Phân lập, đánh giá đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang tại tỉnh phú thọ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------

Nguyễn PhúTâm

PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH
KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG
TANG TẠI TỈNH PHÚ THỌ
Chuyên ngành vi sinh vật học
Mãsố: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. PhíQuyết Tiến

HÀ NỘI - 2016


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu vàkết quả đƣợc công bố trong luận văn
làhoàn toàn trung thực, chính xác và chƣa đƣợc công bố ở bất kỳ công trình
nào khác.
HàNội, ngày 9 tháng 12 năm 2016
Học viên

Nguyễn PhúTâm

ii

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. PhíQuyết Tiến
chủ nhiệm đề tài VAST04.07/16-17 đã hết lòng giúp đỡ, động viên vàtạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn
thành luận văn tốt nghiệp.
Tiếp theo, tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy, côcủa trường
Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái vàTài Nguyên sinh vật và các thầy, cô
của Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tì
nh giảng dạy cho tôi trong suốt thời
gian tham gia khóa học.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn NCS. Vũ Thị Hạnh Nguyên, NCS.
Quách Ngọc Tùng vàcác cán bộ phòng Công nghệ lên men – Viện Công nghệ
sinh học đã chỉ bảo nhiệt tình, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện
luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những
người đã giúp đỡ, động viên vàtạo điều kiện cho tôi trong suốt quátrì
nh học
tập.
HàNội, ngày 9 tháng 12 năm 2016
Học viên

Nguyễn PhúTâm


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................... viii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu ...................................... 3
1.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh .......................................................... 3
1.1.2. Các phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh ................................ 4
1.1.3. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ............................... 5
1.1.3.1. Kháng ung thƣ, kháng viêm ................................................. 5
1.1.3.2. Kiểm soát sinh học ............................................................... 7
1.1.3.3. Một số dƣợc chất khác từ xạ khuẩn nội sinh ....................... 7
1.1.4. Tình hì
nh nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh ......................................... 9
1.1.4.1. Tì
nh hình nghiên cứu trên thế giới ...................................... 9
1.1.4.2. Tì
nh hình nghiên cứu ở Việt Nam ..................................... 10
1.2. Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ................................... 12
1.3. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu15
1.3.1. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh ........................................... 15
1.3.2. Các gen tham gia vào quátrình tổng hợp kháng sinh vàcác hợp
chất trao đổi thứ cấp ................................................................................ 17
1.3.2.1. Gen chức năng pks-I, pks-II tham gia tạo polyketide đa
vòng thơm ....................................................................................... 17
1.3.2.2. Gen chức năng nrps ........................................................... 18
1.3.2.3. Đánh giá đa dạng gen mãhóa PKS-I, PKS-II, NRPS ....... 18
1.3.3. Chất kháng sinh và kháng sinh điều trị ung thƣ

nhóm

anthracycline ........................................................................................... 20


iv

1.4. Cây Màng tang vàtiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng
tang .................................................................................................................. 22
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 24
2.1.1. Mẫu cây Màng tang, chủng giống vi sinh vật ............................... 24
2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu.......................................... 24
2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy...................................................................... 24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 25
2.2.1. Lấy mẫu cây Màng tang ................................................................ 25
2.2.2. Phƣơng pháp xử lýbề mặt mẫu .................................................... 25
2.2.4. Khuếch đại gen mãhóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn ...... 26
2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT28 ....... 26
2.2.5.1. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả năng sinh
melanin ............................................................................................ 26
2.2.5.2. Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử vàbề mặt bào tử .... 27
2.2.5.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ................................................. 27
2.2.6. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa trên phân tích trì
nh tự gen
16S rDNA................................................................................................ 28
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 30
3.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh PhúThọ ........... 30
3.2. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang .................................. 32
3.2.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây Màng tang....... 32
3.2.2. Đa dạng xạ khuẩn trên cây Màng tang theo môi trƣờng phân lập 33
3.2.3. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty .... 34

3.3. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh ................... 35
3.3.1. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn ................... 35
3.3.2. Xác định gen mãhóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và
nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp
kháng sinh ....................................................................................... 39


v

3.3.3. Khả năng sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline .............. 41
3.4. Đặc điểm sinh học vàphân loại của chủng xạ khuẩn MPT28 ................. 42
3.4.1. Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 ................................. 43
3.4.1.1. Đặc điểm hình thái vàbề mặt chuỗi bào tử ....................... 43
3.4.1.2. Đặc điểm sinh hóa.............................................................. 44
3.4.1.3. Ảnh hƣởng của nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả năng
sinh trƣởng của xạ khuẩn ................................................................ 45
3.4.2. Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA của
chủng xạ khuẩn MPT28 .......................................................................... 46
3.4.2.1. Khuếch đại gen 16S rDNA ................................................ 46
3.4.2.2. Giải trì
nh tự đoạn gen 16S rDNA ..................................... 46
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 48
4.1. Kết luận .................................................................................................... 48
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 48
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 57


vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hì
nh thuộc nhóm
anthracycline: DOX, DNR, EPI vàIDA ......................................................... 21
Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập trên một
số môi trƣờng đặc hiệu sau 6 tuần nuôi cấy....................................................30
Hình 3.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân bố trên các bộ phận của cây Màng
tang .................................................................................................................. 32
Hình 3.3. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang đƣợc phân lập trên các
loại môi trƣờng khác nhau .............................................................................. 33
Hình 3.4. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh đƣợc phân theo nhóm màu ...... 35
Hình 3.5. Hoạt tí
nh kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A)
Bacillus cereus ATCC 11778 (B) của các chủng xạ khuẩn nội sinh ............... 37
Hình 3. 6. Sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I, pks-II của một số chủng xạ
khuẩn nội sinh đại diện ................................................................................... 39
Hình 3. 7. Sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps của một số chủng xạ khuẩn nội
sinh đại diện .................................................................................................... 40
Hình 3. 8. Hình thái khuẩn lạc (A) trên môi trƣờng ISP1 vàbề mặt chuỗi bào
tử (B) dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần của chủng
MPT28 ............................................................................................................. 44
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel
agarose 1,0% ................................................................................................... 46


