cho nền y học bên cạnh đó là khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn và kháng ung thư (Golinska P và cs., 2015). Trong số các lồi xạ khuẩn thì

Streptomyces là chi xạ khuẩn phổ biến nhất và được ứng dụng nhiều nhất, điển hình là

thuốc kháng sinh streptomycin. Phần lớn các loài xạ khuẩn được phân lập từ đất, bên cạnh đó cũng được phân lập trên các lồi cây dược liệu. Xạ khuẩn nội sinh với thực vật cịn có thêm đặc tính sinh học q mà các chủng xạ khuẩn khác khơng có như khả năng chịu stress, có khả năng thích nghi cao, chống chịu với nhiều loại vi sinh vật gây bệnh trên thực vật, một số chất kháng sinh mới gần đây đều mang nguồn gốc từ xạ khuẩn nội sinh qua đây ta thấy được tiềm năng của xạ khuẩn nội sinh rất lớn (Loria và cs., 1997).

1.1.2. Xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dương do có phần trăm cytosine và guanine cao trong DNA, có dạng sợi, có hình dạng gần giống với nấm nhưng lại có đặc điểm giống cả khuẩn và nấm; chúng được coi là vi khuẩn có giá trị sinh học và khai thác được khoảng 10000 hoạt chất sinh học, hơn nữa chúng cịn góp phần quan trọng trong chu trình cacbon. Khuẩn lạc của xạ khuẩn có nhiều hạt bụi như vi nấm nhưng chúng bám rất chặt vào mặt thạch, các sợi khuẩn ty và bào tử có cấu tạo như vi nấm (Ranjani Anandan và cs., 2016). Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật đơn bào phân nhánh, hầu hết

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

là vi sinh vật hiếu khí, sinh sản bằng cách phân nhánh hoặc tạo bào tử. Hình thái của chúng trên mơi trường ni cấy thường có dạng hình nón và được bao phủ bởi các sợi khuẩn có cấu tạo như nấm bên trên. Ngồi ra các sắc tố sinh ra từ xạ khuẩn và các vòng tròn đồng tâm quanh khuẩn lạc cũng là tiêu chí để phân loại xạ khuẩn.

Khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn khác nhau về kích thước, hình dạng và độ dày . Màu sắc của nó trải dài từ trắng hoặc hầu như không màu đến vàng, nâu, đỏ, hồng, cam, xanh lá cây hoặc đen (Ranjani Anandan và cs., 2016).

Khuẩn ty khí sinh thường dày hơn sợi nấm nền . Khuẩn ty khí sinh thể hiện sự khác biệt mà có thể dựa vào đó để phân loại các chủng phân lập thành một số nhóm có các đặc điểm hình thái giống nhau trong điều kiện cố định. Đây được coi là một trong

những tiêu chí quan trọng nhất để phân loại chi Streptomyces thành các loài, bao gồm

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

cấu trúc (bơng, nhẵn mịn hoặc bột), sự hình thành các vòng tròn hoặc vùng đồng tâm và sắc tố (Ranjani Anandan và cs., 2016).

Hình 1.2 Sự phát triển khuẩn ty ở xạ khuẩn.

(Nguồn: mycelium in

Streptomyces-Modi-fi-ed-from-Vobis 1997_fig2_261661486)

• Bào tử

Bào tử của xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử. Bào tử của xạ khuẩn có thể có hình trịn, hình bầu dục, hình que, hình trụ… Hình dạng kích thước của cuống sinh bào tử và bào tử có vai trị quan trọng trong việc phân loại xạ khuẩn (Phượng và cs., 2015).

1.Bào tử nảy mầm.

2. Hình thành khuẩn ty cơ chất.

3. Hình thành khuẩn ty khí sinh.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Hình 1.3 Các cách sắp xếp bào tử của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces

• Phân loại:

Theo khóa phân loại Bergey, thứ tự Actinomycetales được chia thành bốn họ - Streptomycetaceae, Actinomycetaceae, Actinoplanaceae, và Mycobacteriaceae ( William và cs., 1989). Trong tập năm của khóa phân loại Bergey, hệ thống xạ khuẩn được phân thành 6 lớp gồm: Actinobacteria, Acidimicrobiia, Coriobacteriia, Nitriliruptoria, Rubrobacteria và Thermoleophilia. Lớp Actinobacteria được chia thành

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

16 bộ là Actinomycetales, Actinopolysporales, Bifidobacteria, Catenulisporales, Corynebacteria, Frankiales, Glycomycetales, Jiangellales, Kineosporiales, Micrococcales, Micromonosporales, Propionibacteria, Pseudonocardcetales, Streptoomyspialtales, Streptoomyspialtales, Streptoomyspialtales.( Yokota A, 1997).

