Nuôi Cấy Bao phấn Hạt Ớt invitro

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM </b>

<b>MÔN HỌC: </b>

<b>CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG CHỌN TẠO GIỐNG THỰC VẬT </b>

<b>(Biotechnology in plant breeding) </b>

<b>BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH </b>

<b>GVHD: TS. Nguyễn Hoài Nguyên Lớp: DH21AE01 </b>

<b>SVTH: Nguyễn Văn Vĩnh - 2153013218 </b>

<b>Khóa: 2023-2024 </b>

<i><b>Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2024 </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

1

<b>“BÀI 1: SỰ SINH SẢN VÔ TÍNH Ở THỰC VẬT” Sinh viên: Nguyễn Văn Vĩnh(MSSV: 2153013218) 1. Kết quả: </b>

<b>Hình 1. Cây đậu được gieo 2 ngày Hình 2. Cây đậu được gieo 14 ngày </b>

<b>Hình 3. Hạt tắc được gieo sau 8 ngày Hình 4. Hạt tắc được gieo sau 14 ngày </b>

1 cm

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

- Trong thí nghiệm, nhận thấy thời gian nảy mầm và phát triển của hạt đậu, hạt tắc và gừng có sự khác nhau. Thời gian nảy mầm được sắp xếp theo thứ tự từ nhanh đến chậm như sau: Hạt đậu(2 ngày) -> Hạt tắc (8 ngày) -> Gừng ( hơn 14 ngày).

<b>2. Thảo luận </b>

- Cấu trúc hạt đậu là cây 2 lá mầm(dicots) dinh dưỡng được tích trữ bên trong nội nhũ giúp hạt có thể phát triển và nảy mầm trước khi có rễ. Lớp vỏ bao quanh hạt khá mỏng, giúp hạt đậu dễ dàng hấp thụ được các dinh dưỡng, nước, oxy giúp đẩy nhanh quá trình phát triển từ hạt lên mầm sau đó thành cây.

- Hạt tắc có lớp vỏ giữa (endosperm) và nội nhũ, nội nhũ giúp dự trữ các dinh dưỡng cho hạt sử dụng trước khi hạt phát triển rễ để hấp thụ dinh dưỡng bên ngoài, nội nhũ cịn đóng vai trị quan trọng trong sự phát triển mầm cây. Lớp vỏ giữa của hạt tắc chứa các dạng dịch và tinh bột nhằm cung cấp năng lượng cho quá trình nảy và phát triển ban đầu của mầm. Cịn giúp bảo vệ mầm khỏi mơi trường bên ngoài và cung cấp nước, chất dinh dưỡng cho quá trình nảy mầm.

- Có thể nhận thấy do sự phát triển mầm của hạt đậu nhanh hơn hạt tắc chính là do lớp vỏ bao quanh hạt, hạt đậu có lớp vỏ khá mỏng chính vì vậy hạt đậu hấp thu dễ dàng dinh dưỡng và nước bên ngồi cung cấp cho sự phát triển cịn đối với hạt tắc có lớp vỏ dày hơn hạt đậu vì vậy sự phát triển của cây tắc chậm hơn cây đậu. Lớp vỏ bao quanh hạt vừa giúp bảo vệ hạt khỏi tác nhân bên ngoài, giúp ổn định sự phát triển mà còn tác động đến thời gian phát triển mầm của hạt.

- Gừng nảy mầm từ khoảng 20 – 28 ngày kể từ ngày gieo vào chậu vì vậy q trình thí nghiệm chỉ được 14 ngày nên cây chưa phát triển mầm kịp. Khi gieo vào chậu ta để củ gừng vào và phủ lớp đất và tưới nước thường xuyên. Gừng sẽ hấp thụ nước sau đó phát triển và mọc mầm từ củ.

<b>3. Trả lời câu hỏi: </b>

Câu 1. Tại sao thông tin di truyền (bộ gen) của cây con được sinh ra bằng phương pháp sinh sản vơ tính lại không thay đổi so với cây mẹ?

<b>Trả lời: </b>

- Sinh sản vơ tính là hình thức sinh sản tạo ra cá thể mới khơng có sự kết hợp giữa giao tử đực và giao tử cái.

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

3

- Chỉ cần 1 cây mẹ với hình thức sinh sản vơ tính có thể tạo ra các cây con có bộ gene giống nhau và giống cây mẹ → Bảo tồn các đặc điểm tốt của cây mẹ, tạo ra các cá thể mới có tính thích nghi cao trong điều kiện mơi trường không thay đổi.