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội
sinh trên thực vật ............................................................................................... 9
Bảng 1.2. Xạ khuẩn mới đƣợc phân lập từ các cây dƣợc liệu ........................ 14

Bảng 1.3. Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh ...................................... 16
Bảng 1.4. Tần xuất xuất hiện gen pks-I, nrps trong các phân nhóm xạ khuẩn
khác nhau.........................................................................................................19
Bảng 2.1. Trì
nh tự cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen
16S rDNA………………………………………………………………........28
Bảng 3.1. Đặc điểm hì
nh thái của các chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân
lập từ mẫu cây Màng tang...............................................................................31
Bảng 3.2. Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 25
chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây Màng tang ...................................... 36
Bảng 3.3. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn .... 37
Bảng 3.4. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS và khả năng sinh
anthracycline của 14 chủng xạ khuẩn nội sinh ............................................... 41
Bảng 3.5. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của chủng MPT28 ............ 42
Bảng 3.6. Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT28 khi nuôi cấy trên các môi
trƣờng khác nhau ............................................................................................. 43
Bảng 3.7. Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nitơ của chủng xạ khuẩn MPT28
sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C ....................................................................... 44
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trƣởng của
chủng MPT28 .................................................................................................. 45
Bảng 3.9. Trì
nh tự gen mãhóa 16S rDNA của chủng MPT28 ....................... 47


viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
STT

Từ viết tắt

Tên đầy đủ

1

ACCd

Aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase

2

ACP

Acyl carrier protein

3

AT

Acyl transferase

4

CA

Citrate acid-agar

5

DAB

Deacetil baceatin

6

DNA

Deoxyribonucleotide acid

7

DNR

Daunorubicin

8

DOX1

Doxorubicin

9

EPI

Epirubicin

10

HGT

Horizontal gene transfer

11

HV

Humic acid-agar

12

IAA

Indol-3-acetic acid

13

IDA

Idarumycin

14

KS

Ketosynthase

15

MRSA

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

16

NaOCl

Sodium hypochlorite

17

NRPS

Nonribosomal peptide synthetase

18

PKS

Ppolyketide synthase

19

PKS-I

Polyketide synthase I

20

PKS-II

Polyketide synthase II

21

RNA

Ribonucleic acid

22

RA

Raffinose-histidine agar

23

SPA

Sodium propionate-asparagine-salt agar

24

VSV

Vi sinh vật


1

MỞ ĐẦU
Vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng thuốc kháng sinh là vấn đề
nghiêm trọng vàthu hút mối quan tâm rất lớn của cộng đồng. Vìvậy, việc
nghiên cứu, lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên là ƣu tiên
hàng đầu của các nhàkhoa học vàcác công ty dƣợc phẩm trên thế giới. Cho
đến nay, các nhàkhoa học vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự
nhiên khác nhau để phát triển các loại thuốc kháng sinh cũng nhƣ các loại
thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu những tác dụng
phụ tới sức khỏe của ngƣời bệnh do một số thuốc tổng hợp hóa học gây ra.
Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật là một nguồn tự nhiên quan
trọng trong điều trị các bệnh gây ra bởi vi sinh vật vàhỗ trợ điều trị chống
ung thƣ. Chẳng hạn, cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) làcây bụi
thuộc họ Lauraceae, trong quả Màng tang rất giàu tinh dầu, lƣợng tinh dầu tối
đa trong quả làkhoảng 5% trọng lƣợng tƣơi. Thành phần chính của tinh dầu
làcitral cóhoạt tính sinh học nhƣ chống viêm, chống oxy hóa, diệt côn trùng,
kháng khuẩn, chống ung thƣ. Cây quế (Cinamomum loureiri) chứa dƣợc chất
trong tinh dầu của lá, vỏ cây vàquả với 90% làcinnamaldehyde cóhoạt tí
nh
kháng khuẩn cao đối với cả vi khuẩn Gram (+) vàvi khuẩn Gram (-). Ngoài
giá trị khoa học, thành phần của cây mang lại, cây dƣợc liệu còn là môi
trƣờng cho các xạ khuẩn nội sinh (sống trong các loại mô thực vật) có khả
năng sinh tổng hợp chất kháng sinh. Theo các nghiên cứu, ƣớc tí
nh khoảng
70% các kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên đƣợc sử dụng trong y học lâm
sàng hiện nay đƣợc sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn. Gần đây, một số công bố cho
thấy các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do xạ khuẩn nội sinh tạo ra trên cây
dƣợc liệu không chỉ có số lƣợng phong phú màcòn có sự đa dạng về chức
năng nhƣ tính kháng vi sinh vật, chống ôxi hóa, chống sốt rét vàkiểm soát
sinh học. Tuy nhiên, số lƣợng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây

Màng tang nói riêng và cây dƣợc liệu nói chung tại Việt Nam vẫn còn rất hạn
chế. Xuất phát từ những định hƣớng trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề


2

tài: “Phân lập, đánh giá đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ
khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh PhúThọ”.
Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ
sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, gồm 3 nội dung
chính:
- Phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng
tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ.
- Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định các chủng xạ
khuẩn nội sinh và xác định sự có mặt của ba gen mã hóa các
enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh gồm
polyketide synthases I (PKS-I), polyketide synthases II (PKS-II)
vànonribosomal peptide synthetase (NRPS).
- Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một
chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao.