Dựa theo thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính (Phượng và cs., 2015):

- Nhóm 1: Thành phần chính là acid L- 2,6- diaminopimelic và glycin thuộc nhóm

này có Streptomyces, Nocardioides.

- Nhóm 2: Thành phần chính là acid meso- 2,6-diaminopimelic và glycine, thuộc

nhóm này có Pilimelia, Micromonospora, Actinoplanes.

- Nhóm 3:Thành phần chính là acid meso-2,6-diaminopimelic, thuộc nhóm này có

Actinomadura, Frankia.

- Nhóm 4: Thành phần chính là acid meso-2,6-diaminopimelic, arabinose và

galactose, thuộc nhóm này có Saccharomomospora, Nocardia.

Điểm khác biệt của xạ khuẩn là chúng có tỉ lệ G+C trong 16S rRNA cao (trên 50%).

• Ứng dụng:

Hình 1.4 Một số ứng dụng của xạ khuẩn

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

(Nguồn: Chú thích:

Pigments: Màu ; Antibiotics: Kháng sinh; Enzymes : Enzyme ; Probiotics: Men vi sinh; Biosurfactant: Chất hoạt động bề mặt ; Nanoparticle synthesis: Nano tổng hợp ; Herbicides: Thuốc diệt cỏ; Larvicides: diệt sâu bọ.

Xạ khuẩn được công nhận rõ ràng về khả năng sản xuất các chất chuyển hóa sơ cấp và thứ cấp có các ứng dụng quan trọng trong các lĩnh vực khác nhau. Chúng cũng là một nguồn hứa hẹn cung cấp nhiều loại enzyme quan trọng, được sản xuất ở quy mô công nghiệp. Một phần lớn thuốc kháng sinh trên thị trường được sản xuất từ xạ khuẩn. Chúng tạo ra các chất ức chế enzyme hữu ích cho việc điều trị ung thư và các chất miễn dịch giúp tăng cường phản ứng miễn dịch. Xạ khuẩn có khả năng phân hủy nhiều loại hydrocacbon, thuốc trừ sâu và các hợp chất béo và thơm. Nhiều chi xạ khuẩn được sử dụng để chuyển hóa sinh học các chất thải nông nghiệp và đô thị thành các sản phẩm hóa học có giá trị cao. Xạ khuẩn có vai trị quan trọng trong cơng nghệ sinh học thực vật vì các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng các mầm bệnh cho cây và rất hữu ích trong việc kiểm sốt sinh học (Ranjani Anandan và cs., 2016).

1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tính đến thời điểm hiện tại việc phân lập xạ khuẩn nội sinh đang là xu hướng của thế giới, trên cơ sở đó nhiều cơng trình nghiên cứu đã được đăng tải trên các diễn đàn học thuật khẳng định vai trò quan trọng và ứng dụng thực tiễn của xạ khuẩn nội sinh trong cuộc sống.

Trong nghiên cứu của mình Abdul Kafur và Anisa Basheer Khan (2011), cho biết

xạ khuẩn nội sinh phân lập được từ lồi cây Catharanthesroseus có khả năng kháng cả

vi khuẩn Gram âm, Gram dương và nấm.

Theo Govindan Rajivgandhi và cộng sự ( 2018) cho biết cao chiết ethyl acetate của

các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ loài tảo lục Cauler pataxifolia có khả năng kháng khuẩn mạnh chống lại những chủng E. coli, P. mirabilis, Pseudomonas

aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter sp.

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Theo Loganathan Karthik và cộng sự (2013) cho thấy rằng các chủng xạ khuẩn phân lập từ biển có khả năng bắt gốc tự do rất tốt với giá trị IC50 đo được là 70,71 µg/mL.

1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước

1.3.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trong nước

Nhiều nghiên cứu khoa học về xạ khuẩn nội sinh đã được cơng bố, trong đó có rất nhiều đề tài nghiên cứu về các chủng có khả năng sinh chất kháng sinh cao như

Streptomyces.

