bài báo cáo thực hành tách chiết và điện di plasmid dna từ tế bào escherichia coli

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.54 MB, 11 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHBỘ MƠN SINH HỌC

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

TÁCH CHIẾT VÀ ĐIỆN DI PLASMID DNATỪ TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI

Nhóm thực tập chiều thứ 3 – Dãy E – Nhóm 1.5.2 – Lớp YHDP22

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHBỘ MƠN SINH HỌC

THƠNG TIN NHĨM THỰC TẬPLớp: YHDP22

Nhóm thực hành: 1.5.2Mẫu: Nhóm 5.2

Danh sách thành viên:

1Cao Thị Hồng Ngân4112250572Đào Tuyết Ngân4112250583Lê Ngọc Thu Ngân4112250594Nguyễn Trần Thanh Ngân4112250605Thái Phương Ngân411225062

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

A.NỘI DUNG TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:1. Vật liệu – Hóa chất – Dụng cụ và thiết bị:

1.1.Vật liệu: Dùng 4 mL dịch cấy khuẩn (chủng vi khuẩn E. coli mang plasmid).1.2. Hóa chất và tác dụng:

- Mơi trường Luria-bertani (LB – gồm peptone, yeast extract, NaCl) cóampicillin 10µg/ml: Được sử dụng cho cấy và duy trì các chủng vi khuẩn

E. coli trong các quy trình vi sinh học phân tử.

- Thạch vi sinh (bactor – agar).

- Dung dịch GTE (Glucose – Tris – EDTA) pH 8 (làm ấm trước khi sửdụng): Giảm độ bền vững của màng, từ đó phá vỡ màng tế bào của vi

khuẩn, do trong dung dịch có:

+ Glucose: Giúp duy trì áp suất thẩm thấu và độ hoà tan (nồng độ dung

dịch bên ngoài gần bằng nồng độ bên trong tế bào), giúp ngăn sự phân lycủa tế bào) => Giảm lượng ADN do kết tụ.

+ Tris: Thành phần đệm ở pH hơi kiềm tính (pH 8.0), ngăn ngừa thuỷ phân

acid của plasmid ADN.

+ EDTA: Tạo liên kết hóa trị II với các ion liên kết trên lớp phospholipid

màng, do đó làm giảm tính bền vững của màng.

- Dung dịch SDS – kiềm 1%: Biến tính ADN-NST, do: SDS có tác dụng

hòa tan các thành phần lipid của màng tế bào cũng như các protein của tếbào, kiềm (NaOH) có tác dụng biến đổi ADN-NST thành các chuỗi đơn,biến tính ADN-NST.

- Dung dịch KOAc 3M (pH 5.5): Trung hòa pH, hồi tính AND:

+ pH 5.5 là mơi trường acid nhẹ, trung hịa mơi trường kiềm của dung kiềm 1% => ổn định cấu trúc ADN, hồi tính ADN vơ tình bị biến tính.+ KOAc (Kali acetate) giúp kết tủa SD (SD không tan trong Kali), kéo theocả lipid, protein bị phân cắt, ADN bị biến tính => chỉ những plasmid cókích thước và khối lượng nhỏ hơn mới tồn tại trong dịch không kết tủa.

SDS-- Ethanol tuyệt đối (lạnh): Tác dụng chống đơng lạnh, kết tủa ADN, ngăn

biến tính, thu được lượng mẫu ADN nhiều hơn.

- Ethanol 70%: Tinh sạch plasmid ADN thu được, tách bỏ muối, SDS còn

bám vào ADN.

- Dung dịch TE (Tris – EDTA) pH 8 (làm ấm trước khi dùng): Bảo quảnADN khỏi các tác động từ các tác nhân do:

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

+ TE: Là hệ đệm cho ADN, ngăn quá trình khử purin khi pH dung dịchgiảm tới 5.0.

+ EDTA: Bảo vệ ADN khỏi hư hỏng do các ADNse.

- Nước cất 2 lần.

- Đệm TAE (Tris – Acetic acid – EDTA) 1X pha từ TAE 50X: Duy trì pH

ổn định trong quá trình điện di, EDTA cung cấp ion hóa trị II Mg tạo độ2+

dẫn cho sự di chuyển của plasmid ADN, giúp ADN di chuyển về cực (+)của bồn điện di.

- Agarose tinh khiết dùng cho điện di.

- Dung dịch nạp mẫu có sẵn thuốc nhuộm ADN (dung dịch GelRed 6X):

Theo dõi quá trình điện di và thu nhận kết quả điện di.