3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu
1.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh
Hiện nay, nhiều công trì
nh nghiên cứu trên thế giới công bố về tƣơng
tác giữa thực vật vàvi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò nhƣ tác

nhân ức chế sinh vật gây bệnh, tổng hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật,
phân giải phospho khóhoàtan, cố định nitơ tự do, tăng độ phìcủa đất... [16],
[53]. Phần lớn các VSV bao gồm vi khuẩn, nấm mốc vàxạ khuẩn đƣợc phân
lập từ đất, vùng rễ, bề mặt hoặc trong các môthực vật.
Khái niệm xạ khuẩn nội sinh đƣợc đƣa ra khi Smith và cộng sự (1957)
phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế nấm
gây bệnh Fusarium oxysporum trong môcây càchua không nhiễm bệnh [58].
Từ đó, đã có nhiều định nghĩa khác nhau về VSV nội sinh nhƣng định nghĩa
của Bacon vàWhite (2000): „„VSV nội sinh lànhững VSV sinh trƣởng trong
mô tế bào thực vật, không gây ra những hiệu ứng xấu tới cây chủ‟‟ đã đƣợc
các nhàVSV học thừa nhận [11]. Theo tài liệu, định nghĩa này hàm chứa một
ý rất quan trọng: VSV nội sinh không những không gây ảnh hƣởng màcòn
tăng cƣờng khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trƣởng, miễn dịch cho vật
chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất... [9].
Trong số các VSV nội sinh, xạ khuẩn đƣợc chú ý bởi khả năng tổng
hợp kháng sinh ức chế VSV gây bệnh [39]. Song song với tác dụng dƣợc lý
thu nhận từ xạ khuẩn nội sinh, một số nhà sinh vật học đã nghiên cứu khả
năng kiểm soát sinh học (biocontrol) của xạ khuẩn nội sinh trong suốt hai thập
kỷ qua [61], [62]. Xạ khuẩn đã đƣợc chứng minh khả năng tăng cƣờng, thúc
đẩy tăng trƣởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cƣờng
khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau [4]. Những hiểu
biết về sinh lý vàmối tƣơng tác phân tử giữa xạ khuẩn vàthực vật lànhững
đặc tí
nh quan trọng để khai thác những đặc tí
nh cólợi của xạ khuẩn nội sinh
trong kích thích sinh trƣởng thực vật và lĩnh vực khác.


4

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai tròquan trọng của xạ
khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh
trong môthực vật làrất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất
cóhoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực
của đời sống. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh đƣợc
chứng minh làrất đa dạng về mặt số lƣợng vàhoạt tính sinh học nhƣ: các chất
kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng ung thƣ, chống oxy hóa, chống
sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trƣởng... [11], [51]. Vìvậy, nghiên
cứu sàng lọc các hợp chất cóhoạt tính sinh học nói chung vàhoạt tí
nh kháng
sinh nói riêng từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu tự nhiên đang là hƣớng
nghiên cứu triển vọng của các nhàkhoa học trên thế giới.
1.1.2. Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh
Xạ khuẩn cƣ trú trong mô thực vật bị ảnh hƣởng lớn bởi các yếu tố môi
trƣờng nhƣ: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất,
lƣợng mƣa, cƣờng độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ... Thêm vào đó,
mật độ xạ khuẩn nội sinh nhìn chung thấp và phụ thuộc vào loại mô khác
nhau trên thực vật [50].
Theo các công trình công bố, quátrình phân lập xạ khuẩn nội sinh cần
xử lýbề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt. Do đó, phải
khử trùng bề mặt mẫu và cắt mẫu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử
trùng trƣớc khi phân lập. Sodium hypochlorite (NaOCl) làmột trong những
tác nhân oxy hóa phổ biến đƣợc sử dụng để khử trùng bề mặt. Mẫu thực vật
đƣợc ngâm trong ethanol 70-99% từ 1-5 phút và1-5% NaOCl trong khoảng
3-20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nƣớc vô trùng nhằm loại bỏ lƣợng
NaOCl còn dƣ. Ngoài ra, hydro peroxide và clorua thủy ngân cũng đƣợc sử
dụng nhƣ chất khử trùng bề mặt hiệu quả [43]. Năm 1992, Sardi và cộng sự
công bố sử dụng hơi của propylen oxit để khử trùng bề mặt thay vìhóa chất
khử trùng dạng lỏng [62]. Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý
bề mặt chỉ với ethanol không hiệu quả với qua trì

nh phân lập VSV nội sinh.
Nếu tăng gấp hai hoặc ba lần các bƣớc khử trùng bề mặt bằng hỗn hợp


5

ethanol vàmột số chất khử trùng khác thìkhông phân lập đƣợc xạ khuẩn nội
sinh. Hiệu quả khử trùng bề mặt đƣợc tăng cƣờng bằng việc sử dụng các chất
hoạt hóa bề mặt nhƣ Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của
chất khử trùng với bề mặt thực vật [13].
Phần mẫu đã khử trùng đƣợc đặt vào trên môi trƣờng thạch thí
ch hợp,
nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C. Trong quátrì
nh phân lập, các nhà
nghiên cứu thƣờng gặp phải làVSV phát triển mạnh trong hai tuần đầu tiên là
vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật. Để ngăn chặn sự sinh
trƣởng của vi khuẩn vànấm không mong muốn cũng nhƣ tìm kiếm loài xạ
khuẩn mới, một số môi trƣờng chọn lọc đã đƣợc sử dụng nhƣ: môi trƣờng
thạch humic acid-vitamin, môi trƣờng thạch casein tinh bột, cao nấm men,
môi trƣờng S… [14], [35], [39]. Ngoài ra, bổ sung các hợp chất kháng sinh
nhƣ acid nalidixic và trimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide để ức chế vi
khuẩn, nấm nội sinh vànâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vì
xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn vànấm [30], [51].
1.1.3. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật
Phần lớn xạ khuẩn nội sinh cóthể sống trong các môthực vật vàkhông
gây bệnh hoặc tác động bất lợi tới quátrình phát triển bình thƣờng của cây.
Ngoài ra, xạ khuẩn nội sinh còn đƣợc nhiều nhàkhoa học nghiên cứu về khả
năng sinh kháng sinh, chất kháng ung thƣ, enzyme, chất kí
ch thích sinh
trƣởng thực vật, ức chế vàkiểm soát bệnh thực vật...