Năm 2017 nhóm tác giả Đỗ Tất Thịnh và cộng sự công bố nghiên cứu về đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn nội sinh cây nghệ vàng có chủng vi khuẩn có khả năng kháng đến 9 chủng vi khuẩn gây bệnh.

Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên cây bưởi diễn của Thảo và cộng sự (2016), kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng phân lập từ đất có khả năng sản sinh nhiều loại enzyme ngoại bào phân giải chitin, lignin, casein,.. và đặc biệt chủng xạ

khuẩn phân lập từ rễ cây bưởi diễn có khả năng kháng Bacillus subtilis và

Staphylococcus aureus. Và chủng xạ khuẩn HNR3X4 được xác định là có khả năng

sinh chất kháng sinh cao nhất trên môi trường Gause I.

Năm 2018, Vũ Thị Hạnh Nguyên và cộng sự đã phân lập trên cây quế

(Cinnamomum Cassia Presl) và thu nhận chủng Streptomyces cavourensis YBQ75 có khả năng kháng Salmonella enterica ATCC 14028 (22,0 mm); Pseudomonas

aeruginosa CNLM (19,3 mm); Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (19,3 mm); Enterobacter aerogenes ATCC 13048 (17,7 mm); Proteus vulgaris CNLM (16,3 mm).

Theo nghiên cứu của Hiếu và cộng sự (2021) chủng xạ khuẩn nội sinh SS743 phân

lập từ cây xương khỉ có khả năng kháng lại vi khuẩn Escherichia coli sinh ESBL và

một số loại vi khuẩn kháng kháng sinh khác, đặc biệt hoạt chất kháng khuẩn từ chủng xạ khuẩn này tương đối bền với pH, nhiệt độ, tia UV và enzyme protease.

1.3.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn trên cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)

Đến thời điểm hiện tại, bên cạnh những nghiên cứu về các hoạt chất của cây cà gai

leo (Solanum procumbens L.) thì chưa có cơng bố nào về xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.).

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

2. TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)

2.1. Đặc điểm thực vật học của cây cà gai leo

Tên khoa học: Solanum procumbens Lour

Giới: Plantae Bộ: Solanales Họ:Solanaceae

Lồi: Solanum procumbens

Hình 1.5 Hình ảnh cây cà gai leo ( Solanum procumbens L.)

2.2. Đặc điểm hình thái và phân bố

Cây dược liệu là nguồn cung cấp nhiều loại thuốc cũng như hợp chất tự nhiên có

cơng dụng chữa bệnh hữu hiệu. Cà gai leo (Solanum procumbens L.) cũng là một trong số đó. Cà gai leo là một loại cây thuộc họ cà (Solanaceae) có tên khoa học là Solanum

procumbens Lour chúng có thân bị, cành có gai dẹp, lá có lơng tập trung chủ yếu ở

mặt dưới mép phiến lá lượn sóng khơng đều hoặc có 4-6 thùy cạn, cuống lá dài 2-8 mm; hoa có vành tím, màu trắng hay tím nhạt, đường kính 10-14 mm, cuống hoa dài, rũ xuống; Quả trịn khơng lông; hột dẹp, vàng, quả non màu lục, nửa phía cuống lục sậm; cuống quả dài 15-20 mm, nhiều lơng... Lồi cây này thường phân bố chủ yếu ở Hải Phịng, Bình Định, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Bắc Giang ( Yên

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Thế), Phú Thọ (Việt Trì). Ngồi ra cịn xuất hiện ở Quảng Tây, Hải Nam ( Trung Quốc). Thường mọc thành bụi rải rác ven rừng , ven đường, bãi hoang (Vũ Văn Hợp, Vũ Xuân Phương, 2003).

