Cố định penicillin G vào trong hạt chitosan sử dụng tế bào Escherichia coli được thẩm thấu

Cố định penicillin G vào trong hạt chitosan sử dụng tế bào
Escherichia coli được thẩm thấu

GVHD: TS. Huỳnh Ngọc Oanh
Học viên: Vũ Hoàng Ý (123106764)
Ngô Thị Diệu Liên (12310736)


NỘI DUNG

• Giới thiệu
• Vật liệu và phương pháp
• Kết quả
• Bàn luận
• Kết luận
• Tài liệu tham khảo


GIỚI THIỆU
•

•

Ngày nay, Enzyme được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Tuy nhiên, khó khăn trong việc thu nhận
và tinh sạch, tính nhạy cảm của enzyme với điều kiện sản xuất ,thời gian bán huỷ ngắn, quá trình hồi tính
khó khăn và sản phẩm dễ tạp nhiễm với những enzyme tự nhiên là vấn đề cần giải quyết chính trong
ngành công nghiệp sử dụng các enzyme nguyên chất. Do đó, enzyme thường được sử dụng ở dạng cố
định.
Các thuộc tính của enzyme cố định phụ thuộc vào enzyme và chất mang. Chitin và chitosan là chất mang
thường được lựa chọn khi cố định enzyme và tế bào(tính ái lực protein, các nhóm chức phản ứng với
enzym, ổn định cơ học, dễ xử lý, kinh tế...)

GIỚI THIỆU
•

Ứng dụng của penicillin G acylase (PGA) trong sản xuất 6-aminopenicillanic acid (6-APA) và 7aminodeacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA), chất trung gian trong sản xuất kháng sinh β-lactam bán
tổng hợp.

•

Quá trình cố định qua 2 bước:

- Các tế bào E.coli (ATCC 11105) được thẩm thấu bằng
N-cetyl-N,N,N-trimethyl ammonium bromide (CTAB) (0.1%, 45 phút, 45rpm)
- Cố định tế bào bằng glutaraldehyde 5% trong dung dịch chitosan 3%


GIỚI THIỆU
•
•
•

Các tế bào được cố định giúp quá trình chuyển hoá tăng 9%
Hoạt tính còn 90% sau 20 lần tái sử dụng.

Mục tiêu nghiên cứu: cố định PGA trong tế bào E.coli được thẩm thấu nhờ liên kết chéo với glutaraldehyde
nhằm tối ưu hoá quá trình cố định.


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu:

•
•
•
•
•
•
•

Tế bào E. Cloli (ATTC 11105)
Penicillin G potasium
Chitosan
Glutaraldehyde
N-cetyl-N,N,N-trimethyl Bromide (CTAB),
p-dimethyl amino benzaldehyde (p-DBA)
Các hoá chất khác


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nuôi cấy tế bào E.coli (ATCC 11105)

•
•
•
•
•
•

o

Tế bào E.coli đông khô (được hồi sinh trong môi trường lỏng Muller-Hinton (24 giờ, 37 C).
o
Thu hoạch (ly tâm 10000rpm, 4 C, 5 phút) và rửa kỹ bằng đệm phosphate (0.1M, pH 7)
Tái hoà tan trong đệm phosphat.
Dịch tế bào được tiêm trong môi trường trung tính đã được tối ưu hoá cho việc sản xuất của PGA.
o
Tế bào được phát triển trong bình lắc ở 220 rpm, 24 C, 44 giờ.
o
Thu hoạch tế bào (ly tâm 10000rpm, 4 C, 5 phút)


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thành phần môi trường trung tính

•
•
•
•
•
•

Phenylacetic acid (PAA) 0.2%
MgSO4.7H2O 0.02%
Cao men 0.5%
NH4Cl 0.1%
K2HPO4 0.1%
pH 7


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Xử lý tế bào với N-cetyl-N,N,N-trimethyl ammonium bromide

•

10g tế bào ướt từ giai đoạn trước cho vào dung dịch CTAB với nồng độ từ 0.05-0,25% được chuẩn bị
trong đệm phosphate

•
•

Hỗn hợp được khuấy nhẹ nhàng ở nhiệt độ phòng trong 45phút.
o
Thu hoạch (ly tâm ở 8000rpm, 4 C, 10 phút)


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Tạo hạt chitosan

•
•

10g tế bào thẩm thấu, 10ml dd chitosan 3% cho vào dd acid acetic 3%
Dùng bơm tiêm tạo hạt trong 2 dung dịch khác nhau:

- Dung dịch NaOH (1M):MeOH
- Dung dịch glutaraldehyde (1-9%)

•

Thu hạt và bảo quản trong đệm phosphate sau 1giờ

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Hạt chitosan

Hạt chitosan chứa tế bào E.coli 11105 thẩm thấu

•
•

A. hạt màu be (cố định bằng NaOH:MeOH )
B. hat màu nâu (cố định bằng glutaraldehyde 5%)


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Khảo nghiệm hoạt động thuỷ phân

•
•
•

6-APA được tạo ta từ phản ứng thuỷ phân penicillin G sẽ phản ứng với p-DBA tạo hỗn hợp sinh màu
Đo màu bằng phương pháp đo quang