1.1.3.1. Kháng ung thư, kháng viêm
Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tí
nh kháng,
ức chế tế bào ung thƣ từ xạ khuẩn nội sinh đang là hƣớng nghiên cứu mới của
các nhàkhoa học trên thế giới. Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội sinh
có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây chủ. Một số giả thuyết nhận định
rằng gen liên quan tới tổng hợp các hợp chất cóhoạt tí
nh sinh học đƣợc tiếp
nhận từ quá trình trao đổi chất giữa VSV và thực vật thông qua hệ thống
chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT). Nhờ đó các nhà VSV học
đã mở ra triển vọng sản xuất các hợp chất sinh học cónguồn gốc từ thực vật


6

nhờ quátrì
nh nuôi cấy VSV, vídụ nhƣ chất kháng tế bào ung thƣ paclitaxel
phổ biến trên cây thông đỏ (Taxus sp.) đƣợc tách chiết từ xạ khuẩn
Kitasatospora sp. vàmột số nấm cộng sinh khác [39].
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh
mới trên xạ khuẩn nội sinh có tỷ lệ khácao so với xạ khuẩn phân lập từ đất
hoặc bề mặt thực vật. Chẳng hạn kháng sinh mới cótên naphthomycin K (dẫn
xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) đƣợc phát
hiện lần đầu tiên từ Streptomyces sp. CS nội sinh trong cây mỹ đăng mộc
(Maytenus hookeri) - loại cây thuốc cótác dụng điều trị ung thƣ, hoạt huyết...
Kết quả kiểm tra hoạt tí
nh sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính
gây độc ức chế dòng tế bào P388 vàA-549 ở nồng độ ức chế lần lƣợt là0,07
và 3,17 µM, nhƣng không có hoạt tí
nh kháng Staphylococcus aureus và vi

khuẩn lao [40], [72].
Ngoài ra, năm chất mới thuộc phân lớp 16 của nhóm macrolide đƣợc
tách chiết vàcho kết quả ức chế mạnh dòng tế bào MDA-MB-435 trong điều
kiện in vitro [72]; hai chất mới thuộc nhóm macrolide thu nhận từ
Streptomyces sp. ls9131 gần đây đƣợc phân lập trên cây mỹ đăng mộc (M.
hookeri), trong đó hợp chất dimeric dinactin có tác động kháng ung thƣ mạnh
vàhoạt tính kháng nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cao [40].
Trƣớc đây, hai hợp chất 5, 7-dimetoxy-4-phenylcoumarin và 5, 7dimetoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ
mạnh, thƣờng thu nhận từ nhiều loài thực vật khác nhau. Nhƣng gần đây,
nhiều công trì
nh công bố rằng hai hợp chất này cũng đƣợc tìm thấy trong S.
aureofaciens CMUAc130 nội sinh [63], [64]. Hoạt tính kháng ung thƣ của hai
chất trên không chỉ hì
nh thành nhóm nitric oxide, prostaglandin E2 và tác
nhân hoại tử khối u (TNF-α), mà còn cảm ứng nitric oxide synthase và
cyclooxygenase-2 trong lipopolysaccharide gây đại thực bào tế bào RAW
264,7. Tác dụng ức chế phụ thuộc vào nồng độ chất vàức chế sự hì
nh thành
TNF-α [63].


7

Do vậy, hiện nay xạ khuẩn nội sinh lànguồn tiềm năng cần đƣợc quan
tâm nhằm khai thác các chất cóhoạt tí
nh sinh học mới và thúc đẩy tìm kiếm
các loại thuốc mới.
1.1.3.2. Kiểm soát sinh học
Trong những năm gần đây, xạ khuẩn nội sinh đã thu hút sự chú ý của
các nhàVSV bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với mầm bệnh do đặc tí

nh
nội sinh và tổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng VSV gây bệnh. Nhiều
nghiên cứu chứng minh đặc tính bảo vệ cây chủ của xạ khuẩn nội sinh chống
lại các VSV gây bệnh từ đất nhƣ Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae,
Plectosporium tabacinum, Gaeumannomyces graminis var. tritici, F.
oxysporum, Pythium aphanidermatum và Colletotrichum orbiculare [13],
[18], [23], [24].
Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào các sản phẩm trao đổi
chất nhƣ chất kháng sinh, enzyme thủy phân, phytohormone... Ngoài ra, các
chủng xạ khuẩn giúp tăng cƣờng hệ thống miễn dịch đối với thực vật nhờ kí
ch
thích các thụ thể tế bào. Vídụ nhƣ chủng S. galbus R-5 không chỉ sinh
cellulase, pectinase mà còn sản xuất actinomycin X2 và fungichromin giúp
tăng cƣờng sức đề kháng trong cây đỗ quyên, tăng cƣờng sản sinh jasmonate
kích thích hệ thống miễn dịch [57].
Conn và cộng sự (2008) công bố kết quả nghiên cứu gây nhiễm
Streptomyces sp. EN27 và Micromonospora sp. EN43 trên hạt giống cây
Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh
Erwinia carotovora vàF. oxysporum; kí
ch hoạt biểu hiện gen tổng hợp acid
jasmonic, acid salicilic vàetylen [17]. Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với
các cây chủ vàcác sản phẩm tự nhiên cóhoạt tí
nh sinh học đƣợc sinh ra bởi
xạ khuẩn nội sinh giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu cótiềm năng ứng dụng
trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng.
1.1.3.3. Một số dược chất khác từ xạ khuẩn nội sinh
Ngoài đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất thông
qua các enzyme thủy phân ngoại bào và khả năng sinh chất kháng sinh đã