- Thang chuẩn ADN 1 kb. 1.3. Dụng cụ và thiết bị:

Dụng cụ:

- Micropipette 10, 100, 200, 1000 µl. - 1 bình tia đựng Ethanol 70%.

- 1 giá ống nghiệm và giá đựng eppendorf. - Hộp đựng đá.

- Khuôn đổ gel agarose và lược.

- 1 hộp đựng rác y tế và hộp đựng dịch thải. - 1 bút marker.

Thiết bị:

- Máy ly tâm lạnh tube 1,5ml. - Máy vortex.

- Tủ sấy. - Lị vi sóng.

- Bồn điện di ADN nằm ngang và bộ nguồn. - Bàn soi UV.

- Máy ảnh. Vật dụng:

- Tube ly tâm eppendorf 1,5ml.

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

- Đầu tip trắng, vàng, xanh. - Giấy thấm không bụi.

- Găng tay cao su và khẩu trang y tế (sinh viên tự chuẩn bị).2. Nguyên tắc tách chiết Plasmid ADN:

Có nhiều cách để thực hiện tách chiết Plasmid ADN: + Phương pháp hóa học.

+ Dùng cột silica (silica membrane spin column).

Nguyên tắc được sử dụng trong bài thực hành: Phương pháp hóa học.

Một số nguyên tắc chung khi tách chiết Plasmid tinh sạch bằng phương pháp hóa học: + Phá vỡ màng tế bào.

+ Loại bỏ một số thành phần: Thành tế bào, màng sinh chất, prôtêin... + Kết tủa Plasmid ADN.

+ Bảo quản.

3. Quy trình thực hiện:

3.1.Tách chiết plasmid ADN của vi khuẩn:

Ngày 1: Nuôi cấy lắc 1 khuẩn lạc trong 10mL mơi trường LB lỏng có ampicillin ở 37

độ C, khoảng 12-16 giờ (được chuẩn bị trước).

Ngày 2: Thực hiện tách chiết plasmid ADN như sau:

Bước 1: Dùng 1 tube eppendorf loại 1,5 mL. Ghi ký hiệu lên nắp eppendorf theohướng dẫn của cán bộ phụ trách (ký hiệu: 1.5.2). Sau đó, lấy 1 mL dịch khuẩn cho vàoeppendorf (dùng micropipette 1000 µl). Ly tâm 13.000 prm trong 1 phút (đặt đối xứngtrong máy ly tâm với nhóm 1.5.1, lưu ý: khi đem eppendorf ra khỏi máy ly tâm phảihết sức cẩn thận tránh va đập làm bể cặn vi khuẩn), đổ bỏ phần nước nổi để lấy cặn vikhuẩn (phải dứt khoát tránh dùng nhiều lực gây rớt cặn và phải thấm nước kĩ càng).

Bước 2: Hòa cặn vi khuẩn trong 100 μl dung dịch GTE bằng máy vortex (cần chắctay khi sử dụng máy vortex, nếu cặn chưa hịa tan với dung dịch thì búng nhẹ phầnđáy của eppendorf). Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Bước 3: Thêm 200 μl dung dịch SDS-kiềm, trộn nhẹ nhàng (giữ eppendorf theochiều dọc lắc nhẹ và đều tay vừa đủ cho dung dịch hòa lẫn vào nhau theo hình bánnguyệt), ủ trong đá 5 phút.

Bước 4: Thêm 150 μl dung dịch 3M KOAc pH 5,5 và trộn nhẹ nhàng, ủ trong đá 5phút sẽ có kết tủa trắng hiện ra.

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

Bước 5: Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút ở 4 độ C.

Bước 6: Chuyển phần nước nổi sang 1 eppendorf 1,5 mL (sử dụng micropipette200 μl), tránh hút phần cặn.

Bước 7: Thêm 1 mL ethanol tuyệt đối lạnh (hoặc 400 μl isopropanol), trộn nhẹ. Đểtủa 20-30 phút ở 4 độ C (trong thùng đá, lưu ý phải ngâm eppendorf trong đá lạnhhồn tồn khơng để nằm trên bề mặt).

Bước 8: Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút để làm lắng cặn plasmid ADN. Bước 9: Đổ bỏ ethanol, tránh làm tróc plasmid ADN.

Bước 10: Thêm 100 μl ethanol 70% vào cặn ADN. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong5 phút ở 4 độ C.

Bước 11: Đổ bỏ ethanol. Úp ngược tube trên giấy thấm để thấm hết nước. Để khơcặn ADN trong khơng khí.