1 đơn vị hoạt động thuỷ phân (U) là lượng enzyme sinh ra 1µm 6-APA trong 1 phút khi bổ sung dung dịch
pennicillin G 2%, pH 7.8


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Đặc điểm hình thái hạt

•
•

Quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Các hạt đông được khô và phủ một lớp vàng trên bề mặt

Hạt cố định bằng NaOH:MeOH

Hạt cố định bằng glutaraldehyde


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Tính ổn định hoạt động

•

Tính ổn định hoạt động của enzyme cố định và các tế bào được xử lý với CTAB được phân tích bằng cách
đo lường hoạt động trong những mẻ và những điều kiện lên men khác nhau


KẾT QUẢ
Ảnh hưởng của nồng độ CTAB lên thẩm thấu tế bào

Biểu đồ 1: ảnh hưởng của CTAB lên hoạt tính tế bào E.coli


KẾT QUẢ
Ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde lên cố định tế bào.

Biểu đồ 2: ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde lên tế bào cố định


KẾT QUẢ
Kích thước và hình thái hạt

A. hạt màu be (cố định bằng NaOH-MeOH)
B. hat màu nâu ( cố định bằng glutaraldehyde 5%)


KẾT QUẢ
Kích thước và hình thái hạt

A. hạt màu be (cố định bằng NaOH-MeOH)
B. hat màu nâu ( cố định bằng glutaraldehyde 5%)


KẾT QUẢ
Hạt màu be
- cố định bằng NaOH-MeOH

Hạt màu nâu
- cố định bằng Glutaraldehyde

- Đk trung bình hạt: 1.7mm - 2.32mm
- Kích thước lỗ trên hạt
Lớn hơn, không đồng đều

•

- Đồng đều và trải đều bề mặt

Kích thước lỗ đồng đều giúp gia tăng quá trình vận chuyển của cơ chất và sản phẩm. Kết quả là hoạt
động thủy phân penicillin xảy ra nhanh hơn, quá trình chuyển đổi tốt hơn.


KẾT QUẢ
Hoạt động thuỷ phân của những dạng tế bào khác nhau

A. Tế bào tự do

B. Tế bào được xử lý với CTAB

C. Tb cố định bằng NaOH:MeOH

D. Tb cố định bằng glutaldehyde


KẾT QUẢ
Khả năng tái sử dụng

Tế bào được cố định
Tế bào thẩm thấu không cố định


BÀN LUẬN
•

Nồng độ tối ưu của CTAB để thẩm thấu tế bào là 0.1%

Ở nồng độ này, hoạt tính tối ưu: 134U/g tế bào. Cao hơn 32g so với tế tự do. Điều này có thể do sự hạn
chế khuếch tán giảm gây nên do thành tế bào. Kết quả này phù hợp với kết quả của những nghiên cứu
trước đó.

•Glutaraldedyde ảnh hưởng đến sự tối ưu hoá cố định. Nồng độ glutaraldehyde tối ưu cho cố định

PGA lên chitosan là 5%, hoạt tính là 56U/g, giảm 90g/u so với tế bào tự do. Sự giảm có thể do phản ứng
không đặc hiệu của glutaraldehyde với các nhóm chức của enzyme, làm thay đổi hình thái và vị trí kết nối
của enzyme.


BÀN LUẬN
•

Trọng lượng phân tử của cơ chất đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính enzyme. Hợp chất có trọng
lượng phân tử thấp (300Da) có thể thoát ra khỏi hạt dễ hơn.

•

Giới hạn trong việc vận chuyển sinh khối cho thấy vai trò quan trọng của các hạt xốp có kích thước
đồng đều tạo nên bởi glutaraldehyde.

•

Sự cố định dẫn đến giảm một phần hoạt tính là do thay đổi trong môi trường enzyme, đặc tính hoá lý
của mạng lưới xung quanh enzyme hoặc tế bào, tương tác bề mặt và suy giảm hoạt động trong suốt
quá trình cố định.


BÀN LUẬN

•

Tế bào thẩm thấu với CTAB làm tăng chuyển hoá hơn 9% so với tế tự do. Điều này có thể do sự hạn
chế khuếch tán giảm bởi thành tế bào. Độ xốp của hạt, trọng lượng phân tử của cơ chất cũng có thể
ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme.

•

Hoạt động tối ưu của chất xúc tác không cố định và cố định với glutaraldehyde tương ứng là 14 U/g
và 44 U/g. Có thể cho thấy ảnh hưởng của glutaraldehyde trong quá trình cố định.


BÀN LUẬN
•

Xu hướng của dòng chuyển hoá: hoạt tính của tế bào cố định bằng glutaraldehyde tuyến tính hơn so
với những tế bào khác. Điều này giúp ta có thể dự đoán thời điểm kết thúc của phản ứng chính xác
hơn.

•

Hoat tính của tế bào cố định được xử lý với CTAB bên trong các hạt polyacrylamide cao hơn khoảng
30% so với tế bào không được xử lý. Có thể các tế bào thẩm thấu có hạn chế khuếch tán thấp hơn .