8

đƣợc khoa học biết đến từ lâu. Gần đây, các nghiên cứu trên xạ khuẩn còn
phát hiện ra nhiều sản phẩm trao đổi chất của nhóm VSV này có ý nghĩa rất
quan trọng đối với sức khỏe con ngƣời.
Một số chủng xạ khuẩn cókhả năng sinh chất pháhủy tế bào hồng cầu
của động vật (nhƣ haemolysin ở Rhodococcus equi). Các nhà khoa học đã
phát hiện tiềm năng rất lớn của các hợp chất này trong xạ khuẩn cótác dụng
làm tan những phần máu đông tụ ở những ngƣời bị bệnh tim mạch. Trong
phòng thínghiệm, việc sàng lọc các chất có hoạt tính chống đông máu (phá
hủy hồng cầu) từ xạ khuẩn đƣợc tiến hành trên mẫu máu động vật nhƣ máu
ngựa, máu thỏ [53].
Một vídụ khác làviệc tạo ra các hợp chất cókhả năng chống lại các tác
nhân gây oxy hóa, làm tăng tuổi thọ của tế bào. Nguyên lýhoạt động của các
chất chống ôxy hóa tìm thấy ở xạ khuẩn cũng tƣơng tự nhƣ axit ascorbic
(vitamin C) hay tocopherol (vitamin E), tức làtrung hòa thể oxy hóa rất cao
của các hợp chất oxy hóa (đƣợc tạo ra trong quá trình trao đổi chất của tế bào
hay dƣới tác dụng của tia cực tím) vàlàm giảm tác dụng oxy hóa của chúng
[61].
Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Sri đã phân lập 65 xạ khuẩn nội sinh
trên 13 cây dƣợc liệu chữa bệnh tiểu đƣờng nhƣ cây lô hội (Alloe vera), dây
ký ninh (Tinospora crispa), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata), nghệ
xanh (Curcuma aeruginosa), rau má(Centela asiatica)... Trong đó, các chủng
thể hiện hoạt tính alpha glucosidase ức chế quátrì
nh thủy phân tinh bột thành
glucose thẩm thấu vào ruột non. Kết quả nghiên cứu trên đã tuyển chọn đƣợc
chủng BWA65 có hoạt tí
nh ức chế alpha glucosidase gấp hơn hai lần so với
chất cóhoạt tính tƣơng tự thu đƣợc từ dịch chiết cây dây kýninh [60].
Mặc dù ý nghĩa khoa học của các hợp chất trao đổi chất kể trên đối với

sự sinh trƣởng và cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trƣờng tự nhiên còn
chƣa rõ ràng nhƣng tác dụng màchúng mang lại trong lĩnh vực y dƣợc, dƣợc
phẩm, nông nghiệp đã đƣợc chứng minh. Chính vìlý do này, các nhàkhoa


9

học hiện nay rất quan tâm tới việc sàng lọc các hợp chất cóhoạt tí
nh sinh học
cao từ xạ khuẩn nói chung vàxạ khuẩn nội sinh nói riêng.
1.1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh
1.1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trong vài thập kỷ qua đã chứng kiến nhiều thành tựu trong tìm kiếm
các loài xạ khuẩn vàcác hợp chất mới cóhoạt tính sinh học từ xạ khuẩn trong
môtế bào thực vật. Do tiềm năng ứng dụng lớn của xạ khuẩn nội sinh nên đối
tƣợng VSV này đang đƣợc quan tâm vànghiên cứu ở nhiều nƣớc trên thế giới
nhƣ: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản… Sơ lƣợc về tì
nh
hì
nh nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thực vật trong hơn 10 năm gần đây
đƣợc thể hiện trong bảng 1.1 [51].
Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội
sinh trên thực vật
Loài thực vật

Chi xạ khuẩn

Tài liệu tham
khảo

Cây trồng
Lúa mì

Streptomyces, Microbispora,

[18]

(Triticum aestivum)

Micromonospora, Nocardioides

Dƣa leo

Streptomyces

[57]

Ngô

Microbispora, Streptomyces,

[10]

(Zea mays)

Streptosporangium

(Cucumis sativus)

Cây dƣợc liệu

Cơm cháy

Glycomyces

[51]

Riềng nếp

Streptomyces, Nocardia, Microbispora,

[64]

(Alpinia galangal)

Micromonospora

Mộc lan

Streptomyces

[14]

Sầu đâu

Streptomyces, Streptosporangium,

[31]

(Azadirachta indica)

Microbispora, Streptoverticillium,

(Sambucus adnata)

(Kennedia nigricans)

Saccharomonospora, Nocardia


10

Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong môthực vật rất phong phúhứa
hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tí
nh sinh học do các chủng xạ
khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực đời sống. Tuy nhiên, so với sự đa dạng
của giới thực vật, số lƣợng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật
vẫn còn rất hạn chế.
Trong hơn 10 năm gần đây (2001-2012), các nhàkhoa học thuộc Viện
VSV học Vân Nam, Trung Quốc đã không ngừng nghiên cứu, cải tiến, tối ƣu
hóa các điều kiện phân lập và đƣa vào bảo tàng giống hơn 5.000 chủng xạ
khuẩn nội sinh phân lập từ hơn 100 loài thực vật [50]. Các hợp chất chuyển
hóa thứ cấp do các chủng xạ khuẩn này sinh ra cũng đƣợc chứng minh làrất
đa dạng về mặt số lƣợng vàhoạt tính sinh học nhƣ các chất kiểm soát sinh
học, chất kháng VSV, kháng tế bào ung thƣ, chống oxy hóa, chống sốt rét,
chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trƣởng… Khi nghiên cứu về đa dạng sinh
học xạ khuẩn nội sinh, nhóm nghiên cứu của Chen và cộng sự thuộc Viện
VSV học Vân Nam, Trung Quốc đã khẳng định xạ khuẩn nội sinh trên cây
dƣợc liệu tại rừng nhiệt đới vô cùng phong phú. Theo đó, Chen vàcộng sự đã
thu nhận 2174 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng khác nhau từ 90 loại cây
dƣợc liệu tại rừng nhiệt đới Xishuangbanna và xác định đƣợc có 19 loài xạ