2.3. Thành phần hóa học

Trong cây cà gai leo có chứa các hợp chất tự nhiên như alkaloid, glycoalkaloid có khả năng ức chế sự nhân lên và làm bất hoạt virus viêm gan B; ngồi ra chúng có khả năng bắt các gốc tự do và ngừa xơ gan hiệu quả; toàn cây có chứa alkaloid, nhiều nhất là ở rễ có chứa solasodin, solanidin.

solasodine_fig1_287723826)

(Nguồn:

Hình 1.6 Một số hợp chất hóa học trong cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)

Trong dân gian người ta thường sử dụng rễ và trái trị mụt nhọt, lở, phong thấp

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

( P.H.Hộ; Vũ Văn Hợp, Vũ Xuân Phương, 2003). Bên cạnh việc sử dụng theo liệu pháp dân gian truyền thống để chữa bệnh, thời gian gần đây các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu về lồi cây này. Trong nghiên cứu của mình ơng Hoang Le Tuan Anh năm 2017 cho biết cà gai leo rất giàu saponin steroid và flavonoid, đây là các hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học kháng nấm kháng khuẩn và gây độc tế bào (Hoang Le Tuan Anh, 2017). Trong một số nghiên cứu gần đây cũng đã công bố các nhóm hợp chất triterpenoid, steroid, alkaloid và các hợp chất polyphenol phân lập từ cây cà gai leo (Nguyễn Trung Nhân và cs., 2021). Từ cao ethyl acetate của thân cây cà gai leo đã được phân lập được một hợp chất anthraquinone bốn hợp chất polyphenol và một hợp chất indole. Bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo, các hợp chất này lần lượt được xác định là ziganein, benzoic acid, salicylic acid, 4-hydroxybenzaldehyde , vanillic acid và indole-3-carbaldehyde (Nguyễn Xuân Hải và cs., 2018). Trong những nghiên cứu gần đây cũng đã chứng minh rằng glycoalkaloid trong các cây họ cà có nhiều hoạt tính sinh học, có khả năng chống khối u, kháng nấm, kháng virus (Zha X và cs., 2007).

2.4. Lợi ích và tác dụng

Cà gai leo là loài cây được biết đến nhiều nhất với công dụng giải độc gan, trước khi có những nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hợp chất cũng như dược tính của cây thì dân gian đã biết sử dụng nó để chữa những bệnh như mụn nhọt, giải rượu,trị rắn cắn, suyễn, phong thấp. Trong cây cà gai leo có chứa các chất alkaloid, glycoalkaloid có tác dụng ức chế sự sao chép và làm bất hoạt virus viêm gan B, chống oxy hóa, ngăn ngừa xơ gan hiệu quả. Glycoalkaloid trong hiện diện nhiều trong rễ cây cà gai leo là một flavonoid có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư và là chất chống oxi hóa mạnh (Martin và cs., 2013).

Cà gai leo còn là thành phần chính của nhiều loại thuốc điều trị viêm gan (Nguyễn Minh Khai và cs., 2001). Trong một số nghiên cứu gần đây cịn cơng bố thêm một số hợp chất phân lập từ cây cà gai leo có khả năng chống tăng sinh các tế bào ung thư, kháng viêm, giảm hàm lượng cholesterol (Friedman và cs., 2000a, 2000b), kháng oxy hóa và ức chế ức chế enzyme alpha-glucosidase (Nguyễn Trung Nhân và cs.,

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

2021). Nghiên cứu chứng minh cao chiết cà gai leo có tác dụng bảo vệ gan chuột khỏi sự nhiễm độc do tiếp xúc với TNT trong thời gian dài ( Nguyen và cs., 2013).

3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI SINH VẬT THỬ NGHIỆM

3.1. Staphylococcus aureus resistant methicillin (MRSA)

Staphylococcus aureus đề kháng với kháng sinh penicillin được phát hiện lần đầu

tiên vào đầu thập niên 1940 sau khi penicillin được đưa vào sử dụng được một thời gian ngắn. Nhưng trong nhiều năm sau đó thì những dịng vi khuẩn kháng penicillin này vẫn nhạy với các penicillin bền vững với penicillinase (oxacillin, methicillin, nafcillin), còn gọi là penicillin M. Đến giữa thập niên 1960, bắt đầu xuất hiện những

dòng vi khuẩn S. aureus kháng penicillin M, được gọi là ―methicillin resistant S.

