đề tài phân lập xác định thành phần và đặc điểm củacác chủng vi sinh vật trong mẫu

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<i><b>B cáo thực hành mơn </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<small>2</small>

Danh sách nhóm

<b>Tên sinh viênMSSV</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<i><b>Đề tài: Phân lập, xác định thành phần và đặc điểm củacác chủng vi sinh vật trong mẫu thực phẩm</b></i>

I. Mục đích nghiên cứu của đề tài

- Là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng vi khuẩn thuần khiết (clon) được gọi là khuẩn lạc. Khi vi khuẩn tăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn sẽ tạo ra những khuẩn lạc. Mỗi nhóm vi khuẩn, mẫu loại vi khuẩn có hình thái tính chất khuẩn lạc khác nhau, đặc trưng từng loại.

II. Nguyên tắc

- Phân lập vi khuẩn là 1 quá trình tách rời một loại vi sinh vật từ quần thể vi sinh vật, sau đó gieo chúng lên bề mặt thạch dinh dưỡng chọc lọc. Sau đó ủ ở điều kiện thích hợp, các vi sinh vật tách riêng biệt gọi là khuẩn lạc.- Chủng vi sinh vật thuần khiết ( hay gọi là chủng sạch) được hiểu là thế hệ con, cháu có dòng từ một tế bào riêng lẻ. Các chủng vi sinh vật được thu nhận từ khuẩn lạc lần đầu chưa chắc đã thuần khiết vì chúng có thể hình thành bởi 1 hoặc nhiều tế bào, vì thế phải làm sạch nhiều lần mới thu được chủng vi sinh vật thuần khiết.

III. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp pha chế môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật- Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

- Phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học- Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật

- Phương pháp phân lập vi sinh vậtIV. Kết quả dự kiến

- Sau khi thực hiện đề tài thu được ít nhất 5 chủng vi sinh vật khác nhau,trong đó có ít nhất 1 chủng nấm mốc, 1 chủng nấm men, 1 chủng vi khuẩngram (+), 1 chủng vi khuẩn gram (-), 1 chủng cầu khuẩn.

V. Tài liệu tham khảo :Thực tập Vi sinh vật học

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

Kết quả và biện luận kết quả...12

Buổi 3. Cấy truyền làm thuần và quan sát vi sinh vật dưới kính hiển vi. .13Nguyên tắc của cấy truyền làm thuần...13

Mục đích của cấy truyền làm thuần...13

Nguyên tắc của kính hiển vi...13

Cấu tạo của kính hiển vi...13

Kết quả và biện luận kết quả...19

Buổi 5. Cấy giữ giống vi sinh vật trong ống nghiệm...20

Mục đích...20

Nguyên tắc...20

Tiến hành thí nghiệm...20

Kết quả và biện luận kết quả...21

Sơ đồ phân lập vi sinh vật...22

<b>Too long to read onyour phone? Save</b>

to read later onyour computer

Save to a Studylist

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

Kế hoạch thực hiện đề tài

Buổi 1. Pha chế môi trường dinh dưỡng

Buổi 2. Cấy phân lập bằng phương pháp cấy hộp trải và hộp đổBuổi 3. Cấy truyền làm thuần và quan sát vi sinh vật dưới kính hiển viBuổi 4. Cấy truyền làm thuần và nhuộm màu vi sinh vật

Buổi 5. Cấy giữ giống vi sinh vật trong ống nghiệm

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

- Yêu cầu của mơi trường dinh dưỡng: có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết;có độ pH thích hợp; có độ nhớt nhất định; khơng chứa các yếu tố đọc hại;hồn tồn vơ trùng đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật.