- Cơ sở tế bào học: Cây mẹ sử dụng hình thức nguyên phân tạo thành các cá thể cây con

Câu 2. Phân tích ngắn gọn ứng dụng, lợi ích và điểm yếu của hình thức sinh sản vơ tính trong nơng

<b>nghiệp. Trả lời: </b>

- Ứng dụng: Sinh sản vơ tính giúp nhân nhanh các giống cây có thể sử dụng bằng các phương pháp: Giâm cành, Chiết Cành,

<b>4. Tài liệu tham khảo: </b>

<b>[1] </b>Bùi Trang Việt (2020), Sinh lý thực vật. Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.

<b>[2] </b>Nguyễn Hồi Ngun (2024), Tài liệu thực hành ứng dụng trong chọn tạo giống thực vật. Trường Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

4

<b>“BÀI 2: SỰ SINH SẢN HỮU TÍNH Ở THỰC VẬT” Sinh viên: Nguyễn Văn Vĩnh(MSSV: 2153013218) 1. Kết quả: </b>

<b>Bầu nhụy Đế hoa </b>

<b>Cuống hoa Vòi nhụy </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

5

<b>Hình 8. Hình ảnh hoa ớt </b>

<b>2. Trả lời câu hỏi: </b>

Câu 1. Mơ tả, phân tích và cho ví dụ về các hình thức thụ phấn ở cây hạt kín.

<b>Trả lời: </b>

Có 2 hình thức thụ phấn ở cây hạt kín

- Tự thụ phấn: Quá trình phấn hoa cùng một cây rơi vào đầu nhụy hoặc nỗn của chính hoa đó, dẫn đến sự kết hợp giữa các giao tử đực và cái cùng nguồn gốc. Phấn hoa di chuyển nhờ gió, nhờ nước, nhờ côn trùng đưa hạt phấn đến nhụy hoa. Vd: đậu hà lan, hoa phong lan, hoa cải, hoa bưởi,…

- Thụ phấn chéo: Quá trình thụ phấn giữa hai cây khác nhau trong cùng một loài thực vật, trong đó hạt phấn từ nhị hoa của một cây được chuyển tới núm nhụy hoa của cây khác để thực hiện quá trình thụ tinh và nảy mầm. Điều kiện để thụ phấn chéo xảy ra là cây có hoa lưỡng tính, tức là có cả bộ phận sinh sản đực và cái trên cùng một cây. Hạt phấn được di chuyển do gió, cơn trùng hoặc các tác nhân khác đến nhụy hoa của cây khác. Quá trình này mang lại nhiều lợi ích cho sự đa dạng sinh học, khả năng sinh sản và tiến hóa của cây trồng.. Vd: Dâu tây, bí ngơ,…

Câu 2. Ở dưa leo, tại sao có trường hợp cây chỉ có tồn là hoa đực? Mô tả ngắn gọn về cơ chế điều khiển giới tính hoa ở dưa leo.

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

• Cơ chế điều khiển giới tính hoa ở dưa leo

- Giới tính hoa ở dưa leo được quy định bởi 3 gen: Gen trội F kiểm soát biểu hiện hoa cái, gen lặn M biểu hiện hoa lưỡng tính, gen lặn A kiểm sốt biểu hiện hoa đực. Các gen kết hợp tác động qua lại biểu hiện giới tính hoa. Người ta chú ý nhiều về hoa cái vì mang tính quan trọng trong sản xuất

- CsFemale1 là Một trong những marker có khả năng nhận diện dịng dưa leo tồn hoa cái và được

<b>thực hiện trong nghiên cứu “CHỈ THỊ PHÂN TỬ CSFEMALE-1 VÀ GIỚI TÍNH CỦA DƯA LEO” của Hồ Thị Bích Phượng, Đặng Thanh Dũng và Lê Thị Trúc Linh. </b>

- Thí nghiệm được thực hiện bằng cách tách DNA từ lá dưa leo, thực hiện phản ứng PCR 2 mồi xuôi và ngược với mục tiêu khuếch đại bộ gen ở kích thước 200bp. Kết quả sản phẩm PCR kích thước 163 bp thấy tồn tồn hoa cái và kích thước 197 bp c các dịng dưa leo đồng hợp có đồng thời hoa đực và hoa cái.