khuẩn mới [15].
Cũng từ những chủng xạ khuẩn đƣợc phân lập trên các cây dƣợc liệu
tại vùng Vân Nam, Trung Quốc nói trên, rất nhiều hợp chất mới đã đƣợc phát
hiện nhƣ: 9-hydroxybafilomycin D, 29-hydroxybafilomycin D, bafilomycin D,
bafilomycin E, bafilomycin A1, bafilomycin B1, bafilomycin B2, bafilomycin
C1, bafilomycin C2, bafilomycin C1 amide, bafilomycin C2 amide; caryolane1,7α-diol, 1,6,11-eudesmanetriol, 11-eudesmene-1,6-diol, 7,4 dihydroxy-8(hydroxymethyl)-1 methoxy-isoflavones, Tripstretine … [12].
1.1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu về VSV nội sinh nói chung và
xạ khuẩn nói riêng. Một số nghiên cứu khác về vi khuẩn, nấm nội sinh có thể
đƣợc tóm tắt nhƣ sau:


11

Nhóm nghiên cứu của Lê Mai Hƣơng tại Viện Hóa hợp chất thiên nhiên
đã thăm dò khả năng tạo chất taxol từ cây thông đỏ (Taxus sp.) ở Việt Nam và
tách chiết một chất gần giống 10-deacetil baceatin III (10-DAB)-chất chuyển
hóa thành taxol. Từ thân cây, nhóm nghiên cứu đã phân lập đƣợc 6 chủng
nấm, trong đó một chủng thuộc loài Mucor circinolloides var. tieghem. Chất
tách chiết từ dịch lên men của chủng nấm nội sinh có đặc điểm gần giống với
10-DAB từ cây thông đỏ. Từ kết quả đó, có thể khẳng định những sản phẩm
trao đổi chất có hoạt tính sinh học không chỉ đƣợc tạo ra từ cây chủ mà còn có
thể tạo ra bởi VSV nội sinh [3].
Từ 54 mẫu cây lúa (Oryza sativa L.) trồng ở 7 huyện và thành phố Tuy
Hòa, Phú Yên, nhóm nghiên cứu của Cao Ngọc Điệp đã phân lập 191 chủng
vi khuẩn nội sinh, trong đó 27 chủng thuộc các chi Burkholderia,
Enterobacter, Bacillus có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp
indol-3-acetic acid (IAA) tốt [7].
Năm 2013, Hoàng Hoa Long và cộng sự đã phân lập chủng vi khuẩn
Bacillus sp. B55 trên cây thuốc lá (Nicotiana attenuata) làm tăng khả năng

sống sót và kích thích sinh trƣởng của cây chủ trong điều kiện tự nhiên có thể
thông qua một số cơ chế nhƣ tổng hợp IAA, 1-aminocyclopropane-1carboxylic acid deaminase (ACCd) và hòa tan phosphat vô cơ. Ngoài ra, đặc
tính kích thích sinh trƣởng cây chủ của chủng vi khuẩn này có quan hệ mật
thiết đối với mật độ chúng bên trong mô cây chủ [5].
Năm 2014, Quách Ngọc Tùng và cộng sự đã phân lập đƣợc 78 chủng
xạ khuẩn nội sinh trên các mẫu cây quế thu thập tại xã Thung Nai, huyện Cao
Phong, tỉnh Hòa Bình. Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của 78 chủng xạ
khuẩn nội sinh cho thấy 16 chủng có khả năng sinh kháng sinh [8].
Năm 2015, Khieu Thi Nhan và cộng sự đã phân lập đƣợc 98 chủng xạ
khuẩn nội sinh trên mẫu cây Long huyết thu thập tại Cúc Phƣơng, Ninh Bình
và 33 chủng xạ khuẩn nội sinh trên mẫu cây Long huyết thu thập tại Bạch Mã,
Thừa Thiên Huế [33].


12

Theo thống kê của Viện Dƣợc liệu, Việt Nam đã phát hiện 4.000 loài
cây thuốc, trong đó có nhiều loại dƣợc liệu quý đƣợc thế giới công nhận nhƣ
cây hồi, quế, atiso, sâm Ngọc Linh... Cho đến nay, trên thế giới và Việt Nam
các công trình nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh, cũng nhƣ về đánh giá đa dạng
xạ khuẩn trên cây Màng tang vẫn còn rất hạn chế.
1.2. Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật
Xạ khuẩn sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và
hạt) của cây chủ vàchủ yếu cƣ trú trong khoảng không giữa các môhoặc nội
bào. Đáng chú ý, thực vật cókhoảng 300.000 loài trên trái đất, mỗi loài thực
vật là nơi cƣ trú của rất nhiều loài xạ khuẩn nội sinh tạo nên sự đa dạng sinh
học [61]. Tuy nhiên, chỉ cómột phần nhỏ thực vật liên quan đến xạ khuẩn nội
sinh đã đƣợc nghiên cứu nên cơ hội để tì
m ra các loài mới vàsản phẩm có
hoạt tí