III. Tiến hành thí nghiệm

1. Chuẩn bị mơi trường ni cấy vi sinh vật- Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất

- Cân đong hóa chất+ Riêng lẻ+ Chính xác- Phối trộn hóa chất+ Riêng lẻ+ Theo trình tự- Đun sơi

- Đo PH môi trường

- Phối trộn vào dụng cụ chứa ( erlen, ống nghiệm, bình thủy tinh, đỉa petri )- Hấp tiệt trùng môi trường (121 ,30 phút,1 atm)

- Đổ đĩa petri

2. Quy trình ni cấy vi sinh vật ( Môi trường PDA )

<b>Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất </b>

+ 1 bình erlen+ 1 becher+ 12 đĩa petri+ 5 ống nghiệm

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

+ Khoai tây+ Agar + Glucozo

<b>Bước 2: Cân đong hóa chất</b>

+ Khoai tây 30g+ Agar 3g+ Glucozo 3g+ Nước cất 150ml

<b>Bước 3: Phối trộn hóa chất</b>

+ Cho agar và glucozo vào becher trộn đều

<b>Bước 4: Đun sôi</b>

+ Cho khoai tây và 150ml nước vào nồi đun sôi khoảng 15-20 phút.+ Sau đó lấy nước luộc khoai tây

+ Tiếp theo cho nước vừa thu được vào hỗn hợp agar và glucozo, hòa tan.+ Sau khi hòa tan,cho hỗn hợp vừa hòa tan đun sôi trên bếp cho đến khihỗn hợp vừa sôi.

<b>Bước 5: Đo PH môi trường</b>

+ Muốn điều chỉnh độ pH của mơi trường có thể dùng HCl 10% hay NaCl10%. Ngồi ra có thể dùng một số hóa chất khác như: H3PO4, H2SO4,KOH, NaHCO3, Na2CO3...

+ Muốn kiểm tra độ pH của môi trường nên dùng máy đo pH (pH-metre).Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao. Trong phịng thínghiệm có thể dùng chỉ thị màu xanh bromotomol hay giấy quỳ để đo pH.Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng khơng cho độ chính xác cao.

<b>Bước 6: Phối trộn vào dụng cụ chứa mơi trường</b>

Hình ảnh cân đong hóa chất

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<small>8</small>+ Cho hỗn hợp vừa hịa tan vào erlen 250 sau đó dùng giấy bạc đậy kínmiệng erlen cố định bằng băng dính hoặc dùng bơng khơng thấm nước bịtkính miệng erlen và dùng giấy báo bịt kín thêm lần nữa và cố định bằngdây thun.

<b>Bước 7: Hấp tiệt trùng môi trường</b>

+ Cho môi trường vào nồi hấp 30-45 phút, 121 ,1atm+ Tiếp theo cho đĩa petri vào tủ sấy để tiệt trùng 180 30 phút

<b>Bước 8: Đổ môi trường ra đĩa petri</b>

+ Đổ môi trường ra 5 đĩa petri đã tiệt trùng

Hình ảnh đậykín hỗn hợpvừa hịa tanbằng giấy

Hình ảnh gói đĩa petri bằng giấy báo cho vào tủấ

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

+ Nhanh tay rót mơi trường vào dụng cụ và đậy giấy bạc lại bình chứa.+ Đối với đĩa petri, mơi trường chỉ được phân phối vào đĩa sau khi đã hấp tiệt trùng.

Thể tích mơi trường khoảng 12-15 ml mỗi đĩa, lớp môi trường thạch dày khoảng 2 mm.

+ Viết nhãn môi trường trên dụng cụ chứa, bao gồm các thông tin: Tên môitrường, ngày khử trùng, người pha chế.

<small>VI. </small>Kết quả và biện luận kết quả

- Sau khi đổ mơi trường PDA vào đĩa petri thì sau một thời gian nó sẽ đơnglại thành dạng thạch do có thành phần agar nên làm cho môi trường củachúng ta đơng lại.Để một vài ngày nếu khơng có sự xuất hiện của vi sinhvật nào trên bề mặt môi trường vậy đã thành cơng.