- Marker CsFemale-1 được thiết kế dựa trên sự khác biệt giữa trình tự gen của dịng dưa leo tồn hoa cái và dịng dưa leo có cả hoa đực và hoa cái (Win et al., 2015)

<b>3. Tài liệu tham khảo: </b>

<b>[1] </b> Bùi Trang Việt (2020), Sinh lý thực vật. Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.

<b>[2] </b> Hồ Thị Bích Phượng, Đặng Thanh Dũng và Lê Thị Trúc Linh (2019) Chỉ thị phân tử CsFemale-1 và giới tính của dưa leo. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, tập/số 55,

<b>trang 62-65. </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

8

<b>“BÀI 3 và 4: NUÔI CẤY BAO PHẤN” Sinh viên: Nguyễn Văn Vĩnh(MSSV: 2153013218) </b>

<b>1. Kết quả: </b>

<b>Hình 1: Bình mơi trường ni cấy bao phấn ớt </b>

<i><b>in vitro sau 5 ngày khơng nhiễm </b></i>

<b>Hình 2: Bình mơi trường ni cấy bao phấn ớt </b>

<i><b>in vitro sau 5 ngày bị nhiễm </b></i>

<b>❖ Kết quả: Thực hiện thí nghiệm ni cấy bao phấn từ hoa ớt trong bình dinh dưỡng được chuẩn </b>

bị sẵn. Hình 1 và 2 là kết quả sau 5 ngày nuôi cấy bao phấn hoa ớt. Kết quả thực hiện nuôi cấy 2 bình: 1 bình khơng nhiễm và 1 bình nhiễm.

<b>3. Trả lời câu hỏi: </b>

<i><b>Câu hỏi :Phân tích và nêu ví dụ cụ thể về ứng dụng của cây in vitro được nuôi cấy từ bao phấn </b></i>

<b>Trả lời: </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

9

• Ứng dụng của cây invitro được nuôi cấy từ bao phấn

- Bảo tồn nguồn gen: Nuôi cấy invitro giúp bảo vệ các nguồn gen thực vật quý hiếm trên bờ vực tuyệt chủng và có giá trị kinh tế cao như Hà thủ ô đỏ, Trầm hương, Tùng Bạch Mã, Đỉnh Tùng,… - Cung cấp giống sạch, các giống cây có khả năng chống chịu được với môi trường năng suất cao, chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh (sâu bệnh, hạn hán, …) và điều kiện nghèo phân bón.

- Nghiên cứu được chu trình sống của cây trong điều kiện in vitro, bắt đầu từ việc gieo hạt, nảy mầm, sinh trưởng, mang hoa, tự thụ phấn và tạo quả theo một vịng trịn khép kín trong ống nghiệm, có ý nghĩa trong nghiên cứu lí thuyết và ứng dụng trong thực tiễn.

<i>• Ví dụ Tạo cây cải Đông Dư đơn bội in vitro bằng nuôi cách bao phấn: Nguồn: Hải, N. T., & </i>

<i>Tâm, Đ. T. T. (2015). TẠO CÂY CẢI ĐÔNG DƯ (Brassica juncea) ĐƠN BỘI IN VITRO BẰNG NUÔI CẤY BAO PHẤN. J. Sci, 13(5), 739-746. </i>

- Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là MS (Murashige and Skoog, 1962), Gamborg (B5) (Gamborg, 1968), NLN (N6) (Lichter, 1989) tùy từng giai đoạn nghiên cứu có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng có nồng độ khác nhau.

- Thí nghiệm được tiến hành tại phịng ni có nhiệt độ 22 - 25⁰C, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 h/ngày.

- Bao phấn vô trùng được thu nhận theo phương pháp sau: Nụ hoa được ngâm trong cồn 70% 30 giây, tiến hành khử trùng bằng NaOCl nồng độ 10% trong 8 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần. Nụ hoa được thấm khô trên giấy thấm vô trùng, tách lấy bao phấn đưa vào môi trường nuôi cấy. Độ bội của cây tái sinh từ bao phấn được xác định thông qua đo hàm lượng ADN bằng máy Flow cytometry, sử dụng cây nhị bội (cây cho hạt phấn) làm đối chứng, theo quy trình của Ollitrault và Michaux Ferriere (1992).

<b>4. Tài liệu tham khảo: </b>

<b>[1] </b><i>ẢNH, N., & HOA, H. CỦA CÂY FORGET-ME-NOT (Browallia americana L.) NUÔI CẤY IN </i>

<i>VITRO. </i>

<b>[2] </b><i>Đỗ Tiến Vinh. Công nghệ nhân giống in vitro. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH </i>

VIỆN KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ CAO NTT.