nh sinh học cónguồn gốc từ tự nhiên làrất lớn. Những nghiên cứu gần
đây đã khẳng định sự đa dạng vàphong phúcủa xạ khuẩn nội sinh vàcác hợp
chất có hoạt tí
nh sinh học [13]. Xạ khuẩn nội sinh đã và đang đƣợc các nhà
khoa học trên thế giới nghiên cứu về tiềm năng ứng vàứng dụng trong lĩnh
vực y học, nông nghiệp vàcông nghiệp [41].
Hiện nay, xạ khuẩn nội sinh đƣợc phân lập từ nhiều loài cây trồng nhƣ
lúa mì, gạo, khoai tây, càrốt, càchua, cây gỗ, nho, rêu và dƣơng xỉ... [32],
[51], [52]. Cũng nhƣ xạ khuẩn phân lập từ đất, tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh thuộc
chi Streptomyces chiếm hơn 50%, tiếp theo là các chi Microbispora,
Micromonospora, Nocardioide, Nocardia vàStreptosporangium [51].
Các nghiên cứu về đa dạng xạ khuẩn nội sinh đƣợc công bố bởi các
nhóm nghiên cứu khác nhau từ Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ... Tan vàcộng
sự (2006) đã phân lập đƣợc 619 chủng xạ khuẩn từ các loại cây càchua khác
nhau vàtất cả các chủng đó đều thuộc chi Streptomyces [66]. Từ 36 cây dƣợc
liệu ở Thái Lan, nhóm nghiên cứu của Taechowisan đã phân lập đƣợc 330
chủng xạ khuẩn thuộc 4 chi khác nhau (Streptomyces, Microbispora,
Nocardia, Micromonospora) [65]. Inderiati và Muliani (2008) đã phân lập
đƣợc các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces từ cây thuốc lá[61]. Hơn


13

nữa, Verma vàcộng sự (2009) cho thấy Streptomyces sp. chiếm khoảng 50%
trong tổng số 55 chủng thu nhận từ cây sầu đâu (Azadirachta indica A. Juss)
tại Ấn Độ [32]. Tổng hợp các nghiên cứu trên cho thấy Streptomyces sp. có
khả năng thích ứng, phát triển mạnh hơn so với các xạ khuẩn thuộc chi khác.
Trái với kết quả trên, nhóm nghiên cứu của giáo sƣ Li thuộc Viện VSV
học Vân Nam, Trung Quốc đã kết luận Microbispora chiếm 67% trên tổng số
81 chủng xạ khuẩn từ rễ cây bắp cải Trung Quốc (Brassica rapa), tiếp theo là

Streptomyces spp. (12,0%) và Micromonospora spp. (11,0%). Takahashi và
Omura (2003) phân lập 33 chủng Microbispora, 32 chủng Streptomyces và10
xạ khuẩn hiếm khác từ lárụng thuộc chín chi của thực vật bậc cao [51]. Theo
Kizuka vàcộng sự (1998), tỷ lệ phân lập Microbispora từ thực vật cao hơn
đất nhiều lần [34]. Nhƣ vậy, chi Streptomyces và Microbispora dƣờng nhƣ
sinh trƣởng trên môi trƣờng đất vànội sinh mặc dù chỉ có một số lƣợng hạn
chế các loài cóthể tồn tại theo cả hai phƣơng thức này.
Phần lớn tỷ lệ phân lập xạ khuẩn nội sinh từ rễ cao hơn các bộ phận
khác trong cây. El-Tarabily vàcộng sự (2006) ƣớc tí
nh mật độ xạ khuẩn nuôi
cấy đƣợc trong dƣa chuột (Cucummis sativus) vàrễ của cây họ đậu (Glycine
max) đạt 105 CFU/g khối lƣợng củ/rễ tƣơi [24]. Tian và cộng sự (2007) đã
phân tí
ch 45 gen 16S rDNA và33 mẫu gen tách dòng từ xạ khuẩn phân lập
trên rễ vàthân cây, thu đƣợc 9 chi xạ khuẩn khác nhau từ rễ và4 chi xạ khuẩn
từ thân [51]. So với thân vàlá, tập hợp các chủng xạ khuẩn phân loại từ rễ
nhìn chung đa dạng hơn.
Cho đến nay, hơn 40 loài xạ khuẩn mới đã đƣợc tìm thấy bằng nhiều
phƣơng pháp phân lập và phân loại khác nhau, bao gồm 4 chi mới thuộc
nhóm Plantactinospora, Actinophytocola, Phytohabitans vàJishengella. Tì
nh
hì
nh phân lập các chủng xạ khuẩn mới trên cây dƣợc liệu thể hiện ở bảng 1.2
[51].


14

Bảng 1.2. Xạ khuẩn mới đƣợc phân lập từ các cây dƣợc liệu
Mãsố của gen

16S rDNA

Trì
nh tự gen
Xạ khuẩn

Cây dƣợc liệu

16S rDNA
đƣợc so sánh

trên GenBank

(%)
AJ784008

DQ343154

GU227146

DQ460469

EU200682

EU814511

Micromonospora

Mãtang

M. endolithica

coriariae

(Coriaria myrtifolia)

(98,94%)

Pseudonocardia

Núc nác

P. halophobica

oroxyli

(Oroxylum indicum)

(97,8%)

Pseudonocardia

Thanh hao hoa vàng

P. saturnea

artemisiae

(Artemisia annua L.)