Hình ảnhđổ mơitrường rađĩa petri

Đây là kết quả sau khi đổ môi trường vào đĩa

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

II. Nguyên tắc

- Phân lập vi khuẩn là một quá trình tách rời một loại vi sinh vật từ quần thể vi sinh vật, sau đó gieo chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc. Sau khi ủ ở các điều kiện thích hợp, các vi vi sinh vật sẽ phân chia nhiều lần tạo thành những quần thể mọc riêng biệt gọi là khuẩn lạc. - Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết: với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau.

+ Lựa chọn nguồn phân lập vi sinh vật;

+ Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu; + Phân lập vi sinh vật thuần khiết;

+ Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc. III. Chuẩn bị dụng cụ

- Que cấy đầu trịn,móc- Đèn cồn

- Que trải- Giá ống nghiệm- Cốc 100ml

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: đã được chuẩn bị ở buổi 1IV. Tiến hành thí nghiệm

1. Lựa chọn nguồn phân lậpa) Nguồn phân lập nấm mốc

- Một số chủng nấm mốc như Aspergillus oryzae, Aspergillus niger vàMucor… có thể phân lập các loài nấm mốc này trên cơm nguội, xơi làmmốc tương, bánh mì để khơ ít ngày.

b) Nguồn phân lập nấm men

- Có thể phân lập nấm men dễ dàng từ các môi trường như: bề mặt trái câyvà dịch ép một số trái cây như táo, lê, nho, dâu, mơ, dứa, trong rượu nếp,trong các bánh men rượu, trong bia, trong nước mía, trong hạt kefia.c) Nguồn phân lập vi khuẩn

- Có thể phân lập vi khuẩn từ đất, nước giải khát nước mía nước thải,<b>(),</b>

thực phẩm tươi (thịt, cá, sữa tươi, rau quả tươi…), thực phẩm bị ôi thiu…

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

2. Kỹ thuật nuôi cấy tạo khuẩn lạc riêng lẽ từ quần thể vi sinh vật trên cácmôi trường phân lập

Bước 1: Xử lí mẫu, pha loãng mẫu hút lấy mẫu nước mía 1ml bằngmicropipett (pipette Pasteur) và hơ với lửa, sau đó cho vào 9ml Nacl 0,9%,nước muối sinh lý. Lấy 1ml ống nghiệm 1 sang ống nghiệm 2 tương tự nhưvậy tới ống nghiệm thứ 5. Trong suốt quá trình thực hiện phải gần đèn cồn.Bước 2: Thực hiện cấy đổ và cấy trải

* Cấy đỗ trên thạch đĩa ( Cho mẫu vào đĩa peptri trước)

- Dùng micropipette và đầu tuýp vô trùng, hút 1 ml mẫu đã pha loãng ở ốngnghiệm 10 vào đĩa petri.

- Tiếp theo,đổ khoảng 15-20 ml môi trường đã đun chảy và để nguội.

- Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch mẫu và môi trường trộn đều trong môi trường cấy.

* Cấy trải trên thạch đĩa ( Cho môi trường trước vào đĩa peptri trước)- Dùng micropipette và đầu tuýp vô trùng, hút 0,1 ml mẫu đã pha loãng ở ống nghiệm 10 lên bề mặt môi trường trong đĩa petri.

- Sau đó dùng que trải thủy tinh nhúng vào cồn và hơ qua ngọn lửa đèn cồn( thực hiện 3 lần), để nguội.

- Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó để cách đèn cồn chừng 1-2 cm, khẽ mở nghiêng một bên hộp (phần hơ lửa), sao chovừa đủ để cho que cấy vào.

- Nhẹ nhàng, nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo một trong các kiểu sau:

+ Theo hình zích zắc trên tồn bộ mặt thạch. + Theo những đường song song.

+ Theo hình zích zắc 3 hoặc 4 góc. <small>Đổ mơi </small>

<small>trường vào mẫu</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<small>12</small>V. Kết quả và biện luận kết quả

Đây là kết quả thu được, đĩa thứ nhất ta thấy những đóm vàng trên bề thạchđó là vi khuẩn.