aureus (MRSA) vì methicillin là kháng sinh đầu tiên được sử dụng để phát hiện

oxacillin (Phạm Hùng Vân, 2013). S. aureus đề kháng với penicillin thông qua cơ chế β-lactamase và hiện nay đã có một tỷ lệ rất cao S. aureus kháng với penicillin bằng

cách tiết enzyme β-lactam; MRSA đề kháng penicillin M chủ yếu qua trung gian gen mecA mã hóa cho protein 2A gắn penicillin (PBP 2A hoặc PBP 2’). Khi được tạo ra, PBP 2A nằm ở vách tế bào vi khuẩn và có ái lực thấp với kháng sinh β-lactam, nhờ vậy mà làm cho vi khuẩn kháng được không chỉ penicillin M mà còn với tất cả các kháng sinh β-lactam (Phạm Hùng Vân, 2013). Nhiễm khuẩn do MRSA được ghi nhận thường xuyên ở các trung tâm y tế, đặc biệt ở các bệnh nhân có thời gian điều trị lâu dài trong bệnh viện. MRSA là yếu tố gây nhiễm trùng nặng và có thể tử vong (Luong và cs., 2021). Theo Tổ chức y tế thế giới (WHO) thống kê cho thấy các bệnh nhiễm trùng hầu hết do vi khuẩn MRSA gây ra. Theo Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm (CLSI)

chỉ ra MRSA là các chủng S. aureus biểu hiện cơ chế kháng qua đột biến gen hoặc qua

cơ chế kháng Methicillin khác, ví dụ thay đổi ái lực của protein gắn Penicillin với Oxacillin gây nhễm trùng bệnh viện nặng. Ngoài ra, trong 2 thập kỷ vừa qua cũng đã xuất hiện chủng MRSA mới có khả năng lây nhiễm ngoài môi trường bệnh viện hầu hết chúng mang gen kháng kháng sinh (Otto., 2013), lây nhiễm cho những người khỏe mạnh và mang độc lực mạnh hơn. Theo Nguyễn Thị Thu Ba và cộng sự (2011) đã nghiên cứu ở 48 bệnh viện tại Canada cho thấy: 11,700/29,000 bệnh nhân nhập viện có mang MRSA gây bệnh nhiễm trùng.

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

3.2. Escherichia coli

E. coli là loài thuộc chi Escherichia, là trực khuẩn Gram âm di động thuộc loại kỵ

khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp cho tăng trưởng là 37 oC, tuy nhiên có thể tăng trưởng từ 10 – 46 0C. Mọc dễ dàng trong Mac Conkey, EMB…

Hình 1.7 Escherichia coli

(Nguồn : agar-and-gram-staining-a-arrow-pointing-pink_fig2_361848244)

coli là một loại vi khuẩn thường được tìm thấy trong ruột của người và động

vật. Vi khuẩn E. coli có thể gây ra các bệnh như: nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm

trùng huyết, viêm màng não ở trẻ sơ sinh và bệnh tiêu chảy ở người và động vật.

Việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do E.coli gây ra đang bị đe dọa bởi ngày càng nhiều các chủng E.coli đa kháng thuốc xuất hiện như chủng E. coli sinh ESBL đều đề

kháng với cephalosporin. Kháng ciprofloxacin, trimethoprim, gentamicin và amikacin lần lượt là 91,3; 84,8%; 30,4% và 4,3%. Tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao đáng kể do vi

khuẩn gây ra bởi E. coli sản sinh ESBL là 60,8%, so với E. coli không sản xuất ESBL

(Mark Melzer và cs., 2007).

Theo Tổ chức y tế thế giới (WHO) cho biết tình trạng kháng thuốc kháng sinh

fluoroquinolone ở E. coli, được sử dụng để điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu đang phổ biến, tỷ lệ E. coli kháng cephalosporin thế hệ thứ ba là 36,0%.

3.3. Salmonella typhi

S.typhi là trực khuẩn Gram âm, có lơng xung quanh thân, có khả năng di động,

không sinh nha bào. Kích thước khoảng 0,4 - 0,6 × 2 – 3 μm. S. typhi là vi khuẩn hiếu

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trong mơi trường thích hợp sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước trung bình 2 – 4 mm.

Hình 1.8 Salmonella typhi

(Nguồn: Slide/30054324)

chỉ gây bệnh cho người, chủ yếu gây bệnh thương hàn. Bệnh thương hàn có

thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột, do khu trú ở túi mật nên có thể gây nhiễm trùng lâu dài. Một số biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Song và cs., 2010).

3.4. Pseudomonas aeruginosa

P. aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong có đơn mao ở một đầu,

nhờ đó di động kích thước 0,6 × 2 μm, hiếu khí tuyệt đối, mọc dễ trên hầu hết các mơi trường thơng dụng, có thể phát ra mùi thơm giống mùi nho (grapelike odor). Mọc tốt ở nhiệt độ 370C đến 420C và có thể mọc ở nhiệt độ 5 – 42 0C, không lên men glucose.