(96,6%)

Glycomyces

Cơm cháy

sambucus

(Sambucus adnata Wal) (97,2%)

Glycomyces

Cam thảo nam

G. algeriensis

scopariae

(Scoparia dulcis)

(97,4%)

Streptomyces

Dóbầu

G. algeriensis

mayteni

(Maytenus

(97,1%)

G. lechevalierae

austroyunnanensis)
EU429322

FJ805428

DQ473536

Actinoallomurus

Keo látràm

A. caesius

acaciae

(Acacia Auriculiformis)

(99,3%)

Nocardia

Thông đỏ

N. nova

callitridis

(Callitris preissii)

(97,4%)

Leifsonia

Nhân sâm

L. poae

ginsengi

(Ginseng)

(97.6%)

Những hiểu biết về đa dạng của xạ khuẩn nội sinh không chỉ giúp sàng
lọc những chủng có lợi màcòn giúp các nhàkhoa học hiểu rõ vai trò chúng
trong hệ sinh thái. Strobel vàDaisy (2003) cho rằng sự đa dạng lớn nhất của
xạ khuẩn nội sinh diễn ra ở khu vực nhiệt đới vàkhu vực cónhiệt độ ấm [62].
Janso vàCarter (2010) công bố kết quả phân lập 123 xạ khuẩn nội sinh từ các
loài cây nhiệt đới thu từ một số địa điểm ở Papua New Guinea và Đảo
Mborokua, quần đảo Solomon. Nhóm nghiên cứu đã tìm thấy 17 chi xạ


15

khuẩn khác nhau khi phân tích trì
nh tự gen 16S rDNA vàphát hiện chi mới
nhƣ Sphaerisporangium vàPlanotetraspora. Phân tích cây phát sinh loài cho
thấy, nhiều chủng xạ khuẩn mới thuộc chi Thermomonosporaceae và
Micromonosporaceae [51].
Tổng hợp các nghiên cứu cho thấy rừng nhiệt đới sở hữu sự đa dạng
sinh học lớn nhất trên thế giới về tài nguyên thiên nhiên vàVSV nội sinh. Tại
rừng nhiệt đới Xishuangbanna của Trung Quốc đã có 2174 xạ khuẩn nội sinh
đƣợc phân lập từ những cây thuốc với các phƣơng pháp phân lập khác nhau
dựa trên quátrì
nh tiền xử lý mẫu, môi trƣờng phân lập. Các chủng này đại
diện cho 10 Bộ phụ khác nhau và32 chi, phát hiện ít nhất 19 loài mới [29],
[51]. Trong đó, một chi mới vàhai loài mới đƣợc phân lập trên cây dó bầu
(Maytenus austroyunnanensis). Rõràng, tại rừng nhiệt đới cónguồn xạ khuẩn
phong phú và đa dạng hơn nhiều so với các khu vực khác vàhứa hẹn lànguồn
phát hiện các chủng xạ khuẩn mới. Xạ khuẩn nội sinh rất đa dạng vàmức độ
đa dạng cóthể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu vàcác loài thực vật khác nhau.
Sự đa dạng về chi và số lƣợng xạ khuẩn nội sinh phần lớn phụ thuộc vào
phƣơng pháp phân lập.
1.3. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc
liệu
1.3.1. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh
Chất kháng sinh đã đƣợc phát hiện vàứng dụng để chữa bệnh cho con
ngƣời. Nhờ kháng sinh mà chúng ta đã đẩy lùi đƣợc nhiều bệnh vàdịch bệnh
nguy hiểm nhƣ: tả, đậu mùa, thƣơng hàn… Phần lớn các chất kháng sinh
đƣợc sử dụng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Trong số 8.000 chất
kháng sinh đã đƣợc biết đến trên thế giới thìtrên 80% làdo xạ khuẩn sinh ra.
Nhiều loài xạ khuẩn nội sinh, đặc biệt lànhững loài đƣợc phân lập từ
cây dƣợc liệu cókhả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh nhƣ
vi khuẩn, nấm và virus. Nhƣ vậy, xạ khuẩn nội sinh cótiềm năng để phát triển

các loại thuốc kháng sinh mới (Bảng 1.3).


16

Bảng 1.3. Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh
Xạ khuẩn

Cây dƣợc liệu

Kháng sinh

Hoạt tí
nh

Streptomyces sp.
NRRL 30562

Hoa mộc lan

Munumbicins A-D

Kháng sinh

Streptomyces sp.
NRRL 30566

Cơm vàng

Kakadumycins

Kháng sinh

Streptomyces sp.
CS

Mỹ đăng mộc

24-demethylbafilomycin A2

Kháng sinh,

Streptomyces

Vẹt dù

Antimycin A18

Kháng nấm

albidoflavus

(Bruguiera
Gymnorrhiza)

Streptomyces sp.
TP-A0556

Thanh mộc

Streptomyces sp.
TP-A0595

Hẹ

Micromonospora
lupini

Đậu lupin

Streptomyces sp.
TP-A0456

Liễu sam

(Kenndia nigriscans)

(Grevillea pteridifolia)

(Maytenus hookeri)

(Aucuba japonica)

Kháng ung
thƣ

Demethylnovobiocin Kháng
VSV
6-Prenylindole

Kháng nấm

Lupinacidins A, B

Kháng ung
thƣ

Cedarmycins A, B

Kháng nấm

(Allium tuberosum)

(Lupinu Angustifolius)

(Cryptomeria japonica)

Cho đến nay, rất nhiều loại thuốc kháng sinh mới đã đƣợc phát hiện
nhƣ munumbicin AD [14], lansai A–D [68], celastramycin AB [50],
kakadumycin và demethylnovobiocin [14], [32]. Chất 6-Prenylindole đƣợc
tách chiết từ dịch lên men chủng Streptomyces sp. TP-A0595 có hoạt tính
kháng nấm gây bệnh thối cổ rễ gây ra bởi nấm Fusarium oxysporum. Những
nghiên cứu trƣớc đó, chất 6-Prenylindole đƣợc biết đến khi đƣợc thu nhận chủ
yếu từ lávàthân cây rêu tản (Hepatopsidae sp.) [51]. Đây là một vídụ điển
hì
nh về khả năng thu nhận các hợp chất hoặc các dẫn xuất tƣơng tự trong thực
vật nhờ xạ khuẩn nội sinh. Streptomyces sp. Tc022 đƣợc phân lập từ rễ cây
riềng nếp (Alpinia galanga) có hoạt tí
nh ức chế mạnh Colletotrichum musae
và Candida albicans. Khi tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy chủng