Hình ảnh đĩa thứ hai, có xuất hiện đóm trịn màu trắng đục bề mặt khơ ráođó là nấm men.

Trong q trình làm có những đĩa bị hỏng như

Đĩa này lí do bị hỏng là do đổ mơi trường khơng đều

Đĩa này trong q trình thao tác do để sát đèn cồn,làm cho môi trường bị tan

hả

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

Buổi 3. Cấy truyền làm thuần và quan sát vi sinhvật dưới kính hiển vi

I. Nguyên tắc của cấy truyền làm thuần

<b>- Sau khi thực hiện cấy phân lập , sau vài ngày sẽ xuất hiện các chủng VSV</b>

trên đĩa petri . Ta thực hiện cấy chuyền làm thuần bằng phương pháp cấyria và cấy điểm qua một đĩa môi trường mới và thao tác này được lặp lạinhiều lần cho đến khi VSV thuần khiết .

II. Mục đích của cấy truyền làm thuần

<b>- Để tạo ra đồng nhất một chủng VSV thuần khiết từ một tế bào riêng lẽ ,</b>

phục vụ cho các công đoạn nghiên cứu đặc điểm , hình thái , nhuộm màucủa từng chủng VSV.

III. Nguyên tắc của kính hiển vi

- Dùng ánh sáng có bước sóng từ 500 nm – 560 nm trong chùm ánh sáng thường để tạo năng suất phân ly lớn giúp phân biệt hai điểm cách nhaukhoảng 0,2 µm trở lên.

- Chức năng của kính hiển vi quang học dùng để quan sát tế bào vi sinh vật,ký sinh trùng, tế bào động vật, thực vật.

IV. Cấu tạo của kính hiển vi

Kính hiển vi quang học được cấu tạo gồm hai phần:

- Hệ thống cơ học: giá kính gồm chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính, ổ gắn và xoay vật kính, bàn kính, thanh trượt di chuyển tiêu bản, ốc dichuyển thanh trượt, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh sơ thơ cấp, ốc điều chỉnh thứ cấp (vi cấp).

- Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màn chắn sáng, nguồn chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng và/ hoặc kính chiếu sáng).

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<small>14</small>Ngồi ra, ở kính dùng nguồn chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây điện, cầu chì, mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng.

V. Tiến hành thí nghiệm1. Cấy truyền làm thuần

- Sau khi cấy phân lập ở bước 1 ,bước 2 , vài ngày sau đĩa petri có cácchủng VSV khác nhau .

- Cấy vi sinh vật từ khuẩn lạc mọc tách rời trên đĩa petri vào một đĩa petrikhác đã chuẩn bị sẵn môi trường.

- Nuôi vi sinh vật ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.

- Loại bỏ các đĩa petri bị nhiễm, chọn ra các đĩa petri có các chủng thuầnkhiết

<b>- ( Cấy ria )cấy truyền bằng que cấy đầu tròn đối với vi khuẩn và nấm</b>

men :

<b>+</b>Dùng que cấy vịng thao tác vơ trùng ( Vi khuẩn và nấm men )

+ Ria các đường trên đĩa pêtri chứa mơi trường thích hợp (ria chữ T và riabốn góc).

Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thựchiện đường ria tiếp theo.

<small> </small>

- ( Cấy điểm ) cấy truyền bằng que cấy đầu mốc đối với nấm mốc

<b>+ Dùng que cấy mốc thao tác vô trùng ( nấm mốc )</b>

+ Cấy một điểm vào trong lòng thạch hoặc ba điểm theo hình tam giác đều

<small> </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

2. Quan sát kính hiển vi ( quan sát vi sinh vật ở buổi 2)

Trước khi sử dụng phải kiểm tra tất cả các bộ phận của kính, dùng khăn mềm để lau các bộ phận của kính để kính ngay ngắn vừa với tầm ngồi. Sau đó cần thao tác các bước sau:

* Bước 1: Chuẩn bị kính

Kết nối kính hiển vi với nguồn điê ‡n , bật cơng tắc kính, điều khiển nút chỉnh ánh sáng để kính để có được ánh sáng thích hợp.