Thử nghiệm oxidase dương tính. Gây tiêu huyết β trên thạch máu, P.aeruginosa có thể

tiết ra 4 loại sắc tố: pyoverdin, pyocyanin, pyomelanin (Nguyễn Thanh Bảo, 2008).

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Hình 1.9 Pseudomonas aeruginosa

(Nguồn: khuẩn mủ xanh tiết ra nhiều enzym và độc tố khác nhau. Vi khuẩn này được coi là một mầm bệnh cơ hội, chủ yếu gây nhiễm trùng bệnh viện ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Vi khuẩn này gây bệnh khi: xạ trị, hóa trị, sức đề kháng của cơ thể bệnh nhân suy giảm, niêm mạc da và mô của bệnh nhân bị tổn thương, sử dụng các dụng cụ y khoa, lạm dụng kháng sinh, tiêu diệt hết vi khuẩn thường trú ở ruột… chúng gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da chảy nước ở các vùng

kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác mạc,… ngoài ra P. aeruginosa là căn nguyên

gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương, xương khớp, huyết, dịch não tủy, tiết niệu và

hô hấp. Một số Pseudomonas aeruginosa tồn tại trong môi trường nước. (Nguyễn

Thanh Bảo, 2008).

3.5. Bacillus cereus

B. cereus là vi khuẩn Gram dương, hình que, sinh bào tử, hiếu khí. Một số

chủng vi khuẩn B. cereus gây ngộ độc thực phẩm, trong khi một số chủng lại có lợi

cho hệ vi sinh vật đường ruột của động vật (Ryan và cs., 2004).

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

Hình 1.10 Bacillus cereus

(Nguồn: vi khuẩn B. cereus như một mối nguy tiềm ẩn trong ngộ độc thực phẩm,

sản sinh ra độc tố gây nôn (cereulide) với nồng độ đọc tố có thể gây nơn dẫn đến ngộ độc thực phẩm là ở mức 10–1280 ng / g (N. Agata và cs., 2002).

B. cereus cũng đã được báo cáo liên quan đến suy giảm miễn dịch bệnh nhân, trẻ

sơ sinh, người nghiện ma túy và bệnh nhân có tiền sử nhiễm trùng vết thương sau phẫu thuật và sau chấn thương (Anja Kotiranta và cs., 2000).

B. cereus là một mầm bệnh ở người được tìm thấy là tác nhân truyền nhiễm của

endophthalmitis và ngộ độc thực phẩm, đôi khi gây chết người (Drobniewski và cs.,1993).

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

1. VẬT LIỆU

1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ 10/2021 đến tháng 9/2022 tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh- cơ sở 3 Trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

1.2. Đối tượng nghiên cứu

Cây cà gai leo (Solanum procumbes L.) bao gồm rễ, thân, lá được thu hái ở Bình

Định

1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và mơi trường

❖ Thiết bị: tủ lạnh, nồi hấp, tủ cấy vơ trùng, tủ ấm, máy vortex, kính hiển vi... ❖ Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, becher, que cấy, đũa cấy, đèn cồn, …

❖ Hóa chất: Thuốc nhuộm Crystal violet, lugol, ethanol 96%, Safranin O, cồn 96o, cồn 70o, kháng sinh Nystastin và acid Nalidixic, Ống Mc Farland 0,5 có độ đục tương đương với 1 - 1,5 x 108 CFU/mL, tấm TLC,...

❖ Môi trường: Gause I, MHA, nước muối sinh lý 0,85%,...

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

Hình 1.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Cây cà gai leo (Solanum

procumbens L.)

Thu nhận và xử lý mẫu

Phân lập xạ khuẩn nội sinh

từ cây cà gai leo (Solanum

procumbens L.)

Thu cao cây cà gai leo

(Solanum procumbens L.)