<b>[3] </b>Hải, N. T., & Tâm, Đ. T. T. (2015). TẠO CÂY CẢI ĐÔNG DƯ (Brassica juncea) ĐƠN BỘI IN

<b>VITRO BẰNG NUÔI CẤY BAO PHẤN. J. Sci, 13(5), 739-746. </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

10

<b>“BÀI 5 VÀ 6: MARKER PHÂN TỬ” Sinh viên: Nguyễn Văn Vĩnh(MSSV: 2153013218) </b>

<b>1. Trả lời câu hỏi </b>

<b>Câu 1. Kể tên một số loại marker DNA tiêu biểu được ứng dụng trong chọn tạo giống thực vật? Trả lời: </b>

Một số marker DNA tiêu biểu ứng dụng trong chọn tạo giống thực vật:

- Marker SNP (Single Nucleotide Polymorphism) là marker trình tự đa hình, sự khác biệt trong trình tự DNA ở một nucleotid.

- Marker SSR (Simple Sequence Repeat) là marker lặp lại những đoạn ngắn của DNA có chứa từ 2 đến 6 nucleotid có trình tự lặp lại liên tiếp từ 2 đến 40 lần.

- Marker đa hình của các đoạn cắt giới hạn (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences-CAPS) là sự khác biệt về độ dài của các đoạn DNA bị cắt bởi enzym cắt giới hạn tại vị trí nucleotid khác biệt giữa hai cá thể.

- Marker đa hình của đoạn khuếch đại (Amplified Fragment Length Polymorphism-AFLP) là sự khác biệt về độ dài của các đoạn DNA đại diện cho các alen khác nhau sau khi khuếch đại.

<b>Câu 2: Liệt kê các phương pháp sinh học phân tử và mơ tả một ví dụ cụ thể về quy trình phân tích </b>

• Ví dụ về quy trình phân tích lá của một số giống/dịng chè được thu thập tại công ty chè Sông Cầu (M1-M16), xã Minh Lập (M17) thuộc huyện Đồng Hỷ, và xã Tân Cương (M18), Thái Nguyên. marker DNA dạng SSR:[2]

- Tách chiết DNA: DNA được tách chiết theo kit GeneJET™ Plant DNA Genomic Purification Mini (Thermo scientific).

- Kỹ thuật PCR-SSR: Dựa trên cơ sở các dữ liệu mồi SSR đã công bố bởi Sharma et al. (2009), Ma et al. (2010), chúng tôi thực hiện kỹ thuật PCR-SSR với 14 cặp mồi sử dụng khuôn là DNA

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

- Phân tích số liệu: Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR, sự xuất hiện các băng điện di được ước lượng kích thước dựa vào marker chuẩn và thống kê các băng điện di với từng mồi ở từng mẫu nghiên cứu. Sự xuất hiện hay không xuất hiện các băng điện di được tập hợp để phân tích số liệu theo nguyên tắc: số 1- xuất hiện phân đoạn DNA và số 0- không xuất hiện phân đoạn DNA. Các số liệu này được xử lý trên máy tính theo chương trình NTSYSpc version pc 2.1 (Applied Biostatistics) để xác định quan hệ di truyền của các giống/dịng chè.

- Xác định và phân tích trình tự một số đoạn SSR: Sản phẩm PCR -SSR được tinh sạch và xác định trình tự trực tiếp trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Anlalyzer (Applied Biosystems). Kết quả trình tự gen được phân tích, so sánh bằng phần mềm sinh học chuyên dụng (Sequence Scaner, BLAST, Bioedit).

<b>2. Tài liệu tham khảo </b>

<b>[1] </b>ThS. Nguyễn Thị Dần (2019). Những ưu điểm nổi bật của chỉ thị phân tử và việc ứng dụng chọn tạo giống cà phê kháng sâu bệnh hại. VIỆN KHOA HỌC KỸ THUẬT NÔNG LÂM NGHIỆP TÂY NGUYÊN.

<b>[2] </b>Thành, N. Đ. (2014). Các kỹ thuật chỉ thị DNA trong nghiên cứu và chọn lọc thực vật. Tạp chí Sinh học, 36(3), 265-294.

<b>[3] </b>Yến, H. T. T., Nhung, D. T., Hoàn, H. T. T., & Lê Bắc Việt, N. H. H. (2017). NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TỪ CHÈ TRỒNG TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN. TAP CHI SINH HOC, 39(1), 68-79.

</div>