* Bước 2: Đặt tiêu bản vào mâm kính

- Trước khi đặt tiêu bản vào mâm kính, phải chọn mặt phải, mặt trái của tiêu bản.Mặt phải của tiêu bản thường có dán lamen, dán nhãn (nếu có lamen và nhãn) hoặc làm giảm bớt độ lóa của gương khi để nghiêng soi ra ánh sáng (nếu khơng có lamen, khơng có nhãn)

- Để mặt phải của tiêu bản lên trên, tay phải mở kẹp tiêu bản, tay trái cầm phía đầu nhãn tiêu bản, đặt tiêu bản vào mâm kính và tay phải thả kẹp giữ tiêu bản ra. Tiêu bản được giữ chặt vào xe đẩy, trên mâm kính.

- Dùng ốc xe đẩy để điều chỉnh sao cho mẫu vật nằm đúng vào trục kính* Bước 3: Quan sát

Nguyên tắc bắt buộc khi quan sát là phải quan sát được ở vật kính có độ phóng đại nhỏ, rồi mới chuyển sang quan sát ở vật kính có độ phóng đại lớn hơn kề nó.

Xem tiêu bản ở vật kính x10

- Hạ tụ quang kính xuống dưới (tức tăng khoảng cách tụ quang với tiêu bản, thị trường mờ đi).

- Xoay vật kính x10 vào khớp của ổ đỡ vật kín.

Mắt nhìn vào bàn đặt tiêu bản (khơng nhìn vào thị kính), hai tay xoay ốc điều chỉnh sơ cấp đưa dần vật kính hướng đến tiêu bản (khơng được chạm vào tiêu bản).

- Đặt mắt hướng vào thị kính, hai tay xoay chậm ốc điều chỉnh sơ cấp hướng ra xa tiêu bản đến khi mắt thấy rõ dần tiêu bản mẫu vật thì dừng lại. Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất.

- Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kính với tiêu bản và màn chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất.

Xem tiêu bản ở vật kính x40

- Nâng tụ quang kính lên vừa phải (thị trường sáng hơn).

- Xoay vật kính x40 vào khớp của ổ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang).

- Đặt mắt hướng vào thị kính, có thể nhìn thấy ngay hình thái của mẫu vật. Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất.

- Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kính với tiêu bản và màn chắn sáng sao cho tiêu bản thấy ảnh rõ nhấtQuan sát vi sinh vật

- Xem chi tiết hình dáng, màu sắc của nấm mốc: khuẩn ty, vách ngăn khuẩnty,cuống bào tử, thể bọng, thể bình, túi bào tử, cách sắp xếp của bào tử... Xem tổng thể hình dáng của nấm mốc ở vật kính x10.

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

<small>16</small>- Tế bào nấm men: Xem ở vật kính x40 quan sát hình dạng tế bào: tế bào đứng riêng lẻ hay kết dính tạo sợi giả - sợi thật, trạng thái nảy chồi. Vẽ hìnhmột thị trường kính hiển vi ở vật kính X40, có các tế bào nấm men.- Xem trạng thái của tế bào vi khuẩn: di động hay đứng yên, kiểu di động của tế bào, hình dạng của tế bào.

VI. Kết quả và biện luận kết quả

<small>Hình ảnh của vi </small> ^{Hình ảnh nấm men,nhìn nó}<small>dày vì lấy vi sinh nhiều</small>

<small>Hình ảnh thu được khi cấy truyền mơi trường PDA,ta thấy có màu tím là do vi sinhvật này có mang sắc tố</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

- Đối với các phương pháp nhuộm màu vi sinh vật được cố định, thườngsử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững.