Khảo sát một số hoạt tính sinh học (Enzyme, tiêu huyết, kháng vi sinh vật gây

bệnh)

Khảo sát một số hoạt tính sinh học( chống biofilm,

kháng khuẩn)Khảo sát khả năng

chống oxi hóa

Định danh chủng xạ khuẩn nội sinh có hoạt tính mạnh nhất

Định danh tên khoa học

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

2.2. Quy trình thu nhận và xử lý mẫu

2.2.1. Thu nhận mẫu

Mẫu được thu nhận và thực hiện lấy mẫu ở tỉnh Bình Định sau đó được bảo quản và vận chuyển đến phịng thí nghiệm. Mẫu thu nhận là mẫu rễ, thân và lá cịn ngun vẹn, khơng dập úng, không nhiễm sâu bệnh. Thực hiện xử lý mẫu sau khi thu nhận.

Hình 2.1 Mẫu cà gai leo được thu hái và phân loại

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

Quy trình chung :

Bước 1: Lắc mẫu trong 3-5 phút (*) bằng ethanol 70%.

Bước 2: Rửa sạch bằng nước cất, tiếp tục khử trùng mẫu với Natri hypoclorid 4%, trong 5-10 phút (*).

Bước 3: Lắc mẫu với ethanol 70% trong 3-5 phút (*).

Bước 4: Các mẫu được rửa năm lần với nước cất vô trùng, nước rửa cuối cùng được trải lên môi trường NA để kiểm tra độ vô trùng (Weyens và cs., 2012; Eevers và cs., 2015).

*Chú thích: Đối với từng mẫu sẽ có thời gian khử trùng bề mặt khác nhau.

2.3. Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cà gai leo ( Solanum procumbens

L.)

Những mẫu đạt hiệu quả khử trùng bề mặt, tức khơng có sự xuất hiện của khuẩn lạc ở đĩa trang nước rửa cuối cùng được tiến hành phân lập xạ khuẩn nội sinh.

Phương pháp 1: Đặt mẫu trực tiếp

Mẫu sau khi thu thập sẽ được cắt thành các đoạn nhỏ khoảng 1cm rồi tiến hành xử lý mẫu như mục 2.2.2 sau đó đặt mẫu trực tiếp lên môi trường Gause I có bổ sung acid nalidixic và nystastin để kìm hãm sự phát hiển của vi khuẩn Gram âm và vi nấm. Ủ mẫu ở 28 oC trong khoảng thời gian từ 7 ngày đến tối đa 21 ngày và quan sát sự xuất hiện của các khuẩn lạc xạ khuẩn. Làm thuần trên đĩa môi trường Gause I.

Phương pháp 2: Phương pháp tiền tăng sinh

Sau khi đã tiến hành xử lý mẫu như mục 2.2.2 đặt mẫu vào mơi trường Gause I lỏng có bổ sung acid nalidixic và nystastin để kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn Gram âm và vi nấm. Ủ lắc 200 rpm ở 28 oC trong vịng 5 đến 7 ngày, sau đó tiến hành pha loãng mẫu và trang dịch khuẩn tiền tăng sinh trên môi trường thạch Gause I, ủ mẫu ở 28 oC trong vòng từ 7 ngày đến tối đa 21 ngày và làm thuần.

Phương pháp 3: Thay thế môi trường phân lập

Môi trường phân lập Gause I sẽ được thay thế bằng dịch xay và lọc vơ trùng từ cây cà gai leo tươi, sau đó được tiến hành đặt mẫu trực tiếp như phương pháp 1.

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

Hình 2.3 Quá trình thu lấy dịch lọc để thay thế môi trường phân lập

Chú thích:

A: Dịch cây cà gai leo sau khi xay B: Dịch cây cà gai leo sau khi lọc

Phương pháp 4: Phân lập từ dịch cây cà gai leo.

Cây cà gai leo sau khi được khử trùng bề mặt như mục 2.2.2 sẽ được đặt vào túi zip vô trùng đã được chiếu UV 30 phút, nghiền cây với dung dịch đệm phosphate sau đó pha lỗng và trang dịch lên mơi trường Gause I và môi trường thay thế bằng dịch lọc cây cà gai leo. Ủ ở 28 oC trong vòng từ 7 đến tối đa 21 ngày và quan sát sự xuất hiện của xạ khuẩn.

Quan sát đại thể bằng mắt thường các khuẩn lạc trên các đĩa môi trường để nhận dạng về kích thước, hình dạng, màu sắc của các khuẩn lạc.

2.3.2.2. Quan sát vi thể

Quan sát vi thể: quan sát bằng cách nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi vật kính 40X, 100X.

</div>