Bước 12: Hịa tan plasmid ADN trong 50 μl TE 1X. Bảo quản ADN ở 4 độ C hoặc-20 độ C (cán bộ phụ trách thực hiện).

3.2. Phân tích ADN bằng phương pháp điện di:

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1% (bước này do cán bộ phụ trách thực hiện). ● Hòa agarose với TAE 1X và đun trong lị vi sóng cho agarose tan hết. ● Chuẩn bị khuôn, lắp ngược và đổ gel. Để cho gel nguội và đặc hoàn tồn. ● Gỡ lược, lấy khn gel đặt vào máy điện di theo đúng chiều quy định của dòng

điện. Đổ TAE 1X cho ngập mặt gel.

Bước 2: Chuẩn bị mẫu: Pha 5µl mẫu ADN với 1µl dung dịch Gelred 6X. ● Vặn chỉnh loại micropipette phù hợp (0.5-10µl) hút 1µl dung dịch Gelred 6X,

nhả dung dịch vào cốc. (bước này do cán bộ phụ trách thực hiện).

● Vặn chỉnh loại micropipette phù hợp (0.5-10µl) hút 5µl mẫu ADN từ tube củanhóm.

● Pha mẫu với dung dịch Gelred 6X bằng cách hút nhả liên tục micropipette chứamẫu ADN cho tới khi trộn đều.

Bước 3: Dùng micropipette 10 hoặc 20µl nạp hết lượng mẫu chuẩn bị (6µl) vàogiếng (khơng để mẫu rơi ra ngồi giếng, nạp vào đúng giếng của nhóm mình).

Bước 4: Chạy điện di ở điện thế khơng đổi 100V trong 40 phút.Bước 5: Lấy gel ra khỏi máy và soi gel trên hộp UV.

Bước 6: Quan sát vị trí hiện diện các băng dưới đèn cực tím. Chụp ảnh.4

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

Bước 7: Xác định kích thước của plasmid ADN dựa vào thang ADN chuẩn.

B.KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM - PHÂN TÍCH - BIỆN LUẬN:

1. Kết quả chạy điện di plasmid ADN:

Hình: Kết quả điện di của nhóm 5.2 (cột đầu từ phải sang)

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Thang ADN chuẩn 1kb: ước lượng kích thước tương đối của ADN trên gel

2. Phân tích kết quả chạy điện di và biện luận:2.1. Phân tích kết quả:

Mẫu điện di của nhóm (giếng 5.2)

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

- Kết quả điện di: Hình ảnh của nhóm 1.5.2 có xuất hiện vạch DNA (Khoanh trắng)

=> Kết quả điện di dương tính.

- Xác định vạch ADN: Từ quan sát được của nhóm đối chiếu với thang chuẩn

DNA, quan sát thấy được sự xuất hiện của 4 băng sáng: - Băng 1: Sáng mờ, kích thước khoảng 10037bp.

- Băng 2: Sáng đậm, nằm gọn thành vạch, kích thích nằm trong khoảng 1000 - 1500bp, nhưng tương đối gần mức 1000bp hơn.

- Băng 3: Sáng đậm, nằm gọn thành vạch, kích thước 800bp.

- Băng 4: Xuất hiện vạch sáng mờm tương đối gọn thành vạch, kích thước dưới 200bp.

2.2. Biện luận:a) Nguyên tắc:

- Vật liệu di truyền ở vi khuẩn E. Coli:

+ ADN thể nhiễm sắc ở nhân: một phân tử ADN xoắn kép dạng vòng.

+ ADN ngoài thể nhiễm sắc - các plasmid: Những phân tử ADN ngắn, tự nhân đôi trong bào tương, chủ yếu gồm 3 cấu dạng: siêu xoắn, thẳng, vòng.

- Nguyên tắc điện di: Đặt giếng vào cực âm của máy chạy điện di. Cho mẫu ADN đã chuẩn bị vào các giếng. Dưới tác dụng của điện trường, ADN tích điện âm (do mang gốc phosphate) sẽ di chuyển từ cực (-) sang cực (+) qua hệ gel agarose với quãng đường khác nhau. Tuỳ thuộc vào kích thước và cấu dạng plasmid,… ADN sẽ hiện ra dưới dạng các band trên miếng gel.

- Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển của plasmid ADN trong gel agarose:+ Nồng độ gel agarose cao → tốc độ di chuyển chậm.

+ ADN kích thước càng lớn (SL bp cao) → tốc độ càng chậm và ngược lại.+ Cấu dạng của các loại plasmid ADN càng cồng kềnh → Tốc độ di chuyển càng chậm: Theo thứ tự giảm dần là siêu xoắn, thẳng, vịng.