III. Chuẩn bị dụng cụ- Đèn cồn

- Bình tia- Que cấy- Kính hiển vi- Chậu thủy tinh- Phiến kính- Lá kính- Cốc 100ml- Nước mía

- Các dung dịch nhuộm+ Dung dịch xanh methylen

+ Dung dịch tím kết tinh (crystal violet)+ Dung dịch lugol

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

<small>18</small>+ Tím gentian.

+ Đỏ trung tính.

- Phương pháp nhuộm: đặt tiêu bản đã cố định lên giá rồi nhỏ vài giọt thuốc nhuộm sau đó cho vi sinh vào. Sau 1 – 2 phút, đổ thuốc nhuộm đi và rửa nhẹ bằng nước sạch tới khi nào thấy nước rửa chảy qua vết bơi khơng cịn màu nữa là được. Để tiêu bản khô dần hoặc thấm khô bằng giấy thấm. Khi tiêu bản khô hẳn đem quan sát dưới kính hiển vi.

* Nhuộm gram

- Quy trình nhuộm Gram cần chuẩn bị một số dụng cụ sau: đèn cồn, que cấy, kính hiển vi, lam kính,…

- Hóa chất cần dùng cho quy trình là:

+ Dung dịch tím Gentian : thành phần gồm tím gentian nồng độ 1/10 , cồn 95 độ, acid phenic và nước cất.

+ Dung dịch Lugol : có chứa iod và kali iot.+ Dung dịch cồn 90 độ.

+ Dung dịch đỏ Fushin kiềm: thành phần gồm Fushin kiềm, cồn 95 độ, acid phenic và nước cất.

- Quy trình nhuộm Gram bao gồm các bước như sau:+ Bước 1: Tạo vết bơi.

Đánh dấu lam kính. Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên lam kính.Lấy vikhuẩn từ các môi trường đã nuôi cấy bằng que cấy sau đó dàn đều trên lam kính với nước muối sinh lý.

+ Bước 2: Cố định tiêu bản bằng cách để cách ngọn lửa đèn cồn 35cm.Mục đích việc cố định tiêu bản: để giết chết vi khuẩn, giúp vi khuẩn gắn chặt vào lam kính và bắt màu thuốc nhuộm tốt hơn.+ Bước 3: Nhuộm tiêu bản:

Phủ kín vùng có vi khuẩn trên lam kính bằng thuốc nhuộm tím kết tinh trong thời gian 60 giây, sau đó rửa lại bằng bình tia. Mục đích: để vi khuẩn thấm đều màu thuốc nhuộm.

Sau đó,phủ thuốc nhuộm lugol trong 1 phút, sau đó rửa lại bằng bình tia.Mục đích: bước này giúp vi khuẩn giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh tốt hơn.

Tiếp theo,tẩy cồn bằng cách phủ cồn 90 độ lên lam và giữ trong 5-10 giây cho tới khi vừa mất màu và rửa lại nước bằng bình tia. Mục đích: đây là bước tẩy màu, nếu trường hợp là vi khuẩn gram âm nó sẽ hịa tan lớp màng lipid bên ngồi. Cần tẩy màu kỹ để vi khuẩn bắt đúng màu thuốc nhuộm tránh nhận định kết quả sai.

Cuối cùng phủ thuốc nhuộm Safranin lên lam và giữ 60 giây sau đó rửa lại bằng bình tia. Mục đích: giúp các vi khuẩn khơng bắt màu tím sẽ bám màu hồng của thuốc thử này.

+ Bước 4: Quan sát kết quả

Để lam khô tự nhiên và soi trên kính hiển vi ở vật kính dầu x100. Đọckết quả nhuộm

Vi khuẩn Gram dương: bắt màu tím.Vi khuẩn Gram âm: bắt màu hồng.

</div>