+ Dịng điện có hiệu điện thế càng lớn, tốc độ di chuyển nhanh, thời gian cần để chạy điện di ngắn,….

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

b) Giải thích kết quả điện di:

- Giai đoạn tinh sạch DNA, thời gian tinh sạch bằng ethanol 70% chưa đủ lâu để loạibỏ hết các muối, SDS, chính vì vậy những thành phần này còn lẫn trong kết tủa plasmid DNA, vì thế trong quá trình bảo quản, những thành phần này làm phân cắt một phầnplasmid, gây đứt gãy plasmid DNA, do đó chất lượng DNA thu được khơng cao.

- Có thể do q trình thực hiện đã xảy ra sai số về nồng độ dung dịch vi khuẩn và hóachất liên quan.

- Trong thao tác trộn mẫu plasmid DNA do thao tác mạnh nên gây ra áp lực cơ học lớn lên plasmid DNA làm gãy plasmid DNA, đây cũng là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự xuất hiện của vệt sáng “smear”. Xuất hiện vệt kéo dài “smear” còn dotrong thao tác thực hành có một số sơ suất chẳng hạn như: Loại bỏ tạp chất (protein, màng…) chưa hết dẫn đến DNA chưa hiện rõ (nhưng tương đối tinh sạch do gom được 2 băng rõ).

- Băng kéo dài “smear” nhạt màu kéo về hướng cực (+) của bồn điện di cho thấy ít thành phần có kích thước nhỏ khác nhau sinh ra do đứt gãy DNA di chuyển về phía cực (+) hoặc do sự xuất hiện ít của RNA vi khuẩn.

2.3. Nguyên nhân và biện pháp khắc phục:

a) Nguyên nhân dẫn đến kết quả điện di không đạt chất lượng tốt:

- Thao tác tách chiết ADN plasmid:

+ Trong quá trình kết tủa các thành phần bị phân tách bởi SDS bằng KOAc vàthu nhận plasmid ADN trong dịch nổi do thao tác không chuẩn xác và nhữngsơ suất trong quá trình sử dụng dụng cụ thí nghiệm đã dẫn đến mất ADNplasmid trong mẫu thu (chứa trong eppendoft mẫu ADN plasmid).

+ DNA mục tiêu mờ có thể do bị thiếu trong q trình hút dịch nổi do thao tácchưa tốt (còn run tay) hoặc lúc đổ bỏ ethanol có thể đã làm thất thoát mộtlượng ADN plasmid.

- Thao tác điện di:

+ Trong quá trình lấy 5µl mẫu từ tube do thao tác khơng chuẩn xác và sơ xuấttrong quá trình sử dụng dụng cụ thí nghiệm (micropipette) khơng lấy đủ lượngdịch.

+ Thao tác dùng micropipette khơng tốt, làm xuất hiện nhiều bọt khí.

+ Ở bước nạp dung dịch vào giếng, không lấy đủ 6µl dung dịch, lúc nạp khơngđủ 6µl dẫn đến thiếu hụt ADN plasmid.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

b) Biện pháp:

- Canh chuẩn thời gian một cách chính xác, yêu cầu phải được ngưỡng thời giantối thiểu trước khi tiến hành bước tiếp theo. Một số trường hợp vội vàng hoặckhơng canh chuẩn thời gian một cách chính xác sẽ làm cho mẫu không đủ thờigian phản ứng tạo ra chất mong muốn.

- Thành thục kĩ năng sử dụng micropipette, cần cầm chắc chắn, hút lọc đúngcách, lấy đủ lượng dịch cần thiết, quan sát kỹ trong quá trình sử dụng, tránh hútnhững chất không cần thiết.

- Cẩn thận trong việc đổ bỏ ethanol, không vội vàng hay mạnh tay vì có thể sẽ đổbỏ hoặc làm hư mẫu ADN.

- Cần quan sát kĩ trong từng hành động. Cẩn thận trong quá trình bỏ mẫu vàogiếng, thao tác phải chính xác tránh gây hao hụt lượng ADN làm kết quả mờ,không thấy được.

- Chú ý: Các ngun tắc thực hành trong phịng thí nghiệm: đặt đúng (đối xứng,đồng đều) Eppendorf vào máy ly tâm, các thao tác liên quan hóa chất.- Hiểu rõ bản chất từng bước thao tác, thực hiện thao tác phù hợp yêu cầu.- Thực hiện đúng và đầy đủ quy trình.

</div>